способ определения концентрации препаратов бензилпенициллина в биологических жидкостях

Формула изобретения

Способ определения концентрации препаратов бензилпенициллина в биологических жидкостях путем использования микробиологического метода диффузии в агар, включающий приготовление препарата тест-микроба, создание слоя агара, вырезание в застывшем агаре лунок, введение в них растворов стандарта и предварительное разведение испытуемых образцов, отличающийся тем, что в качестве тест-микроба используют Staphylococcus aureus ATCC 25923 в количестве 3·10⁶ микробных тел на 1 мл среды, на стекле создают равномерный слой агара толщиной 1-2 мм, в застывшем агаре вырезают лунки диаметром 2 мм, в которые вносят растворы стандарта в концентрациях 0,5; 1,5; 3; 4; 5; 6 мкг/мл и испытуемые образцы, и по значениям стандартных образцов на полулогарифмической бумаге строят калибровочную кривую, выражающую зависимость между дозой и диаметром зон задержки роста, и по ней определяют концентрации испытуемых образцов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологическим методам исследования биологического материала, и может быть использовано в лабораторной практике для обнаружения антибиотиков группы пенициллина в субстратах и изучения их фармакокинетики в процессе терапии.

Известны способы определения концентрации препаратов бензилпенициллина с использованием методов бумажной хроматографии (Алексеев В.Г., Нерсесова А.Ф., Халяпина Я.М. Определение бензилпенициллина, ампициллина и карбенициллина методом бумажной хроматографии.// Журнал прикладной химии, 2005, т.48, № 4, с.613-615) и ионометрии (Гранжан А.В., Чарыков А.К. Применение ионселективных электродов в фармацевтическом анализе (обзор).// Химико-фармацевтический журнал, 1993, т.27, № 7, с.51-56). Однако для реализации данных методов требуется специальное дорогостоящее оборудование, приобретение которого для решения частных исследовательских задач нецелесообразно.

Наиболее близким к заявленному является способ определения концентрации бензилпенициллина в биологических жидкостях и тканях микробиологическим методом диффузии в агар с применением одного слоя питательной среды (Навашин С.М., Фомина И.П. "Рациональная антибиотикотерапия (справочник)". - 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982, с.56-72).

Метод основан на сравнении степени угнетения роста тест-микроба определенными концентрациями антибиотика в испытуемом материале с угнетением его роста известными концентрациями стандарта антибиотика.

Подавление роста тест-микроба осуществляется за счет диффузии антибиотика из исследуемого материала в плотную питательную среду (агар). Исследуемый материал вносится в лунки, вырезанные в толще агара. Для получения воспроизводимых результатов необходима строгая стандартизация условий процесса диффузии.

В прототипе в качестве тест-микроба для исследования препаратов группы пенициллина предлагается Staphylococcus aureus штамма 209 Р в посевной дозе 40·10⁶ микробных тел на мл среды, а формирование слоя агара производится путем внесения 10 мл расплавленной агаровой среды в чашку Петри, установленную на горизонтальной поверхности, отрегулированной по ватерпасу. После застывания агара в его слое вырезают шесть лунок диаметром 8 мм.

При таком способе имеются факторы, обусловливающие нарушение условия строгой стандартизации процесса диффузии:

- сложность создания равномерного слоя агара в связи с объективными причинами в виде особенностей формы чашек Петри и физического явления смачивания, приводящего к искривлению поверхности;

- малое число лунок, размещающихся на одной чашке, приводящее к разобщению стандартных и испытуемых проб.

Коррекцию возникающих погрешностей авторы проводят путем следующих приемов:

- присутствия на каждой чашке контрольной концентрации стандарта, по которой вносятся поправки в получаемые данные;

- обязательного проведения повторных исследований для каждой пробы (не менее трех);

- приведения концентрации исследуемой пробы в пределы, соответствующие интервалу линейной зависимости диаметра зоны подавления роста от концентрации антибиотика (от 0,5 до 2 мкг/мл).

Это определяет значительную трудоемкость и материалоемкость способа:

- для создания стандартной калибровочной кривой требуется 12 чашек;

- на каждую испытуемую пробу расходуется 1 чашка;

- только многократный подбор разведения испытуемой пробы позволяет получить необходимое содержание в ней антибиотика, что увеличивает число проводимых исследований.

Задачей данного изобретения является усовершенствование известного метода.

Технический результат, который будет достигнут от использования изобретения, заключается в снижении трудоемкости и материалоемкости метода.

