способ прогнозирования послеоперационных осложнений у онкологических больных

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития послеоперационных осложнений путем определения количества лимфоцитов в крови, отличающийся тем, что в предоперационный период определяют относительное содержание субпопуляций лимфоцитов CD3+ и CD16+ в периферической крови и рассчитывают лимфоцитарный показатель по формуле

ЛП=[CD3+]-0,5[CD16+],

где ЛП - лимфоцитарный показатель;

[CD3+] и [CD16+] - относительное количество клеток соответствующих субпопуляций лимфоцитов в пробе крови, выраженное в процентах, при величине ЛП 35 прогнозируют высокий риск развития послеоперационных осложнений гнойно-септического характера и/или прогрессирования опухолевого процесса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к способам иммунологического анализа образцов крови. Изобретение может быть использовано для прогнозирования неблагоприятного течения послеоперационного периода, а именно: прогноза в отношении послеоперационных гнойно-септических осложнений, а также прогрессирования опухоли в раннем послеоперационном периоде у онкологических больных.

Гнойно-септические осложнения в послеоперационном периоде являются одной из самых актуальных проблем хирургии. По данным различных исследователей их частота составляет от 0,3 до 30%. Послеоперационные осложнения замедляют выздоровление больных, увеличивают летальность, длительность госпитализации и стоимость стационарного лечения.

Известен способ прогнозирования гнойных осложнений в посттравматическом периоде, в основу которого положен анализ клеточного состава лейкоцитарной формулы на третьи сутки после травмы или оперативного вмешательства (Масютин В.А., Широков Д.М., RU 2102752). На основе количественного соотношения лейкоцитов, лимфоцитов, эозинофилов, моноцитов и палочкоядерных лейкоцитов рассчитывают коэффициент адаптации, величина которого позволяет прогнозировать гнойные осложнения. Недостатком такого подхода является то, что заключение о прогнозе состояния пациента устанавливается после операции, что ограничивает возможности профилактики соответствующих нарушений.

Известен также способ прогнозирования течения послеоперационного периода у больных с последствиями травм по отношению количества гранулоцитов к лимфоцитам, величина которого более 2,0 свидетельствует о благоприятном течении послеоперационного периода (Гольдвис С.Л. с соавт., RU 02260187). Однако есть основания предполагать, что эти выводы не совсем справедливы по отношению к онкологическим больным, последствия операционного вмешательства у которых имеют свои особенности, отличающие их от пациентов с другими заболеваниями или травмами. Так, известен метод оценки прогноза выживаемости онкологических больных, подвергающихся противоопухолевому лечению, также основанный на определении отношения количества гранулоцитов и лимфоцитов, соответственно которому высокое значение этого отношения свидетельствует, напротив, о неблагоприятном прогнозе (Adachi M. с соавт., US Patent 5.403.719). Следует отметить, что в последнем случае прогноз устанавливался в отношении отдаленных результатов лечения, но не в отношении осложнений хирургического лечения.

Наиболее близкими аналогами заявляемого изобретения являются способы, предполагающие оценку состояния Т-клеточного иммунитета. Известен способ прогнозирования гнойно-воспалительных осложнений по так называемому «индексу воспаления», который рассчитывается как отношение количества Т-лимфоцитов, определяемому после инкубации с интерлейкином-1, к количеству Т-лимфоцитов, определяемому до инкубации (Герасимов А.А. с соавт., RU 2193778). Результат показывает относительное количество Т-лимфоцитов, способных к «активации», но не их абсолютное или относительное количество относительно других субпопуляций лимфоцитов. Подсчет Т-лимфоцитов в данном способе выполняется вручную, при помощи микроскопа, по числу «розеток», образуемых лимфоцитами и эритроцитами барана. Результат теста может быть неоднозначным при несоблюдении строгих условий реакции вследствие физиологической лабильности рецепторов. Кроме того, эритроциты барана как иммунологический реагент используются преимущественно в исследовательских целях, в связи с этим доступность данного реагента в стандартной форме сегодня в значительной степени ограничена.

В качестве прототипа заявляемого изобретения выбран способ прогнозирования послеоперационных осложнений в виде генерализованной гнойной хирургической инфекции, основанный на определении наличия Т-иммунодефицита в сочетании со снижением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Камзалакова Н.И. с соавт., RU 02153674). Данный способ требует выполнения нескольких тестов - иммунологического и биохимического, что делает его достаточно трудоемким. Указанный способ также обладает рядом недостатков, препятствующих достижению указанных ниже результатов, а именно:

- указанное определение наличия Т-иммунодефицита осуществляют после проведения хирургического вмешательства, что на практике может не оставить времени для профилактических мероприятий и соответствующего лекарственного лечения;

- способ не учитывает специфику онкологических заболеваний.

Изобретение направлено на решение задачи снижения частоты послеоперационных осложнений и летальности у онкологических больных.

Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет еще на этапе предоперационного обследования выявлять больных группы риска развития осложнений гнойно-септического характера в раннем послеоперационном периоде и/или прогрессирования опухолевого заболевания, индуцированного хирургическим вмешательством. Это, в свою очередь, позволяет своевременно корригировать тактику лечения и проводить профилактическую терапию для предупреждения развития летальных осложнений, обусловленных иммунодефицитным состоянием пациентов. Стандартизированный характер методики, высокая специфичность, стандартность реагентов (моноклональных антител) и автоматизированный принцип подсчета обеспечивают высокую надежность результатов. Широкое использование систем проточной цитофлуориметрии в современных рутинных исследованиях делает методику доступной для клинических учреждений.

Указанные технические и лечебные результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что, так же как в известном способе, прогнозирование развития послеоперационных осложнений осуществляют путем определения количества лимфоцитов в крови.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что в предоперационный период определяют относительное содержание субпопуляций лимфоцитов CD3+ и CD16+ в периферической крови и рассчитывают лимфоцитарный показатель по формуле ЛП=[CD3+]-0,5[CD16+],

где ЛП - лимфоцитарный показатель;

[CD3+] и [CD16+] - относительное количество клеток соответствующих субпопуляций лимфоцитов в пробе крови, выраженное в процентах. При величине ЛП 35 прогнозируют высокий риск развития послеоперационных осложнений гнойно-септического характера и/или прогрессирования опухолевого процесса.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Известно, что хирургическое вмешательство вызывает нейрогуморальный стресс и приводит к значительным нарушениям со стороны иммунной системы. Иммунодефицитное состояние, в свою очередь, снижает сопротивляемость организма в отношении микроорганизмов и вирусов, а также может быть причиной несостоятельности систем противоопухолевого иммунитета.

Авторами изобретения установлено, что оценка состоятельности иммунной системы в дооперационном периоде может служить достоверным и объективным критерием прогнозирования развития осложнений гнойно-септического характера, а также прогрессирования опухолевого процесса с высоким риском летальности в послеоперационном периоде у онкологических больных.

Способ основан на определении количественного соотношения субпопуляций лимфоцитов. При этом наряду с Т-клеточным иммунодефицитом, который определяется по сниженному относительному содержанию CD3+ лимфоцитов, учитывается повышенное относительное количество NK-клеток (CD16+ лимфоцитов), которое, по наблюдениям авторов, является неблагоприятным фактором прогноза у онкологических больных.

В качестве критерия прогноза в отношении развития послеоперационных осложнений авторами изобретения введен эмпирический лимфоцитарный показатель (ЛП), который рассчитывают исходя из относительного количества CD3+ и CD16+ лимфоцитов в периферической крови. В норме величина ЛП составляет от 50 до 70%. При величине ЛП, менее или равном 35%, вероятность послеоперационных осложнений достигает 90%. Используемый критерий является независимым от показателей рутинных лабораторных тестов (показателей общего и биохимического анализа крови, формулы крови).

Выбранный критерий оценки риска послеоперационных осложнений, предлагаемый в заявляемом способе, базируется на ретроспективном анализе результатов обследования 72 пациентов с опухолями легких и средостения, которым было выполнено хирургическое вмешательство на грудной клетке (таблица).

В группе больных, у которых ЛП до операции не превышал 35%, наблюдалась значительно более высокая частота случаев с неблагополучным течением послеоперационного периода - инфекционными осложнениями и прогрессированием опухолевого заболевания. Эти осложнения патогенетически могут быть обусловлены иммунодефицитом у данных больных. При этом развитие осложнений не зависело от возраста пациентов, стадии заболевания, локализации и гистологического типа опухоли и объема оперативного вмешательства. В подавляющем большинстве случаев общее клиническое состояние пациентов, динамические показатели вентиляции легких и результаты рутинного лабораторного обследования в предоперационном периоде не являлись препятствием для назначения хирургического лечения.

Способ осуществляют следующим образом.

Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют из гепаринизированной венозной крови (гепарин 250 ЕД/мл) центрифугированием в градиенте плотности (1,077 г/мл) фиколлверографин ("Pharmacia", Швеция) и дважды промывают средой 199 (МНИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи, Россия) центрифугированием при 200 g.

Послеоперационные осложнения у пациентов в группах с различным лимфоцитарным показателем.
Группа	Число больных	Особенности течения послеоперационного периода (* летальные случаи)	Количество случаев с осложнениями	Количество летальных случаев
Пациенты ЛП 35 (группа риска)	9	Прогрессирование опухоли в послеоперационном периоде (2**). Инфекционные и гнойно-септические осложнения (2**) Расхождение кожно-подкожножировых краев послеоперационной раны (1)	5 из 9 (56%)	4 из 5 (80%)
Пациенты ЛП>35	63	Инфекционные и гнойно-септические осложнения (2). Сердечно-сосудистые осложнения (3*). Негерметичность легочной ткани (1). Гемоторакс (1).	7 из 63 (11%)	1 из 7 (14%)

