способ молекулярного типирования chlamydia trachomatis

Формула изобретения

Способ молекулярного типирования Chlamydia trachomatis, включающий выделение из клинического материала, полученного от пациента с урогенитальным хламидиозом, бактериальной ДНК Chlamydia trachomatis, получение амплифицированных фрагментов вариабельных участков генов Chlamydia trachomatis и проведение их секвенирования с последующим восстановлением последовательностей анализируемых генов, выравниванием и сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей, отличающийся тем, что получают амплифицированные фрагменты трех вариабельных участков генов Chlamydia trachomatis, таких, как ompA, tsf, pmpF.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой способ молекулярного типирования Chlamydia trachomatis. Изобретение может быть использовано для изучения эпидемиологии урогенитального хламидиоза, оценки генетического родства отдельных штаммов возбудителя урогенитального хламидиоза - C.trachomatis - и выявления штаммов C.trachomatis, которые определяют характер клинического течения заболевания.

Хламидии как возбудитель разнообразной патологии человека являются весьма гетерогенными. Среди более 20 представителей семейства Chlamydiaceae, объединенных в два рода (Chlamydia и Chlamydophila), известно как минимум три вида хламидий, вызывающих болезни человека:

- Chlamydia pneumoniae (по современной номенклатуре Chlamydophila pneumoniae) - возбудитель инфекций дыхательных путей, в эксперименте показана роль этого микроорганизма в развитии атеросклероза, однако в клинике это однозначно не доказано;

- Chlamydia psittaci (по современной номенклатуре Chlamydophila psittaci) - возбудитель пситтакоза;

- Chlamydia trachomatis - возбудитель инфекций урогенитального тракта и ряда других;

- другие хламидии могут вызывать болезни животных или лишены патогенных свойств.

Возбудитель урогенитального хламидиоза Chlamydia trachomatis - относится к облигатным патогенам и передается от человека к человеку преимущественно половым путем. В течение последних лет в Российской Федерации заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией вышла на первое место среди всех бактериальных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). В нашей стране сегодня урогенитальный хламидиоз - вторая по распространенности регистрируемая ИППП после трихомоноза.

Разработка эффективных мероприятий по снижению уровня заболеваемости урогенитальным хламидиозом должна базироваться на четких представлениях об особенностях эпидемиологии этого заболевания. Одним из основных условий для решения этих вопросов является возможность выявления сходства и различия между штаммами бактерий одного биологического вида, выделенных от различных пациентов, то есть осуществления типирования.

Одним из критериев выбора способа типирования является воспроизводимость метода и разрешающая (дискриминирующая) способность. При этом получаемые результаты должны легко учитываться и интерпретироваться без привлечения дополнительной экспертизы, под которой подразумевают способность метода оценить, как отдельные типы, штаммы, случайно отобранные из бактериальной популяции. Для количественной оценки дискриминирующей способности методов типирования применяют индекс разнообразия Симпсона (D) [Gaston, M.A. and P.R.Hunter. 1989. Efficient selection of tests for bacteriological typing schemes. J Clin Pathol 42: 763-766; Hunter, P. R. and M. A. Gaston. 1988. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J Clin Microbiol 26:2465-2466.], который рассчитывают по формуле:

где S - число групп, на которое данный метод разделяет всю выборку штаммов, n_j - число штаммов в j-й группе и N - общее число штаммов в исследованной выборке.

В идеале для методов с максимальной разрешающей способностью индекс Симпсона должен быть равен 1. Это означает, что метод может отнести к различным типам два любых штамма.

Другими критериями выбора метода молекулярного типирования могут быть:

- способность осуществлять анализ большого количества образцов; для лабораторий, проводящих обширные эпидемиологические исследования, данный критерий может являться определяющим;

- хранение генетических профилей, то есть создание базы данных, также является важным критерием выбора метода.

В литературе имеется описание различных методик молекулярного типирования С.trachomatis.