Технический результат достигается тем, что в способе определения концентрации препаратов бензилпенициллина в биологических жидкостях путем использования микробиологического метода диффузии в агар, включающем приготовление препарата тест-микроба, создание слоя агара на стекле, вырезание в застывшем агаре лунок, введение в них растворов стандарта и предварительное разведение испытуемых образцов, в качестве тест-микроба используют Staphylococcus aureus ATCC 25923 в количестве 3·10⁶ микробных тел на мл среды, на стекле создают равномерный слой агара толщиной 1-2 мм. В застывшем агаре вырезают лунки диаметром 2 мм, в которые вносят растворы стандарта в концентрациях 0,5; 1,5; 3; 4; 5; 6 мкг/мл и испытуемые образцы.

Сущность изобретения заключается в изменении штамма тест-микроба и технологии заливки агара.

При использовании в качестве тест-микробов Staphylococcus aureus ATCC 25923 в количестве 3·10⁶ микробных тел на мл среды достигается такое соотношение между размерами зон задержки роста и дозами антибиотиков, при котором возможно увеличение диапазона стандартной калибровочной кривой от 0,5 до 6 мкг/мл.

Формирование на поверхности стекла равномерного слоя агара толщиной 1-2 мм позволяет снизить количество используемого материала и способствует адекватной визуализации зон задержки роста тест-культуры (за счет повышения контрастности), а также обеспечивает соблюдение условия строгой стандартизации процесса диффузии из всех лунок, что существенно повышает точность метода и отменяет необходимость многократного испытания проб.

Вырезание в застывшем агаре лунок диаметром 2 мм обеспечивает сокращение площадей зон задержки роста тест-культуры и позволяет разместить калибровочные и испытуемые пробы на одном и том же слое агара, что упраздняет использование контрольных образцов.

Применение растворов стандарта бензилпенициллина в концентрациях 0,5; 1,5; 3; 4; 5; 6 мкг/мл необходимо и достаточно для создания калибровочной кривой, позволяющей определять наличие антибиотика в цельных или разведенных 1:1 испытуемых образцах, что исключает многократный подбор разведения испытуемой пробы и способствует сокращению числа проводимых исследований.

Существенное сокращение числа анализируемых проб (за счет сокращения кратности исследований, отсутствия контрольных образцов и подбора разведения испытуемой пробы) при сохранении необходимой точности метода приводит к значительному уменьшению материальных и трудовых затрат.

Способ осуществляется следующим образом.

Подготавливают необходимое количество расплавленного и охлажденного до 50°С 1,5% агара, в который вносят Staphylococcus aureus АТСС 25923 в количестве, необходимом для получения концентрации 3·10⁶ микробных тел на мл среды.

Заливку агара производят с использованием системы из двух стеклянных пластин, скрепленных зажимами, между которыми установлена П-образная рамка толщиной 1-2 мм. Ориентировочный размер пластин 9×12 см.

После застывания агара снимают зажимы, верхнюю пластину и рамку. В слое агара на нижней пластине пробойником вырезают ряды лунок диаметром 2 мм.

В лунки одного из рядов вносят стандартные растворы бензилпенициллина в концентрациях 0,5; 1,5; 3; 4; 5; 6 мкг/мл, в лунки других рядов - испытуемые биологические жидкости (либо цельные, либо в разведении 1:1).

Пластину помещают во влажную камеру и инкубируют при температуре 37°С в течение 16-18 часов.

Через указанное время измеряют зоны задержки роста тест-культуры стандартными и испытуемыми пробами. По значениям стандартных образцов на полулогарифмической бумаге строят калибровочную кривую, выражающую зависимость между дозой и диаметром зон задержки роста, и по ней определяют концентрации испытуемых проб.

Способ был применен при исследовании уровней антибактериальной активности, создаваемой в крови больных сифилисом в первые часы после введения препаратов бензилпенициллина в процессе специфической терапии. Проведено 60 исследований.

При использовании предлагаемого способа для получения результатов потребовалось приготовление 10 пластин (100 мл агара) и выполнение 130 измерений.

В случае применения способа, указанного в прототипе, для данного количества исследований потребовалось бы изготовление минимум 102 чашек (1020 мл агара) и проведение 612 измерений. Кроме того, дополнительно было бы затрачено время на выполнение дополнительных дозирующих процедур, на вычисление средних значений показателей и корректировку получаемых результатов по контрольным концентрациям.

Данное изобретение позволяет снизить трудоемкость в 4,7 раза и материалоемкость более чем в 10 раз.