устойчивые к цианидам нитрилгидратазы

Формула изобретения

1. Выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого на 95-100% идентична аминокислотным последовательностям, представленным в последовательностях SEQ ID NO: 2, 3 и 5 или 7, 8 и 10, причем указанный полипептид обладает активностью, устойчивой к цианидам нитрилгидратазы.

2. Полинуклеотид по п.1, выбранный из группы, включающей

а) полинуклеотид, который содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 или комплементарные им нуклеотидные последовательности,

б) полинуклеотид, который содержит нуклеотидные последовательности, которые соответствуют последовательностям, указанным в подпункте а), в пределах вырожденности генетического кода,

в) полинуклеотид, который содержит нуклеотидные последовательности, указанные в подпункте а), несущие функционально нейтральные смысловые мутации,

г) полинуклеотид, который гибридизуется с комплементарными последовательностями, указанными в подпункте а), в строгих условиях, где строгие условия предусматривают отмывку в 5×SSC при температуре от 50 до 65°С, где полинуклеотид кодирует устойчивую к цианидам нитрилгидратазу.

3. Полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, которые идентичны на 95-100% последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2, 3 и 5 или 7, 8 и 10, причем указанный полипептид обладает активностью, устойчивой к цианидам нитрилгидратазы.

4. Полипептид по п.3, активность которого, сохранившаяся после превращения метакрилнитрила в присутствии 20 мМ (мМ = ммоль/л) ионов цианида при 20°С через 30 мин, составляет предпочтительно по меньшей мере 90% от сохранившейся активности этого фермента, при его применении для превращения в отсутствии ионов цианида в условиях, которые не отличаются по остальным параметрам.

5. Способ ферментативного получения амидов из нитрилов, заключающийся в том, что

а) превращают соединение, содержащее нитрильные группы, с помощью микробного фермента (полипептида), который обладает нитрилгидратазной активностью, и

б) удаляют образовавшийся амид, применяя для превращения нитрила в амид устойчивую к цианидам нитрилгидратазу-полипептид, содержащий аминокислотные последовательности, которые идентичны на 95-100% последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2, 3 и 5 или 7, 8 и 10, причем указанный полипептид обладает активностью, устойчивой к цианидам нитрилгидратазы.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что применяют для превращения нитрила в амид нитрилгидратазу, активность которой, сохранившаяся после превращения метакрилнитрила в присутствии 20 мМ (мМ = ммоль/л) ионов цианида при 20°С через 30 мин, составляет предпочтительно по меньшей мере 90% от сохранившейся активности этого фермента, при его применении для превращения в отсутствии ионов цианида в условиях, которые не отличаются по остальным параметрам.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что применяют продуцирующие и содержащие фермент микроорганизмы или их лизат.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что применяют покоящиеся клетки микроорганизма.

9. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что применяют очищенную нитрилгидратазу.

10. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что фермент получают из микроорганизмов рода Pseudomonas.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что фермент получают из применяемых микроорганизмов видов Pseudomonas putida или Pseudomonas marginalis.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что применяют микроорганизмы, депонированные под номерами DSM 16275 и DSM 16276.

13. Способ по п.5, отличающийся тем, что соединения общей формулы (I) и (II)





в которых

Х обозначает ОН, Н, алкил, NH ₂;

R обозначает Н, насыщенный алкильный радикал с разветвленной или неразветвленной цепью, несущий от 1 до 12 атомов углерода, необязательно замещенный NH₂,

ненасыщенный алкильный радикал с одной двойной связью с разветвленной или неразветвленной цепью, несущий от 1 до 12 атомов углерода, циклоалкильные группы, содержащие от 3 до 6 атомов углерода, алкиленовые радикалы, замещенные алкилтиогруппами, где алкил в рассматриваемом случае представляет собой С₁ -С₃алкильный радикал, и алкилен представляет собой двухвалентный С₃-С₈алкиленовый радикал,

R' обозначает Н, алкил, несущий от 1 до 3 атомов углерода,

R'' обозначает одноядерное или двухъядерное ненасыщенное кольцо, которое содержит от 6 до 12 атомов углерода и которое необязательно замещено одной или двумя C₁-С₃ алкильными группами, Cl, Br, F, алкилнитрил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода,

превращают в соответствующие амиды.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что соединение общей формулы (I) превращают в присутствии гидроциановой кислоты или соли гидроциановой кислоты.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что превращение осуществляют в присутствии начальной концентрации цианида, составляющей от не более 0,5 мол.% до 3 мол.% в пересчете на применяемый нитрил.

16. Способ по одному или нескольким из пп.13-15, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют 2-амино-4-метилтиобутиронитрил.

17. Способ по одному или нескольким из пп.13-15, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил, который при необходимости присутствует в реакционной смеси при получении этого нитрила.

18. Способ по одному или нескольким из пп.13-15, отличающийся тем, что в качестве нитрила применяют 2-гидрокси-2-метилпропионитрил.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к устойчивым к цианидам нитрилгидратазам, прежде всего из штаммов Pseudomonas putida или Pseudomonas marginalis, которые обладают повышенной устойчивостью к цианидам, их применению для получения амидов из нитрилов в присутствии цианидов и к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим указанный фермент.

Превращение -гидроксинитрилов (циангидрины) и -аминонитрилов в соответствующие амиды с помощью нитрилгидратаз открывает новый вариант синтеза -гидроксиаминокислот и -аминокислот, поскольку процесс гидролиза -гидроксиамидов и -аминоамидов является простым (Process and catalysts for the production of methionine, Ponceblanc, Herve; Rossi, Jean-Christophe; Laval, Philip; Gros, Georges (фирма Rhone-Poulenc Animal Nutrition SA, Франция), (WO 2001060789)). В другом варианте -гидроксиамиды можно подвергать также взаимодействию с гидроксидами щелочных металлов или щелочно-земельных металлов с получением соответствующих солей гидроксикислот. В этом плане наиболее предпочтительной реакцией является взаимодействие 4-метилтио- -гидроксибутирамида (МГА-амид) с гидроксидом кальция, поскольку кальциевую соль МГА можно применять непосредственно в качестве пищевой добавки в виде продукта, который представляет собой альтернативу метионину или МГА.

