питательная среда для культивирования клеток млекопитающих

Формула изобретения

1. Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих MDCK и Vero, используемых в производстве противогриппозных вакцин млекопитающих, включающая сбалансированный солевой раствор в виде раствора Хенкса или раствора Эрла, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата рисовой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.%, и/или соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,9-3,5 мас.%, остаточного азота 5,6-6,6 мас.%, аминокислоты и витамины при следующем содержании компонентов:

ферментативный гидролизат рисовой муки с рН 6,2-6,7,
содержанием аминного азота 2,2-2,8 мас.%,
остаточного азота 3,0-4,2 мас.% и/или соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием
аминного азота 2,9-3,5 мас.%, остаточного	3-20 г/л
азота	5,6-6,6 мас.%,
аминокислоты	0,11-0,86 г/л
витамины	0,55-22,5 мг/л
раствор Хенкса или раствор Эрла	1 л

2. Среда по п.1. отличающаяся тем, что в качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Хенкса, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,9-3,5 мас.%, остаточного азота 5,6-6,6 мас.%, в качестве аминокислот она содержит L-глутамин, L-цистин и в качестве витаминов - холин хлорид, фолиевую кислоту, никотинамид, кальция пантотенат, пиридоксаль гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, миоинозитол и рибофлавин при следующем содержании компонентов:

ферментативный гидролизат соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,9-3,5 мас.%,
остаточного азота 5,6-6,6 мас.%	3-10 г/л
аминокислоты:
L-глутамин	0,1-0,3 г/л,
L-цистин	0,01-0,04 г/л
витамины:
холин хлорид	0,2-1,0 мг/л
фолиевая кислота	0,2-1,0 мг/л
никотинамид	0,2-1,0 мг/л
кальция пантотенат	0,2-1,0 мг/л
пиридоксаль гидрохлорид	0,2-1,0 мг/л
тиамин гидрохлорид 0,2-1,0 мг/л
миоинозитол	0,2-1,0 мг/л
рибофлавин	0,02-0,1 мг/л
солевой раствор Хенкса	1 л

3. Среда по п.1, отличающаяся тем, что в качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Эрла, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.%, в качестве аминокислот L-глутамин, L-цистин, L-аргинин, триптофан и в качестве витаминов: Д-биотин, холин-хлорид, фолиевую кислоту, никотинамид, никотиновую кислоту, кальция пантотенат, пиридоксин гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, рибофлавин, миоинозитол, витамин В 12 при следующем содержании компонентов:

ферментативный гидролизат рисовой муки с рН 6,2-6,7,
содержанием аминного азота
2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.%	3-10 г/л
аминокислоты:
L-глутамин	0,1-0,3 г/л
L-цистин	0,01-0,04 г/л
L-аргинин	0,01-0,5 г/л
триптофан	0,002-0,02 г/л
витамины:
Д-биотин	0,01-0,5 мг/л
холин-хлорид	0,2-5 мг/л
фолиевая кислота	0,01-0,5 мг/л
никотинамид	0,02-1,0 мг/л
никотиновая кислота	0,02-1,0 мг/л
кальция пантотенат	0,01-0,5 мг/л
пиридоксин гидрохлорид	0,02-1,0 мг/л
тиамин гидрохлорид	0,01-0,5 мг/л
рибофлавин	0,01-0,5 мг/л
миоинозитол	0,04-2,0 мг/л
витамин В12	0,2-10 мг/л
солевой раствор Эрла	1 л

4. Среда по п.1, отличающаяся тем, что в качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Эрла, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.% и ферментативный гидролизат соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,9-3,5 мас.%, остаточного азота 5,6-6,6 мас.%, в качестве аминокислот -:

L-глутамин, L-цистин, L-аргинин, триптофан, а в качестве витаминов - Д-биотин, холин-хлорид, фолиевую кислоту, никотинамид, никотиновая кислота, кальция пантотенат, пиридоксин гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, рибофлавин, миоинозитол, витамин В 12 при следующем содержании компонентов:

ферментативный гидролизат рисовой муки с рН
6,2-6,7, содержанием аминного азота
2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.%	3-10 г/л
ферментативный гидролизат соевой муки с рН 6,2-
6,7, содержанием аминного азота
2,9-3,5 мас.%, остаточного азота 5,6-6,6 мас.%,	1-10 г/л
аминокислоты:
L-глутамин	0,1-0,3 г/л
L-цистин	0,01-0,04 г/л
L-аргинин	0,01-0,5 г/л
триптофан	0,002-0,02 г/л
витамины:
Д-биотин	0,01-0,5 мг/л
холин-хлорид	0,2-5 мг/л
фолиевая кислота	0,01-0,5 мг/л
никотинамид	0,02-1,0 мг/л
никотиновая кислота	0,02-1,0 мг/л
кальция пантотенат	0,01-0,5 мг/л
пиридоксин гидрохлорид	0,02-1,0 мг/л
тиамин гидрохлорид	0,01-0,5 мг/л
рибофлавин	0,01-0,5 мг/л
миоинозитол	0,04-2,0 мг/л
витамин B12	0,2-10 мг/л
солевой раствор Эрла	1 л

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к питательным средам, пригодным для роста и пролиферации клеток млекопитающих и для репродукции в них вирусов, например вируса гриппа.

Питательные среды для культур клеток предназначены для поддержания необходимых для их роста физико-химических условий и обеспечения клеток питательными веществами, необходимыми для наработки клеточной биомассы. Развитие биотехнологии, и ее выход на промышленный уровень привело к увеличению потребности и расширению ассортимента питательных сред для культур клеток. Конструирование питательных сред на основе гидролизатов растений позволяет существенно уменьшить риск контаминации препаратов животными патогенами, а также заметно снизить стоимость среды.

Известна питательная среда Axcevir для культивирования клеток MDCK. Среда полностью синтетическая содержит аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества. Среда обеспечивает высокие индексы пролиферации культуры клеток MDCK и степень стандартности исследования (Питательная среда Axcevir-MDCK, производства фирмы Stem Alpha, Франция. Информация о фирме в Интернете: http://www.stemalpha. fr/).

Однако в связи с тем, что указанная среда изготавливается во Франции и импортируется в Российскую Федерацию, в условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество питательной среды для получения клеточной биомассы, использование среды нерентабельно. При применении данной среды резко возрастает стоимость вирусных вакцин и других препаратов, сырьем для которых она является.

Известна питательная среда на основе среды Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки и трипсина в количестве (0,05-1,0 мкг/мл) для культивирования аттестованных перевиваемых линий клеток (Vero, MDCK) для наработки высокопродуктивных штаммов вируса гриппа (патент США № 6344354, МПК С12N 5.00, C12N 7/00, опубл. 05.02.2002).

Однако использование для культивирования клеток питательной среды Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки приводит к внесению в конечный продукт (вакцину) компонентов сырья животного происхождения, которые могут являться источником посторонних вирусов, микоплазм, прионов, а также вызывать дополнительную аллергизацию иммунизируемого организма.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является питательная среда для культивирования клеток млекопитающих, включающая сбалансированную синтетическую среду DMEM/F12, 199 или RPMI, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата, аминокислоты и витамины (патент РФ № 2266325, МПК C12N 5/00, опубл. 20.12.2005). Питательная среда DMEM/F12 содержит 20 аминокислот и 11 витаминов, среда 199 - 21 аминокислоту и 17 витаминов, RPMI - 20 аминокислот и 11 витаминов.

Однако данная питательная среда предназначена для культивирования клеток животных СНО и ВНК. Данных по культивированию животных клеток MDCK и Vero в описании к патенту не имеются. Растительные гидролизаты в жидкой форме получены путем температурного на них воздействия с получением бульона. Данная технология не позволяет обеспечить глубокое расщепление субстрата, что обуславливает низкий выход аминокислот и витаминов.

