экспрессирующий вектор, кодирующий coronavirus-подобную частицу

Формула изобретения

1. Экспрессирующий вектор для клонирования гена вирусного слитого белка Класса I и для применения в качестве кандидата ДНК-вакцины, причем этот экспрессирующий вектор содержит:

i) первую транскрипционную единицу, содержащую ген белка мембраны (ген белка М) Coronavirus, ген белка оболочки (ген белка Е) Coronavirus и внутреннюю последовательность сайта вхождения рибосом (IRES), где IRES встроена в место соединения гена белка мембраны и гена белка оболочки;

ii) первый эукариотический промотор, функционально связанный с геном белка мембраны, где этот первый промотор расположен слева (против хода транскрипции) от гена белка М и запускает экспрессию этой первой транскрипционной единицы;

iii) вторую транскрипционную единицу, содержащую ген SpikeCT Coronavirus и сайт множественного клонирования (MCS) для клонирования или встраивания в рамке считывания гена вирусного слитого белка Класса I, где этот MCS расположен в начале гена SpikeCT и имеет сайты разрезания рестрикционных ферментов; и

iv) второй эукариотический промотор, функционально связанный с геном SpikeCT, где этот второй промотор расположен слева (против хода транскрипции) от гена SpikeCT и запускает экспрессию этой второй транскрипционной единицы;

где транскрипционная активность первого эукариотического промотора является более сильной, чем транскрипционная активность второго эукариотического промотора.

2. Экспрессирующий вектор по п.1, где этот Coronavirus является коронавирусом свиньи, человека или птиц.

3. Экспрессирующий вектор по п.1, где этот Coronavirus является коронавирусом TGEV свиньи, коронавирусом 229Е человека или коронавирусом SARS человека.

4. Экспрессирующий вектор по п.1, где ген белка оболочки имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:1.

5. Экспрессирующий вектор по п.1, где ген белка мембраны имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:2.

6. Экспрессирующий вектор по п.1, где ген SpikeCT имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

7. Экспрессирующий вектор по п.1, который дополнительно содержит сайт инициации репликации для размножения плазмиды в клетке-хозяине.

8. Экспрессирующий вектор по п.1, который дополнительно содержит ген устойчивости к антибиотику в качестве селектируемого маркера.

9. Экспрессирующий вектор по п.1, где первая и вторая транскрипционные единицы имеют полиА-сигнал.

10. Экспрессирующий вектор по п.9, где полиА-сигнал является полиА-сигналом BGH.

11. Экспрессирующий вектор по п.1, который имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:49.

12. Экспрессирующий вектор по п.1, где ген SpikeCT кодирует С-концевой гептадный повтор, расположенный слева от богатого ароматическим остатком района, примыкающего к трансмембранному сегменту белка Spike коронавируса.

13. Экспрессирующий вектор по п.1, где сайт множественного клонирования содержит сайт рестрикции, выбранный из группы, состоящей из Smal, BsaBI, EcoRV и BspEI.

14. Экспрессирующий вектор по п.1, где ген вирусного слитого белка Класса I выбран из группы, состоящей из gp160 HIV, НА вируса гриппа и Spike вируса SARS.

15. Экспрессирующий вектор по п.1, где первый эукариотический промотор выбран из группы, состоящей из промоторов CMV, SV40, RSV, LTR HIV-1, гибридного энхансера промотор бета-актина/промотор CMV, промотора, специфического для мышц десмина, креатинкиназы, промотора бета-актина, промотора EF1-alpha, промотора убиквитина.

16. Экспрессирующий вектор по п.1, где первый эукариотический промотор выбран из группы, состоящей из промотора CMV, гибридного энхансера промотор бета-актина/промотор CMV и промотора бета-актина.

17. Экспрессирующий вектор по п.1, где второй эукариотический промотор выбран из группы, состоящей из промоторов CMV, SV40, RSV, LTR HIV-1, гибридного энхансера промотор бета-актина/промотор CMV, промотора, специфического для мышц десмина, креатинкиназы, промотора бета-актина, промотора EF1-alpha, промотора убиквитина.