Однако -гидроксинитрилы и -аминонитрилы легко расщепляются до альдегидов и гидроциановой кислоты и альдегидов, гидроциановой кислоты и аммиака соответственно. Образовавшаяся гидроциановая кислота является сильным ингибитором почти всех известных нитрилгидратов за исключением нитрилгидратазы из штамма Rhodococcus equi XL-1, для которой установлена наименьшая из известных к настоящему времени потеря активности в присутствии 20 мМ цианида (Production of amides from nitriles by Rhodococcus equi cells having a cyanide resistant-nitrile hydratase. Nagasawa, Tohru; Matsuyama, Akinobu (фирма Daicel Chemical Industries, Ltd., Япония), (ЕР 1266962 A)).

Низкая продуктивность, составляющая примерно 8 г амида на 1 г биомассы в сухом состоянии покоящихся клеток, большая продолжительность реакции, составляющая 43 ч, и относительно невысокая концентрация продукта, составляющая 75 г/л, обусловливают поиск нитрилгидратаз с улучшенными характеристиками.

Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать биокатализаторы, которые не имеют указанных ограничений. Кроме того, поскольку получают -гидроксинитрилы и -аминонитрилы, целесообразной является еще более высокая устойчивость биокатализатора к цианидам для гарантии быстрого и полного взаимодействия альдегида, предпочтительно с 1-3%-ным избытком гидроциановой кислоты, часть которой остается в продукте. Таким образом, в процессе биотрансформации концентрации цианида могут превышать 20 мМ. Побочные продукты и реагенты, такие как амины, которые используют в качестве вспомогательных оснований, не должны также ингибировать активность нитрилгидратазы.

Объектом изобретения являются нитрилгидратазы, обладающие повышенной стабильностью в присутствии ионов цианида в реакционном растворе в процессе превращения нитрилов в амиды.

Изобретение относится к полинуклеотидам, выделенным прежде всего из микроорганизмов рода Pseudomonas, которые кодируют полипептиды, аминокислотные последовательности которых на 90-100% идентичны аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 8, 10, где полипептиды, имеющие последовательности SEQ ID NO: 2, 3, 5 или 7, 8, 10, в сочетании друг с другом в каждом случае обладают активностью устойчивой к цианидам нитрилгидратазы или образуют указанную нитрилгидратазу.

Полинуклеотиды предпочтительно получают из Pseudomonas putida или Pseudomonas marginalis.

Изобретение относится также к полинуклеотидам, выбранным из группы, включающей:

а) полинуклеотиды, которые содержат или состоят из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 или комплементарных им нуклеотидных последовательностей,

б) полинуклеотиды, которые содержат нуклеотидные последовательности, которые соответствуют последовательностям, указанным в подпункте а), в пределах вырожденности генетического кода,

в) полинуклеотиды, которые содержат нуклеотидные последовательности, указанные в подпункте а), несущие функционально нейтральные смысловые мутации,

г) полинуклеотиды, которые гибридизуются с комплементарными последовательностями, указанными в подпункте а) или в), в строгих условиях, где полинуклеотиды кодируют устойчивую к цианидам нитрилгидратазу.

Изобретение относится также к полипептидам, кодируемым указанными полинуклеотидами и имеющим последовательности SEQ ID NO: 2, 3, 5 или 7, 8, 10, которые обладают активностью устойчивых к цианидам нитрилгидратаз, полученным из микроорганизмов рода Pseudomonas, которыми либо могут быть обогащены микроорганизмы, либо они могут присутствовать в выделенной форме. SEQ ID NO: 2 и 7 кодируют альфа-субъединицы нитрилгидратаз, SEQ ID N0: 3 и 8 кодируют бета-субъединицы нитрилгидратаз, a SEQ ID NO: 5 и 10 кодируют белки-активаторы, совместная экспрессия которых оказывает существенное воздействие на активность нитрилгидратаз (Nojiri и др., Journal of Biochemistry, 125, 1999, с.696-704).

Согласно изобретению предпочтительно использовать клетки-хозяева, трансформированные или трансфектированные полинуклеотидами, предлагаемыми в изобретении.

Клетки-хозяева могут представлять собой эукариотические или прокариотические клетки, для которых известна стабильная система экспрессии, в частности предпочтительными для применения организмами-хозяевами являются микроорганизмы, для которых существуют системы экспрессии, такие, например, как Pseudomonas, Pichia, различные виды дрожжей, представители семейства Saccharomyces, Aspergillus или Streptomyces, прежде всего Е.coli. Пригодными являются также микроорганизмы рода Rhodococcus.

Векторную ДНК можно интродуцировать в эукариотические или прокариотические клетки с помощью известных методов трансформации или трансфекции.

Понятия «трансформация», «трансфекция», «конъюгация» и «трансдукция» относятся к методам введения чужеродной ДНК, которые известны из существующего уровня техники.

Изобретение относится также к полинуклеотидам, состоящим практически из одной полинуклеотидной последовательности, которую можно получать путем скрининга с помощью гибридизации соответствующей генной библиотеки Pseudomonas marginalis или Pseudomonas putida, содержащей полный ген или его часть, с зондом, который содержит последовательности полинуклеотидов, предлагаемых в изобретении, которые выбраны из SEQ ID NO: 1, 4 или 6, 9 или их фрагментов, и выделения указанной полинуклеотидной последовательности.