Техническим результатом изобретения является создание более стандартизованной и дешевой питательной среды специально для культивирования клеток MDCK и Vero, используемых в производстве культуральных противогриппозных вакцин.

Указанный технический результат достигается тем, что в питательной среде для культивирования клеток млекопитающих, включающей сбалансированный солевой раствор, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата, аминокислоты и витамины согласно изобретения в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой и/или соевой муки при следующем содержании компонентов:

ферментативный гидролизат рисовой
и/или соевой муки	3-20 г/л
аминокислоты	0,11-0,86 г/л
витамины	0,55-22,5 мг/л
сбалансированный солевой раствор	до 1 л

В качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Хенкса, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат соевой муки, в качестве аминокислот она содержит L-глутамин, L-цистин и в качестве витаминов - холин хлорид, фолиевая кислота, никотинамид, кальция пантотенат, пиридоксаль гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, мио-инозитол и рибофлавин при следующем содержании компонентов:

ферментативный гидролизат соевой муки	3-10 г/л
аминокислоты:
L-глутамин	0,1-0,3 г/л
L-цистин	0,01-0,04 г/л
витамины:
холин хлорид	0,2-1,0 мг/л
фолиевая кислота	0,2-1,0 мг/л
никотинамид	0,2-1,0 мг/л
кальция пантотенат	0,2-1,0 мг/л
пиридоксаль гидрохлорид	0,2-1,0 мг/л
тиамин гидрохлорид	0,2-1,0 мг/л
мио-инозитол	0,2-1,0 мг/л
рибофлавин	0,02-0,1 мг/л
сбалансированного солевого раствора Хенкса	до 1 л

В качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Эрла, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки, в качестве аминокислот: L-глутамин, L-цистин, L-аргинин, триптофан и в качестве витаминов: Д-биотин, холин-хлорид, фолиевая кислота, никотинамид, никотиновая кислота, кальция пантотенат, пиридоксин гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, рибофлавин, мио-инозитол, витамин B₁₂ при следующем содержании компонентов:

ферментативный гидролизат рисовой муки	3-10 г/л
аминокислоты:
L-глутамин	0,1-0,3 г/л
L-цистин	0,01-0,04 г/л
L-аргинин	0,01-0,5 г/л
триптофан	0,002-0,02 г/л
витамины:
D-биотин	0,01-0,5 мг/л
холин-хлорид	0,2-5 мг/л
фолиевая кислота	0,01-0,5 мг/л
никотинамид	0,02-1,0 мг/л
никотиновая кислота	0,02-1,0 мг/л
кальция пантотенат	0,01-0,5 мг/л
пиридоксин гидрохлорид	0,02-1,0 мг/л
тиамин гидрохлорид	0,01-0,5 мг/л
рибофлавин	0,01-0,5 мг/л
мио-инозитол	0,04-2,0 мг/л
витамин В12	0,2-10 мг/л
сбалансированный солевой раствор Эрла	до 1 л

В качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Эрла, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки и ферментативный гидролизат соевой муки, в качестве аминокислот - L-глутамин, L-цистин, L-аргинин, триптофан, а в качестве витаминов - D-биотин, холин-хлорид, фолиевая кислота, никотинамид, никотиновая кислота, кальция пантотенат, пиридоксин гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, рибофлавин, мио-инозитол, витамин В₁₂ при следующем содержании компонентов:

ферментативный гидролизат соевой муки	1-10 г/л
ферментативный гидролизат рисовой муки	3-10 г/л
ферментативный гидролизат соевой муки	1-10 г/л
аминокислоты:
L-глутамин	0,1-0,3 г/л
L-цистин	0,01-0,04 г/л
L-аргинин	0,01-0,5 г/л
триптофан	0,002-0,02 г/л
витамины:
Д-биотин	0,01-0,5 мг/л
холин-хлорид	0,2-5 мг/л
фолиевая кислота	0,01-0,5 мг/л
никотинамид	0,02-1,0 мг/л
никотиновая кислота	0,02-1,0 мг/л
кальция пантотенат	0,01-0,5 мг/л
пиридоксин гидрохлорид	0,02-1,0 мг/л
тиамин гидрохлорид	0,01-0,5 мг/л
рибофлавин	0,01-0,5 мг/л
мио-инозитол	0,04-2,0 мг/л
витамин B12	0,2-10 мг/л
сбалансированный солевой раствор Эрла	до 1 л

