фармацевтическая композиция, включающая действующее начало и сульфобетаин

Формула изобретения

1. Стабильная фармацевтическая композиция, которая включает терапевтически эффективный белок и недетергентный сульфобетаин (NDSB), где NDSB выбирают из группы, включающей диметилэтил-(3-сульфопропил) аммониевой соли, 3-(1-пиридино)-1-пропансульфоната, пропансульфоната диметилбензиламмония, диметил-трет-бутил-(3-сульфопропил) аммониевой соли, 3-(1-метилпиперидин)-1-пропансульфоната и диметил-(2-гидроксиэтил)-(сульфопропил) аммониевой соли.

2. Стабильная фармацевтическая композиция по п.1, в которой терапевтически эффективным белком является G-CSF.

3. Стабильная фармацевтическая композиция по п.2, в которой NDSB является диметил-трет-бутил-(3-сульфопропил) аммониевой солью.

4. Стабильная фармацевтическая композиция по п.1, где указанная композиция дополнительно включает полиол, выбранный из группы, включающей сорбит, инозит и трегалозу.

5. Стабильная фармацевтическая композиция по п.1, где указанная композиция дополнительно включает один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, выбранных из группы, включающей EDTA и ДМСО.

6. Способ получения фармацевтической композиции по п.1, в котором указанную фармацевтическую композицию получают смешиванием NDSB с терапевтически эффективным количеством белка.

7. Применение NDSB для получения стабильной фармацевтической композиции по п.1.

8. Применение NDSB в качестве стабилизатора в фармацевтической композиции по п.1.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит недетергентный сульфобетаин (NDSB).

Уровень техники

Фармацевтические композиции, содержащие действующие фармацевтические ингредиенты, хорошо известны. Описанные обычные фармацевтические композиции включают различные фармацевтически приемлемые эксципиенты, которые из-за различных присущих им свойств (например, стабилизации действующего фармацевтического ингредиента, подведения и/или регулирования значения рН, влияния на растворимость действующего фармацевтического ингредиента, поддержания изотоничности фармацевтической композиции и т.д.) делают возможным применение действующих фармацевтических ингредиентов в фармацевтических композициях. Фармацевтически приемлемые эксципиенты подробно описаны в кн.: Ainley Wade и Paul J.Weller «Handbook of Pharmaceutical Excipients», изд-во American Pharmaceutical Association, 1994.

Терапевтически действующие белки также были описаны в качестве действующих фармацевтических ингредиентов в фармацевтических композициях. Эти фармацевтические композиции также содержат различные фармацевтические эксципиенты, которые благодаря своим свойствам позволяют создавать стабильные фармацевтические композиции, содержащие терапевтически действующие белки. Указанные фармацевтические композиции подробно описаны: см., например, Yu-Chang John Wang and Musetta A.Hanson в J. of Parenteral Science & Technology, 42, 1988, cc.S4-S26; Wong D. и Parasrampuria J. в Biopharm, ноябрь, 1997, cc.52-61.

Стабильные фармацевтические композиции, содержащие белковый гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) терапевтического действия, заявлены в ЕР 373679 и описаны в качестве стабилизирующих главным образом G-CSF в растворе с низкой проводимостью и кислым значением рН в диапазоне 2,75-4,0. Для повышения стабильности добавлялись различные сахара, аминокислоты, полимеры и детергенты. В частности, подчеркивается, что значение рН содержащей G-CSF композиции должно быть менее 4 для того, чтобы уменьшить образование агрегатов и таким образом повысить стабильность. Образование агрегатов и сниженная стабильность при значении рН, превышающем 4,0, находятся в соответствии с имеющимися литературными данными (Kuzniar и др., Pharm Dev Technol 6, 2001, cc.441-447; Bartkowski и др., J Protein Chem 21, 2002, cc. 137-143; Narhi и др., J Protein Chem 10, cc.359-367; Wang W., Int J Pharmaceut 185, 1999, cc.129-188. Стабильность G-CSF, описанная в других фармацевтических композициях в патентах и научной литературе, достигалась добавлением различных стабилизаторов, например, сульфатных ионов (ЕР 1129720), смеси различных консервантов, аминокислот и поверхностно-активных соединений (ЕР 607156), различных буферных систем (фосфата, цитрата, аргинина, ацетата) в присутствии поверхностно-активного соединения (ЕР 674525), высокомолекулярных соединений, например, гидроксипропилцеллюлозы, полиэтиленгликоля, поливинилового спирта, поливинилпирролидона и других (GB 2193621), поверхностно-активного соединения (ЕР 1060746), различных буферных систем (TRIS, HEPES, TRICINE) (EP 0988861), сахаров, например, целлобиозы, гентиобиозы, изомальтозы, рафинозы, трегалозы и других (ЕР 0674524), и одной или нескольких аминокислот (ЕР 1197221, WO 51629, ЕР 1260230 и ЕР 1329224, ЕР 0975335). Хотя низкая ионная сила является предпочтительной в содержащих G-CSF фармацевтических композициях, описывается, что в большинстве случаев для стабилизации G-CSF применяются различные поверхностно-активные соединения и другие стабилизаторы. Кроме того, для поддержания рН в большинстве случаев дополнительно применяются различные буферные системы.