Полинуклеотиды, которые имеют последовательности, предлагаемые в изобретении, можно применять в качестве зондов гибридизации для РНК, кДНК и ДНК, для цели выделения полноразмерных нуклеиновых кислот или полинуклеотидов или генов, которые кодируют белки, предлагаемые в изобретении, или для выделения нуклеиновых кислот или полинуклеотидов или генов, последовательности которых имеют высокую степень сходства с последовательностями генов, предлагаемых в изобретении. Их можно применять также в качестве зондов для так называемых «наборов», «микронаборов» или «ДНК-чипов» для обнаружения и определения соответствующих полинуклеотидов или выведенных из них последовательностей, таких, например, как РНК или кДНК.

Полинуклеотиды, которые имеют последовательности, предлагаемые в изобретении, можно применять также в качестве праймеров, которые можно использовать в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения ДНК из генов, которые кодируют белки, предлагаемые в изобретении.

Такие олигонуклеотиды, служащие в качестве зондов или праймеров, содержат по меньшей мере 25 или 30, предпочтительно по меньшей мере 20, наиболее предпочтительно по меньшей мере 15, последовательно расположенных нуклеотидов. Можно применять также олигонуклеотиды, состоящие по меньшей мере из 40 или 50 нуклеотидов. При необходимости можно применять олигонуклеотиды, состоящие по меньшей мере из 100, 150, 200, 250 или 300 нуклеотидов.

Понятие «выделенный» означает выделенный из его естественного окружения.

Как правило, понятие «полинуклеотид» относится к полирибонуклеотидам и полидезоксирибонуклеотидам, причем это может относиться к модифицированной или немодифицированной РНК или ДНК.

Полинуклеотиды, предлагаемые в изобретении, включают полинуклеотиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 или содержащиеся в них фрагменты, а также полинуклеотиды, которые идентичны по меньшей мере на 90, 93, 95, 97 или 99% полинуклеотидам, имеющим последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9 или содержащиеся в них фрагменты.

Понятие «полипептиды» обозначает пептиды или белки, которые содержат две или большее количество аминокислот, связанных пептидными связями.

Полипептиды, предлагаемые в изобретении, включают полипептиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 8, 10, а также полипептиды, которые по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 91, 95, 97 или 99% идентичны полипептидам, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 8, 10.

Полученные последовательности ДНК можно затем изучать с помощью известных алгоритмов или программ анализа последовательностей, таких как программы Staden (Nucleic Acids Research 14, 1986, с.217-232), Marck (Nucleic Acids Research 16, 1988, с.1829-1836) или программа GCG, разработанная Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 1998, с.74-97).

Кодирующие последовательности ДНК, которые получают из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9, в результате вырожденности генетического кода также являются составной частью изобретения. Аналогично этому составной частью изобретения являются последовательности ДНК, которые гибридизуются с этими последовательностями или их фрагментами. Кроме того, в данной области известны консервативные аминокислотные замены, такие как замена в белках глицина на аланин или аспарагиновой кислоты на глутамовую кислоту, так называемые «смысловые мутации», которые не приводят к существенному изменению активности белка, т.е. являются функционально нейтральными. Кроме того, известно, что замены на N-конце и/или С-конце белка не приводят к существенному ухудшению функции белка или даже могут стабилизировать ее. Специалист в данной области может найти соответствующие указания, в частности, у Ben-Bassat и др. (Journal of Bacteriology 169, 1987, c.751-757), O'Regan и др. (Gene 77, 1989, c.237-251), Sahin-Toth и др. (Protein Sciences 3, 1994, c.240-247) и у Hochuli и др. (Bio/Technology 6, 1988, c.1321-1325) и в известных учебниках по генетике и молекулярной биологии.

Наконец, составной частью изобретения являются последовательности ДНК, полученные с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1, 4, 6, 9. Такие олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере 15 последовательно расположенных нуклеотидов, в частности 20, 30 или 40.

Специалист в данной области может найти инструкции для идентификации последовательностей ДНК с помощью гибридизации, среди прочего в руководстве «The DIG System Users Guide for Filter Hybridization», опубликованном компанией Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) и у Liebl и др. (International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 1991, с.255-260). Гибридизацию осуществляют в строгих условиях, т.е. это означает, что образуются только те гибриды, в которых зонд и последовательность-мишень, т.е. полинуклеотиды, которые взаимодействуют с зондом, идентичны по меньшей мере на 90%. Известно, что на строгость гибридизации, в том числе на стадиях отмывки, можно влиять или оказывать определяющее воздействие путем вариации состава буфера, температуры и концентрации соли. Реакцию гибридизации предпочтительно осуществляют при строгости, существенно меньшей по сравнению со строгостью на стадиях отмывки (руководство Hybaid Hybridisation Guide, фирма Hybaid Limited, Теддингтон, Великобритания, 1996).

Например, для реакции гибридизации можно использовать 5×SSС-буфер при температуре примерно 50-68°С. В этих условиях зонды можно гибридизовать также с полинуклеотидами, которые идентичны последовательности зонда менее чем на 70%. Такие гибриды являются менее стабильными и удаляются при отмывке в строгих условиях. Это можно осуществлять, например, путем понижения концентрации соли до 2×SSC и при необходимости затем до 0,5×SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, фирма Boehringer Mannheim, Маннгейм, Германия, 1995), при этом температуру устанавливают на уровне примерно 50-68°С. При необходимости можно понижать концентрацию соли до 0,1×SSC. Путем ступенчатого повышения температуры гибридизации от 50 до 68°С с интервалами примерно 1-2°С можно выделять полинуклеотидные фрагменты, которые идентичны, например, по меньшей мере на 90-95% последовательности используемого зонда. Дополнительные инструкции по гибридизации поступают в продажу в составе наборов (например DIG Easy Hyb, поставляемый фирмой Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия, каталожный номер 1603558).