Основным методом типирования С.trachomatis до последнего времени являлся метод серотипирования, основанный на выявлении вариантов антигенной структуры основного белка внешней мембраны микроорганизма (The Major outer membrane protein - MOMP). Описано 19 сероваров С.trachomatis и установлено, что серотипы А, В и С вызывают трахому, серотипы от D до K - урогенитальный хламидиоз и три серотипа (L1-L3) - венерическую лимфогранулему; урогенитальный хламидиоз наиболее часто ассоциируется с сероварами D-F [Spaargaren J., Verhaest I., MooiJ S. et al. Analysis of Chlamidya trachomatis. Serovar distribution changes in the Netherlands (1986-2002). Sex Transm Infect 2004, 80: 151-152]. Вместе с тем серотипирование является достаточно трудоемким и длительным процессом, требующим получения чистой культуры хламидий, высокой квалификации персонала и наличия набора моноклональных антител [Wang S.P., Kuo С.С., Bames R.C. et al. Immunotyping of Chlamidya trachomatis with monoclonal antibodies. J Infect Dis 1085, 152:791-800; Osserwarde J.M., Rieffe M. De Vries., Derksen-Navrocki R.P. et al. Comparison of two panels of monoclonal antibodies for determination of Chlamidya trachomatis serovars. J Clin Microbiol 1994, 32: 2968-2974]. В связи с указанными фактами традиционное серотипирование в настоящее время вытесняется молекулярными методами, основанными на амплификации гена, кодирующего основной белок внешней мембраны, и последующем анализе ампликона.

Для амплификации ДНК C.trachomatis чаще всего используют гнездную ПЦР. Получаемые ампликоны исследуются методами анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, обратной гибридизации

[Stothard, D.R. 2001. Use of a reverse dot blot procedure to identify the presence of multiple serovars in Chlamydia trachomatis urogenital infection. J Clin Microbiol 39: 2655-2659 № ; Xiong, L., F. Kong, H. Zhou, and G. L. Gilbert. 2006. Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 44:1413-1418.]., олигонуклеотидных чипов [Zheng, H. P., L. F. Jiang, D.Y.Fang, Y.H.Xue, Y.A.Wu, J.M.Huang, and Z.Y.Ou. 2007. Application of an oligonucleotide array assay for rapid detecting and genotyping of Chlamydia trachomatis from urogenital specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 57: 1-6] и секвенирования [Bandea, С.I., K. Kubota, Т.M.Brown, P.H.Kilmarx, V. Bhullar, S. Yanpaisam, P. Chaisilwattana, W. Siriwasin, and C.M.Black. 2001. Typing of Chlamydia trachomatis strains from urine samples by amplification and sequencing the major outer membrane protein gene (ompi). Sex Transm Infect 77: 419-422; Klint, M., M. Lofdahl, C. Ek, A. Airell, T. Berglund, and B. Herrmann. 2006. Lymphogranuloma venereum prevalence in Sweden among men who have sex with men and characterization of Chlamydia trachomatis ompA genotypes. J Clin Microbiol 44: 4066-4071; Stothard, D.R., G. Boguslawski, and R. B. Jones. 1998. Phylogenetic analysis of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein and examination of potential pathogenic determinants. Infect Immun. 66:3618-3625.]. Сравнительно недавно для типирования С.trachomatis был предложен метод гнездной ПЦР в реальном времени, по разрешающей способности не уступавший секвенированию omp1 гена (Jalal, В., Н. Stephen, S. Alexander, С.Came, and С.Sonnex. 2007. Development of real-time PCR assays for genotyping of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 45:2649-2653.]. Использование некоторых из современных молекулярных методов типирования позволят получать результаты, идентичные традиционному серотипированию.

Наиболее широко распространенным методом, применяемым для молекулярного типирования ряда микроорганизмов, является мультилокусное секвенирование (MultiLocus Sequence Typing - MLST).

Принцип метода MLST основан на проведении секвенирования и последующего анализа нуклеотидных последовательностей большого числа (от 6 до 16) генов домашнего хозяйства микроорганизма. Одними из первых бактерий, к типированию которых был применен метод MLST, были менингококки [Feavers, I.М., S.J.Gray, R.Urwin, J.Е.Russell, J.A.Bygraves, E.B.Kaczmarski, and M.C.Maiden. 1999. Multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J Clin Microbiol 37:3883-3887].

При типировании методом MLST С.trachomatis [K-lint, М., Н.Н.Fuxelius, R.R.Goldkuhl, Н.Skarin, С.Rutemark, S.G.Andersson, К.Persson, and B.Herrmann. 2007. High-resolution genotyping of Chlamydia trachomatis strains by multilocus sequence analysis. J Clin Microbiol 45: 1410-1414.] в качестве мишеней для типирования были использованы высоковариабельные области: два аннотированных гена (hctB и pbpB) и три гипотетических гена (СТ058, СТ144 и СТ172).

