способ диагностики трихомониаза

Формула изобретения

Способ диагностики трихомониаза методом полимеразной цепной реакции с детекцией электрофорезом в геле, отличающийся тем, что в реакции используются праймеры (TV7) нуклеотидного состава:

CACTGTGAACAAATCAGGACGCTT (788-764),

TTGGATACTCCTACTCTCGCCCTTG (568-591);

инкубационная смесь конечным объемом 36 мкл, содержащая: 6 мМ Tris-HCl (рН 8,5 25°С); 3 mM MgSO₄ ; 25 mM KCl; ксиленцианол; 2 mM dNTP; 10 рМ праймеров; 10 мкл ДНК матрицы; 5 ед. Tag-ДНК полимеразы; и программа амплификации: 95°С - 5 мин - 1 цикл, 95°С - 20 с; 55°С - 20 с; 72°С - 40 с - 10 циклов и 93°С - 5 с; 55°С - 5 с; 72°С - 10 с - 30 циклов, с последующей детекцией продукта реакции электрофорезом в геле и оценкой результата по размеру ампликона, который в случае наличия в исследуемом материале T.vaginalis, должен быть длиной 221 пар оснований.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для диагностики трихомониаза и определения наличия ДНК Trichomonas vaginalis в исследуемом образце.

На сегодняшний день регламентированными методами диагностики трихомониаза является бактериоскопический и культуральный [1, 2, 3]. Бактериоскопический (микроскопия нативного препарата и с окраской) как самый доступный, дешевый и простой метод широко используется в практическом здравоохранении. Однако микроскопия нативного препарата возможна только непосредственно после взятия материала, так как трихомонада способна существовать и двигаться во внешней среде очень непродолжительное время, а именно двигательная активность позволяет идентифицировать ее в препарате. Определение трихомонад в окрашенном препарате тоже иногда вызывает сомнения из-за возможности присутствия атипичных форм простейшего или потере морфологических признаков при фиксации и окраске, низком титре возбудителя или из-за большого количества эпителия, лейкоцитов и сходства трихомонад с полиморфно-ядерными лейкоцитами. Поэтому бактериоскопия требует специальной квалификации и опыта для выявления данного заболевания. Для обеспечения диагностики культуральным методом также требуется концентрация нескольких сотен живых простейших в пробе. Работа с культурой требует больших затрат и занимает значительное количество времени, что неблагоприятно и для пациента и с точки зрения возможности дальнейшего распространения инфекции.

По сообщениям разных исследователей чувствительность метода микроскопии варьирует от 38% до 60% [1, 3], а чувствительность культурального метода не превышает 85% [1, 2, 3]. Следовательно, данные методы лабораторной диагностики трихомониаза не отвечают современным требованиям по своей чувствительности, специфичности, способности оценивать и контролировать результаты лечения.

Ограничения культуральных и микроскопических методов для выявления Т.vaginalis вызывают необходимость развивать альтернативные методы.

Иммуноферментные методы неоднократно предлагались для диагностики трихомониаза, однако они не дают удовлетворительных результатов. Специфические антитела могут присутствовать в течение 1 года после излечения заболевания, что делает невозможным дифференцировать состояние болезни от реконвалесценции, либо могут совсем не обнаруживаться из-за низкого их титра и недостаточного гуморального ответа организма. Определение антигенов Trichomonas vaginalis также не обеспечивает должной чувствительности из-за способности простейшего к "мимикрии" путем адсорбции на своей поверхности белков плазмы хозяина [6].

Несмотря на вышеизложенные трудности в диагностике, официальная статистика МЗ РФ по заболеваемости за последние годы показывает, что трихомониаз занимает лидирующее место среди инфекций, передаваемых половым путем. Предполагается, что около 180-200 млн женщин в мире инфицированы Trichomonas vaginalis [3]. А если учитывать, что у 25-50% женщин и у большинства мужчин наблюдают бессимптомное трихомонадоносительство, то о реальном проценте заболеваемости можно только предполагать [4, 3]. Причем более 90% случаев представляет собой смешанный протозойно-бактериальный процесс, что также затрудняет клиническую диагностику инфекции [5].