Специалист в данной области может найти инструкции для амплификации последовательностей ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), в частности, в справочнике Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (изд-во IRL Press, Oxford, UK, 1984) и у Newton и Graham: PCR (изд-во Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).

В целом подход заключается в том, что клонируют ген, который обладает высоким уровнем экспрессии, в векторе с небольшим количеством копий и клонируют гены, которые обладают более низким уровнем экспрессии, в векторе с большим количеством копий и/или с использованием сильного промотора. Клетки-хозяева трансформируют указанными векторами так, что они в каждом случае содержат по сравнению с исходным организмом по меньшей мере одну дополнительную копию нуклеотидных последовательностей, кодирующих образование нитрилгидратазы или других белков.

Трансформированные или рекомбинантные микроорганизмы, полученные таким путем, прежде всего относящиеся к роду Pseudomonas, также являются составной частью изобретения.

Было установлено, что усиление в микроорганизмах генов, которые кодируют нитрилгидратазу, предлагаемую в изобретении, и хелперный белок Р47К, приводит к усиленному производству нитрилгидратазы или также к повышению активности нитрилгидратазы.

В контексте настоящего описания понятие «усиление» обозначает повышение в микроорганизме внутриклеточной активности одного или нескольких ферментов, кодируемых соответствующей ДНК, по сравнению с исходным, нерекомбинантным, микроорганизмом за счет, например, увеличения количества копий гена или генов, использования более сильного промотора или гена, кодирующего соответствующий фермент с более высокой активностью, и при необходимости сочетания этих мер.

Для достижения сверхэкспресии можно подвергать мутации промоторную или регуляторную область или сайт связывания рибосом, расположенный против хода транскрипции относительно структурного гена. Таким же образом действуют кассеты экспрессии, встроенные против хода транскрипции относительно структурного гена. Кроме того, экспрессию можно повышать в процессе ферментативного получения аминокислот с помощью индуцибельных промоторов. Экспрессию можно повышать также с помощью увеличения жизни мРНК.

Кроме того, ферментативную активность можно повышать также путем ингибирования разложения обладающего ферментативной активностью белка. При этом гены или генные конструкции могут либо находиться в различном количестве копий в плазмидах, либо их интегрируют в хромосому и амплифицируют. В альтернативном варианте сверхэкспрессию рассматриваемых генов можно обеспечивать путем изменения состава среды и условий культивирования.

Изобретение относится также к:

1) способу ферментативного получения амидов из нитрилов, заключающемуся в том, что:

а) превращают соединение, содержащее нитрильную группу или нитрильные группы, с помощью микробного фермента, который обладает нитрилгидратазной активностью, и

б) удаляют образовавшийся амид, где

в) для превращения нитрила в амид применяют нитрилгидратазу, предлагаемую в изобретении. Ее активность, сохранившаяся после превращения метакрилнитрила в присутствии 20 мМ (мМ = ммоль/л) ионов цианида при 20°С через 30 мин, составляет предпочтительно по меньшей мере 90% от сохранившейся активности этого фермента при его применении для превращения в отсутствие ионов цианида в условиях, которые не отличаются по остальным параметрам,

2) способу, указанному в подпункте 1), который отличается тем, что активность, сохранившаяся после превращения в присутствии 50 мМ ионов цианида, составляет по меньшей мере 60%,

3) способу, указанному в подпункте 1) или 2), который отличается тем, что применяют микроорганизмы, продуцирующие и содержащие фермент, или их лизат.

4) способу, указанному в подпункте 3), который отличается тем, что применяют покоящуюся клетку микроорганизма,

5) способу, указанному в подпункте 1) или 2), который отличается тем, что применяют очищенный фермент,

6) способу, указанному в подпунктах от 1) до 5), который отличается тем, что фермент получают из микроорганизмов рода Pseudomonas, прежде всего Pseudomonas putida или Pseudomonas marginalis,

7) способу, указанному в подпункте 6, который отличается тем, что фермент получают из микроорганизмов рода Pseudomonas, которые депонированы под номерами DSM 16275 и DSM 16276 и которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 8, 10,

8) способу, указанному в одном или нескольких из подпунктов от 1) до 7), который отличается тем, что соединения общих формул

в которых:

Х обозначает ОН, Н, алкил, несущий от 1 до 4 атомов углерода, NH₂ ;

R обозначает Н, насыщенный алкильный радикал с разветвленной или неразветвленной цепью, несущий от 1 до 12 атомов углерода, необязательно замещенный NH₂,

ненасыщенный алкильный радикал с одной двойной связью с разветвленной или неразветвленной цепью, несущий от 1 до 12 атомов углерода, циклоалкильные группы, содержащие от 3 до 6 атомов углерода,

алкиленовые радикалы, замещенные алкилтиогруппой, где алкил в рассматриваемом случае представляет собой C₁-С₃алкильный радикал и алкилен представляет собой двухвалентный С₃-С₈алкиленовый радикал,

R' обозначает Н, когда R не обозначает Н, или алкил, несущий от 1 до 3 атомов углерода,

R'' обозначает одноядерное или двуядерное ненасыщенное кольцо, которое содержит от 6 до 12 атомов углерода и которое необязательно замещено одной или двумя C₁-С₃ алкильными группами, Cl, Br, F,

одновалентный алкилнитрил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода,

превращают в соответствующие амиды,

9) способу, указанному в подпункте 8), который отличается тем, что соединение общей формулы (I) превращают в присутствии гидроциановой кислоты или соли гидроциановой кислоты,

10) способу, указанному в подпункте 9), который отличается тем, что превращение осуществляют в присутствии от 0,1 мол.% цианида до 3 мол.% цианида в пересчете на применяемый нитрил, предпочтительно от >2 до 3 мол.%.

