композиции, содержащие липазу, протеазу и амилазу, предназначенные для лечения недостаточности поджелудочной железы

Формула изобретения

1. Композиция для лечения недостаточности поджелудочной железы, включающая микробную липазу, микробную протеазу и микробную амилазу, причем соотношение липазы, протеазы и амилазы в указанной композиции составляет примерно 1:1:0,15 единиц USP.

2. Композиция по п.1, где липаза присутствует в форме кристаллов сшитой липазы.

3. Композиция по п.2, где кристаллы липазы подвергнуты сшиванию мультифункциональным сшивающим агентом.

4. Композиция по п.3, где мультифункциональный сшивающий агент представляет собой бис(сульфосукцинимидил)суберат.

5. Композиция по п.1, где протеаза присутствует в форме кристаллов протеазы.

6. Композиция по п.1, где амилаза присутствует в форме аморфной амилазы.

7. Композиция по п.1, где микробная липаза представляет собой бактериальную липазу.

8. Композиция по п.7, где бактериальная липаза представляет собой липазу Pseudomonas.

9. Композиция по п.7, где бактериальная липаза представляет собой липазу Burkholderia.

10. Композиция по п.1, где микробная протеаза представляет собой грибковую протеазу.

11. Композиция по п.10, где грибковая протеаза представляет собой протеазу Aspergillus.

12. Композиция по п.11, где протеаза Aspergillus представляет собой протеазу Aspergillus melleus.

13. Композиция по п.1, где микробная амилаза представляет собой грибковую амилазу.

14. Композиция по п.13, где грибковая амилаза представляет собой амилазу Aspergillus.

15. Композиция по п.14, где амилаза Aspergillus представляет собой амилазу Aspergillus oryzae.

16. Композиция по п.1, где липаза выбрана из группы, состоящей из кристаллов сшитой липазы Pseudomonas и кристаллов сшитой липазы Burkholderia, где указанные кристаллы сшиты бис(сульфосукцинимидил) субератом.

17. Композиция по п.1, где липаза присутствует в форме кристаллов сшитой липазы, выбранных из группы, состоящей из кристаллов сшитой липазы Pseudomonas и кристаллов сшитой липазы Burkholderia, протеаза присутствует в форме кристаллов протеазы Aspergillus melleus, и амилаза присутствует в форме аморфной амилазы Aspergillus oryzae.

18. Композиция по п.1, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый наполнитель.

19. Композиция по п.1, где композиция представлена в форме дозированной лекарственной формы для перорального приема, выбранной из группы, состоящей из таблеток, капсул, взвесей, саше, суспензий и драже.

20. Применение композиции по п.1 для изготовления лекарственного средства для:

лечения нарушения всасывания у млекопитающих, включающего стадию введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции по п.1;

для лечения недостаточности поджелудочной железы у млекопитающего, включающего стадию введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции по п.1;

для увеличения коэффициента поглощения жира и коэффициента поглощения азота у млекопитающего, включающего стадию введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции по п.1; или

для увеличения поглощения углеводов у млекопитающего, включающего стадию введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции по п.1.

21. Применение по п.20, где коэффициент поглощения жира и коэффициент поглощения азота увеличиваются у указанного млекопитающего на одну и ту же величину.

22. Применение по п.20, где млекопитающее страдает кистозным фиброзом.

23. Применение по п.20, где терапевтически эффективное количество указанной композиции обеспечивает поступление в организм указанного млекопитающего примерно 25000 единиц USP липазы, примерно 25000 единиц USP протеазы и примерно 3750 единиц USP амилазы.

24. Применение по п.20, где терапевтически эффективное количество указанной композиции обеспечивает поступление в организм указанного млекопитающего примерно 100000 единиц USP липазы, примерно 100000 единиц USP протеазы и примерно 15000 единиц USP амилазы.

25. Применение по п.23 или 24, где композицию вводят указанному млекопитающему с каждым приемом пищи или закуской.

26. Применение по п.20, где терапевтически эффективное количество указанной композиции увеличивает коэффициент поглощения жира у указанного млекопитающего на величину от примерно 30% до примерно 35% по сравнению с исходным значением коэффициента поглощения жира у указанного млекопитающего, где указанное исходное значение меньше или равно 40%.

27. Применение по п.20, где терапевтически эффективное количество указанной композиции увеличивает коэффициент поглощения азота у указанного млекопитающего на величину от примерно 30% до примерно 35% по сравнению с исходным значением коэффициента поглощения азота у указанного млекопитающего, где указанное исходное значение меньше или равно 40%.

28. Применение по п.20, где терапевтически эффективное количество указанной композиции увеличивает коэффициент поглощения жира у указанного млекопитающего на величину от примерно 10% до примерно 25% по сравнению с исходным значением коэффициента поглощения жира у указанного млекопитающего, где указанное исходное значение превышает 40%, но меньше 85%.

29. Применение по п.20, где терапевтически эффективное количество указанной композиции увеличивает коэффициент поглощения азота у указанного млекопитающего на величину от примерно 10% до примерно 25% по сравнению с исходным значением коэффициента поглощения азота у указанного млекопитающего, где указанное исходное значение превышает 40%, но меньше 85%.

30. Применение по п.20, где терапевтически эффективное количество указанной композиции увеличивает поглощение углеводов у указанного млекопитающего на величину, равную или большую чем примерно 10%, по сравнению с исходным уровнем поглощения углеводов у указанного млекопитающего.

31. Применение по п.20, где терапевтически эффективное количество указанной композиции обеспечивает поступление в организм млекопитающего примерно от 25000 до 100000 единиц USP липазы, примерно от 25000 до 100000 единиц USP протеазы и примерно от 3750 до 15000 единиц USP амилазы.

Описание изобретения к патенту

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка согласно 35 USC § 119(e) претендует на приоритет предварительной заявки на патент Соединенных Штатов № 60/618764, поданной 14 октября 2004, содержание которой включено в настоящую заявку с помощью ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композициям, которые предназначены для лечения состояний, включающих недостаточность поджелудочной железы. Композиции по настоящему изобретению содержат липазу, протеазу и амилазу в определенных соотношениях, что обеспечивает благоприятные результаты у пациентов, как, например, у пациентов, которые страдают недостаточностью поджелудочной железы. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам применения таких композиций для лечения недостаточности поджелудочной железы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пищеварение представляет собой физиологический процесс, с помощью которого поступившая в организм пища расщепляется на легко всасываемые питательные компоненты. После проглатывания пища проходит через различные сегменты желудочно-кишечного тракта, и при этом осуществляется пищеварение, в первую очередь, под действием пищеварительных ферментов. Три группы пищеварительных ферментов, которые важны для этого процесса, включают липазы (для переваривания жира), протеазы (для переваривания белков) и амилазы (для переваривания углеводов).

Переваривание пищи и поглощение питательных компонентов осуществляется в тонком кишечнике. Там проглоченная пища расщепляется под действием пищеварительных ферментов для легкого всасывания. Большая часть пищеварительных ферментов секретируется поджелудочной железой и попадает в тонкую кишку через проток поджелудочной железы.

Поджелудочная железа вырабатывает большое количество экзокринных и эндокринных действующих веществ, требуемых для надлежащего пищеварения, питания и метаболизма. Экзокринная деятельность поджелудочной железы включает секрецию белков, которые действуют в качестве ферментов в тонкой кишке, катализируя гидролиз жира до глицерина и жирных кислот, белков до пептидов и аминокислот, и углеводов до декстринов, дисахаридов и моносахаридов, таких как глюкоза. Экзокринная недостаточность поджелудочной железы (называемая далее по тексту «недостаточностью поджелудочной железы») является результатом снижения функции поджелудочной железы и может быть вызвана целым рядом клинических расстройств. Например, недостаточность поджелудочной железы связана с кистозным фиброзом, хроническим панкреатитом, острым панкреатитом, раком поджелудочной железы и синдромом Швахмана-Даймонда [E.P.DiMagno et al., in The Pancreas: Biology, Pathobiology and Disease, 2d Ed., V.Liang et al., eds., pp. 665-701 (1993)].

У пациентов, страдающих недостаточностью поджелудочной железы, поджелудочной железе не удается выработать и/или секретировать достаточные количества пищеварительных ферментов для поддержания нормального процесса пищеварения, включая переваривание жиров, белков и углеводов. В результате эти пациенты страдают от нарушения поглощения питательных веществ. Клинические проявления недостаточности поджелудочной железы включают спастические боли в животе, вздутие живота, диарею, стеаторею, тошноту и потерю веса.

Недостаточность поджелудочной железы имеется у 89% пациентов, страдающих кистозным фиброзом [D.Borowitz et al., Use of Fecal Elastase-1 to Identify Misclassification of Functional Pancreatic Status in Patients with Cystic Fibrosis , J.Pediatr., 145, pp.322-326 (2004)]. Кистозный фиброз является аутосомным рецессивным генетическим расстройством, которое в первую очередь поражает желудочно-кишечную и дыхательную системы [S.M. Rowe et al., Mechanisms of Disease: Cystic Fibrosis , N. Engl. J. Med., 352, pp. 1992-2001 (1995)]. Аномальные количества и вязкость слизи, вырабатываемой у пациентов с кистозным фиброзом, препятствуют секреции достаточных количеств ферментов поджелудочной железы. Уменьшенный объем секреции поджелудочной железы ведет к сгущению в протоке поджелудочной железы, препятствуя выходу ферментов и бикарбоната в двенадцатиперстную кишку. В результате пациенты с кистозным фиброзом, у которых имеется недостаточность поджелудочной железы, страдают от ухудшения пищеварения и сталкиваются со значительным нарушением всасывания жиров и белков. Например, у таких пациентов, как правило, всасывается менее 60% поступающего с пищей жира [M. Kraisinger et al., Clinical Pharmacology of Pancreatic Enzymes in Patients with Cystic Fibrosis and in vitro Performance of Microencapsulated Formulations , J. Clin. Pharmacol., 34, pp. 158-166 (1994)]. Если не осуществлять лечение заболевания, нарушение пищеварения и всасывания у пациентов с кистозным фиброзом ведет к недостаточности питания, неспособности набирать или сохранять массу тела и уменьшению роста, а также к ухудшению течения хронических гнойных легочных заболеваний. [K. Gaskin et al., "Improved Respiratory Prognosis in CF Patients with Normal Fat Absorption", J. Pediatr., 100, pp. 857-862 (1982); J.M. Littlewood et al., "Control of Malabsorption in Cystic Fibrosis", Paediatr. Drugs, 2, pp. 205-222 (2000)].

В настоящее время стандартная терапия недостаточности поджелудочной железы основана прежде всего на пероральном введении свиной панкрелипазы, содержащей смесь липаз, трипсина, химотрипсина, эластазы и амилаз. Хотя добавки свиных панкреатических ферментов содержат значительные количества амилазы, сообщалось, что пациенты с кистозным фиброзом имеют нормальные уровни амилазы [P.L. Townes et al., Amylase Polymorphism: Studies of Sera and Duodenal Aspirates in Normal Individuals and in Cystic Fibrosis , Am. J. Hum. Genet., 28, pp. 378-389 (1976)]. Соответственно считается, что амилаза не играет роли в увеличении переваривания полисахаридов [E. Lebenthal et al., Enzyme Therapy for Pancreatic Insufficiency: Present Status and Future Needs , Pancreas, 9, pp. 1-12 (1994)]. Липазный, протеазный и амилазный компоненты добавок свиной поджелудочной железы, как правило, присутствуют в соотношении 1:3,5:3,5.

Добавки ферментов поджелудочной железы, как правило, вводят перорально с пищей. Поскольку эти добавки проходят через среду желудка с низким значением pH, их ферментная активность быстро уменьшается. В результате требуются значительные количества концентрата ферментов (иногда не менее 15 капсул или таблеток за один прием пищи), чтобы гарантировать наличие в проксимальной части кишечника достаточно активных ферментов для помощи при недостаточности поджелудочной железы.

Поскольку протеаза и липаза могут обратимо инактивироваться в кислой среде желудка, к продуктам панкрелипазы были применены технологии растворимых в кишечнике покрытий, с целью поместить ферменты в микрокапсулы или другим способом обработать их защитным кишечным покрытием. Хотя такие кишечные покрытия улучшали комплекс свойств продукта, для достижения благоприятного терапевтического результата по-прежнему требовались большие количества добавок [J.H. Meyer, in Pancreatic Enzymes in Health and Disease, P.G. Lankisch, ed., pp. 71-88 (1991)]. Была внедрена линия продуктов с высоким содержанием панкрелипазы (Ultrase^®) с целью уменьшения количества таблеток или капсул, необходимых для лечения недостаточности поджелудочной железы. Однако в 1991 году Cystic Fibrosis Foundation Соединенных Штатов совместно с FDA сообщили о многочисленных случаях фиброзирующей колонопатии у детей с кистозным фиброзом, принимавших такие продукты с высоким содержанием действующих веществ [S.C. Fitzsimmons et al., High-Dose Pancreatic-Enzyme Supplements and Fibrosing Colonopathy in Children with Cystic Fibrosis , N. Engl. J. Med., 336, pp.1283-1289 (1997)]. У этих пациентов структуры, вызванные фиброзом ободочной кишки, часто требовали хирургического вмешательства и в некоторых случаях колэктомии.

В качестве средства против уменьшения дневных доз ферментов поджелудочной железы, FDA удалила с рынка продукты с высоким содержанием действующего вещества (определенные как более чем 2500 USP единиц на 1 кг массы тела) [D.S. Borowitz et al., Use of Pancreatic Enzyme Supplements for Patients with Cystic Fibrosis in the Context of Fibrosing Colonopathy , J. Pediatr., 127, pp. 681-684 (1995)]. Кроме того, Cystic Fibrosis Foundation Соединенных Штатов совместно с FDA рекомендовали подробное исследование комплексной природы экстрактов свиных ферментов [см. там же]. Группа экспертов по согласованию также рекомендовала исследование альтернативных, устойчивых к действию кислот липаз.

Независимо от того, покрыта ли данная добавка, содержащая ферменты поджелудочной железы, кишечным покрытием или нет, биодоступность таких добавок меняется в широких пределах из-за различий в кислотности кишечника пациентов. В результате для улучшения клинической эффективности ферментных добавок многие пациенты употребляют изменяющие pH лекарственные средства, такие как блокаторы гистаминового-2 рецептора (H₂) и ингибиторы протонного насоса (PPI) [P.G. Lankish, "Enzyme Treatment of Exocrine Pancreatic Insufficiency in Chronic Pancreatitis', Digestion, 54 (Supp. 2), pp. 21-29 (1993); D.Y. Graham, "Pancreatic Enzyme Replacement: the Effect of Antacids or Cimetidine", Dig. Dis. Sci., 27, pp. 485-490 (1982); J.H. Saunders et al., "Inhibition of Gastric Secretion in Treatment of Pancreatic Insufficiency", Br. Med. J., 1, pp. 418-419 (1977); H.G. Heijerman et al., "Omeprazole Enhances the Efficacy of Pancreatin (Pancrease) in Cystic Fibrosis", Ann. Inter. Med., 114, pp. 200-201 (1991); M.J. Bruno et al., "Comparative Effects of Adjuvant Cimetidine and Omprazole during Pancreatic Enzyme Replacement Therapy", Dig. Dis. Sci., 39, pp. 988-992 (1994)].