В литературе было описано применение недетергентных сульфобетаинов (NDSB) в качестве сорастворителей (применяемых в высоких концентрациях, примерно в виде 1-молярного раствора) при белковых ренатурациях (Chong Y. и Chen Н. в Biotechiques 29, 2000, cc.1166-1167; Vuillard L. и др., Biochem. J. 305, 1995, cc.337-343; Vuillard L. и др. Electrophoresis 16, 1995, cc.295-297; Vuillard L. и др., Eur. J. Biochem. 256, 1998, cc.128-135; Goldberg M. E. и др., Folding & Design 1, 1995, cc.21-27.

В настоящее время существует потребность получать стабилизированные фармацевтические композиции. Описание NDSB в составе фармацевтических композиций не было найдено ни в научной, ни в патентной литературе.

Подписи к фигурам

Фиг.1. Результат SE-HPLC образцов изобретения и контрольного образца, хранимых при 40°С (±2°С) в течение 1 месяца (40).

Фиг.2. Результат SE-HPLC образцов изобретения, хранимых при 40°С (±2°С) в течение 1 месяца (40).

Описание изобретения

В контексте настоящего изобретения было обнаружено, что NDSB может применяться в качестве эксципиента в составе фармацевтической композиции. При применении NDSB могут быть получены стабилизированные фармацевтические композиции.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей NDSB.

Согласно первой задаче, решаемой в настоящем изобретения, предусмотрена фармацевтическая композиция, которая включает действующий фармацевтический ингредиент и недетергентный сульфобетаин (NDSB).

Действующий фармацевтический ингредиент настоящего изобретения выбран из группы, состоящей из терапевтически эффективных синтетических или природных органических молекул (например, слабо растворимых в воде синтетических и природных органических молекул), и терапевтически действующего белка (например, слабо растворимого в воде и/или гидрофобного белка), и/или других действующих фармацевтических ингредиентов, обладающих терапевтическим действием. Действующий фармацевтический ингредиент, предпочтительно, содержится в терапевтически эффективном количестве. Понятие «терапевтически эффективное количество действующего фармацевтического ингредиента», применяемое в настоящем изобретении, обозначает действующий фармацевтический ингредиент в количестве, обладающем терапевтическим эффектом.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения включает недетергентный сульфобетаин (NDSB).

Понятие «недетергентный сульфобетаин», применяемое в настоящем изобретении, относится к сульфобетаину, который не образует мицелл в водном растворе.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции настоящего изобретения NDSB является четвертичной солью аммония, в которой группы R1, R2, R3 и R4-SO₃ ^- связаны с центральным атомом азота и где:

R1 обозначает метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил или их производные;

R2 обозначает метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил или их производные;

R3 обозначает метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил или их производные, и все комбинации R1, R2 и R3 и R4 могут быть представлены в виде (СН₂)_n, где n=1-6; наиболее предпочтительно, n=3.

Четвертичный атом азота может быть также частью алифатической или ароматической циклической структуры.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления фармацевтической композиции настоящего изобретения NDSB является солью четвертичного аммония формулы 1,

где R1, R2 и R3 могут быть одинаковыми и/или различными, выбранными из группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, пентила, гексила или их производных, и R4 может быть представлен в виде (CH₂)_n , где n=1-6, наиболее предпочтительно, n=3.

Предпочтительно, в фармацевтической композиции настоящего изобретения применяется NDSB, который выбран из группы, включающей диметилэтил(3-сульфопропил)аммониевую соль (SB 195, Vuillard и др., FEBS Letters, 353, 1994, cc.294-296; Goldberg и др., Folding & Design, 1, 1995/1996, cc.21-27, 3-(1-пиридино)-1-пропансульфоната (SB201), пропансульфонат диметилбензиламмония (SB256), диметил-трет-бутил(3-сульфопропил)аммониевую соль (SB222t), 3-(1-метилпиперидин)-1-пропансульфонат (SB221) и диметил(2-гидроксиэтил)-(сульфопропил)аммониевую соль (SB211; Vuillard и др., Anal Biochem, 230, 1995, cc.290-294). Два или более указанных соединения NDSB могут также применяться во всех возможных комбинациях. Предпочтительно применяются диметил-трет-бутил-(3-сульфопропил)аммониевая соль (SB222t), диметилэтил-(3-сульфопропил)аммониевая соль (SB 195) и 3-(1-метилпиперидин)-1-пропансульфонат (SB221). Наиболее предпочтительно применяется диметил-трет-бутил-(3-сульфопропил)аммониевая соль (SB222t).