При конечной концентрации 1 моль концентрация 3 мол.% соответствует 30 мМ цианиду,

11) способу, указанному в одном или нескольких из подпунктов от 1) до 10), который отличается тем, что в качестве нитрила применяют метиониннитрил,

12) способу, указанному в одном или нескольких из подпунктов от 1) до 10), который отличается тем, что в качестве нитрила применяют 2-гидрокси-4-метилтиобутиронитрил.

Предпочтительно применяют реакционную смесь, аналогичную полученной при взаимодействии гидроциановой кислоты, 3-метилтиопропиональдегида в присутствии вспомогательного основания, такого, например, как триэтиламин, что известно из существующего уровня техники.

Ее целесообразно применять без очистки.

Это свидетельствует о повышенной стабильности ферментов, предлагаемых в изобретении, в отношении альдегидов и аминов,

13) способу, в котором применяют 2-гидрокси-2-метилпропионитрил в качестве предшественника метакриламида,

14) изобретение относится также к выделенным и очищенным микроорганизмам рода Pseudomonas, которые депонированы под номерами DSM 16275 (МА32, Pseudomonas marginalis) и DSM 16276 (MA113, Pseudomonas putida), и

15) устойчивым к цианидам нитрилгидратазам, выделенным из штаммов рода Pseudomonas, прежде всего из штаммов Pseudomonas putida и Pseudomonas marginalis, которые депонированы под номерами DSM 16275 и DSM 16276.

Депонирование было осуществлено в соответствии с Будапештским договором 9 марта 2004 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), Брауншвейг.

Эти штаммы наиболее пригодны для получения ферментов, предлагаемых в изобретении.

Понятие «выделенные и очищенные микроорганизмы» относится к микроорганизмам, которые присутствуют в более высоких концентрациях по сравнению с микроорганизмами, встречающимися в естественных условиях.

Изобретение относится также к способу получения описанной выше устойчивой к цианидам нитрилгидратазы, в котором

а) микроорганизм, продуцирующий эту нитрилгидратазу, прежде всего из видов Pseudomonas marginalis или Pseudomonas putida, подвергают ферментации в условиях, которые обеспечивают образование фермента в микроорганизме, и

б) клетки собирают сразу после завершения логарифмической фазы роста.

Затем

а) либо микроорганизм, содержащий фермент, в форме покоящихся клеток, при необходимости после увеличения проницаемости клеточной мембраны, либо

б) клеточный лизат, либо

в) фермент, выделенный из клеток микроорганизма с использованием известных методов, применяют для превращения, предлагаемого в изобретении, нитрилов в амиды.

Нитрилгидратаза может представлять собой фермент, продуцируемый нерекомбинантными микроорганизмами, либо фермент, полученный рекомбинантным путем.

Кроме того, изобретение относится к способам рекомбинантного получения полипептидов, предлагаемых в изобретении, где микроорганизм, продуцирующий эти полипептиды, культивируют, индуцируют соответствующую экспрессию требуемых полинуклеотидов и при необходимости выделяют ферменты из культуры.

Способ, как правило, представляет собой один из способов, в котором:

а) ферментируют микроорганизмы рода Pseudomonas, в которых выделенные полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, которые на 90-100% идентичны аминокислотным последовательностям, содержащим последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2, 3 и 5 или 7, 8 и 10, где полипептиды в каждом случае в совокупности обладают активностью устойчивой к цианидам нитрилгидратазы, усиленной прежде всего в результате рекомбинантой сверхэкспрессии,

б) при необходимости выделяют из этих микроорганизмов полученный рекомбинантно фермент, обладающий нитрилгидратазной активностью, или получают белковую фракцию, содержащую этот фермент, и

в) микроорганизм, указанный в подпункте а), или фермент или фракцию, указанные в подпункте б), переносят в среду, которая содержит соединение, несущее нитрильные группы общих формул (I) и (II).

Предназначенная для использования культуральная среда предпочтительно должна быть адаптирована к конкретным штаммам. Описания культуральных сред для различных микроорганизмов можно найти в справочнике «Manual of Methods for General Bacteriology», опубликованном Американским обществом бактериологии (Вашингтон, округ Колумбия, США, 1981).

В качестве источников углерода можно применять сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, мелассы, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, такие, например, как соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие, например, как уксусная кислота. Эти субстанции можно применять индивидуально или в виде смесей.

В качестве источников азота можно применять азотсодержащие соединения, такие как пептоны, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до разбухания, соевую муку и мочевину, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота можно применять индивидуально или в виде смесей.

В качестве источников фосфора можно использовать фосфорную кислоту, кислый фосфат калия или вторичный кислый фосфат калия или соответствующие содержащие натрий соли. Кроме того, культуральная среда может содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. Наконец, можно применять такие необходимые для роста субстанции, как аминокислоты и витамины. Вышеуказанные субстанции можно добавлять в культуру в виде одноразовой добавки или добавлять соответствующим образом в процессе культивирования.

Для контроля значения pH культуральной среды можно применять соответственно либо основания, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак или аммиачную воду, либо кислоты, такие как фосфорная кислота или серная кислота. Для контроля пенообразования можно использовать противовспенивающие агенты, такие как полигликолевые эфиры жирной кислоты. Для поддержания стабильности плазмид можно добавлять соответствующие конкретной среде вещества, обладающие избирательным действием, такие, например, как антибиотики. Для поддержания аэробных условий в культуру вводят кислород и содержащие кислород газовые смеси, такие, например, как воздух. Температура культуральной среды, как правило, составляет от 10 до 40°С и предпочтительно от 10 до 30°С. Культивирование продолжают до тех пор, пока культура находится на логарифмической фазе роста. Как правило, эта цель достигается в течение периода времени от 10 до 70 ч.