18. Экспрессирующий вектор по п.1, где второй эукариотический промотор выбран из группы, состоящей из промотора pCMV, SV40, бета-актина и EF1-alpha.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Это изобретение относится к области технологии рекомбинантных ДНК, более конкретно к области ДНК-вакцины. В частности, это изобретение относится к новому экспрессирующему вектору, кодирующему вирусоподобную частицу, для клонирования гена вирусного слитого белка Класса I и для применения этого вектора в качестве кандидата ДНК-вакцины.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В течение последних 30 лет вакцинация играла ключевую роль в контроле вирусных заболеваний. Вакцинация основывается на простом принципе иммунитета: как только животное подвергается действию инфекционного агента, оно устанавливает иммунную защиту (иммунитет) против инфекции тем же самым агентом. Задачей вакцинации является индукция животного для установления этой защиты перед инфекцией. Обычно это выполнялось посредством применения живых аттенуированных или убитых форм конкретного вируса в качестве иммуногенов. Успех этих подходов в прошлом был обусловлен, отчасти, презентацией нативного антигена и способностью аттенуированного вируса индуцировать полный диапазон иммунных реакций, получаемых в случае настоящей инфекции. Однако общепринятые вакцинные методологии всегда были подвержены потенциальным ограничениям. Аттенуированные штаммы могут мутировать, становясь более вирулентными или неиммуногенными; неправильно инактивированные вакцины могут вызывать заболевание, которое они должны предотвращать.

Технология рекомбинантных ДНК предоставляет возможность исключения некоторых из этих недостатков общепринятых вакцин, делая возможным развитие вакцин на основе применения определенных антигенов, а не интактного инфекционного агента, в качестве иммуногенов. Эти способы включают в себя пептидные вакцины, состоящие из химически синтезированных, иммунореактивных эпитопов; субъединичные вакцины, получаемые экспрессией вирусных белков в рекомбинантных гетерологичных клетках; и применение живых вирусных векторов для презентации одного или нескольких определенных антигенов. Как пептидные, так и субъединичные вакцины подвержены ряду потенциальных ограничений. Главной проблемой является трудность гарантии того, что конформация сконструированных белков имитирует конформацию этих антигенов в их природном окружении. Для бустинга этой иммунной реакции должны использоваться подходящие адъюванты и, в случае пептидов, белки-носители. Кроме того, эти вакцины индуцируют прежде всего гуморальные реакции и, следовательно, могут не вызывать эффективного иммунитета.

Многочисленные другие способы были развиты для введения новой генетической информации в клетки-мишени. В настоящее время наиболее эффективным способом введения ДНК в клетки-мишени является использование модифицированных вирусов, так называемых рекомбинантных вирусных векторов. Наиболее часто используемые системы вирусных векторов основаны на ретровирусах, аденовирусах, герпесвирусах или аденоассоциированных вирусах (AAV). Все системы имеют характерные для них преимущества и недостатки. Некоторые из этих векторных систем обладают способностью интегрировать их ДНК в геном клетки-хозяина, тогда как другие не имеют этой способности. В случае некоторых векторных систем вирусные гены могут быть полностью удалены из вектора, тогда как в других системах это все еще не является возможным. Некоторые векторные системы имеют очень хорошие свойства доставки in vivo, тогда как другие системы не имеют таких свойств. Некоторые типы векторов очень легко получать в больших количествах, тогда как другие получить очень трудно.