Заявляемая питательная среда содержит ферментативный гидролизат растительных белков, который включает компоненты с высокой питательной ценностью, в частности ферментативный гидролизат рисовой и/или соевой муки, в который дополнительно добавляют не более 4 аминокислот и до 11 витаминов, что позволяет снизить цену конечного продукта. Среды обладают высокой ростстимулирующей активностью по отношению к клеточным культурам Vero и MDCK, используемым в производстве культуральных противогриппозных вакцин. Кроме того, настоящее изобретение позволяет снизить содержание сыворотки в питательной среде. Заявляемая среда для культивирования клеток млекопитающих, содержащая ферментативные гидролизаты рисовой и соевой муки, с пониженной концентрацией сыворотки крови КРС, способна поддерживать жизнеспособность и пролиферацию клеток также эффективно, как и среда, содержащая сыворотку.

Пример 1. Получение ферментативного гидролизата

Указанный результат достигается тем, что ферментативный гидролизат соевой муки и рисовой муки получают при следующих условиях:

Соотношение субстрат: вода 1:8.

Соотношение фермент: субстрат от 0,05 г до 0,2 г фермента на 1 г субстрата (оптимально 0,15).

Температура гидролиза 38-40°С.

рН гидролиза от 7,6 до 8,0 ед. рН (оптимально 7,6-7,8 ед. рН).

время гидролиза от 5 до 24 ч, (оптимально 15 ч).

Получение ферментативного гидролизата.

К обезжиренной и промытой подкисленной водой для удаления окрашенных пигментов соевой (рисовой) муке, добавляют очищенную воду и протеолитический фермент, например папаин, устанавливают необходимые для гидролиза температуру и величину рН. Критерием окончания процесса гидролиза служит постоянство величины аминного азота. После окончания процесса гидролиза смесь прогревают для инактивации фермента при температуре не более 100°С в течение 5-10 мин, затем охлаждают и фильтруют через картон для фильтрации биологических жидкостей, а затем микропористые капроновые фильтры. Приготовленный таким образом жидкий раствор гидролизата лиофильно высушивают.

Полученный ферментативный гидролизат имеет следующие физико-химические характеристики:

Концентрация водородных ионов 1%-ного раствора гидролизата, рН в пределах 6,2-6,7 ед. рН.

Растворимость 5 г гидролизата в 100 мл очищенной воды, не более 3 мин.

Массовая доля влаги, не более 3%.

Массовая доля общего азота, в пределах 3,2-4,6% для гидролизата рисовой муки и для гидролизата соевой муки 5,8-7,6%.

Массовая доля аминного азота, в пределах 2,2-2,8% для гидролизата рисовой муки и для гидролизата соевой муки 2,9-3,5%.

Массовая доля остаточного азота в пределах 3,0-4,2% для гидролизата рисовой муки и для гидролизата соевой муки 5,6-6,6%.

Строгое соблюдение условий гидролиза и регулярный контроль физико-химических параметров в процессе гидролиза позволяет получать в достаточной степени стандартный продукт, имеющий разброс количественных показателей аминокислот не более 20%.

Пример 2. Составы питательных сред

Подобраны концентрации ферментативных гидролизатов, обеспечивающие оптимальные условия для роста и жизнедеятельности клеточных культур культуры (от 3 до 10 г/л), что соответствует содержанию аминного азота в традиционных средах (Игла MEM -120 мг/л, 199 М - 80 мг/л).

Среды для культивирования клеточных культур готовят следующим образом.

1. Питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки: в 1 л сбалансированного раствора Хенкса растворяют ферментативный гидролизат в количестве от 3 до 10 г (оптимально 5 г), L-глутамин в количестве 0,1-0,3 г/л среды), L-цистин в количестве 0,01-0,04 г/л среды и следующие 8 витаминов:

холин хлорид от 0,2 до 1,0 мг/л среды,

фолиевая кислота от 0,2 до 1,0 мг/л,

никотинамид от 0,2 до 1,0 мг/л,

кальция пантотенат от 0,2 до 1,0 мг/л,

пиридоксаль гидрохлорид от 0,2 до 1,0 мг/л,

тиамин гидрохлорид от 0,2 до 1,0 мг/л,

мио-инозитол от 0,2 до 1,0 мг/л,

рибофлавин от 0,02 до 0,1 мг/л.

2. Питательная среда на основе ферментативного гидролизата рисовой муки: в 1 л сбалансированного раствора Эрла растворяют ферментативный гидролизат в количестве от 3 до 10 г (оптимально 5 г), добавляют аминокислоты: L-глутамин в количестве 0,1-0,3 г/л среды, L-цистин в количестве 0,01-0,04 г/л среды, L-аргинин в количестве 0,01-0,5 г/л среды, триптофан в количестве 0,002-0,02 г/л среды, и следующие 11 витаминов:

D-биотин от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

холин-хлорид от 0,2 до 5 мг/л среды,

фолиевая кислота от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

никотинамид от 0,02 до 1,0 мг/л среды,

никотиновая кислота от 0,02 до 1,0 мг/л среды,

кальция пантотенат от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

пиридоксин гидрохлорид от 0,02 до 1,0 мг/л среды,

тиамин гидрохлорид от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

рибофлавин от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

мио-инозитол от 0,04 до 2,0 мг/л среды

витамин В₁₂ от 0,2 до 10 мг/л среды.

3. Питательная среда на основе смеси ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки: в 1 л сбалансированного раствора Эрла растворяют ферментативный гидролизат рисовой муки в количестве от 3 до 10 г (оптимально 5 г), ферментативный гидролизат соевой муки в количестве от 1 до 10 г (оптимально 2 г), и добавляют аминокислоты: L-глутамин в количестве 0,1-0,3 г/л среды, L-цистин в количестве 0,01-0,04 г/л среды, L-аргинин в количестве 0,01-0,5 г/л среды, триптофан в количестве 0,002-0,02 г/л среды, и следующие 11 витаминов:

D-биотин от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

холин-хлорид от 0,2 до 5 мг/л среды,

фолиевая кислота от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

никотинамид от 0,02 до 1,0 мг/л среды,

никотиновая кислота от 0,02 до 1,0 мг/л среды,

кальция пантотенат от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

пиридоксин гидрохлорид от 0,02 до 1,0 мг/л среды,

тиамин гидрохлорид от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

рибофлавин от 0,01 до 0,5 мг/л среды,

мио-инозитол от 0,04 до 2,0 мг/л среды,

витамин B₁₂ от 0,2 до 10 мг/л среды.

Пример 3. Данные по оценке ростстимулирующих свойств питательной среды (ПС)

Проведена оценка ростстимулирующих свойств ПС в процессе пассирования на ней перевиваемых линий клеток Vero и MDCK. В качестве контроля для сравнительного анализа ростовых свойств для клеточной культуры Vero использовали синтетическую среду Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови КРС. Пролиферативная активность клеток Vero, культивируемых на питательных средах представлена в таблице 1.

Таблица 1
Пролиферативная активность клеток Vero
Индексы пролиферации клеток Vero, выращенных на средах
Среда Игла MEM +10% сыворотки крови КРС - контроль	Среда на основе гидролизата соевой муки +5% сыворотки крови КРС	Среда на основе гидролизата рисовой муки +5% сыворотки крови КРС	Среда на основе смеси гидролизатов рисовой и соевой муки +5% сыворотки крови КРС
4,1±0,1	3,9±0,2	4,0±0,2	4,2±0,2

Клетки Vero, выращенные в экспериментальных средах, имели форму, характерную для данного вида клеток, с четко выраженными границами, без признаков дегенерации и морфологически не отличались от клеток, выращенных в контрольной среде.