После этого клетки предпочтительно собирают, промывают и вносят в виде суспензии в буфер при значении pH 6-9, в частности 6,8-7,9. Концентрация клеток составляет от 1 до 25%, прежде всего от 1,5 до 15% (масса во влажном состоянии/объем). Можно повышать проницаемость клеток с помощью физических или химических методов, например с использованием толуола, как это описано у Wilms и др., J. Biotechnol., том 86, 2001, с.19-30, так, чтобы предназначенные для превращения нитрильные соединения могли проникать через стенку клетки и образующиеся амиды могли выходить наружу.

Предпочтительно превращают следующие нитрилы:

насыщенные мононитрилы:

ацетонитрил, пропионитрил, бутиронитрил, изобутиронитрил, валеронитрил, изовалеронитрил и капронитрил,

насыщенные динитрилы:

малонитрил, сукцинонитрил, глутаронитрил и адипонитрил,

ароматические незамещенные и замещенные мононитрилы и динитрилы:

бензонитрил, 2,6-дифторбензонитрил, изофталонитрил и терефталонитрил,

-аминонитрилы:

-аминопропионитрил, -аминометилтиобутиронитрил, -аминобутиронитрил, аминоацетонитрил, все нитрилы, являющиеся производными встречающихся в естественных условиях аминокислот, -амино-3,3-диметилпропионитрил и -амино-2,3-диметилпропионитрил,

нитрилы, содержащие карбоксильные группы:

циануксусная кислота,

-аминонитрилы:

3-аминопропионнитрил,

ненасыщенные нитрилы:

акрилонитрил, метакрилонитрил, аллилцианид и кротонитрил,

-гидроксинитрилы:

-гидрокси-н-пропионитрил, -гидрокси-н-бутиронитрил, -гидроксиизобутиронитрил, -гидрокси-н-гексанонитрил, -гидрокси-н-гептонитрил, -гидрокси-н-октанонитрил, , -дигидрокси- , -диметилбутиронитрил, акролеинциангидрин, метакрилальдегидциангидрин, 3-хлорлактонитрил, 4-метилтио- -гидроксибутиронитрил и -гидрокси- -фенилпропионил.

Концентрация подлежащего превращению нитрила в реакционном растворе не ограничена какими-либо определенными пределами.

Для того чтобы избежать ингибирования ферментативной активности субстратом, как правило, концентрацию нитрила поддерживают на уровне от 0,001 до 10 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 2 мас.%, в пересчете на количество биокатализатора в виде массы клеток в сухом состоянии. Весь субстрат можно добавлять в начале реакции или субстрат можно добавлять непрерывно или периодически в процессе реакции.

Массу клеток в сухом состоянии определяют с помощью анализатора влажности МА45 Moisture Analyser (фирма Sartorius).

Если растворимость нитрильного соединения в водной реакционной системе является слишком малой, то можно добавлять солюбилизатор.

Однако в альтернативном варианте реакцию можно осуществлять в двухфазной системе вода/органический растворитель.

Когда в качестве обладающего ферментативной активностью материала применяют клетки микроорганизма, то соотношение количества используемых клеток и субстрата предпочтительно составляет от 0,02 до 10 мас.% в пересчете на массу клеток в сухом состоянии.

Можно также применять хорошо известные методы для иммобилизации выделенного фермента и последующего использования фермента в этой форме.

Реакцию, как правило, осуществляют при температурах от -5 до 50°С, в частности от 0 до 30°С, в течение периода времени от 0,1 до 100 ч.

Значение pH реакционной смеси, которое следует поддерживать, не ограничено конкретными значениями, если не ухудшается ферментативная активность. После реакции образовавшийся амид можно известным методом выделять из реакционного раствора и очищать.

Изобретение относится также к способу, с помощью которого амид или раствор, содержащий амид, выделяют, например, из клеточной биомассы, и амид либо гидролизуют с получением соответствующей кислоты, либо превращают в соответствующие кислотно-аддитивные соли в присутствии щелочного металла или гидроксидов щелочного металла. Предпочтительно МГА-амид гидролизуют с помощью гидроксида кальция и выделяют соответствующую кальциевую соль.

Примеры

Пример 1

Условия культивирования

Предварительные культуры выращивали в объеме 5 мл в стеклянных пробирках при встряхивании при 30°С в течение 24 ч. 100 мл основной культуры инокулировали 1 мл предварительной культуры и встряхивали в колбе Эрленмейера в общем объеме 1000 мл при 25°С в течение 42 ч.

Среда для предварительной культуры (pH 7,0)
K2HPO4	7 г
KH 2PO4	3 г
Na-цитрат	0,5 г
глицерин	2 г
FeSO4×7H 2O	0,004 г
MgSO4 ×7H2O	0,1 г
ацетамид	2 г
раствор со следовыми количествами солей	0,1 мл
деминерализованная вода	до 1000 мл

Среда для основной культуры (pH 7,0)
K2HPO4	7 г
KH 2PO4	3 г
цитрат натрия	0,5 г
глицерин	2 г
FeSO 4×7H2O	0,004 г
MgSO 4×7H2O	0,1 г
ацетимид	10 г
раствор со следовыми количествами солей	0,1 мл
деминерализованная вода	до 1000 мл

Раствор со следовыми количествами солей
ЭДТК, Na2×2H2O	158 мг
Na 2MoO4×2H2O	4,7 мг
ZnSO 4×7H2O	70 мг
MnSO 4×4H2O	18 мг
FeSO 4×7H2O	16 мг
CuSO 4×5H2O	4,7 мг
COSO 4×6H2O	5,2 мг
деминерализованная вода	до 1000 мл

Пример 2

Выделение и идентификация микроорганизмов

Отбирали два штамма МА32 и МА113, определяя нитрилгидратазную активность покоящихся клеток в присутствии 2 мМ цианида калия. Свойства МА32:

форма клеток	палочки
ширина	0,6-0,8 мкм
длина	1,5-3,0 мкм
подвижность	+
жгутики	полярные >1
реакция по Граму	-
лизис при воздействии 3% КОН	+
аминопептидаза (Cerny)	+
оксидаза	+
катал аза	+
рост при 41°С	-
утилизация субстрата
адипат	-
цитрат	+
малат	+
фенилацетат	-
D-глюкоза	+
мальтоза	-
маннит	+
арабиноза	+
манноза	+
трегалоза	+
сорбит	+
эритрол	+
цитраконат	+
инозит	+
АДГ (алкогольдегидрогеназа)	+
уреаза	-
гидролиз желатина	+
гидролиз эскулина	+
леван из сахарозы	+
денитрификация	+
лектиназа	+
флуоресценция	+
пиоцианин	-

Профиль клеточных жирных кислот типичен для Pseudomonas группы I.

Анализ сегмента длиной 484 пар оснований 16S-pPHK подтвердил 100%-ное сходство с последовательностью Pseudomonas marginalis.

На основе всех полученных данных можно идентифицировать МА32 как Pseudomonas marginalis.

Свойства МА113:

форма клеток	палочки
ширина	0,6-0,8 мкм
длина	1,5-3,0 мкм
подвижность	+
жгутики	полярные >1
реакция по Граму	-
лизис при воздействии 3% КОН	+
аминопептидаза (Сету)	+
оксидаза	+
каталаза	+
рост при 41°С	-
утилизация субстрата
адипат	-
цитрат	+
малат	+
фенилацетат	+
D-глюкоза	+
мальтоза	-
маннит	-
арабиноза	-
манноза	-
трегалоза	-
инозит	-
-аланин	+
-кетоглютарат	+
бензиламин	+
гиппурат	+
азелат	+
D-манделат	+

АДГ	+
уреаза	-
гидролиз желатина	-
гидролиз эскулина	-
леван из сахарозы	-
денитрификация	-
лецитиназа	-
флуоресценция	+
пиоцианин	-

Профиль клеточных жирных кислот типичен для Pseudomonas группы I.

Анализ сегмента длиной 476 пар оснований 16S-pPHK подтвердил 100%-ное сходство с последовательностью Pseudomonas putida.

На основе всех полученных данных можно идентифицировать МА113 как штамм вида Pseudomonas putida.

Пример 3

Определение ферментативной активности

Клетки выращивали согласно методу, описанному в примере 1, выделяли из культуральной среды центрифугированием и ресуспендировали в стандартном буфере (50 мМ калийфосфатный буфер, pH 7,5). 50 мкл этой клеточной суспензии добавляли к 700 мкл стандартного буфера и для инициации реакции добавляли 250 мкл 200 мМ раствора нитрила в стандартном буфере. При этом концентрацию клеток в клеточной суспензии калибровали таким образом, чтобы 5-30% нитрила прореагировало в течение 10 мин при 20°С. После прохождения реакции в течение 10 мин при 20°С реакцию прекращали путем добавления 20 мкл фосфорной кислоты половинной крепости и клетки отделяли центрифугированием.

ЖХВР-анализ
колонка	Intersil ODS-3V
подвижная фаза	смесь, состоящая из 10 мМ калийфосфатного буфера, pH 2,3 и ацетонитрила, в соотношении 85:15 в случае метиониннитрила, МГА-нитрила и ацетоциангидрина и в соотношении 99:1 в случае всех остальных субстратов
скорость потока	1 мл/мин
обнаружение	УФ при 200 нм

Под одной единицей активности (ед.) понимается количество фермента, которое превращает 1 мкмоль метакрилнитрила в амид в течение одной минуты. Когда в дополнение к амиду продуцируется также кислота, то под одной единицей активности (ед.) понимается количество фермента, которое превращает 1 мкмоль метакрилнитрила в амид и кислоту в течение одной минуты.

Относительные активности штаммов МА32 и МА113 представлены на фиг.1 и фиг.2.

Пример 4

Воздействие цианида на активность нитрилгидратазы

50 мкл клеточной суспензии, которую получали аналогично методу, описанному в примере 3, добавляли к 700 мкл стандартного буфера, содержащего 0, 21,4, 53,6 и 107,1 мМ цианид калия (конечная концентрация цианида 0, 20, 50, 100 мМ). Реакцию инициировали, добавляя 200 мкл 200 мМ раствора нитрила в стандартном буфере, который в каждом случае имел такую же концентрацию цианида, что и остальной реакционный раствор. В этом случае использовали такую концентрацию клеток, при которой в смеси без цианида происходило 16%-ное превращение нитрила после выдерживания в течение 10 мин при 20°С. После выдерживания в течение 10 мин при 20°С реакцию прекращали, добавляя 20 мкл 50%-ной концентрированной фосфорной кислоты, и превращение оценивали аналогично методу, описанному в примере 2.

Относительная активность превращения метакрилнитрила как функция от концентрации цианида представлена на фиг.3 и фиг.4.

Пример 5

Превращение ацетонциангидрина с помощью покоящихся клеток Pseudomonas marginalis MA32

Клетки Pseudomonas marginalis МА32 выращивали и центрифугировали согласно методу, описанному в примере 1. Клетки в количестве, содержащем 1,16 г биомассы в сухом состоянии, разбавляли 50 мМ калийфосфатным буфером, pH до конечного объема 50 мл. Кроме того, в реакционную смесь добавляли 0,02 мМ 2-метил-1-пропанбороновую кислоту. Свежеперегнанный ацетонциангидрин непрерывно добавляли при 4°С при интенсивном перемешивании с такой скоростью, чтобы концентрация в реакционной смеси в любой момент времени не превышала 5 г/л. Значение pH поддерживали на постоянном уровне 7,5. Затем реакционную смесь анализировали с помощью ЖХВР согласно методу, описанному в примере 3. Через 140 мин 10,0 г нитрила полностью превращалось в 10,7 г амида и 1,4 г кислоты.