Коронавирусы несут три или четыре белка в их оболочках. Белок М является наиболее обильным компонентом. Небольшой белок Е является минорным, но существенным вирусным компонентом. Важность белка S в патогенезе согласуется с его биологической функцией как в проникновении, так и в распространении вируса (Collins, A.R., et al, 1982, Virology 119:358-371; Williams, R.K., et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5533-5536). При экспрессии на оболочке вириона белок S связывается с клеточным рецептором и индуцирует слияние вирусной и клеточной мембран во время проникновения вируса. После инфицирования белок S, экспрессируемый на плазматической мембране инфицированных клеток, индуцирует слияние клетка-клетка. Белок S играет также роль в иммунной реакции на вирусную инфекцию в качестве мишени для нейтрализующих антител (Collins, A.R., et al., 1982, Virology 119:358-371) и в качестве индуктора клеточно-опосредованного иммунитета (Bergmann, С.С., et al., 1996, J. Gen. Virol. 77:315-325; Castro, R.F., and S. Perlman, 1995, J. Virol. 69:8127-8131). Белки М и Е являются минимальными белковыми единицами для сборки вируса (Baudoux, P., et al., 51998, J. Virol. 72:8636-8643; Bos, E.G., 1996, Virology 218:52-60; de Haan, C.A.M, et al., 1998, J. Virol. 72:6838-6850; Godeke, G.-J, et al., 2000, J. Virol. 74:1565-1571; Vennema H., et al., 1996, EMBO J. 15:2020-2028). Оба эти белка являются интегральными мембранными белками. Одновременная экспрессия белков М и Е является достаточной для запуска образования вирусоподобных частиц (VLP). При одновременной экспрессии белка S с белками М и Е этот белок Е включается в VLP с предположительно аутентичной конформацией. Это было теперь продемонстрировано для вируса гепатита мышей (MHV) (Bos, E.G., 1996, Virology 218:52-60; de Haan, CAM., et al, 1998, J. Virol. 72:6838-6850; Vennema H, et al, 1996. EMBO J. 15:2020-2028), вируса трансмиссивного гастроэнтерита (Baudoux, P., et al., 51998, J. Virol. 72:8636-8643) и вируса кошачьего инфекционного перитонита (Godeke, G.-J., et al., 2000, J. Virol. 74:1565-1571). Существует гипотеза, что мембрана коронавируса состоит в основном из плотного матрикса латерально взаимодействующих белков М, который некоторым образом требует белка Е для активной репликации вируса в результате проникновения в клетку (бадинга) и в котором включены гликопротеины S и НЕ, если они доступны, специфическими взаимодействиями с М через карбоксильный конец и трансмембранный район Spike (de Haan, САМ, et al, 1999, J. Virol. 73:7441-7452; Ngiyen, V-P, and B.G. Hogue, 1997. J. Virol. 71:9278-9284; Opstelten, D.-J.E, et al., 1995, J. Cell Biol. 131:339-349; Vennema H., et al., 1996, EMBO J. 15:2020-2028) Такие Spike-содержащие VLP могут инфицировать клетки с инфективностью, подобной инфективности аутентичного вируса (Bos, E.G., 1996, Virology 218:52-60). Однако не разработаны эффективные ДНК-векторы для использования в качестве ДНК-вакцины.

Таким образом, существует потребность в развитии эффективного ДНК-вектора, кодирующего вирусоподобные частицы, которые могут предоставлять функциональный вирусный слитый белок в поверхности VLP, и эти VLP будут превосходным кандидатом в качестве потенциальной вакцины против вирусных инфекционных заболеваний.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к экспрессирующему вектору для клонирования гена вирусного слитого белка Класса I и для применения в качестве кандидата ДНК-вакцины, причем этот экспрессирующий вектор содержит:

i) первую транскрипционную единицу, содержащую ген белка мембраны (ген белка М) Coronavirus, ген белка оболочки (ген белка Е) Coronavirus и внутреннюю последовательность сайта вхождения рибосом (IRES), где IRES встроена в место соединения гена белка мембраны и гена белка оболочки;

ii) первый эукариотический промотор, функционально связанный с геном белка мембраны, где этот первый промотор расположен слева (против хода транскрипции) от гена белка М и запускает экспрессию этой первой транскрипционной единицы;

iii) вторую транскрипционную единицу, содержащую ген SpikeCT Coronavirus и сайт множественного клонирования (MCS) для клонирования или встраивания в рамке считывания гена вирусного слитого белка Класса I, где этот MCS расположен в начале гена SpikeCT и имеет сайты разрезания рестрикционных ферментов; и

iv) второй эукариотический промотор, функционально связанный с геном SpikeCT, где этот второй промотор расположен слева (против хода транскрипции) от гена SpikeCT и запускает экспрессию этой второй транскрипционной единицы;

где транскрипционная активность первого эукариотического промотора является более сильной, чем транскрипционная активность второго эукариотического промотора.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖА

Чертеж показывает карту плазмиды одного предпочтительного варианта осуществления экспрессирующего вектора этого изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Гены, кодирующие вирусные полипептиды, способные к самосборке в дефектные, не саморазмножающиеся вирусные частицы, могут быть получены из геномной ДНК ДНК-вируса или геномной кДНК РНК-вируса или из доступных субгеномных клонов, содержащих эти гены. Эти гены будут включать в себя гены, кодирующие вирусные капсидные белки (т.е. белки, которые составляют вирусную белковую оболочку), и, в случае имеющих оболочку вирусов, таких как ретровирусы, гены, кодирующие гликопротеины вирусной оболочки. Эти вирусоподобные частицы могут быть выделены и использованы сами в качестве иммуногенов для вакцинации против патогенных вирусов или для терапевтических целей, таких как усиление иммунных реакций в инфицированном индивидууме, или для нацеленной доставки терапевтических агентов, таких как цитотоксические лекарственные средства, к конкретным типам клеток.

Данное изобретение обеспечивает экспрессирующий вектор для клонирования гена вирусного слитого белка Класса I и для применения в качестве кандидата ДНК-вакцины, причем этот экспрессирующий вектор содержит:

i) первую транскрипционную единицу, содержащую ген белка мембраны (ген белка М) Coronavirus, ген белка оболочки (ген белка Е) Coronavirus и внутреннюю последовательность сайта вхождения рибосом (IRES), где IRES встроена в место соединения гена белка мембраны и гена белка оболочки;

ii) первый эукариотический промотор, функционально связанный с геном белка мембраны, где этот первый промотор расположен слева (против хода транскрипции) от гена белка М и запускает экспрессию этой первой транскрипционной единицы;

iii) вторую транскрипционную единицу, содержащую ген SpikeCT Coronavirus и сайт множественного клонирования (MCS) для клонирования или встраивания в рамке считывания гена вирусного слитого белка Класса I, где этот MCS расположен в начале гена SpikeCT и имеет сайты разрезания рестрикционных ферментов; и

iv) второй эукариотический промотор, функционально связанный с геном SpikeCT, где этот второй промотор расположен слева (против хода транскрипции) от гена SpikeCT и запускает экспрессию этой второй транскрипционной единицы;

где транскрипционная активность первого эукариотического промотора является более сильной, чем транскрипционная активность второго эукариотического промотора.

Согласно этому изобретению этот экспрессирующий вектор содержит первую транскрипционную единицу, содержащую ген белка мембраны (ген белка М) Coronavirus, ген белка оболочки (ген белка Е) Coronavirus и внутреннюю последовательность сайта вхождения рибосом (IRES), где IRES встроена в место соединения гена белка мембраны и гена белка оболочки.

Согласно этому изобретению ген белка оболочки этого изобретения кодирует белок оболочки (белок Е) Coronavirus. Этот белок Е является малым, ассоциированным с оболочкой белком. Белок Е является минорным, но существенным вирусным компонентом. В клетках он накапливается в мембранах и индуцирует слипание мембран промежуточного компартмента (IC), приводя к возникновению типичных структур. Часть этих белков появляется внеклеточно в мембранных структурах неизвестной идентичности. Предпочтительно, коронавирус этого изобретения является коронавирусом свиньи, человека или птиц. Более предпочтительно, этот коронавирус является коронавирусом TGEV свиньи, коронавирусом 229Е человека или вирусом SARS (тяжелого острого респираторного синдрома) человека. Более предпочтительно, ген белка Е этого изобретения имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:1.

Согласно этому изобретению ген белка мембраны этого изобретения кодирует белок мембраны (белок М) Coronavirus. Этот белок М является наиболее обильным компонентом; он является гликопротеином типа III, состоящим из короткого аминоконцевого эктодомена, трех последовательных трансмембранных доменов и длинного карбоксиконцевого домена внутри вириона (или в цитоплазме). Предпочтительно, коронавирус этого изобретения является коронавирусом свиньи, человека или птиц. Более предпочтительно, этот коронавирус является коронавирусом TGEV свиньи, коронавирусом 229Е человека или вирусом SARS (тяжелого острого респираторного синдрома) человека. Более предпочтительно, ген белка Е этого изобретения имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:2.

