бензо[d] изоксазол-3-ольные ингибиторы daao

Формула изобретения

1. Соединение формулы 1А или его фармацевтически приемлемая соль:



где А обозначает водород;

Z обозначает О;

R¹ выбран из атома водорода, гидрокси и метокси;

R² выбран из атома водорода, F, Cl, гидрокси, метокси и метила;

R^3a выбран из C₁-С₆алкила, гидрокси, метокси, галогена, циано, СН₂-СН₂-фенила и О-СН₂ -фенила;

R^4a выбран из C₁-С ₆алкила, гидрокси, метокси и галогена.

2. Соединение по п.1, где R^3a и R^4а независимо выбраны из C₁-С₆алкила, гидрокси, метокси и галогена.

3. Соединение по п.1, где R^3a и R^4a независимо выбраны из C₁-С₆алкила и галогена.

4. Применение соединения формулы 1А или его фармацевтически приемлемой соли:



где А обозначает водород;

Z обозначает О;

R¹ выбран из атома водорода, гидрокси и метокси;

R² выбран из атома водорода, F, Сl, гидрокси, метокси и метила;

R^3a выбран из Н, C₁-С₆алкила, гидрокси, метокси, галогена, циано, СН₂-СН₂-фенила и O-СН₂ -фенила;

R^4a выбран из И, C₁-С ₆алкила, гидрокси, метокси и галогена,

для получения лекарственного средства для терапии и/или профилактики снижения обучаемости, памяти и/или познавательной способности, а также снижения памяти и/или познавательной способности, связанных с болезнью Альцгеймера.

5. Применение по п.4, где R¹ и R² обозначают атом водорода.

6. Применение по п.4, где один из R^3a и R^4a обозначает хлор.

7. Применение по п.4, где указанное соединение выбрано из

8. Применение соединения, выбранного из:





для получения лекарственного средства для терапии и/или профилактики снижения обучаемости, памяти и/или познавательной способности, а также снижения памяти и/или познавательной способности, связанных с болезнью Альцгеймера.

9. Соединение формулы IA или его фармацевтически приемлемая соль:



где А обозначает водород;

Z обозначает О;

R¹ выбран из атома водорода, F, гидрокси и метокси;

R² выбран из атома водорода, Cl, гидрокси, метокси и метила;

R^3a выбран из C₁-С₆алкила, гидрокси, метокси, галогена, циано, СН₂-СН₂-фенила и О-СН₂ -фенила;

R^4a выбран из C₁-С ₆алкила, гидрокси, метокси и галогена.

10. Применение соединения формулы IA или его фармацевтически приемлемой соли:



где А обозначает водород;

Z обозначает О;

R¹ выбран из атома водорода, F, гидрокси и метокси;

R² выбран из атома водорода, Сl, гидрокси, метокси и метила;

R^3a выбран из Н, C₁-С₆алкила, гидрокси, метокси, галогена, циано, СН₂-СН₂-фенила и O-СН₂ -фенила;

R^4a выбран из Н, C₁-С ₆алкила, гидрокси, метокси и галогена,

для получения лекарственного средства для терапии и/или профилактики снижения обучаемости, памяти и/или познавательной способности, а также снижения памяти и/или познавательной способности, связанных с болезнью Альцгеймера.

11. Соединение по п.9, где R ¹ и R² обозначают атом водорода.

12. Соединение по п.9, где один из R^3a и R^4b обозначает хлор.

13. Применение по п.10, где R¹ и R ² обозначают атом водорода.

14. Применение по п.10, где один из R^3a и R^4b обозначает хлор.

Описание изобретения к патенту

Данная заявка не является предварительной и показывает преимущество предварительной заявки США № 60/532978 от 29 декабря 2003. Полное раскрытие предварительной заявки США № 60/532978 включено здесь в виде ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Фермент оксидаза D-аминокислот (DAAO) осуществляет метаболизм D-аминокислот и, в частности, осуществляет in vitro метаболизм D-серина при физиологическом уровне pH. Экспрессия DAAO проходит в головном мозге млекопитающих и в периферической области. Роль D-серина как нейротрансмиттера важна в активации N-метил-D-аспартат(NMDA)-селективного подтипа глутаматного рецептора, ионного канала, экспрессируемого в нейронах, обозначенного здесь как NMDA-рецептор. Небольшие органические молекулы, которые ингибируют ферментативный цикл DAAO, могут регулировать уровни D-серина и, таким образом, влиять на активность NMDA-рецепторов в головном мозге. Активность NMDA-рецепторов является важной при разнообразных болезненных состояниях, таких как шизофрения, психоз, атаксия, ишемия, некоторые формы боли, включая невропатическую боль, и дефицит памяти и познавательной способности.

Небольшие органические молекулы, которые ингибируют ферментативный цикл DAAO, могут также регулировать продуцирование токсических метаболитов окисления D-серина, например пероксида водорода и аммиака. Следовательно, данные молекулы могут оказывать влияние на развитие процесса гибели клеток при нейродегенеративных нарушениях. Нейродегенеративные заболевания представляют собой заболевания, при которых ЦНС-нейроны и/или периферические нейроны претерпевают прогрессирующее ослабление функции, обычно сопровождающееся (и, возможно, вызванное) физическим ухудшением структуры самих нейронов или их границ раздела с другими нейронами. Такие состояния включают болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и невропатическую боль. Экспрессия N-метил-D-аспартат (NMDA)-глутаматных рецепторов осуществляется по возбуждающим синапсам во всей центральной нервной системе (ЦНС). Данные рецепторы опосредуют широкий диапазон процессов головного мозга, включая нестабильность синапсов, которые связаны с определенными типами формирования памяти и обучаемости. Для воздействия на нейротрансмиссию требуется связывание NMDA-глутаматных рецепторов с двумя агонистами. Один из этих агонистов представляет собой возбуждающую аминокислоту L-глутамат, при этом полагают, что второй агонист на, так называемом, "стрихнин-нечувствительном глициновом сайте" представляет собой D-серин. У животных D-серин синтезируется из L-серина посредством серинрацемазы и разрушается до соответствующей кетокислоты посредством DAAO. Полагают, что серинрацемаза и DAAO играют ключевую роль в модуляции NMDA-нейротрансмиссии путем регуляции ЦНС-концентраций D-серина.

Болезнь Альцгеймера проявляется как форма слабоумия, которая обычно включает психическое расстройство, отражающееся в потере памяти, спутанности и дезориентации. В контексте настоящего изобретения слабоумие определяют как синдром прогрессирующего ухудшения во множестве доменов познавательной функции, ведущий, в конечном счете, к неспособности поддерживать нормальную социальную и/или профессиональную деятельность. Ранние симптомы включают снижение памяти и небольшое, но прогрессирующее ухудшение специфических познавательных функций, таких как речь (афазия), двигательный навык (апраксия) и восприятие (агнозия). Самым ранним проявлением болезни Альцгеймера часто является ухудшение памяти, которое требуется для диагностики слабоумия по обоим критериям: критерию института National Institute of Neurological and Communicative Disorders и ассоциации Stroke-Alzheimer's Disease and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA) (McKhann и др., 1984, Neurology 34:939-944), который является специфичным для болезни Альцгеймера, и критерию по справочнику The American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, издание четвертое (DSM-IV), который применим для всех форм слабоумия. Когнитивную функцию пациента можно также оценить по когнитивной подшкале шкалы оценок болезни Альцгеймера (ADAS-cog; Rosen и др., 1984, Am. J. Psychiatry 141:1356-1364). Болезнь Альцгеймера обычно лечат при помощи ингибиторов ацетилхолинэстеразы, таких как такрингидрохлорид или донепезил. К сожалению, несколько форм лечения потери памяти и замедленной обучаемости, имеющиеся в настоящее время, считаются недостаточно эффективными, чтобы обеспечить существенное различие для пациента, и в настоящее время нет стандартного ноотропного лекарства для использования при таком лечении.

Нейропсихиатрические нарушения включают шизофрению, аутизм и нарушение, связанное с дефицитом внимания. Клиницисты признают различие между такими нарушениями, и существует много схем их категоризации. Справочник The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, издание четвертое исправленное (DSM-IV-R), опубликованный американской психиатрической ассоциацией (the American Psychiatric Association), обеспечивает стандартную диагностическую систему, которой доверяют специалисты в данной области, и которая включена здесь в виде ссылки. Согласно системе DSM-IV психические нарушения оси I включают: нарушения, диагностируемые в детстве (такие как нарушение, связанное с дефицитом внимания (ADD), и нарушение, связанное с дефицитом внимания - гиперактивностью (ADHD)), и нарушения, диагностируемые у взрослых. Нарушения, диагностируемые у взрослых, включают (1) шизофрению и психотические нарушения; (2) когнитивные нарушения; (3) нарушения настроения; (4) нарушения, связанные с чувством тревоги; (5) пищевые нарушения; (6) нарушения, связанные с приемом определенных веществ; (7) личностные расстройства и (8) "нарушения, еще не включенные" в схему.

ADD и ADHD представляют собой нарушения, которые преобладают, главным образом, у детей и связаны с повышенной двигательной активностью и пониженным объемом внимания. Данные нарушения обычно лечат посредством введения психостимуляторов, например метилфенидата и декстроамфетаминсульфата.