Нестабильность с точки зрения эффективности и фармацевтических свойств, а также недостаточная устойчивость были выявлены в качестве важных факторов, вносящих вклад в слабую реакцию некоторых пациентов на традиционные добавки, содержащие ферменты поджелудочной железы [C.L. Chase et al., "Enzyme Content and Acid Stability of Enteric-Coated Pancreatic Enzyme Products in vitro", Pancreas, 30, pp. 180-183 (2005); D.S. Borowitz et al., J. Pediatr., 127, supra; C.J. Powell et al., "Colonic Toxicity from Pancreatins: a Contemporary Safety Issue", Lancet, 353, pp. 911-915 (1999); E. Lebenthal et al., "Enzyme Therapy for Pancreatic Insufficiency: Present Status and Future Needs", Pancreas, 9, pp. 1-12 (1994); P. Regan et al., "Comparative Effects of Antacids, Cimetidine and Enteric Coating on the Therapeutic Response to Oral Enzymes in Severe Pancreatic Insufficiency", N. Eng. J. Med., 297, pp. 854-858 (1977)]. Эти факторы включают изменения активности ферментов от партии к партии, чувствительность к потере активности через некоторое время при действии солнечного света, тепла или влаги, а также недостаточно определенный профиль нежелательных реакций [D.S. Borowitz et al., J.Pediatr., 127, выше]. Другие факторы, которые усугубляют неэффективность терапии поджелудочной железы, включают разрушение замещающих ферментов желудочным соком и/или имеющимися в просвете кишечника протеазами, асинхронное удаление из желудка ферментных добавок и мясной пищи, а также задержка высвобождения ферментов из препаратов с кишечным покрытием [P.G.Lankish, Digestion, 54 см. выше; P.Regan et al., N. Eng. J. Med., 297, см. выше].

Из-за проблем с эффективностью, стабильностью и биодоступностью, которыми характеризуются стандартные добавки, содержащие панкреатические ферменты, в качестве альтернатив ферментам, полученным из свиней, было предложено применение ферментов, вырабатываемых микроорганизмами. Например, в патенте США № 6051220 описаны композиции, включающие одну или несколько устойчивых к кислотам липаз и одну или несколько устойчивых к кислотам амилаз, причем оба типа ферментов предпочтительно грибкового происхождения. В заявке на патент США 2004/0057944 описаны композиции, включающие липазу Rhizopus delemar, протеазу Aspergillus melleus и амилазу Aspergillus oryzae. В заявке на патент США 2001/0046493 описаны композиции, включающие сшитые кристаллические бактериальные липазы, совместно с грибковыми или растительными протеазами и грибковыми или бактериальными амилазами.

Несмотря на такие разработки, по-прежнему сохраняется потребность в оптимизации лекарственных составов для дальнейшего улучшения как эффективности добавок с ферментами поджелудочной железы, так и соответствия препаратов различным пациентам. Цель получения добавок с ферментами поджелудочной железы, проявляющих максимальную эффективность при наименьших дозировках и отличающихся хорошо известным профилем безопасности, остается очень важной для всех пациентов, страдающих недостаточностью поджелудочной железы, включая пациентов, которые входят в сообщество людей с кистозным фиброзом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на композиции и способы, предназначенные для лечения состояний, включающих недостаточность поджелудочной железы. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, композиции по настоящему изобретению характеризуются кристаллами сшитой микробной липазы, микробной протеазой и микробной амилазой в соотношении примерно 1,0:1,0:0,15 единиц ферментной активности USP. Преимущественно эти композиции характеризуются стабильными ферментными компонентами, что, в свою очередь, гарантирует in vivo высвобождение действующего фермента в желудочно-кишечный тракт и тем самым допускает эффективные режимы лечения недостаточности поджелудочной железы с низкими дозировками.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

На фиг.1 показано изменение среднего коэффициента поглощения жира ( CFA ) по сравнению с исходным уровнем у пациентов, которым вводят композиции по настоящему изобретению во время фазы 2 исследования.

На фиг.2 показано изменение среднего коэффициента поглощения азота ( CNA ) по сравнению с исходным уровнем у пациентов, которым вводят различные композиции по настоящему изобретению во время фазы 2 исследования.

На фиг.3 показана корреляция между коэффициентом поглощения жира ( CFA ) и коэффициентом поглощения азота ( CNA ) в начальный период у пациентов, которым вводят композиции по настоящему изобретению во время фазы 2 исследования.

На фиг.4 показана корреляция между коэффициентом поглощения жиров ( CFA ) и коэффициентом поглощения азота ( CNA ) в период введения препаратов у пациентов, которым вводят композиции по настоящему изобретению во время фазы 2 исследования.

На фиг.5 показана корреляция между разностями коэффициента поглощения жиров ( CFA ) и коэффициента поглощения азота ( CNA ) во время введения препаратов и во время начального периода у пациентов, которым вводят композиции по настоящему изобретению во время фазы 2 исследования.

На фиг.6 показано изменение среднего коэффициента поглощения жиров ( CFA ) по сравнению с исходным уровнем у пациентов с кистозным фиброзом, которым вводят различные дозы композиций по настоящему изобретению во время фазы 1 исследования.

На фиг.7 показано изменение среднего коэффициента поглощения азота ( CNA ) по сравнению с исходным уровнем у пациентов, которым вводят различные дозы композиций по настоящему изобретению во время фазы 1 исследования.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к открытию, согласно которому композиции, включающие липазу, протеазу и амилазу в соотношении примерно 1,0:1,0:0,15 единиц ферментной активности USP, являются эффективными для лечения состояний, включающих недостаточность поджелудочной железы. Это уникальное соотношение между липазой, протеазой и амилазой делает возможным лечение таких состояний при терапевтических режимах с низкими дозировками, которые невозможны при применении стандартных добавок со свиными панкреатическими ферментами. Кроме того, данное соотношение между липазой, протеазой и амилазой позволяет избежать высокой концентрации протеазы, которая, как полагают, несет ответственность за фиброзирующую колонопатию при применении стандартных ферментных добавок [D.S. Borowitz et al., J. Pediatr., 127, см. выше].

Согласно предпочтительному варианту осуществления композиции по настоящему изобретению включают кристаллы сшитой микробной липазы, микробную протеазу и микробную амилазу в соотношении примерно 1,0:1,0:0,15 единиц ферментной активности USP.

Определения

Следует понимать, что определенные ниже термины имеют следующие значения, если не указано иное:

Термин «аморфный» относится к любому состоянию, отличному от кристаллического или полукристаллического состояния. Аморфные вещества включают аморфные твердые вещества и жидкости.

Термин «кристалл» или «кристаллический» относится к одной из форм вещества в твердом состоянии, которая содержит атомы, расположенные в виде периодически повторяющейся в трех измерениях структуры [см., например, Barrett, Structure of Methals, 2^nd ed., (1952)]. Кристаллы или кристаллическая форма фермента отличаются от его аморфных или полукристаллических форм. Кристаллы демонстрируют характерные черты, включая структуру пространственной решетки, характерные формы и оптические свойства, такие как, например, показатель преломления.

Термин «полукристаллический» относится к веществу в твердом состоянии, имеющему как кристаллические, так и аморфные области.

Термин «субъект», «пациент» или «индивидуум» относится к любому млекопитающему, включая любое классифицированное животное само по себе, в т.ч. людей и других приматов.

Термин «нарушение пищеварения» относится к ухудшению расщепления компонентов пищи (таких как жиры, белки и углеводы) до их составных частей, которые могут всасываться в пищеварительном тракте (моно-, ди- или олигосахаридов, аминокислот, олигопептидов, жирных кислот и моноглицеридов). Нарушение пищеварения может быть следствием нескольких состояний, включая недостаточность поджелудочной железы.

Термин «нарушение всасывания» относится к ухудшению всасывания переваренных компонентов пищи, в том числе витаминов и микроэлементов из тонкого кишечника или толстой кишки. Нарушение всасывания может являться следствием нарушения поглощения в слизистых оболочках выстилающих кишечник тканей или отдельных аномалий пищеварения. Нарушение всасывания в кишечнике может наблюдаться для многих компонентов пищи или для конкретных макрокомпонентов, а именно жиров, белков или углеводов, а также для микрокомпонентов, таких как кальций, магний, железо и витамины. Нарушение всасывания может являться следствием нескольких состояний, включая недостаточность поджелудочной железы. Нарушение всасывания белков называют «азотореей». Нарушение всасывания жиров называют «стеатореей».

Термин «липаза» относится к ферменту, который катализирует гидролиз (т.е. разделение гидроксильных групп и атомов водорода соединений на фрагменты за счет присоединения воды) липидов до глицерина и простых жирных кислот. Катализируемая ферментом реакция, как правило, требует присутствия ионов кальция (Ca²⁺). Секретируемые поджелудочной железой липазы исключительно важны для переваривания жиров (триглицеридов) в верхней петле тонкого кишечника. Согласно предпочтительному варианту осуществления липазы, применимые в композициях и способах по настоящему изобретению, не являются липазами, вырабатываемыми поджелудочной железой, т.е. они не выделены из ткани поджелудочной железы человека или животных. Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения применяемые липазы являются микробными липазами. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения применяемые липазы являются бактериальными липазами. Бактериальные липазы включают, например, липазу Pseudomonas и/или липазу Burkholderia.

Микробные липазы могут быть выделены из природных микробиологических источников или они могут представлять собой рекомбинантные микробные липазы, получаемые по технологии рекомбинантной ДНК с применением подходящей клетки-хозяина, выбранной из клеток-хозяев любых бактерий, дрожжей, грибков, растений, насекомых или млекопитающих, предпочтительно бактерий в культуре. Рекомбинантные липазы охватывают или закодированы нуклеиновыми кислотами из природной последовательности липаз. Далее, рекомбинантные липазы включают аминокислотную последовательность, которая гомологична или в основном идентична природной последовательности, а также липазы, закодированные нуклеиновыми кислотами, которые гомологичны или в основном идентичны природным нуклеиновым кислотам, кодирующим липазы. С другой стороны, липазы, применимые в композициях и способах по настоящему изобретению, могут быть синтезированы по стандартным методикам синтеза пептидов.

Термин «протеаза» относится к протеиназе, протеолитическому ферменту или пептидазе, которая представляет собой фермент, катализирующий расщепление внутренних амидных пептидных связей в белке. Конкретно, протеазы катализируют превращение белков в составляющие их аминокислоты путем расщепления амидных связей между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой. Протеазы, как правило, идентифицируют по их каталитическому типу, например пептидазы аспарагиновой кислоты, цистеин (тиол) пептидазы, металлопептидазы, серин пептидазы, треонин пептидазы, щелочные или полущелочные протеазы, нейтральные, а также пептидазы с неизвестным механизмом катализа (см. http://merops.sanger.ac.uk). Согласно предпочтительному варианту осуществления протеазы, применяемые в композициях и способах по настоящему изобретению, не являются протеазами, вырабатываемыми поджелудочной железой, т.е. их не выделяют из ткани поджелудочной железы человека или млекопитающих. Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения протеазы представляют собой микробные протеазы. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения протеазы представляют собой грибковые протеазы. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения протеаза представляет собой протеазу Aspergillus melleus.

Микробные протеазы могут быть выделены из природных микробиологических источников, или они могут представлять собой рекомбинантные микробные протеазы, получаемые по технологии рекомбинантной ДНК с применением подходящей клетки-хозяина, выбранной из любых клеток-хозяев бактерий, дрожжей, грибков, растений, насекомых или млекопитающих, предпочтительно грибков, в культуре. Рекомбинантные протеазы охватывают или закодированы нуклеиновыми кислотами из природной последовательности протеаз. Далее, рекомбинантные протеазы включают аминокислотную последовательность, которая гомологична или в основном идентична природной последовательности, а также протеазы, закодированные нуклеиновыми кислотами, которые гомологичны или в основном идентичны природным нуклеиновым кислотам, кодирующим протеазы. С другой стороны, протеазы, применимые в композициях и способах по настоящему изобретению, могут быть синтезированы по стандартным методикам синтеза пептидов.

Термин «амилаза» относится к ферменту, который вырабатывается в поджелудочной железе, а также в слюнных железах у людей, но не у всех млекопитающих. Амилаза человеческой слюны известна как птиалин. Амилаза является основным пищеварительным ферментом, ответственным за переваривание углеводов, например полисахаридов, в тонком кишечнике, путем превращения двух компонентов крахмала (амилозы и амилопектина) в простые сахара. Более конкретно, амилаза гидролизует крахмал, гликоген и декстрин с образованием глюкозы, мальтозы и предельных декстринов. Клинически уровни амилазы в крови часто повышены при состоянии острого и иногда хронического панкреатита. Термин «амилазы, не вырабатываемые поджелудочной железой» относится к амилазам, которые не выделены из ткани поджелудочной железы человека или животных. Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, амилазы являются микробными амилазами. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения амилаза представляет собой грибковую амилазу. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения амилаза представляет собой амилазу Aspergillus и предпочтительно амилазу Aspergillus oryzae.

Микробные амилазы могут быть выделены из природных микробиологических источников или они могут представлять собой рекомбинантные микробные амилазы, получаемые по технологии рекомбинантной ДНК с применением подходящей клетки-хозяина, выбранной из любых клеток-хозяев бактерий, дрожжей, грибков, растений, насекомых или млекопитающих, предпочтительно грибков, в культуре. Рекомбинантные амилазы охватывают или закодированы нуклеиновыми кислотами из природной последовательности амилаз. Далее, рекомбинантные амилазы включают аминокислотную последовательность, которая гомологична или в основном идентична природной последовательности, а также амилазы, закодированные нуклеиновыми кислотами, которые гомологичны или в основном идентичны природным нуклеиновым кислотам, кодирующим амилазы. С другой стороны, амилазы, применимые в композициях и способах по настоящему изобретению, могут быть синтезированы по стандартным методикам синтеза пептидов.

Термины «терапевтически эффективная доза» или «терапевтически эффективное количество» относятся к такому количеству композиции, которое приводит к предотвращению, отсрочке появления симптомов или облегчению тяжести симптомов состояния, которое будет подвергаться лечению. Терапевтически эффективное количество является таким количеством, которого достаточно для лечения, профилактики, уменьшения тяжести, отсрочки наступления или уменьшения частоты проявления одного или нескольких симптомов состояния, которое будет подвергаться лечению. Состояния, которые могут подвергаться лечению с применением композиций по настоящему изобретению, включают, например, недостаточность поджелудочной железы, нарушение всасывания и нарушение пищеварения.

Термин «единица USP» относится к единице ферментной активности фармакопеи Соединенных Штатов, имеющейся в средстве или композиции. Одна единица USP липазы, протеазы или амилазы определена в Pancrelipase, USP, U.S. Pharmacopeia National Formulary, USP 24, pp. 1254-1255 (2000). В этом источнике раскрыты способы анализа липазы, протеазы и амилазы, причем они включены в настоящую заявку с помощью ссылки.