Согласно этому изобретению для сборки оболочки коронавируса необходимы только белок М и белок Е (Cornelis A.M. de Haan et al., Journal of Virology, June 2000, p.4967-4978). Экспрессия в клетках генов, кодирующих эти белки, приводит к образованию и высвобождению вирусоподобных частиц (VLP), сходных по размеру и форме с аутентичными вирионами.

Согласно этому изобретению первая транскрипционная единица содержит внутреннюю последовательность сайта вхождения рибосом (IRES), которая встроена в место соединения гена М и гена Е. IRES делает возможной трансляцию двух или нескольких белков из двух- или полицистронной мРНК. Единицы IRES сливают с 5'-концами одной или нескольких дополнительных кодирующих последовательностей, которые затем встраивают в эти векторы на конце первоначальной кодирующей последовательности, так что эта кодирующая последовательность отделена от другой последовательности посредством IRES. Согласно этому изобретению любые производные IRES также могут быть использованы в плазмидной конструкции этого изобретения. Последовательность IRES позволяет аппарату рибосом инициировать трансляцию от вторичного сайта в едином транскрипте.

Согласно данному изобретению экспрессирующий вектор этого изобретения содержит первый эукариотический промотор, функционально связанный с геном белка мембраны, где этот первый промотор расположен против хода транскрипции (слева) от гена белка М и запускает экспрессию первой транскрипционной единицы. Предпочтительно, этот первый эукариотический промотор является происходящим из вируса промотором, таким как промотор CMV, SV40, RSV, LTR HIV-1 и гибридный энхансер промотор бета-актина/промотор CMV и промотор специфического для мышц десмина, креатинкиназы, промотор бета-актина и другой вездесущий промотор экспрессии, такой как промотор EF1-alpha, промотор убиквитина, Наиболее предпочтительно, первым эукариотическим промотором является pCMV, гибридный энхансер промотор бета-актина/промотор CMV, промотор бета-актина.

Согласно этому изобретению вторая транскрипционная единица содержит ген SpikeCT и сайт множественного клонирования (MCS), имеющий сайты разрезания рестрикционных ферментов, где этот сайт MCS локализован в начале гена SpikeCT. Ген SpikeCT взаимодействует с доменом взаимодействия белка М, который кодирует С-концевой гептадный (7-кратный) повтор, расположенный слева от богатого ароматическим остатком района, примыкающего к трансмембранному сегменту белка Spike коронавируса. Сайт множественного клонирования (MCS) имеет несколько сайтов разрезания рестрикционных ферментов. Сайт разрезания рестрикционных ферментов включает в себя, но не ограничивается ими, SmaI, BsaBI, EcoRV и BspEI. MCS расположен в начале гена SpikeCT и может быть использован для клонирования или встраивания в рамке считывания гена вирусного слитого белка Класса I. Ген вирусного слитого белка Класса I включает в себя, но не ограничивается ими, gр160 HIV, НА вируса гриппа и Spike вируса SARS. Ген вирусного слитого белка Класса I получают из вирусов, которые адаптируют вирусный механизм слияния Класса I и включают в себя коронавирус, HIV и вирус гриппа, этот ген вводят в клонирующий/экспрессирующий вектор этого изобретения, и затем этот вектор используют в качестве кандидата ДНК-вакцины. Предпочтительно, ген SpikeCT имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА SpikeCT (SEQ ID NO:3)

Согласно этому изобретению экспрессирующий вектор этого изобретения может продуцировать вирусоподобную частицу и экспрессировать функциональный слитый ген вирусов Класса I на поверхности вирусоподобной частицы. Таким образом, несколько сайтов разрезания рестрикционных ферментов (сайт множественного клонирования, MCS), в том числе, но не только, SmaI, BsaBI, EcoRV и BspEI, расположены в начале гена "SpikeCT" и эти сайты могут быть использованы для встраивания или клонирования гена вирусного слитого белка Класса I в клонирующий/экспрессирующий вектор этого изобретения и затем этот вектор может быть использован в качестве кандидата ДНК-вакцины. Вирусы, которые адаптируют вирусный механизм слияния Класса I, включают в себя, но не ограничиваются ими, коронавирус, HIV, вирус гриппа и т.д.