Данная ситуация позволяет предположить, что аналитическая чувствительность диагностических тестов недостаточна. Учитывая то, что среда обитания для трихомонад у мужчин менее благоприятна, чем у женщин, концентрация возбудителя может быть достаточно низкой, особенно в начальный период после заражения, однако риск передачи инфекции не снижается. Следовательно, необходимы подходы, позволяющие обеспечить необходимый уровень чувствительности методов при проведении диагностики.

В связи с изложенными проблемами в настоящее время активно развиваются молекулярно-генетические методы идентификации Т.vaginalis, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью, и наравне с культуральным методом широко используются в клинике. В эту группу входит полимеразная цепная реакция с электрофоретической детекцией. Чувствительность и специфичность этого метода превышает вышеперечисленные [1, 7]. Однако существует вероятность ложноположительных результатов из-за перекрестных реакций вследствие подбора недостаточно специфичной мишени ДНК возбудителя. Ложноотрицательные реакции могут возникать, когда участок для амплификации не консервативен. Следовательно, необходима разработка новых праймеров с учетом последних молекулярно-генетических исследований в этой области.

В настоящее время разрабатываются различные модификации молекулярных методов исследования, направленные на исключение возможности возникновения ошибок и с целью улучшения чувствительности.

Известен способ диагностики трихомониаза, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров

TVK 3/7:

- ATTGTCGAACATTGGTCTTACCCTC

- TCTGTGCCGTCTTCAAGTATGC

дающих в процессе ПЦР продукт длиной 300 пар оснований, с дальнейшей его детекцией методом электрофореза [13].

Недостатком этого способа является низкая чувствительность:

литературные данные указывают на чувствительность праймеров к данной области генома Trichomonas vaginalis в 88% [13].

Известен способ диагностики трихомониаза, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров [9]

TVA 5-1/6:

- ATGTTCTATCTTTTCATTGT (5-24),

- GATCACCACCTTAGTTTACA (102-83);

Продуктом амплификации с использованием этой пары параймеров будет участок ДНК Trichomonas vaginalis 98 пар оснований.

По литературным данным чувствительность праймеров TVA 5-1/6 составляет около 69% [9].

Известен способ диагностики трихомониаза, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием пар праймеров [14]

TV1/TV2:

- TAATGGCAGAATCTTTGGAGAAA (850-872),

- GAACTTTAACCGAAGGACTTCG (1161-1140)

или BTUB9/2

- CATTGATAACGAAGCTCTTTACGAT (847-874),

- CATGTTGTGCCGGACATAACCAT (960-938);

дающих продукт длиной 312 и 112 пар оснований соответственно с дальнейшей его детекцией методом электрофореза.

Табл 1.
Результаты исследования клинических проб на наличие Trichomonas vaginalis культуральным методом и ПЦР [14]
№ проб	14	4	1	3	1	1	1	1	1	1	3	22	6	1	1	1	4	2	3	3	1	2	2	10	1	1	1	1	15	3
культура	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
BTU В 9/2	+	+	+	+	+	-	+	+	-	+	-	+	+	-	+	-	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+	-	-	+	-
TVK 3/7	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
TV1/TV2	+	-	+	-	-	-	+	-	-	-	-	+	-	+	-	-	+	-	+	-	+	-	+	-	-	-	-	-	-	+
«+» положительный результат
«-» - отрицательный

Недостатком диагностики трихомониаза методом ПЦР с данными праймерами является низкая чувствительность, составляющая 59% в реакции с TV1/TV2 и 77% с BTUB9/2 [14].

Таким образом, вышеперечисленные способы не могут обеспечить должной чувствительности которая по разным данным находится в пределах 59%-88% [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14].

Задачей предлагаемого способа является увеличение выявляемости трихомониаза.