Концентрация NDSB применяется в зависимости от значения рН, которое подводится и/или поддерживается. Она выбирается в пределах от 1 до 1000 ммолей, предпочтительно, от 5 до 100 ммолей. Значение рН фармацевтической композиции настоящего изобретения может быть в диапазоне от 2 до 9, предпочтительно от 3 до 8, наиболее предпочтительно от 3,5 до 7,5.

Согласно второй задаче настоящего изобретения была предусмотрена фармацевтическая композиция, которая включает терапевтически эффективный белок и недетергентный сульфобетаин (NDSB).

Понятие «терапевтически эффективный белок», применяемое в настоящем изобретении, означает белок с терапевтическим действием. Терапевтически эффективный белок, применяемый в фармацевтической композиции настоящего изобретения, выбран из группы, состоящей из гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), интерферонов (IFN); например, IFN-альфа 2а, IFN-альфа 2b, IFN-бета, IFN-гамма 1b; интерлейкинов (ILs), например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL5 - IL-10; гранулоцитарного макрофагового колониестимулирующего фактора (GM-CSF); макрофагового колониестимулирующего фактора (M-CSF); эпидермального фактора роста (EGF); эритропоэтина (ЕРО); фолликулостимулирующего гормона (FSH); альбумина сыворотки человека (HSA); дезоксирибонуклеазы (ДНКазы); фактора роста фибробластов (aFGF или bFGF); фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа) и фактора некроза опухоли бета (TNF-бета); кальцитонина; гематопротеина; плазминогенных активаторов и их предшественников (t-PA, урокиназы, проурокиназы, стрептокиназы, белка С); цитокинов; семейства TNF-лигандов (TRAIL, Fasl, остеопротогерина); растворимых рецепторов (р55, р75), гормона роста, например, гормона роста человека, бычьего гормона роста и паратироидного гормона; липопротеинов; альфа-1-антитрипсина; инсулина, проинсулина, субъединицы А инсулина, субъединицы В инсулина; глюкагонов; факторов свертывания крови, например, фактора VIII, фактора IX, тканевого фактора, фактора Виллебрандта; бомбазина; тромбина; энкефалиназы; макрофагового воспалительного белка (MIP-1 альфа); субъединицы А релаксина, субъединицы В релаксина, прорелаксина; ингибина; активина; сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF); гормональных рецепторов или рецепторов фактора роста; интегринов; белка А, белка D; ревматоидных факторов; нейротрофического фактора, формирующегося в кости (BDNF), нейротропина-3, -4, -5 или -6; фактора роста нервов (NGF); фактора роста, полученного из тромбоцитов (PDGF); фактора роста фибробластов (aFGF и bFGF); фактора роста Т-клеток (TGF-альфа и TGF-бета); инсулиноподобного фактора роста (IGF1 и IGF2); тромбопоэтина (ТРО); белка, участвующего в остеогенезе (BMP); супероксиддисмутазы; биологически активных фрагментов вышеуказанных белков и других терапевтически эффективных белков.

Терапевтически эффективные белки настоящего изобретения применяются в терапевтически эффективных количествах.

Понятие «терапевтически эффективное количество белка» в контексте настоящего изобретения относится к количеству белка, обладающему терапевтическим действием.

Наиболее предпочтительным действующим фармацевтическим ингредиентом является G-CSF, предпочтительно применяемый в терапевтически эффективных количествах.

В контексте настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, которая включает G-CSF и недетергентный сульфобетаин (NDSB).

Понятие «G-CSF» в контексте настоящего изобретения означает белок, который регулирует дифференциацию и пролиферацию гематопоэтических клеток у млекопитающих, а также активацию зрелых клеток гематопоэтической системы. Он выбран из группы G-CSF человека и его производных и аналогов, приведенных ниже. Предпочтительно G-CSF относится к рекомбинантному G-CSF человека, продуцируемому в результате экспрессии в бактерии E.coli.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может применяться для всех типов G-CSF; она может также применяться наряду с другими в случае выделения модифицированных форм G-CSF, а именно: метионил-G-CSF (Met-G-CSF), гликолизированного, ферментативно и химически модифицированного (например, пегилированного) G-CSF, аналогов G-CSF и гибридных белков, которые содержат G-CSF.

Понятие «терапевтически эффективное количество G-CSF» в контексте настоящего изобретения относится к количеству G-CSF, необходимому для терапевтического действия G-CSF.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения необязательно может также включать полиол.

Понятие «полиол» в контексте настоящего изобретения относится к какому-либо высокомолекулярному спирту, т.е. химическому соединению, содержащему одну или более гидроксильных групп в составе молекулы.