Согласно этому изобретению второй промотор расположен против хода транскрипции (слева) от гена SpikeCT и запускает экспрессию второй транскрипционной единицы. Предпочтительно, этот второй эукариотический промотор является происходящим из вируса промотором, таким как промотор CMV, SV40, RSV, LTR HIV-1 и гибридный энхансер промотор бета-актина/промотор CMV и промотор специфического для мышц десмина, креатинкиназы, промотор бета-актина и другой вездесущий или конститутивный промотор экспрессии, такой как промотор EF1-alpha, промотор убиквитина. Наиболее предпочтительно, вторым эукариотическим промотором является pCMV, SV40, промотор бета-актина и промотор EF1-alpha.

Согласно этому изобретению транскрипционные единицы этого изобретения содержат полиА-сигнал. Лицам с квалификацией в данной области понятно, что любая транскрипция имеет полиА-сигнал. Предпочтительно, транскрипционные единицы этого изобретения содержат полиА-сигнал BGH.

Согласно этому изобретению этот экспрессирующий вектор содержит сайт инициации репликации для размножения плазмиды в клетке-хозяине. Определение этого сайта инициации репликации зависит от типов клеток-хозяев.

Согласно этому изобретению экспрессирующий вектор этого изобретения дополнительно содержит ген устойчивости к антибиотикам в качестве селектируемого маркера.

Согласно этому изобретению экспрессирующий вектор этого изобретения может самопроизвольно образовывать вирусоподобные частицы. Эти вирусоподобные частицы могут быть использованы в качестве кандидата вакцины против вирусной инфекции. Эти вирусоподобные частицы не содержат генетических материалов вируса. Таким образом, такие частицы не имеют инфекционной способности. Экспрессирующий вектор этого изобретения может вводиться животным и транскрибироваться клетками-хозяевами для продуцирования вирусоподобных частиц.

Большинство вирусов состоят из небольшого количества белков только со структурными ограничениями, налагаемыми на них. Фактически, с использованием этого небольшого количества белков вирусы вынуждены генерировать почти кристаллическую, высоко повторяющуюся поверхность. Такие высоко повторяющиеся антигены эффективно сшивают рецепторы В-клеток в процессе, который генерирует сильный сигнал активации в В-клетках. В противоположность этому, аутоантигены обычно не являются высокоорганизованными, в частности, аутоантигены, доступные В-клеткам. Таким образом, В-клетки используют организацию антигенов в качестве маркера для инфекционного не-аутоантигена. Вакцины на основе вирусоподобных частиц (VLP) используют этот основной феномен, так как VLP обнаруживают поверхности, такие же повторяющиеся и организованные, что и поверхности вирусов. Вследствие этого, подобно вирусам, VLP способны запускать сильные В-клеточные реакции в отсутствие адъювантов. На основе вышеуказанного принципа, вирусоподобные частицы, продуцируемые экспрессией экспрессирующего вектора этого изобретения в клетках, могут быть использованы в качестве кандидата вакцины против вирусных заболеваний.

ПРИМЕРЫ

Ген Е, синтезированный при помощи ПЦР

Для синтеза гена Е вируса SARS (тяжелого острого респираторного синдрома) использовали полимеразную цепную реакцию. Матрица ПЦР (0,1 пмоль) гена Е вируса SARS является смесью праймеров, которые перечислены ниже, и реакцию ПЦР выполняли с использованием стандартного способа ПЦР, описанного Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press), с использованием полимеразы Taq KOD (Novagene.com). Праймеры ПЦР описаны ниже:

ДНК-матрицу сначала денатурировали при 95°С в течение 3 минут. Условия ПЦР перечислены ниже следующим образом:

Первая реакция ПЦР с 10 циклами 3 стадий:

1. Отжиг: 58°С в течение 20 секунд.

2. Удлинение: 72°С в течение 40 секунд.

3. Денатурация: 95°С в течение 1 минуты.

Вторая реакция ПЦР с 20 циклами 3 стадий:

1. Денатурация: 95°С в течение 1 минуты.