Поставленную задачу решают за счет того, что используют праймеры (TV7) нуклеотидного состава:

CACTGTGAACAAATCAGGACGCTT (788-764)

TTGGATACTCCTACTCTCGCCCTTG (568-591);

инкубационная смесь конечным объемом 36 мкл, содержащая: 6 mM Tris-HCl (рН 8.5 25°С); 3 mM MgSO₄; 25 mM KCl; ксиленцианол; 2 mM dNTP; 10 рМ праймеров; 10 мкл ДИК матрицы; 5 ед. Tag-ДНК полимеразы; и программа амплификации: 95°С - 5 мин - 1 цикл, 95°С - 20 сек; 55°С - 20 сек; 72°С - 40 сек - 10 циклов и 93°С - 5 сек; 55°С - 5 сек; 72°С - 10 сек - 30 циклов, с последующей детекцией продукта реакции электрофорезом в геле и оценкой результата по размеру ампликона, который в случае наличия в исследуемом материале Т.vaginalis, должен быть длиной 221 пар оснований.

Для разработки способа:

1) провели дизайн праймеров;

2) оценили специфичность и чувствительность с использованием геномных баз данных (в том числе NCBI) и программ Primer Premier 5, OligoCalculator, Vector NTI Advanced v9.0;

3) рассчитали границы температурного режима реакции;

4) синтезировали олигонуклеотидную последовательность разработанных праймеров с использованием ДНК-синтезатора ASM 800 synthesizer (фирмы Bioset);

5) провели очистку синтезированных праймеров по стандартному протоколу с контролем электрофорезом в полиакриламидном геле;

6) определили оптимальную температуру отжига праймеров путем постановки ПЦР на амплификаторе T-gradient (фирмы Biometra);

7) эмпирически оптимизировали состав реакционной смеси для ПЦР с данными праймерами;

Так как чувствительность ПЦР в первую очередь определяется качеством праймеров, поэтому

- использовали в качестве мишени для амплификации, определяемой нуклеотидной последовательностью праймеров, консервативный участок гена (Trichomonas vaginalis strain TV2 small subunit ribosomal RNA) T.Vaginalis;

- использовали в качестве мишени для амплификации, определяемой нуклеотидной последовательностью праймеров, участок гена специфичный только для Trihomonas vaginalis;

- провели анализ энергетического профиля ДНК с оценкой выбранной последовательности по GC составу, структуре и длине;

- исходя из нуклеотидного состава разработанных праймеров (TV7)

- CACTGTGAACAAATCAGGACGCTT (788-764)

- TTGGATACTCCTACTCTCGCCCTTG (568-591) и с учетом характеристик, рассчитанных в Primer Premier 5, OligoCalculator, Vector NTI Advanced v9.0, определили теоретические границы концентраций компонентов реакционной смеси;

- исходя из характеристик и нуклеотидного состава праймеров, определили теоретические границы температурного режима проведения полимеразной цепной реакции, а также времени этапов денатурации, отжига и элонгации.

Получение экспериментальных данных позволило максимально оптимизировать условия реакции с данной последовательностью праймеров.

Способ реализуют следующим образом.

Выявляют возбудить трихомониаза (простейшее Trichomonas vaginalis) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого выделяют ДНК из исследуемого образца и проводят амплификацию с использованием олигонуклеотидных праймеров с последующим переносом продукта амплификации на гель и оценку результата реакции.