Предпочтительно, полиол выбран из группы, включающей сорбит, глицерин, инозит, трегалозу и маннит.Предпочтительная концентрация полиола находится в пределах 1-10% (мас./об.).

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может также необязательно содержать один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.

Фармацевтически приемлемый эксципиен выбран из группы, состоящей из поглотителей катионов металлов (например, EDTA и аналогичных хелатирующих агентов), растворителей и поглотителей свободных радикалов (например, ДМСО), различных кислот (например, уксусной кислоты, лимонной, метансульфоновой, фосфорной, соляной и других), различных оснований (например, NaOH или органических азотсодержащих оснований, например, буферов Гуда, например, TRIS, TES, HEPES), различных буферных систем (например, уксусная кислота/ацетат, глутаминовая кислота/глутамат, малеиновая кислота/малеат, лимонная кислота/цитрат, фосфорная кислота/фосфат и других), различных фармацевтически приемлемых наполнителей для поддержания изотоничности раствора (например, неорганических солей, например, CaCl₂ и NaCl), белковых стабилизаторов, выбранных из группы поверхностно-активных веществ, например сложных эфиров гликоля и глицерина, сложных и простых эфиров макроголя, производных сорбитана или полисорбатов (полисорбат 20, полисорбат 80), аминокислот, полоксамеров (Pluronic F68), поливинилпирролидона (PVP) и других. Предпочтительно, фармацевтически приемлемый наполнитель выбран из группы EDTA и ДМСО.

NDSB в фармацевтических композициях настоящего изобретения может объединяться с одним или несколькими из перечисленных выше фармацевтически приемлемых эксципиентов.

Понятие «стабилизатор» в контексте настоящего изобретения относится к фармацевтически приемлемому эксципиенту, который может стабилизировать действующий фармацевтический ингредиент (например, белок, например, G-CSF).

Понятие «белковый стабилизатор» в контексте настоящего изобретения относится к фармацевтически приемлемому наполнителю, который может стабилизировать белок (например, G-CSF).

Понятие «стабильность белка» (например, G-CSF) в контексте настоящего изобретения относится к поддержанию содержания белка (например, G-CSF), a также к поддержанию биологической активности белка (например, G-CSF). На снижение стабильности белка (например, G-CSF) могут влиять наряду с прочими следующие процессы: адсорбция белка стенками контейнера, денатурация или разложение белка, а также образование агрегатов, например, белковых димеров (например, димеров G-CSF) и/или белковых мультимеров (например, мультимеров G-CSF) и/или аналогичных молекул с более высокой молекулярной массой. Указанные процессы могут быть результатом различных факторов, например, повышенной температуры, неподходящих контейнеров, применения неподходящих белковых стабилизаторов, нахождения на свету, замораживания/оттаивания, неподходящих способов получения и/или неподходящего хранения.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может стабилизировать белок (например, G-CSF) при температуре выше температуры холодильной камеры (2-8°С), а также при комнатной температуре (т.е. ниже 25°С) и даже при более высокой температуре (например, примерно равной 40°С).

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать только один фармацевтически приемлемый эксципиент, т.е. NDSB, для стабилизации белка (например, G-CSF) и для поддержания подходящего значения рН раствора.

Таким образом, еще одно свойство фармацевтической композиции, предусмотренной в настоящем изобретении, заключается в том, что она включает действующий фармацевтический ингредиент (согласно отмеченному выше) и NDSB в качестве единственного дополнительного эксципиента.

NDSB в фармацевтической композиции представляет защитную молекулу, которая стабилизирует белок и таким образом является белковым стабилизатором, который применяется в других фармацевтических композициях (например, сахарах, аминокислотах и других), а также молекулу, которая подводит подходящее значение рН раствора и таким образом применяется вместо кислот (например, уксусной кислоты, лимонной, метансульфоновой, фосфорной, соляной и других), которые применяются для подведения подходящего значения рН раствора в других фармацевтических композициях. Соединения NDSB также могут поддерживать подходящее значение рН и таким образом заменять различные буферные системы и/или их комбинации, применяемые в других фармацевтических композициях (например, уксусная кислота/ацетат, глутаминовая кислота/глутамат, малеиновая кислота/малеат, лимонная кислота/цитрат, фосфорная кислота/фосфат и другие). По сравнению с применением двух или более молекул с различными функциями применение одной молекулы с несколькими различными функциями лучше в отношении экономии получения, более низкой цены, а также более легкого и быстрого получения фармацевтической композиции, а также лучше для самого пациента, поскольку это касается потребления меньшего количества дополнительных веществ организмом. Отличительными свойствами NDSB, представляющими дополнительные преимущества, является то, что он является простой молекулой, которая нечувствительна к свету, температуре, различным окисляющим агентам (например, кислороду воздуха), гидролизу, не является химически реактивной молекулой и обладает цвиттерионной природой в широком диапазоне рН, что означает, что механизм взаимодействия в этом диапазоне не изменяется существенно.