2. Отжиг: 62°С в течение 20 секунд.

3. Удлинение: 72°С в течение 40 секунд.

Полученные двухцепочечные полноразмерные продукты гена Е анализировали на 1,2% агарозном геле и очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR (Qiagen Inc.) и затем лигировали с вектором pGEM-T (Promega Со.) для получения клонов pGEM(T)/E^A+. Последовательность гена Е представлена в SEQ ID NO:1.

Ген М, синтезированный при помощи сплайсинговер-ПЦР

Синтез гена М вируса SARS (тяжелого острого респираторного синдрома) был сходен со способом ПЦР, описанным выше, матрица ПЦР (0,1 пмоль) гена Е вируса SARS является смесью праймеров, которые перечислены ниже, и реакцию ПЦР выполняли с использованием полимеразы Taq KOD (Novagene.com) следующим образом:

Использовали перечисленные ниже праймеры ПЦР:

Условия ПЦР являются по существу такими, как указанные выше. Полученные двухцепочечные полноразмерные продукты гена М анализировали на 1,0% агарозном геле и очищали с использованием набора для очистки или экстракции из геля QIAquick PCR (Qiagen Inc.) и затем лигировали с вектором pGEM-Т (Promega Co.) для получения клонов pGEM(T)/M. Последовательность гена М представлена в SEQ ID NO:2.

Ген "SpikeCT", кодирующий гептадный район 2 и трансмембранный домен гена белка Spike коронавируса, синтезировали при помощи ПЦР.

Способ и условия ПЦР, очистка и клонирование продуктов ПЦР являются такими же, что и описанные выше. Матрица ПЦР (0,1 пмоль) гена SpikeCT является смесью праймеров, которые перечислены ниже.

Использовали праймеры ПЦР, перечисленные ниже:

Использовали условия ПЦР, указанные выше. Полученные двухцепочечные полноразмерные продукты гена SCT320 очищали с использованием набора для очистки Qiagen/PCR (Qiagen Inc.) и клонировали с использованием вектора pGEM(T) (Promega Co.) для получения pGEM(T)/SpikeCT (EcoRV/BstBI). Плазмида pGEM(T)/SpikeCT (EcoRV/BstBI) содержит ген, который кодирует С-концевой гептадный повтор, расположенный слева от богатого ароматическим остатком района, примыкающего к трансмембранному сегменту белка Spike коронавируса. Кодирующая последовательность гена "SpikeCT" представлена в SEQ ID NO:3.

Конструирование экспрессирующего вектора этого изобретения

Манипулирование ДНК описано в Sambrook and Russel et al., Molecular cloning, third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Express. Рестриктазы, ДНК-лигазу T4, фермент Кленова покупали из New England Biolab.com и использовали в соответствии с рекомендацией изготовителя.

I. Конструирование плазмиды гена М вируса SARS, запускаемого промотором pCMV

Клон pGEM(T)/M использовали в качестве ДНК-матрицы для ПЦР с праймером промотора Т7 и SP6, и условия ПЦР, за исключением того, что температуру отжига устанавливали на 50°С в течение 20 секунд, являются такими же, какие описаны выше. Полученные ПЦР-продукты гена М очищали с использованием набора для очистки Qiagen/PCR (Qiagen Inc.) и расщепляли BcII и NotI с получением ДНК-инсертов, содержащих ген М SARS. Плазмиду pEGFP-N1 (Clontech Co.) расщепляли BgIII и NotI и полученную расщепленную BgIII, NotI плазмиду pEGFP-N1 использовали в качестве ДНК-вектора для лигирования с расщепленными BcII, NotI ДНК-инсертами гена М SARS с получением ДНК-плазмиды pN1/M. Плазмиду pN1/M расщепляли NheI и NotI с получением ДНК-инсертов, содержащих ген М SARS. Плазмиду рАСТ (Promega Co.) расщепляли NheI и NotI. Полученный расщепленный NheI, NotI ДНК-вектор рАСТ лигировали с расщепленными NheI, NotI ДНК-инсертами гена М SARS с получением ДНК-плазмиды рАСТ/М. ДНК-плазмиду рАСТ/М расщепляли BgIII и Asp718 с получением ДНК-инсертов, содержащих промотор CMV и ген М SARS. Плазмиду pCDNA3.1(+) (Invitrogen Co.) расщепляли BgIII и Asp718. Полученный расщепленный BgIII, Asp718 ДНК-вектор pCDNA3.1(+) лигировали с расщепленной BgIII, Asp718 ДНК, содержащей инсерты промотора CMV и гена М SARS, с получением ДНК-плазмиды PCDNA3.1+M.