Характеристики композиций настоящего изобретения

Преимущественно, композиции согласно настоящему изобретению улучшают всасывание жира, белка и крахмала у пациентов, страдающих такими состояниями, как, например, недостаточность поджелудочной железы, что ведет к улучшению снабжения питательными веществами и роста. Композиции сохраняют высокие уровни специфической активности в кислотно-пепсиновой среде. Это происходит потому, что их ферментные компоненты противостоят кислой среде верхней части желудочно-кишечного тракта, в т.ч. низким значениям pH желудка и высоким уровням протеазы в желудочно-кишечном тракте, что дает ферментам возможность достичь кишечника в активной форме. В результате композиции можно вводить в меньших количествах за одну дозировку и с помощью меньшего количества приемов по сравнению с добавками, содержащими свиные панкреатические ферменты. Это, в свою очередь, обеспечивает лучшее согласие пациентов с условиями лечения.

Кроме того, композиции по настоящему изобретению можно вводить субъектам без необходимости применения кишечного покрытия или добавления средств, подавляющих действие кислоты. Это происходит потому, что полученные из микроорганизмов ферментные компоненты, применяемые в различных вариантах осуществления композиций по настоящему изобретению, более устойчивы к действию кислоты в желудке, чем свиные панкреатические ферменты.

Липазный компонент

Липазный компонент композиций по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой микробную липазу. Более предпочтительно, применяется бактериальная липаза, а не липаза грибкового или растительного происхождения.

Предпочтительно липаза является такой липазой, которая стабильна в среде с кислотным значением pH и/или которая устойчива к протеолитическому разрушению. Кроме того, липаза может применяться в форме, которая увеличивает устойчивость к кислотному pH и/или устойчивость к протеолитическому разрушению. В этом случае липаза предпочтительно применяется в форме сшитых кристаллов. Любая из описанных выше липаз может применяться для образования сшитого кристаллического липазного компонента композиций по настоящему изобретению.

Кристаллизация липазы

Кристаллы липазы, применимые в композициях по настоящему изобретению, могут быть выращены с применением стандартных способов, таких как кристаллизация в замкнутом объеме. См., например, патент США 6541606. С другой стороны, кристаллы липазы могут быть выращены регулируемым осаждением белка из водного раствора или водного раствора, содержащего органические растворители. См., например, патент США 5618710 и заявку на патент США 2003/0017144. Специалист в данной области техники поймет, что условия, которыми необходимо управлять во время кристаллизации, включают, например, скорость испарения растворителя, присутствие подходящих дополнительных растворителей и буферных растворов, pH и температуру.

Кристаллы липазы могут быть получены за счет выбора сочетания липазного фермента, подлежащего кристаллизации, с подходящим растворителем или водным растворителем, содержащим подходящие осаждающие средства, такие как соли или органические реагенты. Растворитель смешивают с липазой и необязательно подвергают перемешиванию при температуре, которая, как определено экспериментально, подходит для стимулирования кристаллизации и приемлема для сохранения стабильности и активности белка. Растворитель может необязательно включать дополнительные растворенные вещества, такие как двухвалентные катионы, кофакторы или хаотропы, а также буферные компоненты для регулирования pH. Необходимость в дополнительных растворенных веществах для содействия кристаллизации, а также их концентрации могут быть определены экспериментально. Для способа в промышленном масштабе регулируемое осаждение, приводящее к кристаллизации, может быть наилучшим образом проведено при применении простой комбинации белка, осадителя, дополнительных растворенных веществ, и, необязательно, буферов в периодическом процессе. С другой стороны, также могут применяться лабораторные способы кристаллизации, такие как диализ или диффузия паров. McPherson et al., Methods Enzymol., 114, pp. 112-120 (1985) и Gilliland, J. Crystal Growth, 90, pp. 51-59 (1988) включают обширный перечень подходящих условий, описанных в литературе по кристаллизации. Иногда несовместимость между средой кристаллизации и средством для сшивания может потребовать замены буфера или растворителя перед началом сшивания.

Липаза кристаллизуется при соблюдении ряда условий, включая pH в диапазоне приблизительно 4-9. Осадители, применимые для получения липазного компонента композиций по настоящему изобретению, включают изопропанол, трет-бутанол, 2-метил-2,4-пентандиол (MPD), сульфат аммония, хлорид натрия, хлорид магния и другие соединения, известные специалистам в данной области техники. Применимые соли включают двухвалентные и одновалентные катионы и их соли.

Кристаллы липазы, применимые в композициях по настоящему изобретению, могут иметь наибольший размер от примерно 0,01 мкм до примерно 500 мкм, или от примерно 0,1 мкм до примерно 50 мкм, или от примерно 0,1 мкм до примерно 10 мкм. Они могут иметь форму, выбранную из группы, состоящей из сфер, игл, стержней, пластин, как, например, шестиугольных и квадратных, ромбоидов, кубов, бипирамид и призм.

Сшивание кристаллов липазы

Если кристаллы липазы были выращены в подходящей среде, их можно подвергнуть сшиванию. Сшивание приводит к стабилизации кристаллической решетки за счет введения ковалентных связей между молекулами белка, из которых состоит кристалл. Это делает возможным перенесение фермента в несвойственную ему среду, что, в ином случае, для данного фермента могло бы быть несовместимо с существованием кристаллической решетки или интактного фермента.

В результате сшивания кристаллов липазы могут быть изменены устойчивость фермента (например, в отношении pH, температуры, механическая и/или химическая устойчивость), профиль активности липазы в зависимости от pH, растворимость, однородность размера и объема кристаллов, скорость высвобождения липазы из кристалла и/или размер и форма промежутков между отдельными молекулами фермента, из которых состоит кристаллическая решетка.

Сшивание преимущественно осуществляют таким образом, чтобы образующиеся сшитые кристаллы содержали липазу, которая проявляет не менее примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,7% или 99,9% или более ферментной активности по сравнению с немодифицированной липазой. Устойчивость может быть увеличена не менее чем на примерно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% или более по сравнению с немодифицированной липазой. Устойчивость может быть измерена в условиях хранения, как, например, устойчивость к pH, устойчивость к действию температур, устойчивость к действию протеаз, в т.ч. желудочно-кишечных протеаз и Pronase , устойчивость к растворению, или же, например, биологическая устойчивость in vivo.

В некоторых случаях сшивание кристаллов липазы замедляет переход липазы в раствор, эффективно иммобилизуя молекулы фермента в микрокристаллических частицах. При действии пускового механизма в среде, окружающей сшитые кристаллы липазы, например, при условиях применения, а не хранения, кристаллы липазы растворяются, высвобождая полипептиды липазы и/или увеличивая активность липазы. Скорость растворения может управляться, например, одним или несколькими из следующих факторов: степень сшивания, продолжительность времени действия реагента для сшивания на кристаллы липазы, скорость добавления реагента для сшивания к кристаллам липазы, природа сшивающего агента, длина сшивающего агента, pH, температура, присутствие сульфгидрильных реагентов, таких как цистеин или глутатион, площадь поверхности кристаллов сшитой липазы, размер кристаллов сшитой липазы или форма кристаллов сшитой липазы.

Сшивание кристаллов липазы может быть осуществлено с применением одного реагента для сшивания или их комбинации, включая полифункциональные реагенты, в т.ч. бифункциональные реагенты, одновременно (параллельно) или последовательно. В различных вариантах осуществления под действием пускового механизма окружающей среды или через определенный промежуток времени происходит уменьшение количества или ослабление сшивающих агентов между молекулами в кристаллах липазы, что ведет к растворению липазы или высвобождению активного вещества. С другой стороны, сшивающие агенты могут разрываться в месте прикрепления к молекулам, что ведет к растворению белка или высвобождению активного вещества. См., например, патенты США № № 5976529 и 6140475. Сшивание может быть проведено в соответствии с любой стандартной методикой сшивания.

Итоговая концентрация сшивающих агентов в сшитых кристаллах липазы должна находиться в пределах от примерно 0,001 нМ до примерно 300 нМ, предпочтительно от примерно 1,0 нМ до примерно 50 нМ, наиболее предпочтительно от примерно 2,0 нМ до примерно 5,0 нМ.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, сшивающий реагент представляет собой бис(сульфосукцинимидил)суберат ( BS³ ). Другие применимые сшивающие реагенты включают глутаровый альдегид, янтарный альдегид, октандиальдегид и глиоксаль. Дополнительные полифункциональные сшивающие реагенты включают галогентриазины, например цианурхлорид; галогенпиримидины, например 2,4,6-трихлор/бромпиримидины; ангидриды или галогенангидриды алифатических или ароматических моно- или дикарбоновых кислот, например малеиновый ангидрид, (мет)акрилоилхлорид, хлорацетилхлорид; N-метилольные соединения, например N-метилолхлорацетамид; диизоцианаты или диизотиоцианаты, например фенилен-1,4-диизоцианат и азиридины. Другие сшивающие реагенты включают эпоксиды, как, например, диэпоксиды, триэпоксиды и тетраэпоксиды. Для ознакомления с представительным перечнем других доступных сшивающих реагентов см., например, каталог Pierce Chemical Company, издание 2003-2004 гг. Другие примеры реагентов для сшивания включают: диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат·HCl (DTBP); дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP); бисмалеимидогексан (BMH); 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (DFDNB); диметилсуберимидат·2HCl (DMS); дисукцинимидилглутарат (DSG); дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST); 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидгидрохлорид (EDC); этиленгликольбис[сульфосукцинимидилсукцинат] (сульфо-EGS); сложный эфир N-[ -малеимидобутирилокси]сукцинимида (GMBS); N-гидроксисульфосукцинимидил-4-азидобензоат (сульфо-HSAB); сульфосукцинимидил-6-[ -метил- -(2-пиридилдитио)толуамидо]гексаноат (сульфо-LC-SMPT); бис-[ -(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид (BASED); и NHS-PEG-винилсульфон (NHS-PEG-VS).

Кроме этого, могут применяться реагенты, осуществляющие обратимое сшивание. Некоторые обратимо сшивающие реагенты являются полифункциональными сшивающими реагентами, которые включают пусковой механизм в виде отдельной группы. Реакционноспособная функциональная группа вовлечена в связывание реакционноспособных аминокислот боковых цепей в белке, и пусковой механизм состоит из связи, которая может быть разорвана при изменении одного или нескольких условий в окружающей среде (например, pH, наличия восстанавливающего реагента, температуры или термодинамической активности воды).

Сшивающий агент может быть гомофункциональным или гетерофункциональным. Реакционноспособная функциональная группа (или фрагмент) может, например, быть выбрана из одного из следующих видов функциональных групп (где R, R', R'' и R''' могут представлять собой алкил, арил или водород):

I. Реакционноспособные доноры ацильной группы как, например, сложные эфиры карбоновых кислот RCOOR', амиды RCONHR', ацилазиды RCON₃, карбодиимиды R-N=C=N-R', сложные эфиры N-гидроксиимидов RCO-O-NR', имидоэфиры R-C=NH₂ ⁺ (OR'), ангидриды RCO-C-COR', карбонаты RO-CO-O-R', уретаны RNHCONHR', галогенангидриды кислот RCOHal (где Hal=галоген), ацилгидразиды RCONNR'R'', а также O-ацилизоуреазы RCO-O-C=NR' (-NR''R''').

II. Реакционноспособные карбонильные группы как, например: альдегиды RCHO и кетоны RCOR', ацетали RCO(H ₂)R' и кетали RR'CO₂R'R (реакционноспособные карбонилсодержащие функциональные группы, известные специалистам в области иммобилизации и сшивания белков (Pierce Catalog and Handbook, Pierce Chemical Company 2003-2004; S.S.Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, (1991))).

III. Доноры алкилов и арилов как, например, алкил- или арилгалогениды R-Hal, азиды R-N₃, эфиры серной кислоты RSO₃R', эфиры фосфорной кислоты RPO(OR')₃, алкилоксониевые соли R₃O ⁺, соли сульфония R₃S⁺, эфиры азотной кислоты RONO₂, акцепторы Михаэля RCR'=CR'''COR'', арилфториды ArF, изонитрилы RN⁺ C-, галогенамины R₂N-Hal, алкены и алкины.

IV. Серусодержащие группы как, например, дисульфиды RSSR', сульфгидрилы RSH и эпоксиды R₂COCR' ₂.

V. Соли как, например, аклильные или арильные аммониевые соли R₄N⁺, карбоксилаты RCOO^-, сульфаты ROSO₃ ^-, фосфаты ROPO₃'', а также амины R₃N.

Обратимые сшивающие реагенты включают, например, пусковой фрагмент. Пусковой фрагмент включает алкильную, арильную или другую цепь с активирующей группой, которая может реагировать с белком, подвергаемым сшиванию. Эти реакционноспособные группы могут являться различными группами как, например, группами, допускающими нуклеофильное, свободнорадикальное или электрофильное замещение, включая, в числе прочих, галогениды, альдегиды, карбонаты, уретаны, ксантаны и эпоксиды. Например, реакционноспособные группы могут проявлять лабильность при действии кислот, оснований, фторидов, ферментов, восстановления, окисления, тиолов, металлов, фотолиза, свободных радикалов или нагревания.

Кристаллы сшитой липазы могут быть получены в форме порошка с помощью, например, лиофилизации или распылительной сушки. Лиофилизация, или сушка в замороженном состоянии, дает возможность удалять воду из композиции с получением кристаллов, которые можно хранить без замораживания (при комнатной температуре) в течение продолжительного периода времени и затем легко восстанавливать в виде раствора в водном, органическом или смешанном водно-органическом растворителе по выбору, без образования аморфных суспензий и с минимальным риском денатурации. Carpenter et al., Pharm. Res., 14, pp. 969-975 (1997). Лиофилизацию можно осуществлять, как описано в патенте США 5618710 или любым другим способом, известным в технике. Например, кристаллы сшитой липазы, во-первых, замораживают и затем помещают в глубокий вакуум, где кристаллическая вода сублимируется, позволяя получить кристаллы липазы, содержащие только прочно связанные молекулы воды.

Характеристики кристаллов сшитой липазы

Ферментная активность кристаллов сшитой липазы может быть измерена с помощью любой стандартной методики. Например, активность липазы может быть определена спектрофотометрически, как описано в примере 6 патента США 5618710. Активность липазы можно оценить, наблюдая за гидролизом п-нитрофенилацетата, являющегося субстратом. За расщеплением субстрата следят по увеличению поглощения на 400 нм при исходной концентрации субстрата 0,005% и исходной концентрации фермента 1,5×10^-8 М. Липазу добавляют в реакционную смесь объемом 5 мл, содержащую субстрат в 0,2 М Tris с pH 7,0 при комнатной температуре. Перед измерением поглощения кристаллическую липазу удаляют из реакционной смеси центрифугированием.

С другой стороны, активность липазы можно измерить in vitro с помощью гидролиза оливкового масла, как описано в примерах 2-4 патента США 5614189.

Кроме этого, активность липазы можно измерить in vivo. Например, небольшой объем (около 3 мл) оливкового или кукурузного масла можно пометить тиоцианатом ⁹⁹Tc-(V) и кристаллическую липазу можно пометить ¹¹¹In. Меченый жир смешивают с пищей для животных, которая посыпана меченой кристаллической липазой. Получают сцинтиграфические изображения проксимальной и дистальной частей желудка и тонкого кишечника до тех пор, пока в желудке не останется <5% введенной радиоактивности. Затем строят кривые выведения каждого изотопа (например, процент удержания в желудке в зависимости от времени) и определяют количества изотопов, поступающих в проксимальную, среднюю и дистальную части тонкого кишечника из соответствующих представляющих интерес областей.