Шизофрения представляет группу нейропсихиатрических нарушений, характеризующихся дисфункциями мыслительного процесса, такими как мании, галлюцинации и экстенсивное удаление интересов пациента от интересов других людей. Приблизительно один процент населения во всем мире страдает от шизофрении, и данное нарушение сопровождается высокими степенями заболеваемости и смертности. Так называемые, негативные симптомы шизофрении включают притупление эмоций, анергию, алогичность и социальную самоизоляцию, которые можно оценить, используя SANS (Andreasen, 1983, шкалы для оценки негативных симптомов (SANS), Iowa City, Iowa). Позитивные симптомы шизофрении включают манию и галлюцинацию, которые можно оценить, используя PANSS (шкалу позитивных и негативных синдромов) (Kay и др., 1987, Schizophrenia Bulletin 13:261-276). Когнитивные симптомы шизофрении включают ухудшение получения, организации и использования интеллектуальных знаний, которое можно оценить по когнитивной подшкале «шкалы позитивных и негативных синдромов» (PANSS-когнитивная подшкала) (Lindenmayer и др., 1994, J. Nerv. Ment. Dis. 182:631-638) или при помощи когнитивных задач, например, применяя тест с сортировкой карт «Wisconsin Card Sorting Test». Для лечения позитивных симптомов шизофрении, таких как мании и галлюцинации, можно использовать общеизвестные антипсихотические лекарства, которые действуют на допаминовые D₂ рецепторы. Вообще, общеизвестные антипсихотические лекарства и нетипичные антипсихотические лекарства, которые действуют на допаминовые D₂ и серотониновые 5HT₂ рецепторы, ограничены в способности лечить когнитивный дефицит и негативные симптомы, например притупление эмоций (то есть отсутствие выражения лица), анергию и социальную самоизоляцию.

Другие состояния, которые проявляются как дефицит памяти и обучаемости, включают легкую забывчивость и закрытую травму черепа. Легкая забывчивость относится к слабой тенденции неспособности извлекать или вспоминать информацию, которая была отмечена, заучена и сохранена в памяти (например, неспособность вспомнить, где положены ключи или припаркована машина). Легкая забывчивость обычно поражает людей старше 40 лет и может быть оценена при помощи стандартных оценочных механизмов, например, по шкале оценки памяти Wechsler Memory Scale. Закрытая травма черепа относится к клиническому состоянию после повреждения или травмы головы. Так, состояние, которое характеризуется когнитивным ухудшением и ухудшением памяти, можно диагностировать согласно DSM-IV как "амнестическое нарушение в результате общего медицинского состояния".

Известные ингибиторы DAAO включают бензойную кислоту, пиррол-2-карбоновые кислоты и индол-2-карбоновые кислоты, которые описаны Frisell, и др., J. Biol. Chem., 223:75-83 (1956) и Parikh и др., JACS, 80:953 (1958). В литературе описаны производные индола и, в частности, некоторые индол-2-карбоксилаты для лечения нейродегенеративных заболеваний и нейротоксических повреждений. EP 396124 раскрывает индол-2-карбоксилаты и производные, предназначенные для лечения или терапии нейротоксического повреждения в результате нарушения ЦНС или травматического случая или для лечения или терапии нейродегенеративного заболевания. Даны несколько примеров травматических случаев, результатом которых является нейротоксическое повреждение, включая гипоксию, аноксию, ишемию, связанную с перинатальной асфиксией, остановку сердечной деятельности или инсульт. Нейродегенерация связана с нарушениями ЦНС, такими как судороги и эпилепсия. Патенты США № № 5373018; 5374649; 5686461; 5962496 и 6100289 (Cugola) раскрывают лечение нейротоксического повреждения и нейродегенеративного заболевания, используя производные индола. Ни в одной из указанных выше ссылок не упоминается улучшение или повышение обучаемости, памяти или познавательной способности.

WO 03/039540 раскрывает повышение обучаемости, памяти и познавательной способности и лечение нейродегенеративных нарушений при использовании ингибиторов DAAO, включая индол-2-карбоновые кислоты. Тем не менее сохраняется потребность в новых лекарствах, которые являются клинически эффективными при лечении дефектов памяти, пониженной обучаемости и снижения познавательной способности, и других симптомов, связанных с активностью NMDA-рецепторов или ее отсутствием.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неожиданно было обнаружено, что некоторые производные бензо[d]изоксазол-3-ола демонстрируют более сильное ингибирование активности DAAO, чем известные ингибиторы. Обнаружено, что поразительно низкие концентрации данных соединений ингибируют DAAO in vitro, в частности, по сравнению с известными ингибиторами DAAO, такими как бензойная кислота, пиррол-2-карбоновая кислота и индол-2-карбоновая кислота. Благодаря своей способности ингибировать DAAO-активность, некоторые производные бензизоксазола пригодны при лечении разнообразных заболеваний и/или состояний, при которых регуляция уровней D-серина и/или продуктов его окисления является эффективной для улучшения симптомов, наряду со снижением нежелательных побочных эффектов. В частности, соединения могут быть пригодны для повышения уровней D-серина и снижения уровней токсических продуктов окисления D-серина; таким образом, соединения пригодны для повышения обучаемости, памяти и/или познавательной способности или для лечения шизофрении, для лечения или профилактики потери памяти и/или познавательной способности, связанной с болезнью Альцгеймера, для лечения атаксии или профилактики снижения нейронной функции, характерного для нейродегенеративных заболеваний.

Таким образом, в одном аспекте данное изобретение касается способов повышения уровня D-серина и снижения количества токсических продуктов окисления D-серина для улучшения обучаемости, памяти и/или познавательной способности или для лечения шизофрении, лечения или профилактики потери памяти и/или познавательной способности, связанной с болезнью Альцгеймера, для лечения атаксии, или для профилактики снижения нейронной функции, характерной для нейродегенеративных заболеваний.

Способы включают введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтического количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата:

где

Z¹ обозначает N или CR³;

Z² обозначает N или CR⁴;

Z³ обозначает О или S;

A обозначает водород, алкил или M ⁺;

M обозначает алюминий, кальций, литий, магний, калий, натрий, цинк или их смесь;

R ¹, R², R³ и R⁴ независимо выбраны из водорода, алкила, гидроксиалкокси, арила, ацила, галогена, циано, галогеналкила, NHCOOR⁵ и SO₂NH ₂;

R⁵ обозначает арил, арилалкил, гетероарил или гетероарилалкил; и,

по меньшей мере, один из Z¹ и Z² отличен от N.

Во втором аспекте данное изобретение касается способов лечения аутизма, шизофрении, болезни Альцгеймера, атаксии или нейродегенеративного заболевания, включающих введение терапевтически эффективного количества указанного выше ингибитора оксидазы D-аминокислот (DAAO) формулы I субъекту, нуждающемуся в лечении одного или нескольких таких состояний.

В предпочтительных вариантах соединения формулы I представляют собой замещенные бензо[d]изоксазол-3-олы, то есть, по меньшей мере, один из R ¹, R², R³ и R⁴ отличен от водорода. Типичными соединениями являются:

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается способов повышения уровня D-серина и снижения количества токсических продуктов окисления D-серина для улучшения обучаемости, памяти и/или познавательной способности или для лечения шизофрении, лечения или профилактики потери памяти и/или познавательной способности, связанной с болезнью Альцгеймера, для лечения атаксии или для профилактики снижения нейронной функции, характерного для нейродегенеративного заболевания. Способы включают введение субъекту терапевтического количества соединения формулы I:

или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата; где

Z¹ обозначает N или CR³;

Z² обозначает N или CR⁴;

Z³ обозначает О или S;

A обозначает водород, алкил или M⁺ ;

M обозначает алюминий, кальций, литий, магний, калий, натрий, цинк или их смесь;

R¹ , R², R³ и R⁴ независимо выбраны из водорода, алкила, гидроксиалкокси, арила, ацила, галогена, циано, галогеналкила, NHCOOR⁵ и SO₂NH ₂;

R⁵ обозначает арил, арилалкил, гетероарил или гетероарилалкил; и,

по меньшей мере, один из Z¹ и Z² отличен от N.

Терапевтическое лечение соединением формулы I улучшает и/или исправляет память, обучаемость и познавательную способность, в особенности, у людей, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, Хантингтона или Паркинсона. Соединения также облегчают когнитивные дисфункции, связанные со старением, и облегчают кататоническую шизофрению.

Соединения формулы I обладают уникальными фармакологическими характеристиками в отношении ингибирования DAAO и влияния на активность NMDA-рецепторов в головном мозге, в частности, путем регулирования уровня D-серина. Следовательно, данные соединения эффективны при лечении состояний и нарушений, регулируемых DAAO, D-серином и/или активностью NMDA-рецепторов, главным образом, нарушений, связанных с ЦНС, при уменьшении побочных эффектов по сравнению с приемом стандартных в настоящее время препаратов. Данные состояния и нарушения включают, но не ограничены этим, нейропсихиатрические нарушения, такие как шизофрения, аутизм, нарушение, связанное с дефицитом внимания (ADD и ADHD), и проблемы обучения у детей, и нейродегенеративные заболевания и нарушения, такие как MLS (мозжечковая атаксия), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, синдром Дауна, невропатическая боль, слабоумие, связанное с множественным инфарктом, эпилептический статус, контузионные повреждения (например, повреждение спинного мозга и повреждение головы), индуцированная вирусной инфекцией нейродегенерация (например, СПИД, энцефалопатии), эпилепсия, легкая забывчивость и закрытая травма черепа. Соединения формулы I могут также быть пригодны для лечения нейротоксического поражения после церебрального инсульта, тромбоэмболического инсульта, геморрагического инсульта, церебральной ишемии, спазма мозговых сосудов, гипогликемии, амнезии, гипоксии, аноксии, перинатальной асфиксии и остановки сердечной деятельности.