II. Конструирование плазмиды гена Е IRES-SARS

Плазмиду plRES2-EGFP (Clontech Co.) расщепляли XhoI и NcoI с получением ДНК-инсерта "IRES". Вектор GL3basic (Promega Co.) расщепляли XhoI и NcoI. Расщепленный XhoI, NcoI ДНК-вектор GL3basic лигировали с расщепленным XhoI, NcoI ДНК-инсертом IRES с использованием ДНК-лигазы Т4 (NEB Co.). Смесь для лигирования трансформировали в компетентные клетки Е. coli DH5 с получением ДНК-плазмиды pGL3B/IRES-luciferase. Клон Т/E^A+, содержащий ген Е SARS с инсерционным мутацией второго аланина, расщепляли NcoI и XbaI с получением ДНК-инсертов гена Е SARS. ДНК-плазмиду pGL3B/IRES-luciferase расщепляли NcoI и XbaI. Этот расщепленный NcoI, XbaI ДНК-вектор pGL3B/IRES-luciferase лигировали с расщепленными NcoI, XbaI ДНК-инсертами гена E ^A+ SARS с получением ДНК-плазмиды pGL3B/IRES-E^A+ .

III. Конструирование запускаемой pCMV экспрессирующей плазмиды генов М+Е (экспрессирующего вектора Coronavirus-подобной частицы (CoVLP))

ДНК-плазмиду pGL3B/IRES-E ^A+ расщепляли BamHI и XbaI с получением ДНК-инсертов, содержащих IRES и ген E^A+ SARS. ДНК-плазмиду pCDNA3.1+M расщепляли BamHI и XbaI. Полученный расщепленный BamHI, XbaI ДНК-вектор pCDNA3.1+M лигировали с расщепленными BamHI, XbaI ДНК-инсертами, содержащими слитый ген IRES и Е^А+ SARS, с получением плазмиды pCDNA3.1+M/IRES-E^A+.

IV. Конструирование ДНК-вектора этого изобретения

Плазмиду pGEM(T)/SpikeCT (EcoRV/BstBI), в которой содержится ген, который кодирует С-концевой гептадный повтор, расположенный слева от богатого ароматическим остатком района, примыкающего к трансмембранному сегменту белка Spike коронавируса, расщепляли Spel и достраивали с использованием фермента Кленова и dNTP. После разделения на 1,2% агарозном геле этот ДНК-фрагмент очищали с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen Inc.) и дополнительно расщепляли BstBI. Полученные фрагменты гена "SpikeCT" использовали в качестве ДНК-инсертов и лигировали с расщепленной BsaBI, BstBI, очищенной из геля ДНК-векторной плазмидой pCDNA3.1+M/IRES-E ^A+. После трансформации в клетки Е. coli DH5 получали ДНК-вектор изобретения, так называемый CoVLP-клонирующий вектор. В нем имеются сайты разрезания нескольких рестрикционных ферментов (сайт множественного клонирования, MCS), в том числе SmaI, BsaBI, EcoRV, BspEI, расположенные в начале гена "SpikeCT", и эти сайты могут быть использованы для клонирования слитого в рамке считывания гена вирусного слитого белка Класса I с геном SpikeCT в векторе изобретения и затем полученная ДНК-плазмида может быть использована в качестве кандидата ДНК-вакцины. Карта CoVLP-клонирующего вектора показана на чертеже. Последовательность CoVLP-клонирующего вектора представлена в SEQ ID NO:49.

ДНК-последовательность клонирующего вектора CoVLP

(pCDNA3.1+M+IRES+SpikeCT) (SEQ ID NO:49))