Выделение ДНК возбудителя для ПЦР проводят путем фенолхлороформной экстракции. Инкубационная смесь для ПЦР конечным объемом 36 мкл содержит: 6 mM Tris-HCl (рН 8.5 25°C); 3 mM MgSO₄; 25 mM KCl; ксиленцианол; 2 mM dNTP; 10 рМ праймеров; 10 мкл ДНК матрицы; 5 ед. Tag-ДНК полимеразы. ПЦР проводят с использованием горячего старта во избежание неспецифического отжига праймеров. Для этого нижнюю смесь, содержащую праймеры и dNTP, отделют от верхней воском, который плавится при температуре около 70°C. Это обеспечивает запуск реакции только в ячейке амплификатора с последующим циклическим изменением температуры по заданным параметрам. Температурный режим проведения ПЦР:

95°C - 5 мин	- 1 цикл,
95°C - 20 сек
55°C - 20 сек	- 10 циклов
72°C - 40 сек
93°C - 5 сек
55°C - 5 сек	- 30 циклов
72°C - 10 сек

После завершения ПЦР оценку результата реакции проводят в комнате для анализа продуктов ПЦР. Анализируют продукт амплификации разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле в стандартном ТБЕ буфере для электрофореза. В лунку добавляют по 10 мкл образца. Электрофорез проводят около 25 мин. Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор» с последующей визуализацией на компьютере. Положительными считают пробы, полосы которых располагаются в геле на том же расстоянии от старта, что и полоса маркерной лестницы, соответствующая величине фрагмента в 221 пар оснований.

Для определения диагностической чувствительности метода ПЦР с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров (TV7) сравнивали результаты микробиологического посева клинического материала, полученного от 16 пациентов с результатами ПЦР диагностики с TV7 этих же образцов (табл.2, чертеж).

Результат амплификации ДНК, выделенного из микробиологического посева, с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров показан на чертеже. Полосы расположены на том же растоянии от старта, что и полоса маркерной лестницы, соответствующая размеру фрагмента длиной 221 пар оснований, что свидетельствует о наличии в исследуемых образцах Т.vaginalis.

Микробиологический посев проводят по стандартной методике. То есть осуществляют внесение вагинального соскоба в питательную среду, высокоспецифичную только для Trichomonas vaginalis, инкубируют смесь при 37°C в течение 24 часа с последующей визуальной оценкой придонного роста в виде плотного белого осадка.

Выделение ДНК для ПЦР проводят путем фенолхлороформной экстракции.

Табл.2
Результаты исследования клинических проб на наличие Trichomonas vaginalis культуральным методом и ПЦР.
№ пр	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
м/п	-	-	+	+	+	+	+	+	+	-	-	+	+	+	+	+
ПЦР	-	-	+	+	+	+	+	+	+	-	-	+	+	+	+	+
м/п - результат анализа на наличие Trichomonas vaginalis методом микробиологического посева
ПЦР - результат анализа на наличие Trichomonas vaginalis методом ПЦР с разработанными (tub 1/2) праимерами.

По результатам эксперимента все пробы, положительные с использованием культурального метода, были положительны в ПЦР с TV7.

Для оценки способа было также проведено сравнение результатов анализов клинического материала от 25 пациентов, проведенных методом ПЦР с разработанными праймерами (TV7), а методом прямой иммунофлуорисценции (ПИФ) было исследовано 7 и микробиологическим посевом 22 (табл.3).

Для проведения анализа использовали следующий клинический материал:

У женщин:

- отделяемое задненижнего свода влагалища, забранное универсальным зондом, объемом 0,05±0,025 мл.

- соскоб из цервикального канала, забранный универсальным зондом или цитощеткой, объемом 0,05±0,025 мл.

У мужчин:

- соскоб из уретры, забранный универсальным зондом или цитощеткой, объемом 0,05±0,025 мл.

Табл.3
Результаты исследования клинического материала, проведенного методами микробиологического посева. ПЦР с tub 1/2 и ПИФ
№ пр	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25
м/б посев	-	-	-	н/т	-	н/т	-	+	+	-	+	-	н/т	-	-	-	+	н/т	+	-	+	-	-	-	+
ПЦР	+	+	-	+	-	-	-	+	+	-	+	-	+	+	-	+	+	-	+	+	+	-	-	+	+
ПИФ	+	+	н/т	+	-	-	-	+	-	-	-	н/г	+	н/т	-	+	-	-	-	н/т	-	-	-	+	-
н/т - проба не тестировалась

Из 25 образцов 15 показали наличие возбудителя методом ПЦР с разработанными праймерами (TV7). Из 15 проб, положительных по ПЦР, по м/б посеву были положительны 7 (46%), 4 отрицательных по посеву показали наличие возбудителя по методу ПИФ. Все 7 проб, положительных по ПИФ, были положительны по ПЦР (100%), причем в одной пробе подтвердилось наличие возбудителя всеми тремя методами. Две пробы были положительны только при анализе методом ПЦР с разработанными праймерами (TV7).