Основные недостатки указанного способа: при воспроизведении описанного метода MLST возникает ряд трудностей, связанных с подбором праймеров для амплификации генов и условий реакции. Кроме этого, метод требует выделения хламидий в чистой культуре. Типирование по пяти генам является достаточно дорогостоящим и трудоемким.

Данный способ является наиболее близким к заявляемому способу молекулярного типирования C.trachomatis. Данный способ выбран в качестве ближайшего аналога предлагаемого способа.

Задачей изобретения является разработка более эффективного способа молекулярного типирования C.trachomatis.

Технический результат изобретения заключается в повышении разрешающей способности метода молекулярного типирования C.trachomatis, воспроизводимости и производительности способа, а также в увеличении легкости интерпретации получаемых результатов и легкости выполнения.

Это достигается за счет того, что из клинического материала, полученного от пациентов с урогенитальным хламидиозом, производят выделение бактериальной ДНК C.trachomatis; с помощью полимеразной цепной реакции получают амплифицированные фрагменты вариабельных участков трех генов C.trachomatis, таких как ompA, tsf и pmpF; проводят их секвенирование, восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей.

Характеристика генов, отобранных для типирования C.trachomatis:

ompA - ген, кодирующий основной белок наружной мембраны C.trachomatis;

tsf - ген, кодирующий фактор элонгации C.trachomatis (EF-TS); играет важную роль в биосинтезе белка, а также вовлечен в регуляцию других белков C.trachomatis, ассоциированных с циклом развития микробной клетки, что может иметь значение в изменении фенотипических свойств микроорганизма и определять фенотипические различия между сероварами C.trachomatis [Zhang Y., Tao J., Zhou M. et al. Elongation factor Ts of C.trachomatis: structure of the gene and properties of the protein. Arch Biochem Biophys 1997, 344:43-52; Brunelle В. W, Nicholson T.L., Stephens R.S. Microarrey-based genomic surveying of gene polymorphisms in C.trachomatis. Genome Biology 2004, 5:R42];

pmpF - член семейства генов Chlamydiales, локализованных во внешней мембране и кодирующих полиморфные мембранные белки, ответственные за аутотранспорт, транлокацию N-терминального региона клеточной поверхности C.trachomatis и адгезию микроорганизма к клеткам организма хозяина [Gomes J.P., Nunes A., Bruno W.J. et al. Polymorphisms in the Nine Polymorphic Membrane Proteins of C.trachomatis across All Serovars: Evidence for Serovar Da recombination and Correlation with Tissue Tropism. J Bacteriol Jan 2006: 275-286].

Способ осуществляется следующим образом.

Из клинического материала, полученного от больных с урогенитальным хламидиозом, стандартным способом производят выделение бактериальной ДНК C.trachomatis.

С помощью полимеразной цепной реакции получают амплифицированные фрагменты вариабельных участков трех генов C.trachomatis (ompA, tsf, pmpF). Характеристика использованных в работе генов-мишеней, примененных для типирования C.trachomatis, праймеров для их амплификации и условий постановки полимеразной цепной реакции для C.trachomatis, представлена в таблице 1.

Таблица 1 Гены-мишени, использованные для типирования C.trachomatis, праймеры для их амплификации и условия постановки полимеразной цепной реакции
	ген	Название праймера	Последовательность 5'-3'	Размер ампликона п.н.	Условия амплификации
1	ompA	ompAf	ctaagaaaagatcctaatataa	1260	30 циклов
2	ompAr	gatagcgagcacaaagaga	95°С - 30 сек
56°С - 15 сек
72°С - 20 сек
3	tsf	tsff	tccagaagacaaagtgctcaa	823	30 циклов
4	tsfr	gagcgacttctccatggaaa	95°С - 30 сек
60°С - 15 сек
72°С - 20 сек
5	pmpF	pmpF1f pmpF2f pmpF3f	tatcctttgcttgcctcagtt ggttacattgacatccgagat cctataccatcacgcttaataa
1032	30 циклов
1190	95°С - 30 сек
6	pmpF1r pmpF2r pmpF3r	caggcagcagagttatttaga gcgatggaggtagcagatgt gctcctcctgcattgatgta	1130	60°С - 15 сек
	72°С - 20 сек

Постановку реакции секвенирования проводят с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA).

Восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводят с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).

Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивают с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

На основании нуклеотидной последовательности штамму C.trachomatis присваивают номер сиквенс-типа, который помещают в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.

Пример № 1

Обследован пациент мужского пола (1) с подозрением на наличие инфекции, передаваемой половым путем. При обследовании соскобного материала уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациента обнаружена ДНК C.trachomatis.

Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.

Этапы исследования включали:

- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);

- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);

- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов исследуемых генов С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. № Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. № 960-9, фирма Sigma, США); раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ) [водный раствор дНТФ-дАТФ (кат № Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. № Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. № Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. № Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. № ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);

- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. № А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. № 11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. № Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. № Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);

- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;

- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);

- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).

Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Г в 35 положении.

В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.

В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены А на С в 134 положении.

На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 10 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов С.trachomatis.

Пример № 2

Обследована пациентка женского пола (2) с целью исключения урогенитального хламидиоза, которая являлась половым партнером пациента (1). При обследовании соскобного материала шейки матки и уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациентки обнаружена ДНК C.trachomatis.

Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.

Этапы исследования включали:

- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала шейки матки и уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);

- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);

- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. № Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. № 960-9, фирма Sigma, США); 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. № Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ) [водный раствор дНТФ-дАТФ (кат. № Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. № Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. № Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. № Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. № ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);

- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. № А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. № 11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. № Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. № Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);

- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;

- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);

- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).

Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Г в 35 положении.

В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.

В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены А на С в 134 положении.

На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 10 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.

В результате типирования C.trachomatis, выделенной от пациентов (1) и (2), являвшихся половыми партнерами, было установлено наличие в урогенитальном тракте обоих партнеров C.trachomatis, относившейся к одному сиквенс-типу.

Полученные данные позволяют заключить, что примененный метод типирования C.trachomatis может быть применен для установления заражения половых партнеров (в частности, в судебно-медицинской экспертизе) и изучения путей распространения урогенитальной хламидийной инфекции.

Пример № 3

Обследована пациентка женского пола (3) с подозрением на наличие инфекции, передаваемой половым путем. При обследовании соскобного материала шейки матки и уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациентки обнаружена ДНК C.trachomatis.

Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.

Этапы исследования включали:

- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала шейки матки и уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (000 НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);

- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);

- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. № Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. № 960-9, фирма Sigma, США); 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. № Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ)[водный раствор дНТФ - дАТФ (кат. № Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. № Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. № Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. № Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. № ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);

- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. № А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. № 11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. № Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. № Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);

визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;

- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе АВ 1-313 0 (Applied Biosystem, USA);

- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).

Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Ц в 97 положении.

В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.

В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены Г на А в 347 положении.

На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 12 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.

В результате типирования C.trachomatis, выделенной от пациентов (1) и (2), являвшихся половьми партнерами, и пациентки (3) было установлено, что в урогенитальном тракте обследованных половых партнеров - пациенты (1) и (2), присутствует C.trachomatis, относящаяся к одному сиквенс-типу, а в урогенитальном тракте пациентки (3) присутствует C.trachomatis, относящаяся к другому сиквенс-типу. Таким образом, примененный метод типирования C.trachomatis позволил выявить различие между двумя штаммами C.trachomatis, полученными от лиц, не являющихся половыми партнерами, что свидетельствует о его высокой дискриминирующей способности.

Полученные данные позволяют заключить, что примененный метод типирования С.trachomatis может быть применен для оценки генетического родства отдельных штаммов возбудителя урогенитального хламидиоза, а также путей распространения урогенитальной хламидийной инфекции.

При сравнении заявленного метода типирования с другими наиболее распространенными методами были выявлены следующие преимущества указанного способа:

- проведение секвенирования вариабельных участков трех генов C.trachomatis, обладающих выраженным нуклеотидным полиморфизмом, позволяет (в сравнении с генотипированием по одному гену) значительно повысить разрешающую способность и воспроизводимость метода типирования C.trachomatis;

- исследование небольшого (в сравнении с методом MLST) числа генов C.trachomatis позволяет значительно снизить стоимость и сократить время проведения исследований по типированию штаммов C.trachomatis и увеличивает его производительность; а также увеличить легкость интерпретации получаемых результатов и легкость выполнения.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известных методов молекулярного типирования C.trachomatis приведена в таблице 2.