Свойством настоящего изобретения является применение NDSB в качестве стабилизатора в фармацевтической композиции.

Свойством настоящего изобретения является применение NDSB в качестве стабилизатора белка в фармацевтической композиции.

Свойством настоящего изобретения является применение NDSB в качестве агента для подведения рН фармацевтической композиции.

Свойством настоящего изобретения является применение NDSB в качестве буферного агента в фармацевтической композиции.

Предпочтительная фармацевтическая композиция настоящего изобретения является жидкой фармацевтической композицией, что, несмотря на это, лимитирует применение соединений NDSB в лиофилизированных фармацевтических содержащих белок композициях в контексте настоящего изобретения.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения делает возможным парентеральное введение подкожно, внутривенно или внутримышечно без изменения состава, разбавления или дополнительного предварительного приготовления, которые могут привести к уменьшению активности действующего фармацевтического ингредиента, например, белка, например, G-CSF, и к дополнительным техническим проблемам во время введения.

Предпочтительно фармацевтическая композиция настоящего изобретения не содержит белков сыворотки человека, с которыми возможна вирусная контаминация. В этом случае снижается возможность появления различных аллергических реакций, которые могут быть результатом введения альбуминов сыворотки человека. Ее получают в изотоническом растворе, который является фармацевтически приемлемым и не вызывает нежелательных эффектов.

В фармацевтической композиции настоящего изобретения терапевтически эффективное количество белка соответствует терапевтически эффективным количествам белка, которые коммерчески доступны. В случае применения G-CSF терапевтически эффективное количество G-CSF выбирают из диапазона от 0,3 мг/мл до 1,2 мг/мл, которые, несмотря на это, не ограничивают настоящее изобретение.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может применяться в получении медицинских препаратов (для лечения) и для лечения заболеваний, требующих применения терапевтически эффективных белков, перечисленных выше.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может также применяться для лечения всех тех заболеваний и для получения медицинских препаратов, предназначенных для лечения всех тех заболеваний, для которых показано применение G-CSF. Указанные заболевания и осложнения могут быть выбраны из группы, состоящей из: нейтропении и ее клинического осложнения, уменьшенной возможностью госпитализации при фибрильной нейтропении после химиотерапии, мобилизации кроветворных зародышевых клеток, альтернативной инфузии донорских лейкоцитов, хронической нейтропении, нейтропенической и ненейтропенической инфекции, трансплантации приемных датчиков, хронических воспалительных заболеваний, сепсиса и септического шока, сниженного риска, сниженной заболеваемости, сниженной смертности и сниженного количества суток госпитализации при нейтропенических и ненейтропенических инфекциях, профилактики инфекций и осложнений инфекций у нейтропенических и ненейтропенических пациентов, профилактики внутрибольничных инфекций и снижения смертности и частоты возникновения внутрибольничных инфекций, применения внутрь у новорожденных детей, стимулирования иммунной системы новорожденных, улучшения клинического результата у пациентов в отделении интенсивной терапии и у больных, находящихся в критическом состоянии, вакцинации и обработки ожогов, кожных язв и повреждений, интенсификации химиотерапии и/или радиотерапии, панцитопении, повышения противовоспалительных цитокинов, снижения высоких доз химиотерапевтических интервалов с помощью профилактического использования G-CSF, потенциации противоопухолевых эффектов протодинамической терапии, профилактики и лечения заболеваний, вызванных различными церебральными дисфункциями, лечения тромботических заболеваний и их осложнений и восстановления эритропоэза после облучения.

Объектом настоящего изобретения является применение NDSB для получения фармацевтической композиции.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть заложена в фармацевтическую упаковку, выбранную из группы, состоящей из ампул, инъекционных шприцов и флаконов. Фармацевтическая упаковка делает возможным применение объемов в пределах 0,2-2 мл (на дозу).

Кроме того, объектом настоящего изобретения также является способ получения фармацевтической композиции настоящего изобретения. Способ получения фармацевтической композиции настоящего изобретения предусматривает смешивание NDSB с терапевтически эффективным количеством действующего фармацевтического ингредиента (например, белка, например, G-CSF).

Настоящее изобретение детально иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается ими. В частности, примеры относятся к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Примеры

Аналитические методы

Для анализа фармацевтической композиции настоящего изобретения применяют следующие методы: ситовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (SE-HPLC), высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (RP-HPLC), электрофорез в натрий-додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и измерение биологической активности in vitro.

SE-HPLC

SE-HPLC применяют для определения концентраций агрегатов G-CSF, в частности, димеров и полимеров. Предел обнаружения для определения димеров и полимеров составляет 0,01%.