Предпочтительно, сшитый липазный компонент композиций по настоящему изобретению обладает высокой специфической активностью. Высокая специфическая активность липазы, как правило, такова, что фермент демонстрирует специфическую активность в отношении триолеинов (оливковое масло), превышающую 500, 1000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или более единиц/мг белка.

Предпочтительно, сшитый липазный компонент композиций по настоящему изобретению также стабилен в течение продолжительного периода времени в условиях агрессивной среды, имеющейся в различных областях желудочно-кишечного тракта, т.е. желудке, двенадцатиперстной кишке и кишечнике. Например, липаза предпочтительно устойчива, по крайней мере, в течение часа, в среде с кислотным pH, например среде, в которой значение pH менее чем 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5 или ниже. В настоящем описании термин «стабильный» или «устойчивый» означает, что кристаллы липазы более активны, чем растворимая форма липазы в данных условиях и в течение данного времени. Таким образом, стабильные кристаллы липазы сохраняют более высокий процент своей исходной активности по сравнению с соответствующей растворимой формой липазы. В некоторых вариантах осуществления кристаллы липазы сохраняют не менее 10% исходной активности после пребывания в указанных условиях в течение указанного времени. В других вариантах осуществления липаза сохраняет не менее 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более своей активности.

С другой стороны или в качестве дополнения, компонент композиций по настоящему изобретению, представляющий собой кристаллы сшитой липазы, является устойчивым к теплу. Например, в различных вариантах осуществления он стабилен в течение, по крайней мере, одного часа при 30°C, 37°C или 40°C.

Протеазный компонент

Протеазный компонент композиций по настоящему изобретению представляет собой микробную протеазу. Предпочтительно, применяется протеаза грибкового, а не бактериального или растительного происхождения. Более предпочтительно, протеаза представляет собой протеазу Aspergillus. Наиболее предпочтительно протеаза представляет собой протеазу Aspergillus melleus. Согласно предпочтительному варианту осуществления протеазный компонент композиций по настоящему изобретению находится в кристаллизованной не сшитой форме. Кристаллы протеазы могут быть получены по методикам получения кристаллов, описанным выше для липазы, с применением, например, этанола в качестве осадителя. С другой стороны, протеазный компонент композиций по настоящему изобретению может находиться в некристаллических формах, в сшитых кристаллических формах или может быть покрыт, или инкапсулирован, или включен в состав каким-либо иным образом так, чтобы он не способствовал распаду других белковых компонентов композиции.

Амилазный компонент

Амилазный компонент композиций по настоящему изобретению представляет собой микробную амилазу. Предпочтительно применяется амилаза грибкового, а не бактериального или растительного происхождения. Более предпочтительно, амилаза представляет собой амилазу Aspergillus. Наиболее предпочтительно амилаза представляет собой амилазу Aspergillus oryzae. Согласно предпочтительному варианту осуществления амилазный компонент композиций по настоящему изобретению находится в аморфной форме. С другой стороны, амилазный компонент композиций по настоящему изобретению может находиться в кристаллических формах, включая сшитые, и некристаллических формах, или может быть покрыт, или инкапсулирован или включен в состав каким-либо иным образом так, чтобы он сохранял свою активность после перорального введения.

Композиции, включающие сшитые кристаллы липазы, протеазу и амилазу

Композиции по настоящему изобретению включают такие композиции, которые содержат кристаллы сшитой микробной липазы, микробную протеазу и микробную амилазу в соотношении примерно 1,0:1,0:0,15 единиц ферментной активности USP, в сочетании с одним или несколькими наполнителями. Предпочтительно, липаза является бактериальной липазой, а протеаза и амилаза являются грибковыми ферментами. Наиболее предпочтительно, композиция включает кристаллы бактериальной липазы, которая подвергнута сшиванию с применением сшивающего реагента BS-3, кристаллы протеазы Aspergillus melleus и растворимую амилазу Aspergillus oryzae в соотношении примерно 1,0:1,0:0,15 единиц ферментной активности USP.

Сшивание липазного компонента композиций по настоящему изобретению обеспечивает дополнительную стабильность при экстремальных значениях pH и защиту от протеолиза, тогда как для протеазного и амилазного компонентов сохраняется максимальная растворимость с целью эффективного растворения. Более конкретно, кристаллизация и сшивание липазного компонента помогает получить композицию с повышенной активностью ферментов при более низких дозировках. Кристаллическая форма протеазы также помогает получить повышенную стабильность, чистоту и эффективность ферментов.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения липаза может находиться в любой стабилизированной форме и любой из протеазного или амилазного компонента композиции или они оба могут находиться в кристаллической, аморфной или полукристаллической форме. С другой стороны, либо один, либо оба указанных компонента могут присутствовать в лиофилизированной форме. И, независимо от их формы, либо один, либо оба компонента могут быть сшитыми.

Композиции по настоящему изобретению преимущественно приводят к согласованному увеличению коэффициента поглощения жира и коэффициента поглощения азота у пациентов, которые подвергаются действию композиций. Кроме того, композиции по настоящему изобретению включают такое количество амилазы, которое обеспечивает повышенное переваривание крахмала и всасывание углеводов у указанных пациентов. Благодаря настоящему изобретению было обнаружено, что такой результат по перевариванию крахмала и всасыванию углеводов может быть достигнут с применением значительно меньших количеств амилазы по отношению к липазе и протеазе по сравнению с теми, которые присутствуют в свиных панкреатических добавках. Это открытие противоречит существующему в технике мнению, что амилаза не является необходимой для лечения недостаточности поджелудочной железы, в частности у пациентов с кистозным фиброзом.

Инертные носители, применимые в композициях по настоящему изобретению, служат наполнителями или комбинациями наполнителей как, например, те наполнители, которые применяются в фармацевтических композициях. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в число наполнителей входят микрокристаллическая целлюлоза, мальтрин, кросповидон, коллоидный диоксид кремния, стеарат магния и тальк. В дополнительную группу предпочтительных наполнителей входят следующие наполнители или их смеси: сахароза, трегалоза, лактоза, сорбит, лактит, маннит, инозит, соли натрия и калия как, например, ацетат, фосфаты, цитраты и борат, глицин, аргинин, полиэтиленоксид, поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль, гексиленгликоль, метоксиполиэтиленгликоль, желатин, гидроксипропил- -циклодекстрин, полилизин и полиаргинин.

Другие предпочтительные наполнители могут являться любым из следующих веществ или их смесью: любые 1) аминокислоты, такие как глицин, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аспарагин, глутамин, пролин; 2) углеводы, например моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, арабиноза, ксилоза, рибоза; 3) дисахариды, такие как лактоза, трегалоза, мальтоза, сахароза; 4) полисахариды, такие как мальтодекстрины, декстраны, крахмал, гликоген; 5) альдиты, такие как маннит, ксилит, лактит, сорбит; 6) глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота; 7) циклодекстрины, такие как метилциклодекстрин, гидроксипропил- -циклодекстрин и т.п.; 8)неорганические молекулы, такие как хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, фосфаты натрия и калия, борная кислота, карбонат аммония и фосфат аммония; 9) органические молекулы, такие как ацетаты, цитраты, аскорбаты, лактаты; 10) эмульгирующие или солюбилизирующие/стабилизирующие средства, такие как гуммиарабик, диэтаноламин, глицерилмоностеарат, лецитин, моноэтаноламин, олеиновая кислота, олеиловый спирт, полоксамеры, полисорбаты, лаурилсульфат натрия, стеариновая кислота, сорбитанмонолаурат, сорбитанмоностеарат, другие производные сорбитана, полиоксильные производные, воски, производные полиоксиэтилена, производные сорбитана; и 11) средства для увеличения вязкости, такие как агар, альгиновая кислота и ее соли, гуаровая камедь, пектин, поливиниловый спирт, полиэтиленоксид, целлюлоза и ее производные, пропиленкарбонат, полиэтиленгликоль, гексиленгликоль, тилоксапол. Также могут применяться соли перечисленных соединений.

Дополнительные примеры наполнителей описаны в Handbook of Pharmaceutical Excipients, опубликованной совместно Американской Фармацевтической Ассоциацией и Фармацевтическим Обществом Великобритании. Применительно к композициям по настоящему изобретению наполнители являются инертными ингредиентами, а липаза, протеаза и амилаза являются действующими ингредиентами. Соотношение действующих и инертных ингредиентов в композициях по настоящему изобретению, выраженное в виде соотношения масса/масса, может находиться в диапазоне от примерно 1:9 до примерно 9:1, предпочтительно от примерно 1:6 до примерно 6:1.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения любой компонент, например липазный, протеазный или амилазный, может быть включен в композицию совместно с полимерным носителем. Это позволяет получить устойчивые к действию кислот композиции с управляемым высвобождением, которые делают возможным доставку ферментов в кишечник, т.е. дистальную часть кишечника, в эффективных количествах при небольших дозировках после перорального приема.

Применимые полимерные носители включают, например, полимеры, применяемые для инкапсулирования белковых кристаллов, с целью доставки белков, включая доставку с биологически регулируемым высвобождением. Такие полимеры включают биосовместимые и биоразрушаемые полимеры или их смеси. Предпочтительно полимерный носитель представляет собой биоразрушаемый полимер. Скорость распада и, следовательно, доставки ферментов будет определяться конкретной методикой инкапсулирования, полимерной композицией, сшиванием полимера, консистенцией полимера, стабильностью полимера, геометрией кристаллов фермента и степенью сшивания полимера, если оно имеет место. Согласно одному из вариантов осуществления композиции по настоящему изобретению заключены в матрицу из полимерного носителя; таким образом, обеспечена дополнительная защита липазного, протеазного и амилазного компонентов от агрессивной среды желудочно-кишечного тракта.

Пути введения и формы композиций, режимы и способы лечения

Согласно предпочтительному варианту осуществления композиции по настоящему изобретению применимы в способах лечения недостаточности поджелудочной железы у любых субъектов, включая субъекты, страдающие кистозным фиброзом. Согласно альтернативному варианту осуществления композиции по настоящему изобретению применимы в способах лечения нарушения всасывания у субъекта. Другие варианты осуществления настоящего изобретения включают применение композиций по настоящему изобретению для увеличения коэффициента поглощения жиров или для увеличения коэффициента поглощения азота у субъекта. Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает применение этих композиций для увеличения как коэффициента поглощения жиров, так и коэффициента поглощения азота у субъекта, необязательно на одну и ту же величину. В еще одном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению применимы в способах увеличения поглощения углеводов у субъекта.

Способы лечения с применением композиций по настоящему изобретению включают стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества такой композиции. Любой из способов по настоящему изобретению может применяться для лечения любого субъекта, страдающего недостаточностью поджелудочной железы, включая пациентов с кистозным фиброзом. Аналогично, любой из этих способов может применяться для лечения любого пациента с кистозным фиброзом.

Способы лечения по настоящему изобретению включают способы, в которые входит стадия введения субъекту терапевтически эффективного количества композиции по настоящему изобретению, где это терапевтически эффективное количество увеличивает коэффициент поглощения жиров у субъекта на величину от примерно 30% до примерно 35% по сравнению с исходным уровнем, причем исходный коэффициент поглощения жиров у указанного субъекта меньше или равен 40%. Предпочтительно, увеличение коэффициента поглощения жиров у такого субъекта составляет примерно 30% по сравнению с исходным уровнем. В альтернативном варианте осуществления способы лечения включают стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества композиции по настоящему изобретению, где это терапевтически эффективное количество увеличивает коэффициент поглощения жиров у субъекта на величину от примерно 10% до примерно 25% по сравнению с исходным уровнем, причем исходный коэффициент поглощения жиров у этого субъекта превышает 40%, но ниже 85%. Предпочтительно увеличение коэффициента поглощения жиров у такого субъекта составляет примерно 15% по сравнению с исходным уровнем.

Кроме того, способы лечения по настоящему изобретению включают такие способы, в которые входит стадия введения субъекту терапевтически эффективного количества композиции по настоящему изобретению, где это терапевтически эффективное количество увеличивает коэффициент поглощения азота у данного субъекта на величину от примерно 30% до примерно 35% по сравнению с исходным уровнем, причем исходный коэффициент поглощения азота у этого субъекта меньше или равен 40%. Предпочтительно увеличение коэффициента поглощения азота у такого субъекта составляет приблизительно 30% по сравнению с исходным уровнем. В альтернативном варианте осуществления способы лечения включают стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества композиции по настоящему изобретению, где это терапевтически эффективное количество увеличивает коэффициент поглощения азота у данного субъекта на величину от примерно 10% до примерно 25% по сравнению с исходным уровнем, где исходный коэффициент поглощения азота у этого субъекта превышает 40%, но менее 85%. Предпочтительно, увеличение коэффициента поглощения азота у этого субъекта составляет примерно 15% по сравнению с исходным уровнем.

В другом варианте осуществления способы лечения по настоящему изобретению включают такие способы, в которые входит стадия введения субъекту терапевтически эффективного количества композиции по настоящему изобретению, где это терапевтически эффективное количество увеличивает поглощение углеводов у данного субъекта до уровня, который превосходит исходный уровень примерно на 10% или более. В другом варианте осуществления такие способы включают те способы, в которых терапевтически эффективное количество композиции по настоящему изобретению является таким, что оно увеличивает поглощение углеводов у данного субъекта до уровня, который превосходит исходный уровень примерно на 20% или более. В настоящем описании считается, что 10% увеличения поглощения углеводов составляет 90 лишних калорий в день. Через 365 дней, т.е. в течение года, было бы усвоено в общей сложности 32850 дополнительных калорий. Поскольку увеличение веса на 1 фунт требует примерно 3500 калорий, за год в результате увеличения поглощения углеводов у субъекта на 10% будет набрано немногим более 9 фунтов.

Могут быть созданы композиции по настоящему изобретению, предназначенные для любого стандартного пути доставки, включая введение через верхнюю часть желудочно-кишечного тракта, например, через рот (например, в виде капсул, таблеток, суспензий или с пищей) или через желудок или верхнюю часть кишечника (например, по трубке или с помощью инфузии), а также пероральный путь. Предпочтительно получают композиции для перорального приема. Соответственно композиции могут быть получены в виде любой лекарственной формы, включая твердые и жидкие формы, суспензии или дисперсии, такие как, например, капсулы, таблетки, каплеты, саше или драже. В случае младенцев и детей младшего возраста, а также для любых взрослых, которые не способны принимать таблетки или капсулы, композиции вводятся в форме жидкости, суспензии или саше, и могут вводиться с другой совместимой пищей или продуктами.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению вводятся субъекту во время употребления пищи или легкой закуски, в виде одной или нескольких капсул, суспензий или саше. Предпочтительно композиции по настоящему изобретению вводятся субъекту в виде одной или двух капсул, суспензий или саше за один прием пищи или легкой закуски. Композиции могут вводиться после употребления половины пищи или легкой закуски. Терапевтически эффективное количество композиции для лечения недостаточности поджелудочной железы по настоящему изобретению включает липазу, протеазу и амилазу в соотношении примерно 1:1:0,15 единиц ферментной активности USP и, на одну дозу, включает количество активной липазы от примерно 5000 единиц USP до примерно 100000 единиц USP; количество активной протеазы от примерно 5000 единиц USP до примерно 100000 единиц USP; и количество активной амилазы от примерно 750 единиц USP до примерно 15000 единиц USP. Более предпочтительно такие композиции включают липазу, протеазу и амилазу в соотношении примерно 1:1:0,15 единиц ферментной активности USP и на одну дозу включают: количество активной липазы от примерно 25000 единиц USP до примерно 100000 единиц USP; количество активной протеазы от примерно 25000 единиц USP до примерно 100000 единиц USP; и количество активной амилазы от примерно 3750 единиц USP до примерно 15000 единиц USP. Наиболее предпочтительно такие композиции включают липазу, протеазу и амилазу в соотношении примерно 1:1:0,15 единиц ферментной активности USP и на одну дозу включают количество активной липазы, равное примерно 25000 единиц USP; количество активной протеазы, равное примерно 25000 единиц USP; и количество активной амилазы, равное примерно 3750 единиц USP.