Соединения формулы I обычно более селективны, чем известные ингибиторы DAAO, включая индол-2-карбоксилаты, и демонстрируют более высокую селективность ингибирования DAAO относительно связывания по сайтам связывания D-серина на NMDA-рецепторах. Соединения также демонстрируют благоприятный профиль активности, включая хорошую биодоступность. Таким образом, они обеспечивают преимущества относительно многих известных в данной области способов лечения нарушений, регулируемых DAAO, D-серином или активностью NMDA-рецепторов. Например, в отличие от многих общеизвестных антипсихотических терапевтических средств ингибиторы DAAO могут производить желательное уменьшение когнитивных симптомов шизофрении. Общеизвестные антипсихотические средства часто дают нежелательные побочные эффекты, включая позднюю дискинезию (необратимое непроизвольное двигательное расстройство), экстрапирамидальные симптомы и акатизию, и их можно снизить или ликвидировать посредством введения соединений формулы I.

В другом аспекте настоящее изобретение также касается соединений формулы Ia или их фармацевтически приемлемых солей или сольватов и содержащих их фармацевтических композиций:

где

A обозначает водород, алкил или M⁺;

M обозначает алюминий, кальций, литий, магний, калий, натрий, цинк или их смесь;

Z обозначает O или S;

R¹ и R² независимо выбраны из водорода, алкила, гидрокси, алкокси, арила, ацила, галогена, циано, галогеналкила, NHCOOR ⁵ и SO₂NH₂;

R ⁵ обозначает арил, арилалкил, гетероарил или гетероарилалкил; и

R^3a и R^4a независимо выбраны из алкила, гидрокси, алкокси, арила, ацила, галогена, циано, галогеналкила, NCOOR⁵ и SO₂NH₂ .

Соединения формулы Ia образуют подмножество соединений формулы I, и, таким образом, могут использоваться в способах по настоящему изобретению. Предполагается, что приведенные здесь ссылки на соединения формулы I включают соединения формулы Ia.

В предпочтительных вариантах соединения формулы I и Ia представляют собой бензо[d]изоксазол-3-олы, замещеные в положении 5 и/или в положении 6. Предпочтительными заместителями для соединений формулы I и Ia и для 5-, 6- и 5,6-замещенных бензо[d]изоксазол-3-олов являются галогены (в особенности, хлор), гидрокси, алкил (в особенности, высший алкил (C₆-C₂₀)) и алкокси. Особо предпочтительные бензо[d]изоксазол-3-ольные, ингибиторы оксидазы D-аминокислот включают:

Изобретение включает соединения формулы I и Ia, а также фармацевтически приемлемые соли и сольваты данных соединений. Выражение "соединение или фармацевтически приемлемая соль или сольват соединения" подразумевает значение "или" в смысле включение, которое одновременно охватывает и соль, и сольват. Фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничены этим, неорганические соли алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка и органические соли лизина, NN'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглумина (N-метилглюкамина), прокаина и трометамина.

Субъекты для лечения согласно настоящему изобретению включают людей (пациенты) и других млекопитающих, нуждающихся в лечении указанного состояния. Пациентами, нуждающимися в лечении для улучшения или повышения обучаемости и памяти являются те, которые демонстрируют симптомы слабоумия или снижения обучаемости и памяти. Пациенты с амнезией имеют ухудшенную способность в познавании новой информации или неспособны вспомнить полученную ранее информацию или прошлые события. Дефицит памяти является наиболее очевидным при решении задач, требующих спонтанно что-то вспомнить, и также может быть очевиден, если позже экзаменатор дает человеку стимулы для воспоминаний. Нарушение памяти должно быть достаточно тяжелым, чтобы вызывать заметное ухудшение в социальной или профессиональной деятельности, и должно представлять существенный спад относительно прежнего уровня деятельности. Дефицит памяти может быть связан с возрастом или являться результатом заболевания или другой причины. Слабоумие характеризуется множественными клинически существенными дефицитами в познавательной способности, что представляет существенное отклонение от прежнего уровня деятельности, включающее ухудшение памяти, в том числе неспособность к изучению нового материала или забывание ранее изученного материала. Память можно формально исследовать, оценивая способность регистрировать, держать в памяти, вспоминать и осознавать информацию. Диагностика слабоумия также нуждается, по меньшей мере, в одном из следующих когнитивных нарушений: афазия, апраксия, агнозия или нарушение в исполнительной деятельности. Эти дефициты речи, двигательной деятельности, способности распознавать объекты и абстрактного мышления, соответственно, должны быть достаточно тяжелыми в сочетании с дефицитом памяти, чтобы вызывать ухудшение в профессиональной или социальной деятельности, и должны представлять спад относительно более высокого прежнего уровня деятельности.

Соединения формулы I и Ia можно также использовать в сочетании с терапией, включающей введение D-серина или его аналога, например, соли D-серина, сложного эфира D-серина, алкилированного D-серина или предшественника D-серина, или можно использовать в сочетании с терапией, включающей введение антипсихотических средств, антидепрессантов, психостимуляторов и/или средств для терапии болезни Альцгеймера.

У животных имеется несколько общепринятых моделей обучаемости и памяти для проверки благотворных эффектов, повышающих когнитивную функцию, и связанных с ними потенциальных побочных эффектов лечения. Описания исследований, которые можно применять для оценки изменений в познавательной способности у видов, отличных от человека, даны в работе Sarter, Martin, Intern. J. Neuroscience, 32:765-774 (1987). Исследования включают водный лабиринт Морриса (Stewart and Morris, Behavioral Neuroscience, R. Saghal, Ed., p. 107 (1993)), модель отсроченного несовпадения с образцом и социально дискриминационные модели.

Водный лабиринт Морриса является одной из моделей обучаемости и памяти, наилучшим образом подтвержденных, и он чувствителен к эффектам разнообразных фармакологических агентов, повышающим когнитивную функцию. Задание, выполняемое в лабиринте, является особо чувствительным к манипуляциям с гиппокампом в головном мозге, областью головного мозга, важной для пространственной обучаемости у животных и усиления памяти у людей. Кроме того, улучшение деятельности в водном лабиринте Морриса является предсказанием клинической эффективности соединения как агента, усиливающего когнитивную функцию. Например, лечение ингибиторами холинэстеразы или селективными мускариновыми холинергическими агонистами уменьшает дефицит обучаемости на животной модели обучаемости и памяти с лабиринтом Морриса, а также у клинически исследуемых пациентов со слабоумием. Кроме того, данный пример на животных точно моделирует повышение степени ухудшения с наступлением старости и повышенную уязвимость следов памяти при задержке перед исследованием или помехе, что характерно для пациентов с амнезией. Тест представляет задачу простой пространственной обучаемости, при которой животное помещают в резервуар с прохладной водой, которая непрозрачна в результате добавления порошкового молока. Животные изучают расположение платформы относительно визуальных подсказок, находящихся внутри лабиринта и исследовательской комнаты; данное обучение относится к изучению места. Группы животных принимают контрольный раствор или дозу терапевтического агента с необходимым временным интервалом до тренинга или после тренинга. Контрольные животные обычно достигают платформы за пять-десять секунд после трех дней тренинга. Оценкой модулирующего влияния терапевтического агента на память является изменение данного временного периода. На второй или тестовой фазе исследования животных, которые ранее изучили положение платформы, помещают в резервуар, из которого удалена платформа. Животные, которые помнят положение платформы, проводят больше времени в квадранте, который содержал платформу, и больше пересекают положение, ранее занимаемое платформой. Улучшение памяти или когнитивной способности проявляют животные, проводящие больше времени в правильном квадранте или больше пересекающие положение, ранее занимаемое платформой, по сравнению с контрольными животными. Снижение памяти или когнитивной способности проявляют животные, проводящие меньше времени в правильном квадранте или меньше пересекающие положение платформы, чем контрольные животные.

В исследовании на модели отсроченного несовпадения с образцом животному предоставляют стимул (например, уровень A). Через некоторый период времени животному предоставляют две альтернативы (например, уровень A и уровень B). Выбор решения, которое не соответствует исходному стимулу (уровень B) дает вознаграждение. Большая, чем случайный выбор, результативность собственного решения указывает, что исходный стимул был сохранен в памяти. С увеличением времени между стимулом и выбором, результативность снижается и приближается к чистому выбору. Количество правильных выборов в данный момент времени пропорционально когнитивной способности. Дефицит познавательной способности или памяти можно индуцировать физически, биохимически или используя старых животных.

В исследовании социального взаимодействия вводят чужое животное (животное B) в клетку с исследуемым животным (животное A). Животное A признает введенное животное за чужака и исследует его. Если животное B удалить и позже ввести обратно, исследуемое животное (животное A) затрачивает меньше времени на исследование нового соседа по клетке, так как оно помнит его с предыдущего введения. С увеличением времени между введениями на исследование нового животного, введенного второй раз, затрачивается больше времени, так как его хуже помнят. Время, затраченное на исследование нового соседа по клетке при втором введении, обратно пропорционально когнитивной способности. Дефицит познавательной способности или памяти можно индуцировать физически, биохимически или используя старых животных.