Суспензию лимфоцитов переносят по 50 мкл в лунки 96-луночного полистиролового планшета и добавляют специфические антитела к антигенами CD3+ и CD16+ («Сорбент Лтд», Россия). Инкубируют клетки в течение 40 мин при +4°С, осаждают центрифугированием и трижды отмывают средой 199. В лунки вносят по 50 мкл раствора флуоресцентного конъюгата - F(ab)2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ («Сорбент Лтд», Россия), разведенных 1:100 в среде 199 и инкубируют в течение 45 мин при +4°С. По окончании инкубации клетки отмывают средой 199, как описано выше, и после заключительного центрифугирования в лунки добавляют по 50 мкл 1% раствора параформальдегида, приготовленного на изотоническом растворе. Клетки суспендируют.

Подсчет клеток выполняют на проточном цитофлуориметре («Beckton-Dikinson», США), определяя процентное отношение антиген-позитивных клеток к общему количеству мононуклеарных клеток в пробе. Рассчитывают ЛП по вышеприведенной формуле.

Величина ЛП5 35% указывает на высокий риск развития послеоперационных осложнений гнойно-септического характера, а также на риск прогрессирования опухолевого процесса в ближайшие сроки после операции.

Примеры выполнения.

Пример 1

Больной С., 25 лет. Диагноз: злокачественная герминогенная опухоль переднего средостения, смешанного строения с вовлечением в процесс левого легкого, передней грудной стенки слева, перикарда, с метастатическим поражением плевры и головного мозга. Для установления гистологической формы новообразования и решения вопроса о лекарственном лечении выполнена парастернальная медиастинотомия слева и биопсия опухоли.

Результаты лабораторного обследования: лейкоциты 9,6×10⁹/л, лимфоциты - 10%, CD3+ - 27%, CD16+ - 12%, ЛП=21%.

После операции состояние больного оставалось стабильным. Однако через 2 недели появились нарастающие признаки сдавления органов средостения и явления пареза, что было обусловлено бурным ростом опухоли средостения, метастатическим поражением головного мозга. Несмотря на проводимую инфузионную, симптоматическую, обезболивающую и кровезаместительную терапию состояние больного оставалось тяжелым, пациент скончался в результате прогрессирования опухоли.

Пример 2

Больной Е., 52 г.

Диагноз: центральный рак верхней доли левого легкого T3N2M0, IIIA стадия.

Больному проводилось предоперационное лечение: гемостатическая, антибактериальная терапия с учетом флоры, определенной при бактериологическом исследовании мокроты, с положительной динамикой в виде уменьшения признаков интоксикации, уменьшения количества отхождения гнойной мокроты, улучшения показателей внешнего дыхания. Результаты лабораторного обследования: лейкоциты 10×10⁹/л, лимфоциты - 14%, CD3+ - 21%, CD16+ - 1%, ЛП=20,5%. Больному выполнена комбинированная пневмонэктомия слева с резекцией перикарда, блуждающего и диафрагмального нервов. Выявлен гнойный очаг и произведена эвакуация гноя. В послеоперационном периоде состояние больного крайне тяжелое, обусловлено тяжелым септическим шоком, полиорганной недостаточностью с преобладанием сердечно-легочной, на фоне выраженной интоксикации, гипоксии тканей циркуляторного генеза. В условиях реанимационного отделения проводилась интенсивная терапия, направленная на коррекцию вводно-электролитных, метаболических нарушений, коррекция циркуляторной гипоксии, антибактериальная и симптоматическая терапия. Плевральная полость санировалась через проточно-промывную систему растворами антисептиков. Пациент скончался на фоне нарастания сердечно-легочной недостаточности.

Пример 3

Больной М., 70 лет. Диагноз: центральный рак верхней доли левого легкого T4N1M0, IIIB стадия. Сопутствующие заболевания: хроническая обструктивная болезнь легких, пневмосклероз, ДН 1 ст., ишемическая болезнь сердца, атеросклеротический кардиосклероз, атеросклероз аорты, сосудов сердца и головного мозга, нарушение ритма сердца: мерцательная аритмия, пароксизмальная форма, желудочковая экстрасистолия. Лейкоциты 6,5×10⁹/л, лимфоциты - 19%, CD3+ - 71%, CD16+ - 6%, ЛП=68%. Больному выполнена комбинированная пневмонэктомия слева (резекция перикарда) с медиастинальной лимфаденэкомией. Послеоперационный период осложнился нарушением ритма сердца по типу пароксизмов мерцательной аритмии. Проводилась кардиальная терапия - с положительным эффектом, восстановлен синусовый ритм. Проводилась антибактериальная, кардиотропная, респираторная, инфузионная, симптоматическая терапия, перевязки, плевральные пункции. Швы сняты на 12-е сутки. Послеоперационная рана зажила первичным натяжением. Выписан в удовлетворительном состоянии.

Заявляемый способ обладает значительными преимуществами и отвечает критериям патентоспособности.