Композиции по настоящему изобретению, предназначенные для детей, включают липазу, протеазу и амилазу в соотношении примерно 1:1:0,15 единиц ферментной активности USP и на одну дозу включают количество активной липазы от примерно 12500 единиц USP до примерно 25000 единиц USP; количество активной протеазы от примерно 12500 единиц USP до примерно 25000 единиц USP; и количество активной амилазы от примерно 1875 единиц USP до примерно 3750 единиц USP. Композиции по настоящему изобретению, предназначенные для детей младшего возраста, включают липазу, протеазу и амилазу в соотношении примерно 1:1:0,15 единиц ферментной активности USP и на одну дозу включают количество активной липазы от примерно 500 единиц USP до примерно 1000 единиц USP; количество активной протеазы от примерно 500 единиц USP до примерно 1000 единиц USP; и количество активной амилазы от примерно 75 единиц USP до примерно 150 единиц USP. Для всех значений и диапазонов ферментной активности, обсуждаемых в настоящей заявке, одна единица активности липазы, протеазы и амилазы определена в соответствии с упомянутыми выше анализами для соответствующего фермента. Указанные выше количества также соответственно являются терапевтически эффективными количествами для лечения нарушения всасывания или нарушения пищеварения у взрослых, детей или детей младшего возраста; или для увеличения любого показателя из числа коэффициента поглощения жиров, коэффициента поглощения азота, поглощения углеводов или усвоения крахмала у взрослых, младенцев или детей младшего возраста.

Наиболее эффективный способ введения и режим дозировки композиций по настоящему изобретению будет зависеть от желаемого результата, предыдущего лечения, если оно проводилось, состояния здоровья субъекта и уровня развития самого болезненного состояния, реакции на лечение и суждения лечащего врача.

При улучшении состояния субъекта по необходимости может быть принят поддерживающий режим. Впоследствии дозировка или частота приема или оба этих показателя могут быть уменьшены, в зависимости от симптомов, до уровня, при котором сохраняется улучшение состояния. Однако субъектам может потребоваться периодическое лечение на долговременной основе при любом рецидиве состояния или его симптомов.

Для того чтобы можно было лучше понять настоящее изобретение, в заявке приведены следующие примеры. Эти примеры приведены только с целью иллюстрации и их не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения каким бы-то ни было образом.

ПРИМЕРЫ

Следующие далее примеры относятся к композициям по настоящему изобретению, а также к клиническим исследованиям, направленным на оценку их безопасности и эффективности при лечении недостаточности поджелудочной железы. Эти исследования включают фазу 1 и фазу 2 клинических испытаний у пациентов с кистозным фиброзом, страдающих недостаточностью поджелудочной железы.

Исследования фазы 2 направлены на оценку эффективности композиций по настоящему изобретению, которую проводят путем измерения изменений следующих параметров: коэффициента поглощения жиров ( CPA ), коэффициента поглощения азота ( CNA ), перорального всасывания углеводов, массы стула в течение дня, частоты стула (количества раз в день), а также качества жизни, выраженного в желудочно-кишечных симптомах, которое измеряется с помощью опросного листа для больных кистозным фиброзом ( CFQ ). Кроме того, в рамках исследования оценивалась дозировка таких композиций, обеспечивающая наиболее высокий уровень клинически значимого повышения коэффициента поглощения жиров от исходного уровня (в отсутствии ферментов) у подвергаемого лечению субъекта.

Как показано в фазе 2 исследований, композиции по настоящему изобретению за период введения обеспечивают статистически значимое увеличение средних значений CFA и CNA по сравнению с исходным уровнем у субъектов с кистозным фиброзом, страдающих недостаточностью поджелудочной железы. Было найдено, что композиции по настоящему изобретению являются эффективными при минимальных дозах 25000 единиц USP липазы, 25000 единиц USP протеазы и 3750 единиц USP амилазы на капсулу («средняя доза» или «ветвь 2» исследования); ведущих к значительному ( 10%) увеличению как CFA, так и CNA у большинства субъектов. CFA и CNA также увеличивались при воздействии доз, содержащих липазу, протеазу и амилазу в соотношении 100000:100000:15000 единиц ферментной активности USP на капсулу («высокая доза» или «ветвь 3» исследования). Однако статистические различия между режимами средних доз и высоких доз отсутствовали как для CFA, так и для CNA. Композиции по настоящему изобретению, использованные в фазе 2 исследования, включают также композиции, вводимые в дозах 5000 единиц USP липазы, 5000 единиц USP протеазы и 750 единиц USP амилазы на капсулу («низкая доза» или «ветвь 1» исследования).

Преимущественно, даже после внесения поправок на исходные значения CFA и CNA и пол субъектов, которым вводят композиции, это влияние композиций по настоящему изобретению на CFA и CNA остается статистически значимым (p=0,0003 и <0,0001 соответственно для групп, получавших средние и высокие дозировки). Когда оба коэффициента CFA и CNA рассматривались как отдельные квартили (фиг. 1 и 2), наибольшие изменения наблюдались у субъектов с исходными величинами <40% и пропорционально меньшие изменения имели место у субъектов с исходными величинами CFA и CNA >40%. Что касается CFA, среднее увеличение в группе из восьми субъектов с исходным уровнем CFA 40%, получавших средние дозы, составило 35,3%. Среднее увеличение в группе из 12 субъектов с исходным уровнем CFA 40%, получавших высокие дозы, составило 30,4%. Среднее увеличение CFA у 20 субъектов с исходным уровнем CFA 40% для обеих групп, получавших средние и высокие дозы, составило 32,3%.

Композиции по настоящему изобретению приводят также к заметному лечебному эффекту, выраженному в изменении частоты и массы стула в течение дня у субъектов, которым вводится композиция. Субъекты, получающие высокие дозы, за период введения композиций демонстрировали значительное уменьшение частоты стула по сравнению с исходным уровнем, хотя уменьшение массы стула было статистически значимым для групп, получавших как средние, так и высокие дозы. Фактически имела место высоко значимая обратная корреляция (R=-0,7283; p<0,0001) между изменением поглощения жира и изменением массы стула. Следовательно, в этом отношении высокая в рамках исследований доза (ветвь 3) значимо не отличается от средней дозы (ветвь 2).

Хотя у всех субъектов исследования отсутствовали общие статистически значимые изменения, отмеченные в провоцирующем тесте с крахмалом в присутствии и в отсутствие ферментов, эффект, наблюдаемый у субъектов, которым вводили высокие дозы как в максимальном изменении глюкозы, так и в площади под кривой ( AUC ), изменялся в направлении (p<0,057), которое предполагает активность амилазы. Кроме того, специальный анализ, использующий точный тест Фишера, показал, что большинство субъектов в группе, получающей средние дозировки, и в группе, получающей высокие дозировки, имели 10% увеличение максимального изменения уровня глюкозы после провоцирующего теста с крахмалом по сравнению с группой, получавшей низкие дозы, на основании сравнения периодов, когда осуществлялось и не осуществлялось введение ферментов (p=0,0138). Эти результаты показывают, что амилаза действует как важный компонент композиций по настоящему изобретению, приводя к улучшению переваривания крахмала и поглощения углеводов.

У субъектов, которым вводили композиции по настоящему изобретению, не отмечалось серьезных нежелательных явлений, причем композиции обладали хорошей переносимостью при всех уровнях дозировки в фазе 2 исследования. Ни один из субъектов не умер во время исследования.

Пример 1. Получение композиций для исследования

Композиции, используемые в фазе 1 и фазе 2 обсуждаемых в настоящей заявке исследований, включали липазу, протеазу и амилазу, причем каждый из ферментов отдельно в контролируемых условиях вырабатывался различными штаммами микроорганизмов, после чего осуществляли выделение, очистку и высушивание. Процедуру проводили так, чтобы получить композиции, которые были бы стабильны и сохраняли сильную ферментную активность в тонком кишечнике.

Липаза: Способы получения и выделения липазы из бактерий хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, липазный компонент композиций получали с помощью ферментации из бактерий Burkholderia cepacia (известных ранее, как Pseudomonas cepacia). Ферментацию проводили в 25000 литровом ферментере. Штамм бактерий получали из банка лиофилизованных замороженных эталонных клеток, выращивали на скошенной питательной среде, доводя количество засеваемой культуры до восьми литров, затем проводили ферментацию в 2500-литровом инокуляторе и, наконец, в 25000-литровом ферментере. После ферментации живые микроорганизмы уничтожали тепловой обработкой и удаляли центрифугированием. Белок концентрировали упариванием с последующим осаждением и промыванием этанолом в корзиночной центрифуге.

Липазу более высокой степени очистки получали осаждением сульфатом аммония, адсорбцией и элюированием с применением целлюлозы DEAE и последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием с помощью ультрафильтрации. Полученное вещество очищали далее обработкой ацетоном и CM-целлюлозой и затем добавляли глицин в качестве стабилизирующего средства. Полученное вещество очищали мембранной фильтрацией и затем лиофилизировали. Затем это вещество просеивали и исследовали на специфическую активность, чистоту и отсутствие патогенов.

После этого очищенную липазу подвергали обработке диафильтрацией для удаления глицинового стабилизатора. Затем липазу осаждали и кристаллизовали в 25% трет-бутаноле с последующим сшиванием с помощью BS³ в описанном выше диапазоне концентраций, предпочтительно таким образом, чтобы конечная концентрация сшивающего агента в сшитых кристаллах липазы находилась в пределах от примерно 2,0 мМ до примерно 5,0 мМ. Кристаллы сшитой липазы промывали пятью объемами 15% этанольного буфера с последующим дополнительным промыванием пятью объемами 15% этанольного буфера (с 1,5 мМ ацетатом кальция, pH 5,0) для уменьшения как остаточного содержания сшивающего агента, так и трет-бутанола. Полученное вещество лиофилизировали и упаковывали для отправки в бутыли из полиэтилена высокой плотности, укупоренные клейкой лентой, и упакованные в однослойный мешок из ПЭ с силикагелем в качестве поглотителя влаги. Каждую партию отдельно анализировали на микробиологическое загрязнение бактериями Burkholderia cepacia, а также другими микробами, причем они должны были продемонстрировать отсутствие Burkholderia cepacia и патогенов, прежде чем быть допущенными к клиническому применению.

Протеаза: Способы получения и очистки протеазы известны специалистам в данной области техники. Например, протеазу получали твердофазной ферментацией Aspergillus melleus. Засеваемую культуру выращивали в растворе и затем переносили на влажные отруби. Как только стерилизованные отруби покрывали засеваемой культурой, твердофазные компоненты выгружали на поддоны для ферментации в комнатах для ферментации. После завершения ферментации фермент экстрагировали из твердой биомассы перфузией воды через большие емкости для экстракции.

Полученный экстракт, содержащий протеазу, затем пропускали через гранулы древесного угля и фильтровали для удаления взвешенных частиц. После этого концентрировали раствор и обрабатывали древесным углем второй раз. Протеазу осаждали этанолом и затем высушивали в вакууме для заключительной очистки.

Протеазу растворяли и затем пропускали через ионообменную смолу. Затем вещество фильтровали, после чего переносили в емкости для кристаллизации, где кристаллизовали с помощью многократных добавлений этанола. Как только кристаллизация заканчивалась, отделяли кристаллы в корзиночной центрифуге и промывали дополнительным количеством этанола. Кристаллы извлекали из корзиночной центрифуги и высушивали сжатым воздухом с последующим высушиванием в вакууме. Сразу же после высушивания порошок переносили в емкости для сыпучих веществ с целью окончательного просеивания и упаковки.

Амилаза: Способы получения и очистки амилазы известны специалистам в данной области техники. Например, амилазу получали твердофазной ферментацией Aspergillus oryzae. Засеваемую культуру выращивали в растворе и затем переносили на влажные отруби. Как только стерилизованные отруби покрывали засеваемой культурой, твердофазные компоненты выгружали на поддоны для ферментации. После завершения ферментации фермент экстрагировали из твердой биомассы перфузией воды через емкости для экстракции. Затем фильтрованный экстракт концентрировали и подвергали диафильтрации. За диафильтрацией следовала тепловая обработка и доведение pH до нужного значения, после чего осуществляли еще одну диафильтрацию и концентрирование. Затем к веществу добавляли рыбий желатин в качестве стабилизатора, причем он составлял до 30% общей массы продукта, после чего осуществляли распылительную сушку. Как только вещество высушивали, его подвергали просеиванию, смешивали с декстрином и упаковывали. Декстрин применяли в качестве стабилизатора для длительного хранения, и его масса могла бы составлять до 30% от общей массы конечного продукта. Белок в полученных активных фармацевтических ингредиентах был более чем 90% чистоты по данным SEC ВЭЖХ с детектированием при 280 нм. В этих 90% не учитывалось наличие желатина или декстрина, как наполнителей; причем ни один из наполнителей не обладал значительным поглощением при 280 нм. После очистки и обработки капсулы совместно заполняли липазой, протеазой и амилазой. Более конкретно, высушенные ферменты смешивали в сухом состоянии (с наполнителями) и заполняли полученной смесью желатиновые капсулы. Композиции были названы TheraCLEC .

Пример 2 - Фаза 2 исследований

Применяемые дозировки

Композиции, применявшиеся в фазе 2 исследования, включали действующие ингредиенты, представлявшие собой кристаллы сшитой липазы Burkholderia cepacia, кристаллы протеазы Aspergillus melleus и растворимую амилазу Aspergillus oryzae; а также следующие неактивные ингредиенты: микрокристаллическую целлюлозу, мальтрин, кроссповидон, коллоидный диоксид кремния, стеарат магния и тальк. Композиции содержали липазу, протеазу и амилазу в соотношении 1:1:0,15 единиц ферментной активности USP.

Композиции доставлялись в форме капсул с двумя различными силами воздействия. Состав большей силы, именуемый TCT20 , помещался в твердые непрозрачные белые желатиновые капсулы размера 2 и содержал 20000 единиц USP липазы, 20000 единиц USP протеазы и 3000 единиц USP амилазы. Состав меньшей силы, именуемый TCT5 , помещался в твердые непрозрачные белые желатиновые капсулы размера 5 и содержал 5000 единиц USP липазы, 5000 единиц USP протеазы и 750 единиц USP амилазы. Соотношение активных и неактивных ингредиентов, выраженное как масса/масса, составляло 3:4 для TCT20 и 2:5 для TCT5.

В фазе 2 исследования применяли капсулы плацебо размера 2 и размера 5 для того, чтобы замаскировать дозу TheraCLEC . Капсулы плацебо содержали те же неактивные ингредиенты, что и капсулы TheraCLEC , и имели тот же внешний вид, что и капсулы TheraCLEC , так что принадлежность капсул к тому или иному виду (активные или плацебо) была не известна. Субъекту давали капсулы в соответствующем количестве и соответствующего типа, т.е. TheraCLEC или плацебо, для достижения слепого уровня дозировки, который случайно выбирали для субъекта.