Прибор ВЭЖХ содержит: УФ-детектор, оперативный аппарат для дегазации, бинарный модуль насоса и термостатируемый аутосамплер (например, ВЭЖХ-системы фирмы Waters Alliance). Анализ проводят в следующих условиях:

Хроматографические условия:

Колонка: TSK G3000 SW, 10 мкм, 300×7,5 мм внутреннего диаметра

Температура колонки: 30°С

Подвижная фаза: фосфатный буфер рН 7,0 (5 ммоль фосфата натрия, 50 ммоль NaCl)

Скорость потока: 0,8 мл/мин, изократический способ

Обнаружение: УФ-детектор, длина волны 215 нм.

Объем инъекции: 20 мкл (количество инъецируемого белка: 6-12 мкг)

Температура аутосамплера от +2 до +8°С

Время пробега: 20 мин.

RP-HPLC

RP-HPLC применяют для определения содержания G-CSF и количественного определения примесей, которые варьируют в зависимости от степени гидрофобности.

Система HPLC содержит: УФ-детектор, оперативный аппарат для дегазации, бинарный модуль насоса и термостатируемый аутосамплер и термостатируемый отдел колонки (например, ВЭЖХ-системы фирмы Waters Alliance). Анализ проводят в следующих условиях:

Хроматографические условия:

Колонка: YMC-Pack ODS-AQ, 200 ангстрем, сферическая, 3 мкм, 150×4,6 мм внутреннего диаметра

Температура колонки: 65°С

Подвижная фаза: Фаза А: 0,1% трифторуксусная кислота (TFA) и 50% ацетонитрила (ACN) в воде

Фаза В: 0,1% TFA и 95% ACN в воде для ВЭЖХ

Скорость потока: 1,0 мл/мин, градиент:

Время (мин)	Подвижная фаза В (%)
0,0	8
4,0	8
19,0	28
19,1	100
21,0	100
21,1	8
25,0	8

Обнаружение: УФ-детектор, длина волны 215 нм.

Объем инъекции: 10 мкл (количество инъецируемого белка: 3-6 мкг)

Температура аутосамплера +2 - +8°С

Время выхода: 25 минут.

SDS-PAGE

SDS-PAGE применяют для визуального определения присутствия белковых димеров и других агрегированных форм (тримеров и форм с высокой молекулярной массой).

Образцы загрузки получают в буфере загрузки, не содержащей восстанавливающий агент. Вертикальный SDS-PAGE, NuPAGE Bis-Tris 12%-ный гель 8×8 см, толщина 1,0 мм, 15 линий (фирма Invitrogen) в электрофорезном буфере MOPS SDS (фирма Invitrogen).

Электрофорез длится 1 час при постоянном напряжении 200 В. Образцы окрашивают красителем кумасином синим (0,1% Phast Gel Blue R 350 в 30%-ном метаноле).

Тестирование in vitro биологической активности G-CSF

Биологическую активность G-CSF определяют по способу, основанному на стимулировании клеточной пролиферации (клеток NFS-60) с применением известного метода (Hammerling, U. и др. в J Pharm Biomed Anal 13, 1995, cc.9-20) и применением международного стандартного рекомбинантного G-CSF человека (88/502 получен из клеток дрожжей; NIBSC Potters Bar, Hertfordshire, Великобритания; см. Mire-Sluis, A.R. и др. в J Immunol Methods 179, 1995, cc.117-126).

Измерение значений рН

Значение рН измеряют с применением рН-метра МА 5741 (фирма Iskra) и биотриодных электродов (фирма Hamilton). Калибровку рН-метра осуществляют в пределах рН 3,0-5,0 соответствующими свежими калибровочными буферами. Значение рН измеряют при температуре 25°С. Стандартное отклонение измерений рН составляет 0,003 единицы от значения рН (0,3%).

Условия для тестирования стабильности G-CSF в фармацевтических композициях

4°С: хранение в холодильнике при температуре холодильной камеры (в пределах от +4 до +6°С)

40°С: хранение при 40±2°С

25°С: хранение при комнатной температуре от 25 до 30°С в 1 мл наполненного шприца в процессе встряхивания при 75 об/мин в шейкере Vibromix 314EVT.