У людей способы улучшения обучаемости и памяти можно оценить по таким тестам как шкала памяти Векслера (Wechsler Memory Scale) и мини-ментальный тест (Minimental test). Стандартным клиническим исследованием для определения, имеет ли пациент ухудшенную обучаемость и память, является мини-ментальный тест на обучаемость и память (Folstein и др., J. Psychiatric Res. 12:185, 1975), главным образом, для людей, страдающих от травмы головы, болезни Корсакова (Korsakoff) или инсульта. Результат исследования служит показателем краткосрочной рабочей памяти, такого типа памяти, которая быстро ухудшается на ранних стадиях слабоумия или амнезии. Пациенту читают десять пар несвязанных слов (например, армия-стол). Затем пациента просят вспомнить второе слово, называя первое слово из каждой пары. Оценкой ухудшения памяти является уменьшенное количество вспомненных слов, ассоциированных в пары, относительно соответствующей контрольной группы. Улучшение обучаемости и памяти состоит либо в (a) статистически существенной разнице между результатом для пациентов, прошедших лечение, по сравнению с участниками плацебо-группы; либо в (b) статистически существенном изменении результата по направлению к норме по определениям, подходящим к модели заболевания. Животные модели или клинические случаи заболевания демонстрируют симптомы, которые по определению отличны от нормальных контролей. Таким образом, мероприятия эффективной фармакотерапии являются существенными, но необязательно с полной обратимостью симптомов. Улучшению могут способствовать (на моделях животных или на людях с патологией памяти) клинически эффективные лекарства, "усиливающие когнитивную функцию", которые служат улучшению работы памяти. Например, агенты, усиливающие когнитивную функцию, которые действуют как холиномиметические заместительные терапии у пациентов, страдающих от слабоумия и снижения памяти Альцгеймеровского типа, существенно улучшают краткосрочную рабочую память в таких примерах как задача с парными ассоциатами. Другое потенциальное применение для терапевтических вмешательств против ухудшения памяти предлагается при возрастных дефицитах деятельности, которые эффективно моделирует лонгитюдное исследование краткосрочной памяти у старых мышей.

Шкалу памяти Векслера широко используют в исследовании когнитивной функции и способности памяти «карандаш и бумага». У нормальных людей стандартизованный тест дает среднее значение 100 и стандартное отклонение 15, так что легкую амнезию можно детектировать при снижении на 10-15 пунктов от метки, более тяжелую амнезию при снижении на 20-30 пунктов и так далее. При клинической беседе применяют набор тестов, включая, но не ограничиваясь этим, мини-ментальный тест, шкалу памяти Векслера или исследование обучаемости с парными ассоциатами, для диагностики симптоматического снижения памяти. Данные тесты обеспечивают общую чувствительность к обоим типам ухудшений, общему когнитивному ухудшению и специфическому снижению способности к обучению/памяти (Squire, 1987). Кроме конкретного диагноза слабоумия или нарушений памяти, данные клинические подходы также идентифицируют возрастной когнитивный спад, который отражает объективное уменьшение психической функции вследствие процесса старения, то есть в пределах нормы, данной человеческим возрастом (DSM TV, 1994). Как отмечается выше, "улучшение" обучаемости и памяти в контексте настоящего изобретения происходит, когда существует статистически существенное различие по направлению к норме в исследовании с парными ассоциатами, например, между результатом для пациентов, прошедших лечение терапевтическим агентом, по сравнению с членами плацебо-группы или между последовательными тестами для одного и того же пациента.

Для идентификации соединений, которые эффективны при лечении шизофрении, можно использовать предшествующее ингибированию исследование. Данное исследование основано на наблюдениях, что животные или люди, которых подвергают воздействию громким звуком, демонстрируют испуг, и что животные или люди, которых подвергают воздействию сериями звуков низкой интенсивности до тестового звука высокой интенсивности, больше не демонстрируют такой сильный испуг. Это называют предварительным ингибированием. Пациенты с диагнозом шизофрения демонстрируют дефекты при предварительном ингибировании, то есть предварительные воздействия меньшей интенсивности уже не ингибируют испуг в ответ на интенсивный тестовый звук. Аналогичные дефекты в предварительном ингибировании можно вызвать у животных посредством обработки лекарствами (скополамин, кетамин, PCP или MK801) или при разведении потомства в изоляции. Эти дефекты в предварительном ингибировании у животных можно частично инвертировать при помощи лекарств, которые, как известно, эффективны для пациентов с шизофренией. Полагают, что предварительно ингибированные животные модели имеют показательное значение для предсказания эффективности соединений при лечении пациентов с шизофренией.

Модель с лигированием спинального нерва (SNL) (Kim SH и Chung JM (1992). Для определения эффектов терапевтических агентов на хроническую невропатическую боль можно использовать экспериментальную модель периферической невропатии, продуцированной сегментарным лигированием спинального нерва у крыс, Pain 50:355-63.). Животным проводят анестезию изофлураном, удаляют левый поперечный отросток L5 и туго перевязывают спинальные нервы L5 и L6 шелковой нитью 6-0. Затем закрывают рану при помощи внутренних швов и внешних скобок. Через 10-11 дней после операции удаляют с раны зажимы. Оценивают базисное значение, значения после повреждения и после лечения для механической чувствительности, не наносящей вреда, используя нити 8 Semmes-Weinstein (Stoelting, Wood Dale, EL, USA), варьируя жесткость (0,4, 0,7, 1,2, 2,0, 3,6, 5,5, 8,5, и 15 г) согласно способу вверх-вниз (Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung JM и Yaksh TL (1994). Количественная оценка тактильной аллодинии в крысиной лапе, J. Neurosci Methods 53:55-63.). Животных помещают на перфорированную металлическую платформу и дают привыкнуть к окружению в течение минимум 30 мин до исследования. Для каждого животного в каждой обработанной группе определяют среднее значение и стандартное отклонение от среднего (SEM). Так как данный стимул обычно не считается болезненным, существенные индуцированные повреждением увеличения реактивности в данном исследовании интерпретируют как меру механической аллодинии. Механическую гиперчувствительность поврежденной лапы определяют, сравнивая значения для противоположной лапы с ипсилатеральной лапой в группе, принимающей наполнитель. Данные анализируют, используя тест Mann-Whitney. Исследуют стабильность во времени значений для поврежденных лап в группе, принимающей наполнитель, применяя двухфакторный дисперсионный анализ по Фридману. Эффект лекарства анализируют в каждой временной точке, проводя однофакторный дисперсионный анализ по Крушкал-Валлису (Kruskal-Wallis) с последующим тестом по Дунну Dunn или отмеченным ранговым тестом по Манн-Витни.

При необходимости соединения формулы I и Ia можно также использовать в сочетании с терапией, включающей введение D-серина или его аналога, такого как соль D-серина, сложный эфир D-серина, алкилированный D-серин или предшественник D-серина. Соединения можно также использовать в сочетании с терапией, включающей введение антипсихотических средств (для лечения шизофрении и других психотических состояний), психостимуляторов (для лечения нарушения, связанного с дефицитом внимания, депрессии или нарушеннной обучаемости), антидепрессантов, ноотропов (например, пирацетама, оксирацетама или антирацетама), ингибиторов ацетилхолинэстеразы (например, соединений, родственных психостигмину, такрина или донепезила) и/или терапевтических средств для лечения болезни Альцгеймера (для лечения болезни Альцгеймера). Такие способы совместной терапии включены в данное изобретение.

Используемое здесь выражение "терапевтически эффективное количество» обозначает количество соединения, материала или композиции, содержащей соединение настоящего изобретения, которое эффективно для произведения желательного терапевтического эффекта посредством ингибирования DAAO, по меньшей мере, у подпопуляции клеток животного, блокируя тем самым биологические последствия этого пути в обработанных клетках, при разумном соотношении преимущество/риск, применимом к любому медицинскому лечению.

Выражение "фармацевтически приемлемая соль" касается соли, полученной из фармацевтически приемлемых нетоксических оснований, включающих неорганические основания и органические основания. Подходящие для соединений настоящего изобретения фармацевтически приемлемые аддитивные соли оснований включают соли металлов, полученные из алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка, или органические соли, полученные из лизина, N,N'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглумина (N-метилглюкамина) прокаина и трометамина.

Вообще, соединения настоящего изобретения являются коммерчески доступными или могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области. Кроме того, можно применять описанные ниже способы или их модификации, использующие легко доступные исходные материалы, реагенты и общеизвестные методики синтеза. При данных взаимодействиях можно также использовать варианты, которые сами по себе известны, но здесь не упоминаются.

В контексте настоящего изобретения предполагается, что алкил включает линейные, разветвленные или циклические углеводородные структуры и их комбинации, включая низший алкил и высший алкил. Предпочтительными алкильными группами являются группы C₂₀ или ниже. Низший алкил обозначает алкильные группы от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода и включает метил, этил, н-пропил, изопропил, и н-, втор- и трет-бутил. Высший алкил обозначает алкильные группы, имеющие семь или более атомов углерода, предпочтительно 7-20 атомов углерода, и включает н-, втор- и трет-гептил, октил и додецил. Циклоалкил обозначает подмножество алкилов и включает циклические углеводородные группы от 3 до 8 атомов углерода. Примеры циклоалкильных групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил и норборнил.