Пролиферативная активность клеток MDCK, культивируемых на мало сывороточных питательных средах представлена в таблице 2.

Таблица 2
Пролиферативная активность клеток MDCK
Индексы пролиферации клеток MDCK, выращенных на средах
Среда Игла MEM +5% фетальной сыворотки - контроль	Среда Axcevir-MDCK +2% фетальной сыворотки - контроль	Среда на основе гидролизата рисовой муки +2% фетальной сыворотки
4,0±0,1	5,4±0,2	4,5±0,1

Культура клеток MDCK, пассируемая на питательной среде Игла MEM с добавлением 5% сыворотки крови плодов коров (контрольная культура клеток), состоит из эпителиоподобных клеток с крупными ядрами разнообразной формы, содержащими крупные ядрышки от одного до нескольких. Цитоплазма иногда ячеистая с включениями. Культура клеток MDCK формирует монослой на 2-3 сутки роста. Индекс пролиферации культуры после I пассажа составил 4,0.

При пассировании клеточной культуры на питательной среде для культивирования клеток MDCK (Axcevir-MDCK) с добавлением 2% сыворотки крови плодов коровы (вторая контрольная клеточная культура) клетки имеют типичную для данной линии морфологию, формируют монослой на 2-3 сутки, сохраняют высокую пролиферативную активность (индекс пролиферации клеточной культуры после I пассажа составил 5,4).

При пассировании клеток MDCK на экспериментальной среде на основе ферментативных гидролизатов рисовой муки с добавлением 2% сыворотки крови плодов коровы отмечаются незначительные изменения морфология клеток, клетки несколько удлиненной веретенообразной формы, при этом наложения слоев клеток не наблюдается. Несмотря на незначительные отличия морфологии клеток, пассируемых в экспериментальной среде по сравнению с пассируемыми в контрольных средах ростстимулирующая активность питательной среды на основе гидролизата рисовой муки сопоставима с контролем (индекс пролиферации клеток после I пассажа составлял 4,5).

Таким образом, описываемый способ получения ПС на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки позволяет получить среды с высокими росстимулирующими свойствами для некоторых перевиваемых клеточных культур млекопитающих, что позволяет применять ее для получения большого количества клеточной биомассы в биотехнологических производствах.

Пример 4. Данные по оценке репродукция холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа H1N1, H3N2 и В

Проведена оценка репродукции холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа H1N1, H3N2 и В, выращенных на клетках MDCK в различных средах. Изучение размножения реассортантных штаммов, выращенных при использовании экспериментальных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки показало, что все вирусные са⁺-штаммы хорошо размножаются с максимальным титром 10^8,5-10^9,0 ЭИД ₅₀/мл при оптимальной множественности заражения 0,001 ЭИД ₅₀/кл, что совпадает с максимальными титрами при использовании контрольных сред - Игла MEM и Axcevir-MDCK.

Результаты размножения реассортантных штаммов, выращенных при использовании экспериментальных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой муки представлены в таблице 3.

Таблица 3
Динамика накопления ca+ -штаммов вируса гриппа на клетках MDCK при оптимальной множественности заражения
Множественность заражения (ЭИД50/кл)	Дни учета	Титр вируса в lg ЭИД50 /мл для са+-штамма
А/47/Шандон/93/1 (H1N1)	А/47/Иоганнесбург/94/2 (H3N2)	В/60/Петербург/95/20
0,001	1	3,5±0,1	2,5±0,1	1,5±0,1
	2	5,5±0,1	6,5±0,1	3,5±0,1
	3	8,7±0,2	9,0±0,2	6,5±0,1
	4	8,5±0,2	9,0±0,1	8,5±0,2
	5	8,5±0,1	9,0±0,2	8,5±0,1