Пример 1: Тесты на стабильность

Приготовляют следующие жидкие фармацевтические композиции:

FP1 0,3 мг/мл G-CSF, 39 ммоль NDSB, 5 ммоль Na EDTA, рН 4,4

FP2 0,3 мг/мл G-CSF, 39 ммоль NDSB, 5 ммоль Na EDTA, 5%-ный ДМСО, рН 4,4

FP3 0,3 мг/мл G-CSF, 7 ммоль NDSB, 5%-ный сорбит, рН 4,4

FP4 0,6 мг/мл G-CSF, 6 ммоль NDSB, 8%-ный сорбит, рН 4,6

FP5 0,6 мг/мл G-CSF, 13 ммоль NDSB, 8%-ный сорбит, рН 4,3

FP6 0,6 мг/мл G-CSF, 10 ммоль NDSB, 8%-ный сорбит, рН 4,5

FP7 0,6 мг/мл G-CSF, 10 ммоль NDSB, 5%-ный сорбит, рН 4,4

FP8 0,6 мг/мл G-CSF, 10 ммоль NDSB, 10%-ный сорбит, рН 4,4

FP9 0,6 мг/мл G-CSF, 10 ммоль NDSB, 8%-ный инозит, рН 4,4

FP10 0,6 мг/мл G-CSF, 10 ммоль NDSB, 8%-ная трегалоза, рН 4,4

FP11 0,6 мг/мл G-CSF, 50 ммоль NDSB, 8%-ный сорбит, рН 4,9

Базовая фармацевтическая композиция:

A(S16-10ACT): 0,3 мг/мл G-CSF, 10 ммоль уксусной кислоты, 5%-ный (масса/объем) сорбит, 0,004% Tween 80, рН подводят до 4,0 с помощью NaOH (идентичный Neupogen).

Образцы G-CSF в концентрации 0,6 мг/мл хранились при температуре 40°С в течение 1 месяца. Их анализируют с применением SE-HPLC; в колонку загружают 6 мкг G-CSF. Фигура 1 показывает соответствующие результаты (AU = единица абсорбции).

Легенда фигуры 1:

1	FP1
2	FP2
R	S16-10ACT

Образцы G-CSF в концентрации 0,6 мг/мл хранят при температуре 40°С в течение 1 месяца. Образцы анализируют с применением SE-HPLC; на колонку наносят 6 мкг G-CSF. Результаты показаны на фиг.2 (AU = единица абсорбции).

Легенда фигуры 2:

4	FP4
5	FP5
9	FP9

Результаты тестов на стабильность

Анализ SE-HPLC образцов FP1 и FP2, хранимых в течение 1 месяца при 40°С, показывает, что образцы стабильны, поскольку нет видимого повышения содержания агрегатов и гидрофобного разложения продуктов (табл.1, фиг.1). Стабильность сравнивают с базовым образцом (AS16-10ACT), который идентичен коммерческой фармацевтической композиции, содержащей G-CSF (фирма Neupogen, G-CSF=0,3 мг/мл). Стабильность также подтверждается анализами RP-HPLC, которые не показывают существенных изменений в примесях или в содержании белка после хранения. Эти результаты согласуются с результатами анализа SDS-PAGE (результаты не представлены) и с измерениями биологической активности in vitro. Биологическая активность in vitro G-CSF, который применялся в исследованиях, находится на уровне международного стандарта (номер в каталоге 88/502, фирма NIBSC, Великобритания). Биологическая активность FP1 и FP2 in vitro не изменяется после хранения в условиях тестирования (результаты не показаны).

Таблица 1
	NDSB	pH	Эксципиент	Период хранения	Температура	Димеры (SE-HPLC)	Высшие агрегаты (SE-HPLC)
AS 16-10АСТ с=0,3 мг/мл	-	4,0	Tween80 Сорбит	1 месяц	40°С	0,00%	0,13%
FP1	39 ммоль	4,4	EDTA	1 месяц	40°С	0,00%	0,18%
FP2	39 ммоль	4,4	EDTA ДМСО	1 месяц	40°С	0,00%	0,23%
FP3	7 ммоль	4,4	сорбит	1 месяц	40°С	0,00%	1,02%
%: количество димера/высших агрегатов относительно общего количества G-CSF; с = концентрации G-CSF.

Результаты показывают, что стабильность фармацевтических композиций, содержащих NDSB, сравнимы с базовым образцом (AS16-10ACT). Более высокие концентрации NDSB показывают преимущественное влияние на стабильность.

SE-HPLC-анализ образцов FP4 - FP11, хранимых при 25°С в течение от 1 недели до 1 месяца, показали, что образцы стабильны, поскольку не наблюдается заметного повышения содержания агрегатов и гидрофобного разложения продуктов, (табл.2, фиг.2). Стабильность сравнима со стабильностью базового образца (AS16-10ACT), который идентичен коммерческой фармацевтической композиции, содержащей G-CSF (продукт Neupogen, G-CSF=0,3 мг/мл). Стабильность также подтверждается анализами RP-HPLC, которые не показывают существенных изменений в примесях или в содержании белка после хранения. Эти результаты согласуются с результатами анализа SDS-PAGE (результаты не представлены) и с измерениями биологической активности in vitro. Биологическая активность in vitro G-CSF, который применялся в исследованиях, находится на уровне международного стандарта (номер в каталоге 88/502, фирма NIBSC, Великобритания). После хранения в условиях исследования биологическая активность in vitro образцов с FP4 по FP11 изменяется (результаты не представлены).