Арил и гетероарил обозначают 5- или 6-членный ароматический или гетероароматический цикл, содержащий 0-3 гетероатома, выбранных из атома азота, кислорода или серы; бициклическую 9- или 10-членную ароматическую или гетероароматическую циклическую систему, содержащую 0-3 гетероатома, выбранных из атома азота, кислорода или серы; или трициклическую 13- или 14-членную ароматическую или гетероароматическую циклическую систему, содержащую 0-3 гетероатома, выбранных из атома азота, кислорода или серы. Ароматические 6-14-членные карбоциклические циклы включают, например, бензол, нафталин, индан, тетралин и флуорен; и 5-10-членные ароматические гетероциклические циклы включают, например, имидазол, пиридин, индол, тиофен, бензопиранон, тиазол, фуран, бензимидазол, хинолин, изохинолин, хиноксалин, пиримидин, пиразин, теразол и пиразол.

Арилалкил обозначает алкильный остаток, присоединенный к арильному циклу. Примерами являются бензил и фенетил. Гетероарилалкил обозначает алкильный остаток, присоединенный к гетероарильному циклу. Примеры включают пиридинилметил и пиримидинилэтил. Алкиларил обозначает арильный остаток, имеющий одну или более присоединенных к нему алкильных групп. Примерами являются толил и мезитил.

Алкокси или алкоксил обозначает группы с 1-8 атомами углерода линейной, разветвленной, циклической конфигурации и их комбинации, присоединенные к исходной структуре через атом кислорода. Примеры включают метокси, этокси, пропокси, изопропокси, циклопропилокси и циклогексилокси. Низший алкокси обозначает группы, содержащие от одного до четырех атомов углерода.

Ацил обозначает группы с 1-8 атомами углерода линейной, разветвленной, циклической конфигурации, насыщенные, ненасыщенные и ароматические и их комбинации, присоединенные к исходной структуре через карбонильную функциональную группу. Один или более атомов углерода в ацильном остатке могут быть заменены атомами азота, кислорода или серы до тех пор, пока место присоединения к исходному соединению остается на карбониле. Примеры включают ацетил, бензоил, пропионил, изобутирил, трет-бутоксикарбонил и бензилоксикарбонил. Низший ацил обозначает группы, содержащие от одного до четырех атомов углерода.

Гетероцикл обозначает циклоалкильный или арильный остаток, в котором от одного до двух атомов углерода заменены гетероатомами, такими как атомы кислорода, азота или серы. Примеры гетероциклов, которые попадают в область изобретения, включают пирролидин, пиразол, пиррол, индол, хинолин, изохинолин, тетрагидроизохинолин, бензофуран, бензодиоксан, бензодиоксол (обычно называемый метилендиоксифенил, когда является заместителем), теразол, морфолин, тиазол, пиридин, пиридазин, пиримидин, тиофен, фуран, оксазол, оксазолин, изоксазол, диоксан и тетрагидрофуран.

«Замещенный» относится к остаткам, включая, но не ограничиваясь этим, алкил, алкиларил, арил, арилалкил и гетероарил, где до трех свободных атомов Н остатков замещены низшим алкилом, замещенным алкилом, замещенным алкинилом, галогеналкилом, алкокси, карбонилом, карбокси, карбоксалкокси, карбоксамидо, ацилокси, амидино, нитро, галогеном, гидрокси, OCH(COOH)₂, циано, первичным амино, вторичным амино, ациламино, алкилтио, сульфоксидом, сульфоном, фенилом, бензилом, фенокси, бензилокси, гетероарилом или гетероарилокси.

«Галогеналкил» обозначает алкильный остаток, где один или более атомов Н замещены атомами галогена; термин «галогеналкил» включает пергалогеналкил. Примеры галогеналкильной группы, которая попадает в область изобретения, включают CH ₂F, CHF₂ и CF₃.

В контексте настоящего изобретения соединения, которые, как полагают, обладают активностью ингибиторов DAAO, представляют собой соединения, демонстрирующие 50% ингибирование ферментативного цикла DAAO (IC₅₀) при концентрации примерно <100 мкМ, предпочтительно, примерно <10 мкМ и более предпочтительно примерно <1 мкМ.

Многие из описанных здесь соединений могут содержать один или более центров ассиметриии, таким образом, могут давать энантиомеры, диастереомеры и другие стереоизомерные формы, которые можно определить в терминах чистой стереохимии, как (R) или (S). Считают, что настоящее изобретение включает все такие возможные изомеры, а также их рацемические и оптически чистые формы. Оптически активные (R)- и (S)-изомеры можно получить, используя хиральные синтоны или хиральные реагенты, или разделить, используя общеизвестные методики. Если описанные здесь соединения содержат олефиновые двойные связи или другие центры геометрической асимметрии, и пока не определено иначе, полагают, что соединения включают оба геометрических изомера, E и Z. Более того, предполагают, что все таутомерные формы также включены.

Несмотря на то, что для соединений формулы I и Ia может быть вероятным введение в виде сырого химического вещества, предпочтительно представлять их в виде фармацевтической композиции. Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I и Ia или его фармацевтически приемлемую соль или сольват вместе с одним или несколькими фармацевтическими носителями и необязательно с одним или несколькими другими терапевтическими ингредиентами. Носитель(носители) может быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими ингредиентами препарата и не опасным для его реципиента.

Препараты включают препараты для перорального, парентерального (включая подкожное, интрадермальное, внутримышечное, внутривенное и внутрисуставное), ректального и локального (включая дермальное, буккальное, подъязычное и внутриглазное) введения. Наиболее подходящий способ может зависеть от состояния и нарушения реципиента. Для удобства препараты можно представить в виде единичной дозированной формы и можно получить любым способом, хорошо известным в области аптечного дела. Все способы включают стадию объединения соединения или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата ("активного ингредиента") с носителем, который составляет один или более вспомогательных ингредиентов. Вообще, препараты готовят посредством однородного и тесного объединения активного ингредиента с жидкими носителями, или мелко молотыми твердыми носителями, или обоими и затем, если необходимо, формования продукта в виде требуемого препарата. Пероральные препараты хорошо известны специалистам в данной области, и общие способы их получения имеются в любом стандартном учебнике по аптечному делу, например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A.R. Gennaro, ed. (1995), полное раскрытие которого включено здесь в виде ссылки.

Препараты настоящего изобретения, подходящие для перорального введения, можно представить в виде дискретных единиц, например капсул, облаток или таблеток, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии «масло в воде» или «вода в масле». Активный ингредиент можно также представить в виде болюса, электуария или пасты.

Таблетку можно получить прессованием или формованием, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки можно получить прессованием на подходящем оборудовании активного ингредиента в свободно текущем виде, например, в виде порошка или гранул, необязательно в смеси со связующим, лубрикантом, инертным разбавителем, смазывающим поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки можно получить формованием на подходящем оборудовании смеси порошкового соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут иметь оболочку или бороздку и могут быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечить длительное, замедленное или регулируемое высвобождение содержащегося в них активного ингредиента. Системы доставки лекарств для перорального и парентерального приема с длительным высвобождением хорошо известны специалистам в данной области, и общие способы осуществления длительного высвобождения перорально или парентерально вводимых лекарств обнаружены, например, в работе Remington: The Science and Practice of Pharmacy, pages 1660-1675 (1995).

Препараты для парентерального введения включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты и растворенные вещества, которые делают препарат изотоническим с кровью предполагаемого реципиента. Препараты для парентерального введения также включают водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Препараты можно представить в виде стандартных доз в многодозовых контейнерах, например закупоренных ампулах и пробирках, и можно хранить в высушенном замораживанием (лиофилизованном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например физиологического раствора, физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) или подобного непосредственно перед использованием. Приготовленные для немедленного использования растворы и суспензии для инъекций можно получить из стерильных порошков, гранул и таблеток описанного ранее вида. Препараты для ректального введения можно представить в виде суппозиториев с обычными носителями, такими как масло какао или полиэтиленгликоль. Препараты для локального применения во рту, например трансбуккального или подъязычного, включают лепешки, содержащие активный ингредиент во вкусовой основе, такой как сахароза и аравийская камедь или трагакант, и пастилки, содержащие активный ингредиент в такой основе как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь.

Фармацевтические композиции, содержащие соединения формулы I и Ia, обычно можно представить в виде единичной дозированной формы и приготовить любым способом, хорошо известным в области аптечного дела. Предпочтительными единичными дозированными препаратами являются препараты, содержащие эффективную дозу или ее подходящую фракцию активного ингредиента или его фармацевтически приемлемой соли. Величина профилактической или терапевтической дозы обычно варьируется в зависимости от природы и тяжести подлежащего лечению состояния и способа введения. Доза и, возможно, частота приема дозы также варьируются в соответствии с возрастом, массой тела и реакцией индивидуального пациента. Вообще, полные дневные дозы составляют примерно от 1 мг в день примерно до 7000 мг в день, предпочтительно примерно от 1 до 100 мг в день и более предпочтительно примерно от 25 до 50 мг в день в виде единой дозы или поделенных доз. В некоторых вариантах общая дневная доза может составлять примерно от 50 до 500 мг в день и предпочтительно, примерно от 100 до 500 мг в день. Кроме того, рекомендуется, чтобы дети, пациенты старше 65 лет и пациенты с ухудшенной почечной или печеночной функцией сначала принимали низкие дозы и затем титровали дозировку по индивидуальным реакциям и уровням в крови. В некоторых случаях может быть необходимо использовать дозировку за пределами этих диапазонов, что понятно специалистам в данной области. Кроме того, отмечено, что клиницист или лечащий врач знает, как и когда прервать, отрегулировать или закончить лечение в соответствии с индивидуальной реакцией пациента.