Во время фазы 2 исследования приблизительно в середине каждого приема пищи или закуски в течение 28-дневного периода введения препаратов субъект получал в общей сложности шесть капсул, в число которых входили капсулы TheraCLEC или плацебо, причем одна из капсул имела размер 5 и 5 капсул имели размер 2, как указано ниже:

Таблица 1
Распределение введения исследуемых препаратов по отношению к плацебо по ветвям исследования
	Количество капсул за один прием пищи/закуски
Ветвь исследования	Капсулы размера 5	Капсулы размера 2
ветвь 1	1 TCT5	5 плацебо
ветвь 2	1 TCT5	1 TCT20 4 плацебо
ветвь 3	1 плацебо	5 TCT20

Выбор дозировок и распределение по времени

Наивысшая фиксированная дозировка, равная 100000 единиц USP липазы/прием пищи, была эквивалентна 1250 единиц USP липазы на 1 кг для субъекта массой 80 кг и 2500 единиц USP липазы на 1 кг для 40 кг субъекта.

Таблица 2
Дозировки исследуемого препарата TheraCLEC
	Единицы USP/ прием пищи или закуски
	TheraCLEC
Активный компонент	ветвь 1	ветвь 2	ветвь 3
Липаза	5000	25000	100000
Протеаза	5000	25000	100000
Амилаза	750	3750	15000

Дополнительные параметры фазы 2 исследования

Фаза 2 исследования представляла собой рандомизованное тестирование с применением двойной слепой методики и с параллельным изменением диапазона дозировки. В исследование было включено в общей сложности 129 мужчин и женщин из приблизительно 26 населенных пунктов США, которые получали TheraCLEC в трех уровнях дозировки (приблизительно 42 субъекта на каждый уровень). Исследование разделялось на четыре отдельных периода наблюдения и оценки: отбора, начального периода, периода введения препаратов и завершающего периода.

Совокупность участников фазы 2 исследования

Тестирование композиций, полученных, как описано выше, проводилось на трех группах субъектов. Модифицированная группа участников, которым намечалось введение препаратов ( mITT ), включала всех подходящих субъектов, прошедших начальный период (без введения ферментов), получивших хотя бы одну рандомизованную дозу, имевших хотя бы одну оценку безопасности в период введения и у которых собирали стул в промежутке от одного маркера стула до другого маркера. Были протестированы другие группы субъектов, и результаты согласовывались с результатами группы mITT.

Период отбора (день S1-начальный период)

В день один посещения для отбора (день S1) субъектов интервьюировали с целью определения их пригодности для включения в состав участников исследования. Субъектов также подвергали всестороннему физическому исследованию.

Субъектов просили в течение периода исследования придерживаться пищевого рациона с высоким содержанием жира. Субъектам разрешалось употреблять медикаменты, необходимые для лечения и регулирования их основного заболевания - кистозного фиброза и родственных заболеваний. Субъекты не получали ферментные добавки или диетические вспомогательные средства, которые могли рассматриваться как ферментные добавки, в течение таких этапов исследования, как начальный период (дни B1-B3) и период введения препаратов (дни T1-T28).

Субъекты были разделены случайным образом для получения одной из трех слепых доз TheraCLEC .

Начальный период (дни B1-B3)

В течение 10-14 дней с момента первичного посещения для отбора от пациентов требовалось явиться в стационарное лечебное учреждение в голодном состоянии и до первого приема пищи в течение дня (завтрака). Начальный период начинался с первого приема пищи в течение дня (завтрака) в день B1. Перед завтраком определяли массу тела. Затем у субъекта начинался 72-часовой период регулируемой диеты без добавок панкреатических ферментов. Маркер стула (500 мг красителя синего № 2 FD&C) употреблялся в начале первого приема пищи в день B1. Поступление жиров и белков фиксировалось на основании реального потребления. Собирание стула для оценки содержания жира и азота в фекальной массе начинали после выхода первого маркера (стул, содержащий первый маркер, выбрасывали) и заканчивали, когда впервые замечали в стуле второй маркер (стул, содержащий второй маркер, собирали).

Каждый день в течение начального периода оценивали наличие нежелательных явлений у субъекта и действие сопутствующих лекарственных препаратов, регистрировали основные показатели состояния организма и проводили краткое исследование физического состояния.

Период введения препаратов (дни T1-T28)

Введение первой дозы исследуемого препарата каждому субъекту проводили в день один периода введения препаратов (T1) приблизительно в середине первого приема пищи после завершения предварительных процедур и провоцирующего теста с крахмалом в день T1 (обед). Затем субъекты находились под наблюдением в течение, как минимум, 30 минут после введения первой дозы. Если наблюдалась хорошая переносимость, субъекты получали ту же дозу исследуемого препарата приблизительно в середине каждого из трех приемов пищи и двух закусок со дня T1 и на протяжении всех 28 дней периода введения препарата. В данном исследовании середина приема пищи определялась, как момент времени, в который субъекты употребляли приблизительно одну вторую часть еды или закуски.

В день T29 субъекты прекращали принимать исследуемые препараты. В течение дня T29/ET осуществлялось посещение офиса и проводилось полное исследование физического состояния. Кроме этого, оценивалось наличие нежелательных явлений у субъектов.

Завершающий период (дни F7±2)

Во время завершающего периода субъекты содержались на диете с большим количеством жира и употребляли обычные ферменты, прописанные их лечащими врачами. Посещение офиса, означающее окончание завершающего периода (день F7±2), планировалось таким образом, чтобы оно осуществлялось в пределах 7±2 дней после посещения, соответствующего завершению периода введения препарата (день T29). В ходе этого посещения проводилось краткое исследование физического состояния субъектов и оценивалось наличие нежелательных явлений и действие сопровождающих препаратов.

Анализ стула на содержание жира и азота

Во время первичного посещения для отбора собирали стул для спот-теста фекальной эластазы с целью оценки пригодности субъекта для исследования. У каждого из субъектов в различные моменты времени по ходу исследования тестировали стул на содержание скрытой крови и лейкоцитов.

Во время начального периода в стационаре и периода введения препарата в стационаре субъектам давали индикаторный маркер (500 мг синего № 2 FD&C) в начале первого приема пищи контролируемой диеты (завтрака), которая состояла из примерно 100 граммов жира и, как минимум, примерно 2 граммов белка на килограмм массы тела в день. Фактическое поступление жира и белка регистрировалось на основе количества употребленной пищи.

Через 72 часа пребывания на контролируемой диете субъектам давали второй индикаторный маркер на основе синего красителя вместе с приемом тестовой пищи для начального провоцирующего теста. Собирание стула для определения содержания фекального жира и азота начинали после того, как проходил первый синий маркер, и заканчивали, когда проходил второй синий маркер. Измеряли массу собранного стула и анализировали его на содержание жира и азота. Seligson, D (ed), Standard Methods of Clinical Chemistry, Volume II, Fatty Acids in Stool, 1985, Academic Press, pp 34-39; Veldee MS, Nutritional Assessment, Therapy, and Monitoring in Burtis CA, Ashwood ER (eds). Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3^rd Ed., 1999, W.B. Sanders Co, pp 1385-86.

Коэффициент поглощения жира (% CFA) вычисляли вручную, используя два вида экспериментальных данных:

(1) потребление жира в г/24 часа по данным главного диетолога исследования, и

(2) выделения жира в г/24 часа по данным клинической лабораторной службы Mayo.

Коэффициент CFA рассчитывали вручную следующим образом:

(среднее количество потребленного жира в г/24 часа - среднее количество выделенного жира в г/24 часа) × 100/ среднее количество потребленного жира в г/24 часа.

Коэффициент поглощения азота (%CNA) вычисляли вручную, используя два вида экспериментальных данных:

(1) потребление азота в г/24 часа по данным главного диетолога исследования, и

(2) выделения азота в г/24 часа по данным клинической лабораторной службы Mayo.

Коэффициент CNA рассчитывали вручную следующим образом:

(среднее количество потребленного азота в г/24 часа - среднее количество выделенного азота в г/24 часа) × 100/среднее количество потребленного азота в г/24 часа.

Оценка эффективности - коэффициент поглощения жира

Суммировали по группам с различной дозировкой коэффициент поглощения жира в начальном периоде, во время периода введения препарата, а также изменение от исходного уровня до уровня в момент введения препарата. Приведенный коэффициент поглощения жира представлял собой среднее двух независимых расчетов CFA, использовавших два результата по содержанию жира в фекалиях из одной отобранной порции стула. Разность среднего коэффициента поглощения жира среди трех групп с различной дозировкой во время периода введения препарата анализировали с применением однофакторного дисперсионного анализа. Для оценки трех возможных попарных сравнений при сохранении общего 5% количества ошибок типа I применяли тест стьюдентизированного диапазона Tukey (Тьюки). Зависимая переменная включала измерения во время периода введения препарата.

Кроме этого проводили линейный регрессионный анализ, исследующий параллельные эффекты в группах с различными дозировками и средний исходный уровень CFA. Зависимая переменная вновь включала измерения, полученные во время периода введения препарата. Дополнительные факторы, которые тестировали в данной модели, включали следующие исходные факторы: возраст, пол, расовая принадлежность и BMI (индекс массы тела). Для этих дополнительных факторов применяли пошаговую методику с целью устранения из модели незначимых факторов (p>0,10). Попарные сравнения в данном линейном регрессионном анализе также проводили с применением теста стьюдентизированного диапазона Tukey.

Коэффициент поглощения жира (CFA) во время начального периода исследований, во время периода введения препарата и изменение от исходного значения во время введения препарата для совокупности субъектов mITT суммирован ниже в таблице 3 по группам с различной дозировкой. Для участников всех трех групп наблюдалось значительное увеличение среднего значения CFA по сравнению с исходным уровнем за период введения препарата. CFA в период введения был значительно больше в обоих ветвях исследования, а именно ветви исследования 2 (средние дозировки) и ветви исследования 3 (высокие дозировки) по сравнению с ветвью исследования 1 (низкие дозировки). Кроме того, в ветвях исследования 2 и 3 было продемонстрировано большее среднее увеличение CFA от периода отсутствия ферментов до периода введения ферментов, чем в ветви 1. Хотя в ветви 3 было продемонстрировано постоянное численное превышение результатов над результатами ветви 2, эта разность не являлась статистически значимой.

Таблица 3
Средний коэффициент поглощения жира - дисперсионный анализ
	Ветвь исследования 1 (N=39)	Ветвь исследования 2 (N=41)	Ветвь исследования 3 (N=37)	Всего (N=117)	Величина p*
Начальный период
N	39	41	36	116
Среднее значение (SD)	55,0 (17,54)	55,6 (20,29)	52,2 (19,14)	54,4 (18,94)
Период введения препарата**
N	39	41	37	117
Среднее значение (SD)	56,2 (18,16)	67,0 (18,08)	69,7 (17,86)	64,3 (18,81)	0,0032
Изменение по сравнению с исходным уровнем
N	39	41	36	116
Среднее значение (SD)	1,2 (14,77)	11,4 (19,10)	17,3 (18,37)	9,8 (18,59)	0,0005
Процентное (%) изменение по сравнению с исх.уровнем
N	39	41	36	116
Среднее значение (SD)	5,6 (32,15)	42,7 (95,46)	45,9 (53,51)	31,2 (68,69)	0,0153
* Итоговые величины p по результатам дисперсионного анализа. ** Результаты при введении препаратов (с использованием теста стьюдентизированного диапазона Tukey для попарных сравнений): ветвь исследования 1 относительно ветви исследования 2, величина p mITT = 0,0229. ветвь исследования 2 относительно ветви исследования 3, величина p mITT = 0,7874. ветвь исследования 1 относительно ветви исследования 3, величина p mITT = 0,0041.

Если исходные значения CFA 0-100% разбить на квинтили, становится ясно, что во всех ветвях исследования имелось более существенное увеличение коэффициента по сравнению с исходным уровнем CFA, находившимся в диапазоне 0-40%, чем в случае, когда исходный уровень CFA превышал 40% (см. фиг.1). Кроме того, чем ниже исходное значение CFA, тем больше реакция на введение препарата.

Оценка эффективности - коэффициент поглощения азота

Коэффициент поглощения азота (CNA) в начальный период (B1-B3) и в период введения препарата для совокупности субъектов mITT приведен ниже в таблице 4 по группам с различной дозировкой. Приведенные значения коэффициента поглощения азота представляли собой среднее значение двух независимых расчетов CNA, полученных с использованием двух результатов по содержанию азота в фекальной массе из одного сбора стула. Различия средних значений CNA между тремя группами с различной дозировкой анализировали способом, аналогичным способу анализа средних значений CFA.

По аналогии с измерениями CFA для участников всех трех групп с различной дозировкой имело место значительное увеличение среднего значения CNA во время периода введения препарата по сравнению с начальным периодом. У субъектов всех трех групп с различной дозировкой CNA во время введения препарата был значительно больше как в ветви исследования 2, так и в ветви исследования 3, по сравнению с ветвью исследования 1. Кроме того, в ветвях исследования 2 и 3 было продемонстрировано большее среднее увеличение CNA от периода отсутствия ферментов до периода введения ферментов, чем в ветви исследования 1. Хотя в ветви 3 было продемонстрировано постоянное численное превышение результатов над результатами ветви 2, эта разность не являлась статистически значимой.

Таблица 4
Средний коэффициент поглощения азота - дисперсионный анализ
	Ветвь исследования 1 (N=39)	Ветвь исследования 2 (N=41)	Ветвь исследования 3 (N=37)	Всего (N=117)	Величина p*
Начальный период
N	39	41	36	116
Среднее значение (SD)	60,6 (16,38)	58,8 (17,88)	56,8 (16,36)	58,8 (16,84)
Период введения препарата**
N	39	41	37	117
Среднее значение (SD)	61,6 (15,46)	71,3 (16,38)	74,6 (13,51)	69,1 (16,05)	0,0009
Изменение по сравнению с исходным уровнем
N	39	41	36	116
Среднее значение (SD)	1,1 (14,89)	12,5 (18,37)	17,5 (18,00)	10,2 (18,33)	0,0002
Процентное (%) изменение по сравнению с исх. уровнем
N	39	41	36	116
Среднее значение (SD)	9,0 (48,83)	37,6 (96,72)	40,6 (45,04)	29,0 (69,74)	0,0883
* Итоговые величины p по результатам дисперсионного анализа. ** Результаты при введении препаратов (с использованием теста стьюдентизированного диапазона Tukey для попарных сравнений): ветвь исследования 1 относительно ветви исследования 2, величина p mITT = 0,0145. ветвь исследования 2 относительно ветви исследования 3, величина p mITT = 0,6130. ветвь исследования 1 относительно ветви исследования 3, величина p mITT = 0,0009.

Если исходные значения CNA 0-100% разбить на квинтили, при взгляде на фиг.2 становится ясно, что во всех группах с различным уровнем дозировки имелось более существенное увеличение коэффициента по сравнению с исходным уровнем, если этот исходный уровень CNA составлял 40% или менее по сравнению со случаем, когда исходный уровень CNA превышал 40%. Действие препаратов в ветвях исследования 2 и 3 по-прежнему оказывалось более эффективным, чем в ветви исследования 1. Кроме того, чем ниже исходное значение CNA, тем больше реакция на введение препарата.