Зависимость реакции от времени для штамма МА113 представлена на фиг.5.

Пример 6

Превращение неочищенного МГА-нитрила с помощью покоящихся клеток Pseudomonas marginalis MA32

Клетки Pseudomonas marginalis MA32 выращивали и центрифугировали согласно методу, описанному в примере 1. Клетки в количестве, содержащем 0,34 г биомассы в сухом состоянии, разбавляли 50 мМ калийфосфатным буфером, pH 8,0 до конечного объема 70 мл. Кроме того, в реакционную смесь добавляли 0,02 мМ 2-метил-1-пропанбороновую кислоту. Неочищенный МГА-нитрил непрерывно добавляли при 4°С при интенсивном перемешивании с такой скоростью, чтобы концентрация в реакционной смеси в любой момент времени не превышала 10 г/л. Значение pH поддерживали на постоянном уровне 8,0. Затем реакционную смесь анализировали с помощью ЖХВР согласно методу, описанному в примере 3. Через 510 мин 10,05 г нитрила полностью превращалось в 11,13 г амида и 0,31 г кислоты. Это соответствует конечной концентрации 139 г амида на 1 л.

МГА-нитрил получали непосредственно из 3-метилтиопропиональдегида и небольшого избытка гидроциановой кислоты. 50 мМ раствор этого МГА-нитрила в воде содержал 0,5 мМ цианид (Spektroquant^®, фирма Merck).

Зависимость реакции от времени для штамма MA32 представлена на фиг.6.

Пример 7

Клонирование кластера генов нитрилгидратазы из Pseudomonas marginalis МА32 и конструирование экспрессионного вектора

Кластер генов нитрилгидратазы, кодирующий -субъединицу, -субъединицу и белок-активатор нитрилгидратазы, коэкспрессия которого оказывает существенное влияние на активность нитрилгидратазы (Nojiri и др., Journal of Biochemistry, 125, 1999, с.696-704), амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймеры 1F и 1R, которые интродуцировали сайты расщепления, распознаваемые рестриктазами NdeI и HindIII. Полученный таким образом ПЦР-продукт встраивали путем лигирования в вектор, расщепленный с помощью NdeI и HindIII, при этом интродуцированные гены находились под контролем промотора рамнозы. Полученный таким образом вектор обозначили как рКЕ31.

Рестрикционная карта представлена на фиг.7, а последовательность в SEQ ID NO:1.

Экспрессионной плазмидой трансформировали штамм Е.coli DSM 14459, депонированный в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) 22 августа 2001 г.

Праймеры:

1F	5' -CTC CAC CAT ATG AGT ACA GCT ACT TCA ACG -3'
1R	5' -CTT CAT AAG CTT CTA TCT CGG ATC AAA TGG-3'

1F: SEQ ID NO: 11

1R: SEQ ID NO: 12

Гены локализованы на следующих сегментах SEQ ID NO: 1:

ген -субъединицы:	нуклеотиды 25-609
ген -субъединицы:	нуклеотиды 650-1312
ген белка-активатора:	нуклеотиды 1309-2577

Пример 8

Клонирование кластера генов нитрилгидратазы из Pseudomonas putida МА113

Кластер генов нитрилгидратазы, кодирующий -субъединицу, -субъединицу и белок-активатор нитрилгидратазы, коэкспрессия которого оказывает существенное влияние на активность нитрилгидратазы (Nojiri и др., Journal of Biochemistry, 125, 1999, c.696-704), амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймеры 1F и 1R.

Последовательность представлена в SEQ ID NO: 6.

Праймеры:

2F	5'-ATG ACG GCA ACT TCA ACC CCT GGT G-3'
2R	5'-ТСА GCT CCT GTC GGC AGT CG-3'

2F: SEQ ID NO: 13

2R: SEQ ID NO: 14

Гены локализованы на следующих сегментах SEQ ID NO: 6:

ген -субъединицы:	нуклеотиды 1-582
ген -субъединицы:	нуклеотиды 624-1286
ген белка-активатора:	нуклеотиды 1283-2371

Пример 9

Гетерологичная экспрессия нитрилгидратаз из Pseudomonas marginalis МА32 в штамме Е.coli DSM 14459

Штамм Е.coli DSM 14459 был депонирован в связи с созданием патента DE 10155928.

Трансформированные с помощью рКЕ31 клетки выращивали при 37°С при встряхивании в LB-среде (LB-бульон, Miller, VWR), содержащей 2 мМ цитрат железа(III) и 100 мкг/мл ампициллина. Через 12-16 ч в основную среду вносили такое количество предварительной культуры, чтобы значение ОП₆₀₀ последней составляло 0,1. Основная среда соответствовала по составу предварительной культуре, но содержала дополнительно 2 г/л L-рамнозы. Клетки собирали после культивирования при 30°С в течение 22 ч.

Пример 10

Определение ферментативной активности

Культивирование клеток и определение активности осуществляли согласно методам, описанным в примере 9 и примере 3.

Клетки штамма Е.coli DSM 14459, трансформированные плазмидой рКЕ31, имели удельную активность 17 ед./мг СБМ (биомасса в сухом состоянии).

Пример 11

Определение ферментативной активности в присутствии 100 мМ цианида калия

Культивирование клеток и определение активности в присутствии 100 мМ цианида калия осуществляли согласно методам, описанным в примере 9 и примере 4.

Клетки штамма Е.coli DSM 14459, трансформированные плазмидой рКЕ31, имели удельную активность 11 ед./мг СБМ.