Следует понимать, что кроме ингредиентов, конкретно упоминаемых выше, препараты данного изобретения могут включать другие агенты, общеизвестные в области, относящейся к препарату рассматриваемого типа, например, препарат, подходящий для перорального введения, может включать вкусовые агенты.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Общая методика получения бензо[d]изоксазол-3-олов

Метиловый эфир 2-гидрокси-4-метилбензойной кислоты. В круглодонную колбу на 50 мл, снабженную мешалкой, в атмосфере сухого азота загружают 4-метилсалициловую кислоту (1,5 г, 10,0 ммоль, 1,0 экв.), затем сухой MeOH (15 мл). Реакционную смесь охлаждают до 0°C на бане со льдом и добавляют по капле чистый SOCl₂ (1,1 мл, 15,0 ммоль, 1,5 экв.). Реакционной смеси дают нагреться до комнатной температуры и затем перемешивают при кипении с обратным холодильником в течение 5 час. После этого избыток MeOH удаляют в вакууме, остаток растворяют в EtOAc и экстрагируют насыщенным NaHCO₃, органический слой сушат MgSO₄ и фильтруют. Удаление избытка растворителя из фильтрата в вакууме дает 1,20 г (72%) указанного в заголовке соединения в виде прозрачного масла. (¹H CDC1 ₃, 400 МГц): 10,71 (с, 1H), 7,70 (д, J=8,1 Гц, 1H), 6,75 (с, 1H), 6,69 (д, J=8,1 Гц, 1H), 3,93 (с, 3H), 2,34 (с, 3H).

2-N-Дигидрокси-4-метилбензамид. В круглодонную колбу на 250 мл, снабженную мешалкой, загружают гидроксиламиногидрохлорид (3,5 г, 50,0 ммоль, 25,0 экв.), а затем H₂O (35 мл) и водный раствор NaOH (3,0M/H₂O, 38 мл, 114 ммоль, 57,0 экв.). В отдельной колбе растворяют сырой метиловый эфир 2-гидрокси-4-метилбензойной кислоты (332 мг, 2,0 ммоль, 1,0 экв.) в диоксане и добавляют по капле к указанному выше раствору. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 час, охлаждают до 0°C на бане со льдом и нейтрализуют до pH 5 (бумажные индикаторы pH) концентрированной водной HC1 (10,0M/H ₂0). Реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры, добавляют EtOAc, сырой продукт распределяют в делительной воронке (3xEtOAc), органический слой сушат MgSO₄ и фильтруют. Удаление из фильтрата избытка растворителя в вакууме дает 331 мг (99%) указанного в заголовке соединения в виде грязно-белого твердого вещества. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,29 (с, 1H), 11,37 (с, 1H), 9,26 (с, 1H), 7,54 (д, J=8,0 Гц, 1H), 6,70 (с, 1H), 6,648 (д, J=8,1 Гц, 1H), 2,24 (с, 3H).

6-Метилбензо[d]изоксазол-3-ол. В круглодонную колбу на 50 мл, снабженную мешалкой, в атмосфере сухого азота загружают 2-N-дигидрокси-4-метилбензамид (331 мг, 2,0 ммоль, 1,0 экв.) и карбонилдиимидазол (1,0 г, 6,0 ммоль, 3,0 экв.), а затем сухой ТГФ (20 мл). Реакционную смесь перемешивают при кипении с обратным холодильником в течение 30 мин и затем добавляют чистый TEA (415 мкл, 3,0 ммоль, 1,5 экв.). Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником еще 20 час, охлаждают до комнатной температуры и избыток ТГФ удаляют в вакууме. Остаток растворяют в EtOAc, экстрагируют водным HCl (1,0M/H₂O), органический слой сушат MgSO₄), фильтруют и избыток растворителя удаляют из фильтрата в вакууме. Очистка сырого продукта методом флэш-хроматографии (силикагель, 0%->40% градиент 2% AcOH/EtOAc в гексане) дает 167 мг (56%) белого твердого вещества. ( ¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,19 (с, 1H), 7,59 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,34 (с, 1H), 7,12 (д, J=8,0 Гц, 1H), 2,07 (с, 3H); (¹³C ДМСО-d₆ , 100 МГц): 165,09, 163,59, 141,18, 124,588, 120,76, 112,08, 109,80, 21,33.

5-Метилбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного 2-N-дигидрокси-5-метилбензамида, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,19 (с, 1Н), 7,48 (с, 1H), 7,42-7,40 (м, 2H), 2,38 (с, 3H); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц) 165,01, 161,61, 132,22, 131,92, 120,38, 114,47, 109,64, 20,45.

5-Хлорбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного 2-N-дигидрокси-5-хлорбензамида, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,55 (с, 1H), 7,78, (с, 1H), 7,60 (м, 2H); (¹³ C ДМСО-d₆, 100 МГц) 164,67, 161,65, 130,66, 127,17, 120,63, 115,90, 111,88.

5-Метоксибензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного метилового эфира 2-гидрокси-5-метоксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,21 (с, 1H), 7,45 (д, J=9,0 Гц, 1H), 7,18 (дд, J=9,5 Гц, J'=11,5 Гц, 1H), 7,14 (д, J'=11,5 Гц), 3,80 (д, J'=11,5 Гц, 3H); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 165,23, 158,26, 155,44, 120,50, 114,51, 110,90, 101,60, 55,67.

5-Гидроксибензо[d]изоксазол-3-ол . Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного метилового эфира 2,5-дигидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,03 (с, 1H), 9,55 (с, 1H), 7,34 (д, J=9,0 Гц, 1H) 7,02 (дд, J=9,4 Гц, J'=2,4 Гц, 1H), 6,94 (д, J=2,4 Гц, 1H); ( ¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц) 164,97, 157,41, 153,22, 120,14, 114,74, 110,52, 103,89.

6-Гидроксибензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного метилового эфира 2,4-дигидроксибензойной кислоты, как описано выше. ( ¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,00 (с, 1H), 10,29 (с, 1H), 7,49 (д, J=9,1 Гц, 1H), 6,75-6,73 (м, 2H); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц) 165,17, 164,91, 160,57, 121,90, 113,13, 106,52, 95,10.

5-Бромбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступной 5-бром-2-гидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,55 (с, 1H), 7,93 (д, J=1,8 Гц, 1H), 7,73 (дд, J=1,8 Гц, J'=8,9 Гц), 7,56 (д, J'=8,8 Гц); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 164,48, 161,98, 133,26, 123,70, 116,52, 114,76, 112,29.

7-Метоксибензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного метилового эфира 2-гидрокси-3-метоксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,29 (с, 1H), 7,26-7,13 (м, 3H), 3,92 (с, 3H); ( ¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 165,48, 153,07, 143,98, 124,17, 115,95, 112,41, 111,57, 55,97.

4-Гидроксибензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного метилового эфира 2,6-дигидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 11,90 (с, 1H), 10,49 (с, 1H), 7,30 (т, J=8,0 Гц, J'=8,2 Гц, 1H), 6,85 (д, J'=8,3 Гц, 1H), 6,55 (д, J=7,9 Гц, 1H); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 165,24, 164,89, 153,41, 132,00, 107,55, 103,44, 100,24.

6-Фторбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного метилового эфира 4-фтор-2-гидроксибензойной кислоты, как описано выше. ( ¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,47 (с, 1H), 7,77 (дд, ⁴J(H,F)=5,4 Гц, J=8,7 Гц, 1H), 7,53 (дд, J'=1,7 Гц, ³J(H,F)=10,0 Гц, 1H), 7,19 (дт, J'=1,4 Гц, ³J(H,F)=9,5 Гц, J=9,0 Гц, 1H); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 165,02, 163,65 (д, ³J(C,F)=14 Гц), 163,33 (д, ¹J(C,F)=247 Гц), 122,90 (д, ³J(C,F)=11 Гц), 111,97 (д, ²J(C,F)=26 Гц), 111,27, 97,70 (д, ²J(C,F)=27 Гц).

4-Фторбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного метилового эфира 6-фтор-2-гидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,69 (с, 1H), 7,60 (дт, ⁴J(H,F)=5,4 Гц, J=8,2 Гц, J'=8,2 Гц, 1H), 7,40 (д, J=8,5 Гц, 1H), 7,19 (т, ³J(H,F)=9,7 Гц, J=8,1 Гц, 1H); (¹³C ДМСО-d ₆, 100 МГц): 165,15, 163,45, 155,13 (д, ¹J(C,F)=254 Гц), 132,50 (д, ³J(C,F)=18 Гц), 108,55 (д, ² J(C,F)=18 Гц), 106,74, 106,78.

6-Метоксибензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступного метилового эфира 2-гидрокси-4-метоксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,14 (с, 1H), 7,56 (д, J=8,6 Гц, 1H), 7,09 (д, J'=1,9 Гц, 1H), 6,87 (дд, J=8,7 Гц, J'=1,9 Гц, 1H), 3,82 (с, 3H); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 165,08, 164,99, 162,23, 121,68, 113,21, 107,43, 93,34, 55,79.