Полученные данные позволяют сделать вывод об очень высокой чувствительности предлагаемого способа. Статистическую обработку результатов проводили по критерию знаков.

Разработанный способ иллюстрируется следующим примерами.

Пример № 1.

Больная, 37 лет обратилась с жалобами на обильные выделения из половых путей, зуд вульвы, дискомфорт. При осмотре: шейка матки цилиндрическая, передняя губа гипертрофирована, множество открытых проток желез. Гипертрофия шейки матки.

Микроскопическое исследование отделяемого цервикального канала, уретры и влагалища показало лейкоцитоз в 30-35, 10-12, 40-45, в поле зрения соответственно, трихомонады с характерной сопутствующей микрофлорой в виде внеклеточных грамотрицательных кокков и палочек. Обнаружены трихомонады также в результате микробиологического посева. При этом иммуноферментный анализ крови дал отрицательный результат на антитела к Trichomonas vaginalis. Было также проведено исследование клинического материала на наличие трихомонад методом ПЦР с разработанными праймерами. Для проведения анализа использовали отделяемое задненижнего свода влагалища, забранное универсальным зондом объемом 0,05±0,025 мл. ДНК возбудителя для ПЦР выделили по стандартной методике, путем фенолхлороформной экстракции. Полимеразную цепную реакцию проводили в пробирках типа эппендорф, объемом 0,2 мл, содержащих 6 mМ Tris-HCl (рН 8.5 25°C); 3 mM MgSO₄; 25 mM KCl; ксиленцианол; 2 mM dNTP; 10 рМ праймеров; 5 ед. Tag-ДНК полимеразы и 10 мкл ДНК, выделенной из клинического материала пациента. ПЦР проводили с использованием горячего старта во избежание неспецифического отжига праймеров. Для этого нижнюю смесь, содержащую праймеры и dNTP, отделют от верхней воском, который плавится при температуре около 70°C. Далее пробирки поместили в амплификатор, который обеспечивает циклическое изменение температуры по заданной программе (95°C - 5 мин - 1 цикл; 95°C - 20 сек; 55°C - 20 сек; 72°C - 40 сек - 10 циклов и 93°C - 5 сек; 55°C - 5 сек; 72°C - 10 сек - 30 циклов), необходимое для прохождения реакции и получения продукта в виде участка ДНК (ампликона) Trichomonas vaginalis в достаточной, для дальнейшей детекции, концентрации. После завершения ПЦР анализировали продукт амплификации разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле в стандартном ТБЕ буфере для электрофореза. В лунку добавляли по 10 мкл образца. Электрофорез проводили около 25 мин. Результаты электрофореза учитывали, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор» с последующей визуализацией на компьютере. В результате анализа продуктов реакции, в геле четко дифференцировалась полоса, располагающаяся на том же расстоянии от старта, что и полоса маркерной лестницы, имеющая величину фрагмента около 221 п.н., что соответствует специфическому фрагменту ДНК, который должен быть получен в результате полимеразной цепной реакции, в случае присутствия в клиническом материале Trichomonas vaginalis. Таким образом, результат анализа был положительный. Больной был поставлен диагноз трихомониаз.

Пример № 2.