Улучшение коэффициентов CFA и CNA и корреляция между ними

Исследование отразило значительное увеличение средних значений коэффициентов CFA и CNA во время периода введения препарата по сравнению с исходными значениями в группах со средним и высоким уровнями дозировки среди участников всех трех групп. Кроме того, в ветви исследования 3 (в группе с высоким уровнем дозировки) было продемонстрировано наибольшее среднее увеличение коэффициентов CFA и CNA в течение этого периода времени, хотя различие между средними и высокими дозировками не было статистически значимым. Даже после учета исходных значений CFA и CNA и пола субъектов, это влияние введения препаратов на CFA и CNA оставалось статистически значимым (p=0,0003 и <0,0001 соответственно).

Корреляция между увеличением CFA и увеличением CNA также была статистически значимой. Фиг.3 и 4 иллюстрируют эту корреляцию между CFA и CNA у пациентов mITT, которым вводили все дозы композиций по настоящему изобретению, на исходном уровне и на уровне введения препарата соответственно. Фиг.5 иллюстрирует различие корреляций между CFA и CNA у этих пациентов на уровне введения препаратов и на исходном уровне.

Оценка эффективности - анализ изменений по сравнению с исходным уровнем - отбор проб стула

Средние изменения частоты и массы стула в период введения препаратов по сравнению с начальным периодом по отношению к соответствующей величине в конце периода введения препаратов показаны отдельно для каждой исследованной группы в таблице 5 и таблице 6 соответственно.

Во всех трех ветвях исследования имело место уменьшение частоты стула в период введения препарата по сравнению с начальным периодом (p=0,0968, p=0,0975 и p=0,1807 соответственно). В частности, в ветви исследования 3 было продемонстрировано наибольшее среднее уменьшение (-.2.6 в mITT) частоты стула в период введения препарата по сравнению с начальным периодом (p=0,0003). Однако межгрупповое сравнение изменений частоты стула не выявило статистически значимой разницы между ветвями исследования.

Кроме того, имело место значительное уменьшение массы стула в период введения препаратов по сравнению с начальным периодом в группах со средним и высоким уровнями дозировки среди всех трех групп субъектов (p=0,0001). Хотя из всех трех групп участников исследования в ветви 3 было показано наибольшее среднее уменьшение массы стула в период введения препаратов по сравнению с начальным периодом (p<0,0001), попарное сравнение с применением теста стьюдентизированного диапазона Tukey не выявило статистически значимой разницы между ветвями исследования со средними и высокими дозировками препаратов.

Таблица 5
Изменение частоты стула в период введения препаратов по сравнению с начальным периодом
	Ветвь исследования 1 (N=39)	Ветвь исследования 2 (N=41)	Ветвь исследования 3 (N=37)	Всего (N=117)	Величина p*
Начальный период
N	39	41	37	117
Среднее значение (SD)	7,7 (3,04)	8,2 (3,49)	8,8 (4,56)	8,3 (3,73)
Период введения
N	39	41	37	117
Среднее значение (SD)	6,9 (3,06)	7,4 (4,37)	6,2 (3,01)	6,9 (3,56)
Изменения по сравнению с начальным периодом					0,0968
N	39	41	37	117
Среднее значение (SD)	-0,8 (3,39)	-0,9 (4,52)	-2,6 (4,04)	-1,4 (4,07)
Парный t-тест**	0,1393	0,2211	0,0003	0,0003
* Итоговые величины p по результатам дисперсионного анализа. ** Парный t-тест Примечание: результаты изменения по сравнению с исходным уровнем (с применением теста стьюдентизированного диапазона Tukey для попарных сравнений): ветвь исследования 1 относительно ветви исследования 2, mITT, величина p = 0,5502. ветвь исследования 2 относительно ветви исследования 3, mITT, величина p = 0,4842. ветвь исследования 1 относительно ветви исследования 3, mITT, величина p = 0,2040.

Таблица 6
Изменение массы стула (в граммах) в период введения препаратов по сравнению с начальным периодом
	Ветвь исследования 1 (N=39)	Ветвь исследования 2 (N=41)	Ветвь исследования 3 (N=37)	Всего (N=117)	Величина p*
Начальный период
N	38	41	36	115
Среднее значение (SD)	1234,0 (529,46)	1251,8 (474,14)	1396,8 (613,79)	1291,3 (539,16)
Период введения
N	38	41	37	116
Среднее значение (SD)	1174,1 (565,34)	937,3 (539,91)	869,2 (448,92)	993,2 (533,10)
Изменения по сравнению с начальным периодом					0,0001
N	38	41	36	115
Среднее значение (SD)	-59,9 (399,46)	-314,5 (455,89)	-514,2 (428,37)	-292,9 (463,44)
Парный t-тест**	0,3612	<0,0001	<0,0001	<0,0001
* Итоговые величины p по результатам дисперсионного анализа. ** Парный t-тест Примечание: результаты изменения по сравнению с исходным уровнем (с применением теста стьюдентизированного диапазона Tukey для попарных сравнений): ветвь исследования 1 относительно ветви исследования 2, mITT, величина p = 0,8842. ветвь исследования 2 относительно ветви исследования 3, mITT, величина p = 0,2415. ветвь исследования 1 относительно ветви исследования 3, mITT, величина p = 0,1971.

Оценка эффективности - переваривание крахмала и поглощение углеводов, измеренное по увеличению содержания глюкозы в крови

В провоцирующем тесте с крахмалом субъекты, которые не принимали пищу в течение ночи, т.е. как минимум 8 часов, получали стандартную тестовую пищу, включающую 100 граммов хлеба из белой муки (50 г углеводов) во время пребывания в стационаре в начальный период и период введения препаратов. Субъектам давали отдохнуть в течение 30 минут до начала стартового провоцирующего теста, и их активность была ограничена во время проведения измерений. Уровни глюкозы в крови измеряли глюкометром (Accucheck, Bayer). Измерения производили непосредственно перед тестовым приемом пищи. TheraCLEC вводили приблизительно в середине употребления хлеба. Последовательные измерения глюкометром производили в течение 4-часового периода. Рассчитанные значения включали максимальное изменение уровня глюкозы от уровня до приема пищи и максимальные изменения уровня глюкозы в присутствии и в отсутствие фермента (T17-T1). Субъекты с сахарным диабетом не принимали участия в провоцирующем тесте с крахмалом, если уровень глюкозы в крови был менее 75 мг/дл в голодном состоянии.

Реакцию организма, выражавшуюся в увеличении содержания глюкозы в крови, измеряли среди совокупности участников групп mITT с помощью следующих переменных.

Изменение уровня глюкозы с момента времени 0: изменение уровня глюкозы в каждый из моментов времени с момента времени 0.

Максимальный уровень глюкозы: максимальное значение уровня глюкозы с момента времени 0.

Максимальное изменение уровня глюкозы: определялось как максимальный уровень глюкозы минус уровень глюкозы в момент времени 0.

Время до появления максимального уровня глюкозы (T_max): определялось как время в часах от времени 0 до максимального изменения уровня глюкозы.

Для каждой из этих переменных представлена следующая описательная статистика по группам с различным уровнем дозировок:

1. Значение в отсутствие TheraCLEC

2. Значение в присутствии TheraCLEC

3. Значение в присутствии TheraCLEC - значение в отсутствие TheraCLEC

4. Соотношение значение в присутствии TheraCLEC : значение в отсутствие TheraCLEC (R).

Эти описательные статистические данные представлены как для всех субъектов, так и только для субъектов, у которых отсутствует диабет. Считалось, что у субъектов имеется связанный с кистозным фиброзом диабет, если у них была либо известная история болезни диабета, причем они принимали инсулин или связанные с диабетом пероральные лекарственные средства, либо измеренный у них в голодном состоянии уровень глюкозы 126 мг/дл или послеобеденный уровень глюкозы 200 мг/дл.

При составлении таблицы 7 из анализа были удалены данные для 25 субъектов, имевших диабет, связанный с кистозным фиброзом, для уменьшения непостоянства данных, связанного как с высокими исходными уровнями глюкозы, так и с уменьшением уровня глюкозы во время «провоцирующего теста с крахмалом» в результате утренней инъекции инсулина. Введение TCT5, по-видимому, приводило к появлению значительно меньшего (p=0,0053) количества субъектов с максимальным увеличением уровня глюкозы 10 мг/дл в присутствии фермента по сравнению с его отсутствием, чем TCT25. Кроме того, результаты таблицы 7 предполагают, что диапазон средних доз амилазы в ветви исследования 2 одинаково эффективен по сравнению с высокими дозами в ветви исследования 3.

Таблица 7
Провоцирующий тест с крахмалом у недиабетических пациентов с кистозным фиброзом - обзор максимальных изменений уровня глюкозы при наличии/отсутствии действия фермента
Максимальная глюкозы при наличии/отсутствии фермента	Ветвь исследования 1: TCT5	Ветвь исследования 2: TCT25	Ветвь исследования 3: TCT100
<10	21	14	15
>10	4	16	11
>20	3	8	8
* Общие данные точного теста Фишера: p=0,0138 TCT5 по отношению к TCT25, p=0,0053 TCT5 по отношению к TCT100, p=0,0644 TCT25 по отношению к TCT100, p=0,4357

В целом, данное исследование продемонстрировало, что у субъектов, которым вводились композиции по настоящему изобретению, достигалось улучшение переваривания крахмала и поглощения углеводов согласно данным по содержанию глюкозы в крови, причем субъектам, входившим в группу с высоким уровнем дозировок, требовалось меньше времени для достижения такого результата.

Пример 3 - Фаза 1 исследования

Перед фазой 2 описываемых исследований композиции по настоящему изобретению также оценивали с точки зрения их безопасности и предварительно оценивали их эффективность в рамках фазы 1 испытаний у пациентов с кистозным фиброзом, страдающих от недостаточности поджелудочной железы.

Исследование с открытой информацией о препаратах, с различными диапазонами дозировок выполняли для определения итоговой безопасности, переносимости и клинической активности TheraCLEC у 23 пациентов с кистозным фиброзом, страдающих от недостаточности поджелудочной железы. Субъекты получали 100, 500, 1000, 2500 или 5000 единиц липазы/кг/прием пищи в составе TCT в течение 3 дней. Проводили наблюдение за клиническими и лабораторными параметрами безопасности и нежелательными явлениями.

Во время фазы 1 исследования отсутствовали серьезные нежелательные явления или случаи смерти. Большинство нежелательных явлений были слабыми, хотя обычными были жалобы на желудочно-кишечный тракт. TheraCLEC повышал коэффициент поглощения жира и коэффициент поглощения азота у всех групп, за исключением субъектов, которые получали 100 единиц липазы/кг/прием пищи. Для всех субъектов при других уровнях дозировки среднее увеличение CFA = 20,6±23,5, среднее увеличение CNA=19,7±12,2% и уменьшение средней массы стула = 425±422 граммов.

TheraCLEC хорошо переносился в этом исследовании с непродолжительным введением препарата в дозировках до 5000 единиц липазы/кг/прием пищи. Предварительные данные по эффективности продемонстрировали положительное влияние на поглощение жира и азота. Преимущественно эти результаты наблюдались при дозировке 500 единиц липазы/кг/прием пищи и, по-видимому, нет необходимости повышать дозировку выше этого уровня для достижения указанных результатов. Эти данные были подтверждены в более обширных рандомизованных испытаниях фазы 2.

План фазы 1 исследований

Исследования с открытой информацией о препаратах в нескольких медицинских центрах с различными диапазонами дозировок проводили с основной целью определения итоговой безопасности и переносимости пяти уровней дозировки TheraCLEC субъектами с кистозным фиброзом, страдающими от недостаточности поджелудочной железы. Вторичные цели заключались в определении влияния TheraCLEC на поглощение жира и азота во рту, на желудочно-кишечные симптомы, а также на частоту и массу стула. TheraCLEC включал фиксированные пропорции липазы, амилазы и протеазы. Разделение участников на группы по уровню дозировок основывалось на дозировке липазы на кг за один прием пищи, как показано в таблице 8.

Таблица 8
Группы по уровню дозировки
Активные компоненты	Единиц USP/кг/прием пищи
Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 4	Группа 5
Липаза	500	1000	2500	5000	100
Протеаза	500	1000	2500	5000	100
Амилаза	75	150	375	750	15

Препараты доставлялись в виде капсул со следующими ферментами в фиксированных пропорциях: липаза 20000 единиц USP + протеаза 20000 единиц USP + амилаза 3000 единиц USP на одну капсулу.

Субъекты с кистозным фиброзом поступали в один из одиннадцати медицинских центров, аккредитованных CF Foundation, где их набирали для описываемого исследования. Все пациенты подписывали форму согласия на участие в исследовании, одобренную Институтским Наблюдательным Советом, и в случае педиатрических пациентов также давалось согласие родителей. Субъектов включали в исследование, если их возраст находился в пределах от 13 до 45 лет, если у них имелся диагноз «кистозный фиброз» на основании стандартных критериев [B.J. Rosenstein et al., The diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement , J. Pediatr., 132, pp. 589-595 (1998)], имелась недостаточность поджелудочной железы, установленная на основании содержания фекальной эластазы <100 мг/г, которое измеряли при амбулаторном скрининге с применением моноклонального анализа ELISA ScheBo (BioTech, США), наблюдался коэффициент поглощения жира 80%, измеренный при амбулаторном скрининге, объем форсированного выдоха в одну секунду (FEV₁) был 30% предсказанного, индекс массы тела был > 10-го персентиля и больные имели клинически стабильное состояние с отсутствием симптомов острой инфекции верхней или нижней части дыхательных путей. Субъектов исключали из исследования, если они были беременны или кормили грудью, в предшествующие шесть месяцев наблюдался приступ синдрома непроходимости дистальной части кишечника, требующий вмешательства в кабинете экстренной помощи или в клинике, они принимали лекарственные препараты, которые изменяли pH в желудке (например, антагонисты гистаминового-2 рецептора, ингибиторы протонной помпы или антациды) в течение последней недели и не могли прекратить прием этих препаратов во время исследования, были больны в прошлом фиброзирующей колонопатией, аллергическим бронхолегочным аспергиллезом или печеночным заболеванием, определенным с помощью следующих критериев: двукратное превышение аланинаминотрансферазы (AST), аспартатаминотрансферазы (ALT) или щелочной фосфатазы над нормальным уровнем; имелись в прошлом варикозные кровотечения; на биопсии печени заметны симптомы цирроза или серьезного заболевания; имеется трансплантат печени; субъект принимал в предыдущем году урсодеоксихолевую кислоту. Также исключались субъекты, которые были неспособны прекратить питание с помощью зонда во время проходящей в стационаре части исследования, субъекты с установленной гиперчувствительностью к пищевым добавкам, или субъекты, которые в предшествующий месяц участвовали в программах исследования других не утвержденных лекарств, биологически активных веществ или устройств.