4-Метоксибензо[d]изоксазол-3-ол . Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступной 2-гидрокси-6-метоксибензойной кислоты, как описано выше. ( ¹H CD₃OD, 400 МГц): 7,52 (т, J=J'=8,2 Гц, 1H), 7,01 (д, J=8,4 Гц, 1H), 6,74 (д, J'=8,0 Гц, 1H), 3,95 (с, 3H); (¹³C CD ₃OD, 100 МГц): 165,83, 165,37, 155,89, 132,83, 104,28, 103,26, 102,25, 55,12.

5-Фторбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступной 5-фтор-2-гидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,48 (с, 1Н), 7,61 (дд, ⁴J(H,F)=5,3 Гц, J=9,0 Гц, 1Н), 7,53 (дд, J'=2,2 Гц, ³J(H,F)=7,7 Гц, 1Н), 7,49 (дт J'=2,2 Гц, ³J(H,F)=9,0 Гц, J=9,0 Гц, 1H); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 165,31, 159,62, 158,02 (д, ¹J(C₅ F)=238 Гц), 119,00 (д, ²J(C,F)=27 Гц), 111,61 (д, ³J(C,F)=9 Гц), 106,47, 106,22.

6-Бромбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из 6-бром-2-гидроксибензойной кислоты (J. Med. Chem. (1992), 35, 739), как описано выше. (¹H CD₃ OD, 400 МГц): 7,71 (с, 1Н), 7,61 (д, J=8,3 Гц, 1Н), 7,45 (д, J=8,3 Гц, 1H); (¹³C CD₃OD, 100 МГц) 166,77, 165,43, 127,79, 126,08 123,62, 115,27, 114,56.

7-Фторбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступной 3-фтор-2-гидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,73 (с, 1H), 7,57 (д, J=7,9 Гц, 1Н), 7,53 (дд, ³J(H,F)=11,3 Гц, J=8,0 Гц, 1H), 7,31 (дт, ⁴J(H,F)=4,0 Гц, J=7,9 Гц, J'=7,9 Гц, 1H); (¹³C CD₃ OD, 100 МГц): 167,05 (д, ⁴J(C,F)=3 Гц), 152,49 (д, ² J(C,F)=14 Гц), 147,88 (д, ¹J(C,F)=249 Гц), 125,22 (д, ³J(C,F)=5 Гц), 119,92 (д, ⁴J(C,F)=3 Гц), 118,13 (д, ³J(C,F)=5 Гц), 117,11 (д, ² J(C,F)=14 Гц).

7-Хлорбензо[d]изоксазол-3-ол . Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступной 3-хлор-2-гидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹ H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,74 (с, 1H), 7,74, (с, 1H), 7,72 (с, 1H), 7,33 (т, J=J'=7,8 Гц, 1H); (¹³C CD₃OD, 100 МГц): 167,18, 160,58, 131,51, 125,37, 121,18, 117,87, 116,71.

7-Гидроксибензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступной 2,3-дигидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,17 (с, 1H), 10,37 (с, 1H), 7,11 (дд, J=8,0 Гц, J'=1,7 Гц, 1Н), 7,07 (т, J=J'=7,7 Гц, 1H), 6,93 (дд, J=8,0 Гц, J'=1,7 Гц, 1H); (¹³C CD₃OD, 100 МГц): 167,29, 154,69, 143,12, 125,26, 117,58, 116,69, 112,51.

5-Йодбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают из коммерчески доступной 5-йод-2-гидроксибензойной кислоты, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,48 (с, 1H), 8,08 (с, 1H), 7,85 (д, J=8,8 Гц, 1Н), 7,42 (д, J=8,7 Гц, 1Н); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 164,11, 162,43, 138,62, 129,68, 117,15, 112,49, 86,28.

ПРИМЕР 2: общая методика бромирования бензо[d]изоксазол-3-олов

5-Бром-6-метилбензо[d]изоксазол-3-ол . В пробирку высокого давления на 25 мл, снабженную мешалкой и завинчивающейся тефлоновой крышкой, загружают 6-метилбензо[d]изоксазол-3-ол (745 мг, 5,0 ммоль, 1,0 экв.) и ледяную уксусную кислоту (5,0 мл). Добавляют по капле чистый Br₂ (774 мкл, 15,0 ммоль, 3,0 экв.). После перемешивания при 80°C в течение 20 час реакционной смеси дают медленно охладиться до комнатной температуры. Полученный осадок собирают фильтрованием и быстро промывают ледяной уксусной кислотой 3 x 1,0 мл. Кристаллизация данного сырого продукта (624 мг) из 50 мл MeCN дает 567 мг указанного в заголовке соединения (чистота 96%, определенная методом ОФ-ВЭЖХ). Дополнительная кристаллизация из 70 мл толуола дает 519 мг (46%) белого твердого вещества (чистота 98,1%, определенная методом ВЭЖХ). (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,45 (с, 1H), 7,94 (с, 1H), 7,61 (с, 1H), 2,45 (с, 3H); (¹³C CD₃OD, 100 МГц): 165,96, 164,50, 142,34, 125,39, 119,73, 115,78, 112,67, 24,10.

5,6-Дибромбензо[d]изоксазол-3-ол . Указанное в заголовке соединение получают бромированием, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,72 (с, 1H), 8,15 (с, 1H), 8,12 (с, 1H); (¹³ C CD₃OD, 100 МГц): 165,90, 164,04, 117,33, 116,46, 128,08, 126,48, 119,30.

5-Бром-6-хлорбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают бромированием, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,71 (с, 1H), 8,13 (с, 1H), 8,03 (с, 1H); (¹³ C CD₃OD, 100 МГц): 165,83, 164,03, 137,92, 126,71, 117,19, 116,71, 113,14.

ПРИМЕР 3: общая методика хлорирования бензо[d]изоксазол-3-олов

5-Хлор-6-метилбензо[d]изоксазол-3-ол . В круглодонную колбу на 25 мл, снабженную мешалкой, загружают 6-метилбензо[d]изоксазол-3-ол (298 мг, 2,0 ммоль, 1,0 экв.) и TFA (2,0 мл) и охлаждают до 0°C на бане со льдом. Добавляют по капле чистый N-хлорморфолин (242 мкл, 2,0 ммоль, 1,0 экв., Organic. Syntheses, CV 8, 167) и реакционной смеси дают нагреться до комнатной температуры за 30 мин. Добавляют EtOAc, сырой продукт распределяют в делительной воронке (EtOAc/1,0M водная HCl), органический слой сушат MgSO₄ и удаляют из фильтрата избыток растворителя в вакууме. Кристаллизация сырого продукта (383 мг) из смеси 20 мл толуола и 6 мл EtOAc дает 206 мг (чистота 94%, определенная методом ВЭЖХ) белого твердого вещества. (¹H ДМСО-d ₆, 400 МГц): 12,41 (с, 1H), 7,77 (с, 1H), 7,59 (с, 1H), 2,43 (с, 3H); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 164,46, 161,87, 138,53, 128,08, 120,59, 113,78, 111,83, 20,49.

5,6-Дихлорбензо[d]изоксазол-3-ол . Указанное в заголовке соединение получают хлорированием, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,73 (с, 1H), 8,03 (с, 1H), 8,01 (с, 1H); (¹³ C ДМСО-d₆, 100 МГц): 164,46, 161,39, 133,60, 125,82, 122,27, 114,85, 112,40.

5-Хлор-6-бромбензо[d]изоксазол-3-ол. Указанное в заголовке соединение получают хлорированием, как описано выше. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,74 (с, 1H), 8,16 (с, 1H), 7,99 (с, 1H); (¹³ C CD₃OD, 100 МГц): 166,11, 163,47, 130,04, 126,00, 122,95, 116,87, 116,53.

ПРИМЕР 4: общая методика йодирования бензо[d]изоксазол-3-олов

5-Йод-6-метилбензо[d]изоксазол-3-ол. В пробирку высокого давления на 25 мл, снабженную мешалкой и завинчивающейся тефлоновой крышкой, загружают твердый ICl (648 мг, 4,0 ммоль, 2,0 экв.) и AcOH (6,0 мл). Добавляют одной порцией твердый 6-метилбензо[d]изоксазол-3-ол (298 мг, 2,0 ммоль, 1,0 экв.), затем воду (15 мл). Гетерогенную реакционную смесь перемешивают при 80°C в течение 64 час. Твердый осадок удаляют фильтрованием, добавляют к фильтрату EtOAc, сырой продукт распределяют в делительной воронке (EtOAc/1,0M водный HCl), органический слой сушат MgSO ₄ и удаляют из фильтрата избыток растворителя в вакууме. Двойная перекристаллизация объединенного осадка и сырого продукта после водной обработки (471 мг) из 15 мл и 10 мл толуола соответственно дает 106 мг (19%) (чистота 92%, определенная методом ВЭЖХ) белого твердого вещества. (¹H ДМСО-d₆, 400 МГц): 12,35 (с, 1H), 8,16 (с, 1H), 7,60 (с, 1H), 2,48 (с, перекрывается с ДМСО-d₆); (¹³C ДМСО-d₆, 100 МГц): 163,76, 163,37, 142,88, 130,47, 114,87, 110,72, 93,42, 28,204.