Результаты, представленные в табл.2, показывают, что фармацевтические композиции с добавкой NDSB являются стабильными. Слабое снижение стабильности по сравнению с базовым образцом (табл.1) отмечают в образцах, которые подвергались более экстремальным условиям (1 месяц, 40°С). Возможно, что указанное снижение стабильности происходит в результате того, что значение рН выше 4 не является благоприятным для G-CSF, что также очевидно из литературных данных. Базовый образец получен при значении рН 4,0.

Пример 2

Состав предложенных фармацевтических композиций G-CSF

Составы предложенных фармацевтических композиций представлены в табл.3.

Таблица 3
Образец	Содержание G-CSF (мг/мл)	Неактивные ингредиенты	рН
FP1	0,3	39 ммоль NDSB, 5 ммоль Na EDTA, 5% ДМСО	4,4
FP2	0,3	39 ммоль NDSB, 5 ммоль Na EDTA	4,4
FP3	0,3	7 ммоль NDSB, 8%-ный сорбит	4,4
FP4	0,6	6 ммоль NDSB, 8%-ный сорбит	4,6
FP5	0,6	13 ммоль NDSB, 8%-ный сорбит	4,3
FP6	0,6	10 ммоль NDSB, 8%-ный сорбит	4,5
FP7	0,6	10 ммоль NDSB, 5%-ный сорбит	4,4
FP8	0,6	10 ммоль NDSB, 10%-ный сорбит	4,4
FP9	0,6	10 ммоль NDSB, 8%-ный инозит	4,4
FP10	0,6	10 ммоль NDSB, 8%-ная трегалоза	4,4

Получение насыпного концентрата

Исходный материал G-CSF для получения насыпного концентрата получают экспрессией в E.coli. Насыпной концентрат получают в растворе с чистой кислотой (уксусная кислота или НС1) при рН 4,4 с применением концентрации G-CSF=1,5 мг/мл. SE-HPLC-анализ этого концентрата показывает, что содержание димеров и высших агрегатов ниже определяемого предела. Содержание примесей, определенное с помощью RP-HPLC-анализа, находится в пределах от 2 до 4%. (RP-HPLC-анализ свежего образца Neupogen показал сравнимое количество примесей).

Качество веществ

NDSB: NDSB-195 (фирма Calbiochem) для анализа, сорбит: качество Европейской фармакопеи; глицерин: фирма Merck; для анализа; инозит: миоинозит (фирма Fluka: >99,5% HPLC), трегалоза (фирма Fluka: >99,5% HPLC), EDTA (фирма Sigma: 99%), ДМСО (фирма Merck: >99,5%), Tween 80 (фирма Sigma, низкий уровень пероксидов, содержит ВНТ в качестве антиоксиданта); вода для инъекций: качество Европейской фармакопеи; вода для анализа: Milli-Q (фирма Millipore).

Получение базовой фармацевтической композиции

A (S16-10ACT): Фракции гель-фильтрации, которые содержат мономер G-CSF, накапливают и замещают буфером, содержащим 10 ммоль уксусной кислоты и 5% сорбита в воде для инъекций. Значение рН буфера подводилось раствором NaOH до 3,96. Замещение проводилось на приборе Labscale^TM TFF System/Millipore с применением трех мембран Ultracel-5 PLCC. Tween 80 добавляют до тех пор, пока не получают концентрацию 0,004%. Значение рН конечного раствора после замещения составляет 4,0 с концентрацией 0,304 мг/мл.

Получение заявляемых фармацевтических композиций:

Основное положение:

Предложенные фармацевтические композиции получают разбавлением насыпного концентрата адекватным стерильным буферным раствором, предварительно профильтрованным через фильтр 0,2 PES/Nalgene. Конечная концентрация G-CSF составляет 0,3 мг/мл и 0,6 мг/мл, соответственно.

Фармацевтические композиции FP1 и FP2 помещают во флаконы объемом 2 мл, изготовленные из бесцветного стекла гидролитического типа 1, промытые, стерилизованные и укупоренные пробками из бромбутилкаучука, снабженными алюминиевыми колпачками.

Другими фармацевтическими композициями (FP3 - FP11) наполняют (вручную) инъекционные шприцы (объем 1,3-1,4 мл) так, чтобы было минимальное количество воздуха вокруг отверстия.

FP1, FP2, FP3: К 1 части насыпного концентрата добавляют 4 части подходящего буферного раствора. Получают конечные концентрации, указанные в табл.3. Значение рН больше не подводят.

FP4 - FP11: К 4 частям насыпного концентрата добавляют 6 частей раствора с подходящим буфером. Получают конечные концентрации, указанные в табл.3. Значение рН больше не подводят.