Больная, 57 лет. Жалобы на периодические выделения из половых путей. В анамнезе: оперирована по поводу кисты яичника и миомы матки. Проходила лечение трихомониаза в 2007 году, муж не лечился. Половые контакты регулярные, не защищенные. При микроскопическом исследовании клинического материала трихомонад не обнаружено, однако мазок воспалительного характера, лейкоцитоз в пределах 20-25 в поле зрения. ПИФ и ИФА отрицательны на трихомонады. Но по микробиологическому посеву хороший придонный рост. Исследование ПЦР, используя вышеописанный способ, также показало присутствие в пробе ДНК Trichomonas vaginalis. ПИФ выявил антигены mycoplasma hominis. Был поставлен диагноз хронический трихомониаз, микоплазмоз в стадии ремиссии.

Предлагаемый способ позволяет обеспечить высокую выявляемость трихомониаза и может быть использован не только для диагностики, но и для контроля после лечения.

Список литературы

1. Адаскевич В.П. Инфекции, передаваемые половым путем. - Нижний Новгород: Издательство НГМА, М.: Медицинская книга, 1999, 416 с.

2. Арустамова С.В. О смешанных инфекциях женских гениталий грибами Candida и влагалищными трихомонадами: Автореф. канд. мед. наук. - Омск, 1974. - 15 с.

3. Беднова В.Н., Погорельский Л.В., Васильев М.М. и др. Тактика обследования и терапии больных инфекционными урогенитальными заболеваниями, осложненными дисбактериозом (пособие для врачей). М., 1996, 14 с.

4. Берестова О.А. Проблемы резистентности к антибактериальным препаратам: в списке препаратов, к которым развилась резистентность, тиберал (орнидазол) не значится // Здоровье женщины. - 2003. - Т.16, № 4. - С.63-66.

5. Васильев М.М. Современные проблемы диагностики и лечения гонорейной и трихомонадной инфекции // Вестник дерматологии и венерологии. - 1998. - № 4. - С.39-42.

6. Рогожина Т.Б., Лыкова С.Г. Иммуноферментный метод лабораторной диагностики трихомониаза // Сибирский журнал дерматологии и венерологии. - 2003. - № 4. - С.56-57.

7. Сюч Н.И. Актуальные вопросы лабораторной диагностики мочеполового трихомониаза // Вестник дерматологии и венерологии. - 2000. - № 3. - С.4-6.

8. C.N.D.Schee, A.V.Belkum, L.Zwijgers Improved diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swabs and urine specimens compared to diagnosis by wet mount microscopy, culture, and fluorescent staining // Journal of clinical microbiology. - 1999. - v.37, N.12. - p.4127-4130.

9. G.Madico, T.C.Quinn, A.Rompalo Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples // Journal of clinical microbiology. - 1998. - v.36, N.11. - p.3205-3210.

10. J.R.Schwebke, L.F.Lawing. Improved detection by DNA amplification of Trichomonas vaginalis in males // Journal of clinical microbiology. - 2002. - v.40, N.10. - p.3681-3683.

11. K.A.Wendel, E.J.Erbelding, C.A.Gaydos, A.M.Rompalo. Use of urine polymerase chain reaction to define the prevalence and clinical presentation of Trichomonas vaginalis in men attending an STD clinic // Sex Transm Infect. - 2003. - v.79. - p.151-153.

12. L.J.Snipes, P.M.Gamard, E.M.Narcisi Molecular epidemiology of Metronidazole resistance in a population of Trichomonas vaginalis clinical isolates // Journal of clinical microbiology. - 2000. - v.38, N.8. - p.3004-3009.

13. L.F.Lawing, S.R.Hedgers, J.R.Schwebke. Detection of Trichomonosis in Vaginal and Urine Specimens from Women by Culture and PCR // Journal of clinical microbiology. - 2000. - v.38, N.10. - p.3585-3588.

14. T.Crucitti, E. Van Dyck, A.Tehe, S.Abdellati, B.Vuylsteke, A.Buve, M. Laga Comparison of culture and different PCR assays for detection of Trichomonas vaginalis in self collected vaginal swab specimens // Sex Transm Infect. - 2003. - v.79. - p.393-398.