Пример 4: in vitro определение активности DAAO

Очищенная DAAO свиньи, добавленная к содержащей буфер смеси 50 мМ D-серина, продуцирует H₂ O₂ в стехиометрических количествах для каждой окисленной молекулы D-серина. Продуцирование H₂O₂ можно контролировать при помощи коммерчески доступного красного красителя Amplex Red, который в присутствии H₂O ₂ превращается в флуоресцентный продукт резоруфин. Для каждого описанного ингибитора также измеряют флуоресценцию во время добавления 80 мкМ H₂O₂ в отсутствие DAAO для контроля искусственного ингибирования конверсии красителя и определения количества продуцируемого H₂O₂ . В альтернативном исследовании активности DAAO очищенную DAAO свиньи добавляют к содержащей буфер смеси 1 мМ фенилглицина в присутствии соединений. Активность DAAO контролируют спектрофотометрически при ферментативной конверсии фенилглицина в бензоилмуравьиную кислоту по оптическому поглощению при 252 нм.

Проводят серийные разведения ингибиторов ферментативного цикла DAAO для снижения уровня ингибирования. Параметры нелинейного уравнения регулируют, подгоняя полученные серии уровней ингибирования для экстраполяции концентрации соединения до достижения 50% ингибирования (IC₅₀). Эти числа являются средними для количества (n) независимых измерений (в отдельные дни) ингибирования.

ТАБЛИЦА 1

Из таблицы 1 можно видеть, что величины IC₅₀ описанных ранее ингибиторов DAAO все составляют более 1 мкМ соединения для ингибирования более 50% активности DAAO. Производные бензизоксазола настоящего изобретения демонстрируют, по меньшей мере, данную высокую ингибирующую активность, и некоторые индивидуальные примеры являются активнее в 5 раз или более, требуя менее 200 нМ соединений для 50% ингибирования активности DAAO.

Пример 5: определение сродства к NMDA рецепторам

Для определения сродства описанных здесь соединений относительно сайта связывания D-серина на NMDA-рецепторе (также известного как "глициновый сайт" или "стрихнин-нечувствительный глициновый сайт") проводят исследование по связыванию радиолиганда с использованием мембран, полученных из коры головного мозга крыс. Радиоактивный лиганд представляет собой [3H]MDL105,519. Количество радиоактивности, демонстрируемое соединениями, оценивают при помощи сцинтилляционного подсчета. Неспецифическое связывание считают в присутствии 1 мМ глицина. Сродство рассчитывают из величин % ингибирования специфического связывания [3H]MDL105,519 исследуемыми соединениями.

Индол-2-карбоновая кислота ингибируют 77% специфического связывания радиомеченого соединения в исследовании при 100 мкМ, тогда как следующее соединение, типичный представитель замещенного бензо[d]изоксазол-3-ола, не показывает сродства (менее 10% ингибирования специфического связывания [3H]MDL-509,519) в исследовании при 100 мкМ для сайта связывания D-серина NMDA-рецептора:

Пример 6: определение поглощения головным мозгом крыс

В экспериментах, которые оценивают проникновение исследуемых соединений в головной мозг крыс, используют перфузионную систему, где левую сонную артерию канюлируют и отходящие артерии перевязывают. Исследуемое соединение плюс внутренние контроли перфузируют в течение 30 сек в левое полушарие в физиологическом растворе с фосфатным буфером с pH 7,4. Внутренними контролями являются атенолол (с низким поглощением головным мозгом) и антипирин (с высоким поглощением головным мозгом). Через 30 сек промывки перфузатом головной мозг удаляют хирургически. Левое полушарие гомогенизируют; исследуемые соединения (плюс внутренние контроли) экстрагируют из гомогената головного мозга и анализируют, используя ЖХ/МС/МС для определения концентрации исследуемого соединения и внутренних контролей в головном мозге. Поглощение выбранных соединений головным мозгом крыс, выраженное как пмоль/г головного мозга/сек ± SD для N = 4 крысы, показано в таблице 2.

ТАБЛИЦА 2
Соединение	Степень поглощения головным мозгом крыс, пмоль/г головного мозга/сек.
	199
	162

Пример 7: определение содержания D-серина в головном мозге

Определения D-серина в головном мозге млекопитающих показывают, что уровень эндогенного производства уравновешивается разложением D-серина. D-серин продуцируется из l-серина при действии серинрацемазы, тогда как d-серин подвергается метаболизу при действии DAAO. Экзогенно вводимый d-серин производит краткосрочные увеличения уровней d-серина головного мозга, благодаря действию DAAO. Таким образом, ингибиторы DAAO в несколько раз повышают уровни D-серина головного мозга, как показано в данном изобретении. Клиническая применимость экзогенно вводимого d-серина продемонстрирована на шизофрениках; смотри работу Coyle, Joseph J., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1003: 318-327 (2003) и патенты США № № 6227875; 6420351 и 6667297. Следовательно, определения уровней d-серина в головном мозге крыс полезны для оценки потенциального терапевтического действия ингибиторов DAAO на повышение уровней d-серина с целью лечения шизофрении.

In vivo повышение уровня D-серинавголовном мозге. Соединения суспендируют в физиологическом растворе с фосфатным буфером (pH 7,4 с 2% Tween80) и во время эксперимента вводят внутрибрюшинно взрослым самцам крыс Sprague Daly (40-60 дневного возраста, Charles River Laboratories, Inc.) массой 185-225 г. Через несколько часов крыс умерщвляют декапитацией и мозжечок быстро удаляют и замораживают до -80^оC для дальнейшего исследования. Остаток головного мозга также удаляют и замораживают. В день исследования ткань головного мозга гомогенизируют в 5-кратном объеме охлажденной на льду 5% трихлоруксусной кислоты. Гомогенат центрифугируют при 18000g в течение 30 мин. Осадки отбрасывают. Супернатант промывают 3 раза насыщенным водным диэтиловым эфиром, отбрасывая органический слой. После фильтрования водного слоя через фильтровальную мембрану с размером пор 0,45 мкм образцы готовы к преобразованию с использованием o-фталдиальдегида (OPA) и BOC L-Cys-OH согласно способам Хашимото (Hashimoto) и коллег (Hashimoto A, и др., J Chromatogr., 582(1-2):41-8 (1992)). Излагая кратко, 50 мг каждого дериватизационного агента растворяют в 5 мл метанола. Аликвоту в 200 мкл данного раствора добавляют к 100 мкл образца, растворенного в 700 мкл боратного буфера (0,4M, pH доводят до 9,0 при помощи гидроксида натрия). Уровни D-серина детектируют флуорометрически (длина волны возбуждения 344 нм, длина волны эмиссии 443 нм), вводя аликвоты по 10 мкл в систему для высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Типичные соединения из соединений данного патента продуцируют устойчивые и существенные повышения уровней D-серина в головном мозге крыс. В частности, производное бензо[d]изоксазол-3-ола, вводимое двумя отдельными дозами (125 мг/кг, а затем 75 мг/кг через 3 час) продуцирует 2-кратное увеличение уровней D-серина в мозжечке через 6 час после первой дозы.

Пример 8: дозированные формы

Дозированная форма в виде таблетки, не содержащей лактозы

В таблице 3 приведены ингредиенты для дозированной формы соединения формулы I и Ia в виде таблетки, не содержащей лактозы.

Таблица 3
Ингредиент	Количество на таблетку (мг)
5-Хлорбензо[d]изоксазол-3-ол	75
Микрокристаллическая целлюлоза	125
Тальк	5,0
Вода (на тысячу таблеток)	30,0 мл*
Стеарат магния	0,5
* Вода испаряется при получении

Активный ингредиент смешивают с целлюлозой до образования однородной смеси. Меньшее количество кукурузного крахмала смешивают с подходящим количеством воды, получая пасту. Затем ее перемешивают с однородной смесью до образования однородной влажной массы. Добавляют к полученной влажной массе оставшийся кукурузный крахмал и перемешивают до получения однородных гранул. Затем гранулы пропускают через подходящую мельницу, используя сито 1/4 дюйма из нержавеющей стали. Затем размолотые гранулы сушат в подходящей сушильной печи до получения требуемого содержания влаги. Высушенные гранулы далее размалывают на подходящей мельнице, используя сито 1/4 меш из нержавеющей стали. Затем подмешивают стеарат магния и из полученной смеси прессуют таблетки требуемой формы, плотности, твердости и разрушаемости. На таблетки наносят покрытие, применяя стандартные водные или неводные методики.

Дозированная форма в виде таблетки

Другой дозированный препарат в виде таблеток, подходящих для использования с активными ингредиентами данного изобретения, приведен в таблице 4.

Таблица 4
Ингредиент	Количество на таблетку (мг)
	Формула A	Формула B	Формула C
5-Хлорбензо[d]изоксазол-3-ол	20	40	100
Микрокристаллическая целлюлоза	134,5	114,5	309,0
Крахмал BP	30	30	60
Предварительно желатинированный кукурузный крахмал BP	15	15	30
Стеарат магния	0,5	0,5	1,0
Компрессионная масса	200	200	500

Активный ингредиент просеивают и смешивают с целлюлозой, крахмалом и предварительно желатинированным кукурузным крахмалом. Добавляют подходящие объемы очищенной воды и гранулируют порошки. После сушки гранулы просеивают и смешивают со стеаратом магния. Затем гранулы прессуют в таблетки, используя штампы.

Можно получить таблетки с другими эффективностями, изменяя соотношение активного ингредиента и фармацевтически приемлемого носителя, компрессионную силу или различные штампы.