способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека

Формула изобретения

1. Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесения в лунки микропанели реагента R4 и анализируемой пробы, содержащей компонент С4 комплемента человека с неизвестной активностью, инкубацию, выливание содержимого лунок, внесения конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека, а затем после инкубации и удаления инкубационного раствора внесения субстрата этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента С4 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат.

2. Набор для определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, реагент R4, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С4.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонента C4, преимущественно его изотипа С4В [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета липополисахарида, затем определяемого C4 из растворов, его содержащих, в присутствии реагента R4, т.е. сыворотки крови человека, лишенной активности C4. Количество ковалентно связавшегося компонента CЗ зависит от концентрации функционально активного определяемого компонента C4. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента СЗ определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к СЗ, конъюгированных с ферментом.

Единственным недостатком этого способа является трудность в сорбции липополисахарида на полистироловых микропанелях, обычно используемых в иммуноферментном анализе, и плохое сохранение активирующей способности при хранении.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С4 классического пути системы комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора классического пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего реагент R4 (сыворотки крови человека, лишенной активности компонента С4), и анализируемой пробы, содержащей компонент C4 комплемента человека с неизвестной активностью, и проведение инкубации, в ходе которой происходит формирование C3-конвертазы (C4b2а) на сорбированном активаторе в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С4, в результате чего происходит активация этой конвертазой компонента C3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента CЗ человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности компонента C3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, реагент R4 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента C4), конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента C4, а именно его C4B изотипа, обладающих хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования трудносорбируемого и плохо сохраняющего свою активирующую способность препарата липополисахарида.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента C4

Растворяют аптечный препарат дерината в фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg ²⁺. В лунки микропанели ряда вносят по 100 мкл того же буфера, содержащего 10 мкл реагента R4 (R4 - сыворотка крови человека, лишенная активности компонента C4 [2]), и анализируемую пробу, содержащую компонент C4 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента CЗ человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата компонента C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента C4

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, реагент R4 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента C4), конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента C4 с коэффициентом корреляции R²=0,998, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С4 описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Лахтин М.В., Лахтин В.М., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента C4 комплемента человека. Патент РФ 2253117. Бюл. № 15. 27.05.2005.

2. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента C2, C3, C4 и C5. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. № 5. С.652-659.