Если субъекты удовлетворяли критериям во время первичного посещения по поводу отбора, их помещали в исследовательский клинический центр. Прописанная субъекту ферментная терапия прекращалась, субъект принимал перорально индикаторный маркер (краситель синий № 2 FD&C 500 мг) и переходил на специальную диету, состоящую из 100 граммов жира и минимум 2 граммов белка на килограмм массы тела в день, разделенных на три приема пищи и две закуски. Фактическое потребление жира и белка фиксировалось на основании количества принятой пищи. Через 72 часа пребывания субъекта на специальной диете диету прекращали и давали второй индикаторный маркер. В это время пациенты вновь получали свою нормальную ферментную терапию. Сбор стула для оценки содержания жира и азота в фекалиях начинали после первого стула, в котором наблюдался синий маркер, и заканчивали, когда проходил второй маркер, причем этот стул включали в собранную массу. Рассчитывали CFA, и если коэффициент был 80%, считалось, что субъект подходит для фазы введения препаратов описываемого исследования.

Субъектов вновь помещали в клинический исследовательский центр и прекращали введение обычных добавок панкреатических ферментов. Давали краситель в качестве маркера, назначали специальную диету, и субъект принимал исследуемые препараты во время каждого из трех приемов пищи и двух закусок в течение следующих 72 часов в дозировках, установленных для данной группы, как описано выше по тексту. Субъектам давались инструкции принимать исследуемые препараты перед каждым приемом пищи. Через 72 часа специальная диета прекращалась и субъектам давали второй индикаторный маркер. В это время пациенты вновь получали свою нормальную ферментную терапию. Методика сбора стула была аналогична описанной выше. Заключительный телефонный звонок осуществлялся в течение трех дней с момента, когда участник исследования покидал исследовательский клинический центр, и заключительное посещение производилось в срок от трех до семи дней после выхода больного из центра.

Мониторинг безопасности включал частоту нежелательных явлений, которая определялась путем окончательного опроса субъектов исследования во время амбулаторных посещений и пребывания в стационаре, а также во время запланированных телефонных звонков, частоту появления аномальных результатов лабораторных тестов, включая регулярные гематологические исследования, химический анализ сыворотки, а также профиль свертывания крови, анализ мочи, выделение мочевой кислоты с мочой и определение гема и лейкоцитов в стуле. Также следили за частотой проявления желудочно-кишечных симптомов, которую определяли с помощью GI-specific modified Cystic Fibrosis Questionnaire (CFQ) (Модифицированный вопросник по симптомам желудочно-кишечного тракта для больных кистозным фиброзом) [A.Quittner et al., CFQ Cystic Fibrosis Questionnaire, a Health Related Quality of Life Measure , English Version 1.0 (2000)].

Надзор за данными испытаниями осуществлял Therapeutics Development Network Data Safety and Monitoring Board (DSMB) (Совет по развитию терапии, сетевым данным по безопасности и мониторингу), относящийся к CF Foundation. DSMB следил за данными по безопасности групп с увеличивающимися дозировками на протяжении исследования, причем требовалась формальная оценка безопасности прежде чем субъекты могли быть включены в состав группы, получавшей дозировку 5000 единиц липазы/кг/прием пищи, т.к. эта доза превышала современные рекомендации по дозировке. Кроме того, DSMB несла ответственность за остановку испытаний в любой момент времени по причине беспокойства за безопасность субъектов.

Композиция фазы 1

Три ферментных компонента TheraCLEC , т.е. липазу, протеазу и амилазу, получали независимо. Липазу получали ферментацией из бактерий Burkholderia cepacia (ранее известных как Pseudomonas cepacia) и затем обрабатывали для получения кристаллов липазы, которые после этого подвергали сшиванию, создавая форму фермента, устойчивую к кислотам и протеазам без применения кишечного покрытия (именуемую TheraCLEC -липазой). Каждую партию специально культивировали для выявления микробиологического загрязнения Burkholderia cepacia, причем для допуска партии к клиническому применению она не должна была содержать Burkholderia cepacia. Протеазный компонент получали из Aspergillus melleus; амилазный компонент получали при ферментации Aspergillus oryzae. Подобным же образом эти продукты проходили многостадийную очистку, после чего их подвергали культивированию для выявления любых плесенных и дрожжевых грибков.

Три перечисленных ферментных компонента, входящих в TheraCLEC , были заключены в содержащую порошок капсулу. Предклинические исследования эффективности продемонстрировали, что липаза и протеаза были эффективны при дозировках 500 единиц липазы/кг/прием пищи и 1000 единиц протеазы/кг/прием пищи в модели собаки с недостаточностью поджелудочной железы. In vitro анализ полученной из Aspergillus амилазы в TheraCLEC проводили с использованием методологии как USP, так и FCC (Food Chemical Codex)(кодекс пищевой химии) (которая эквивалентна методологии USP, применяемой для тестирования лекарств). Грибковая амилаза имела другой профиль pH по сравнению со свиной амилазой. Грибковая амилаза в двадцать раз более активна при pH 4,8, чем свиная амилаза. Таким образом, для TheraCLEC была выбрана доза амилазы по отношению к липазе в двадцать раз ниже той, которую можно было бы обнаружить в стандартной капсуле панкрелипазы.

3. Анализ данных фазы 1 исследования

Коэффициент поглощения жира рассчитывали по следующей формуле:

То же уравнение, в котором использовалось количество граммов азота, применяли для расчета коэффициента поглощения азота (CNA).

Авторы планировали суммировать демографические и прогностические характеристики, включая возраст, пол, расовую принадлежность, генотип, функцию легких и спот-тест фекальной эластазы по дозировочным группам и в целом. Размер выборки для описываемой фазы 1 исследования согласно оценкам составлял 20 субъектов, по 4 субъекта в дозировочной группе. Исследование не служило материалом для формального статистического тестирования. Авторы планировали группировать нежелательные явления с использованием стандартной системы классификации. Частота появления аномальных результатов лабораторных исследований табулировалась по периоду исследования, моменту времени и дозировочной группе.

4. Результаты фазы 1 исследования

В 11 центрах кистозного фиброза в списки было включено двадцать три субъекта (14 М). Средний возраст субъектов составлял 23,5±7,8 (SD) (диапазон = 15,2-44,5 лет) (таблица 9). По одному дополнительному субъекту было включено в состав групп 1, 3 и 5 в результате того, что несколько центров привлекли субъектов одновременно.

Таблица 9
Демография участников исследования
Количество пациентов	Возраст (n=23)
Запланировано	20	Параметр	Лет
Включено	23	Средний	23,5
Прекращено введение исслед. препарата	0	Стандартное отклонение	7,8
Мин-Макс	15,2-44,5 лет
Расовая принадлежность (n=23)	Пол (n=23)
Параметр	N(%)	Параметр	N(%)
Европейская раса	22 (95,7%)	Мужской	14 (61%)
Черная раса	0 (0,0%)	Женский	9 (39%)
Азиаты	0 (0,0%)
Латиноамериканцы	0 (0,0%)
Другие	1 (4,3%)

5. Безопасность

TheraCLEC хорошо переносился на всех уровнях дозировки. Не было зафиксировано серьезных нежелательных явлений или случаев смерти, и не было пациентов, отстраненных от исследования. Во время периода, предшествовавшего введению препаратов, в отсутствие ферментной терапии, желудочно-кишечная система являлась наиболее беспокоящей пациентов системой организма, причем 14 субъектов при общем количестве 23 сообщали о нежелательных явлениях в этот период. Наиболее обычными нежелательными явлениями в период, предшествовавший введению препаратов, являлись дискомфорт в брюшной полости (4 субъекта, сообщившие о 5 случаях), боль в верхней части брюшной полости (4 субъекта, сообщившие о 4 случаях) и скопление газов (4 субъекта, сообщившие о 4 случаях). Второй системой организма, наиболее часто причинявшей беспокойство пациентам, являлась дыхательная система, причем 5 субъектов сообщили о 8 нежелательных явлениях в период, предшествовавший введению препарата. Наиболее обычным нежелательным явлением в этот период был кашель (4 субъекта, сообщившие о 4 случаях).

Нежелательные явления, появлявшиеся во время введения препаратов и начавшиеся после дня 2, наблюдались у 18 (78,3%) из 23 субъектов. Отсутствовали статистически значимые различия между группами по частоте появления нежелательных явлений при введении препаратов (p=0,6196). Имелось 11 (47,8%) субъектов с нежелательными явлениями, связанными с приемом препаратов (определялись как события, классифицированные исследователем, как возможно или вероятно связанные с исследуемыми препаратами).

У шести субъектов во время исследования наблюдалось увеличение уровня аланинаминотрансферазы (ALT) и/или аспартатаминотрансферазы (AST). Четыре субъекта имели повышенные уровни ферментов, которые появились после введения исследуемых препаратов. Один субъект (группа 1) имел высокий уровень ALT во время посещения в конце исследования, и один субъект (группа 5) имел повышенный уровень AST при завершающей оценке во время последнего посещения.

6. Эффективность

Как показано в таблице 10 и на фиг.6 и 7, предварительные клинические данные по активности в группах 1-4 продемонстрировали, что введение TheraCLEC увеличивало коэффициенты CFA и CNA по сравнению с периодом отсутствия каких-либо добавок панкреатических ферментов. Для всех субъектов в группах 1-4 среднее увеличение CFA составляло 20,6±23,5% и среднее значение CNA увеличивалось на 19,7±12,2%. Масса стула также уменьшалась после введения TheraCLEC в этих же группах при среднем уменьшении, составлявшем 425±422 граммов. При действии самых низких дозировок TheraCLEC (группа 5: 100 единиц USP липазы/кг/прием пищи, 100 единиц USP протеазы/кг/прием пищи и 15 единиц USP амилазы/кг/прием пищи) имело место минимальное повышение CFA и CNA по сравнению с их уровнями до введения ферментов.

Таблица 10
Клиническая активность TheraCLEC : изменения в период введения препаратов по сравнению с периодом отбора
Изменения от исх. уровня	Группа 1 (N=5)	Группа 2 (N=4)	Группа 3 (N=5)	Группа 4 (N=4)	Группа 5 (N=5)	Всего (N=23)
CFA1 среднее значение (SD)	22,7% (19,4)	17,7% (25,9)	18,9% (11,9)	17,2% (42,3)	1,2% (20,3)	15,4% (23,8)
CNA2 среднее значение (SD)	20,3% (14,2)	14,4% (18,0)	15,8% (5,7)	20,6% (16,5)	0,1% (4,1)	14,0% (13,7)
Частота стула среднее значение (SD)	-1,2 (1,5)	-0,8 (1,7)	-2,6 (1,7)	-2,8 (2,6)	0,2 (3,3)	-1,4 (2,4)
Масса стула средняя масса (г) стула (SD)	-311,4 (371,7)	-308,8 (367,5)	-613,2 (423,3)	-836,0 (284,7)	-116,8 (373,2)	-425,5 (422,2)
SD=стандартное отклонение 1Коэффициент поглощения жира=100*(количество граммов потребленного жира - количество граммов полученного жира)/(количество граммов потребленного жира). 2Коэффициент поглощения азота=100*(количество граммов потребленного азота - количество граммов полученного азота)/(количество граммов потребленного азота).

Результаты фазы 1 исследования

TheraCLEC , по-видимому, показал себя безопасным и хорошо переносимым препаратом в описанном трехдневном исследовании. У возникавших во время введения препарата нежелательных явлений отсутствовала связь с дозировкой. Во время описываемого исследования частыми были жалобы на желудочно-кишечный тракт, причем они имели место во время приема субъектами их обычных препаратов, в то время, когда субъекты не принимали ферментов, а также во время приема TheraCLEC , хотя с наименьшей частотой жалобы поступали в течение амбулаторного периода, когда субъекты принимали обычные препараты. Во время той части исследования, которая проходила в стационаре, субъектов на регулярной основе опрашивали по поводу жалоб на желудочно-кишечный тракт, вызывая таким образом отклонение результатов. Увеличение уровней печеночных ферментов и наличие в стуле гема и лейкоцитов не было более частым во время приема субъектами TheraCLEC по сравнению с периодами, когда они не получали ферментов или получали обычные препараты.

При приеме TheraCLEC имело место увеличение поглощения жиров и азота по сравнению с исходным уровнем, что продемонстрировало эффективность липазного и протеазного компонентов TheraCLEC . По-видимому, при дозировках липазы, превышающих 500 ед/кг/прием пищи, реакция организма перестает зависеть от дозы. Хотя имела место тенденция в сторону уменьшения каловой массы при увеличении дозировок, диапазон был значительным. Значения CFA в данном исследовании, по-видимому, были ниже значений, указанных в опубликованных литературных данных. В число возможных объяснений входит отклонение результатов из-за выбранных субъектов, диеты, методики сбора стула и расписания приема ферментов.

Все субъекты в данном исследовании имели серьезную недостаточность поджелудочной железы, что определялось с помощью скрининга фекальной эластазы и подтверждалось значением коэффициента CFA в отсутствие ферментов. Другие исследования включали пациентов с достаточной функцией поджелудочной железы, что приводило к сдвигу средние значения коэффициента CFA в область более высоких значений [R.C.Stern et al., "A Comparison of the Efficacy and Tolerance of Pancrelipase and Placebo in the Treatment of Steatorrhea in Cystic Fibrosis Patients with Clinical Exocrine Pancreatic Insufficiency", Am J. Gasteroenterol., pp. 1932-1938 (2000); M.P Francisco et al., "Ranitidine and Omeprazole as Adjuvant Therapy to Pancrealipase to Improve Fat Absorption in Patients with Cystic Fibrosis", J. Pediatr. Gastrenterol. Nutr., 35, pp. 79-83 (2002)].

В данном исследовании субъекты в течение дня получали не менее 100 г жира. Значения CFA в литературе, которые были получены на основании обычной диеты пациентов, вероятно, относились к меньшему поступлению жира, т.к. многие амбулаторные пациенты употребляют менее 100 граммов жира в день [P. Durie et al., "Uses and Abuses of Enzyme Therapy in Cystic Fibrosis", J. Royal Soc. Med., 91, suppl. 34, pp. 2-3 (1998); D.A. Kawchak et al., "Longitudinal, Prospective Analysis of Dietary Intake in Children with Cystic Fibrosis", J. Pediatr., 129, pp. 119-129 (1996)]. Поступающий в меньших количествах жир мог бы быть легче переработан остаточной компенсаторной лингвальной липазой, наблюдаемой у пациентов с кистозным фиброзом [B. Fredrikzon et al., "Lingual Lipase: an Important Lipase in the Digestion of Dietary Lipids in Cystic Fibrosis?", Pediatr. Res., 14, pp. 1387-1390 (1980)].

В качестве маркера при сборе стула применялся синий пищевой краситель. В ряде случаев средний медицинский персонал клинического исследовательского центра сообщал, что карминовый красный или угольный маркеры могут обнаруживаться в стуле с трудом. Краситель синий № 2 FD&C при пероральной дозировке 500 мг легко заметен при появлении в стуле и четко выделяет начало и конец сбора стула. Укороченный сбор стула может привести к обнаружению меньшего количества жира в общей массе стула, что ведет к ошибочно высокому значению CFA. Предыдущие исследования могли содержать ошибочные данные относительно высоких значений CFA из-за трудности идентификации начала и конца сбора стула. Поскольку процесс сбора стула является неприятным, люди склонны завершать его как можно быстрее.

Хотя изложенное выше изобретение было описано в определенных подробностях с привлечением иллюстраций и примеров для ясности и легкости понимания, обычному специалисту в данной области техники в свете идей данного изобретения будет совершенно очевидно, что изобретение можно подвергнуть определенным изменениям и модификациям не отступая от сути и объема изложенного в настоящей заявке, включая приложенную формулу изобретения.