вакцина против рсv-2

Формула изобретения

1. Применение белка ORF-2 цирковируса свиней 2 типа (PCV-2) для производства вакцины, которая включает, по меньшей мере, 20 мкг/доза указанного белка ORF-2, для защиты положительных по антителам материнского происхождения (MDA-положительных) поросят от инфекции PCV-2.

2. Применение п.1, где вакцина включает, по меньшей мере, 50 мкг/доза указанного белка ORF-2.

3. Фармацевтическая композиция, включающая, по меньшей мере, 20 мкг/доза белка ORF-2 PCV-2 и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в качестве вакцины для защиты MDA-положительных поросят от инфекции PCV-2.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, включающая, по меньшей мере, 50 мкг/доза белка ORF-2 PCV-2.

5. Фармацевтическая композиция по п.3 или 4, отличающаяся тем, что указанная композиция включает подходящий адъювант.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что указанный адъювант представляет собой эмульсию "масло-в-воде".

7. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что указанный адъювант включает витамин Е.

8. Применение белка ORF-2 цирковируса свиней 2 типа по п.1 или 2, где указанный белок ORF-2 получают путем экспрессии в бакуловирусном векторе экспрессии в клетках насекомых, и где указанный бакуловирусный вектор экспрессии содержит последовательность гена ORF-2 PCV-2 под контролем подходящего промотора.

9. Применение белка ORF-2 по п.8, где указанный промотор представляет собой промотор р10.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к вакцине против цирковируса свиней (PCV-2) и способу получения такой вакцины для защиты поросят от PCV инфекции.

Считается, что PCV-2 связан с послеотъемным мультисистемным синдромом потери веса (PMWS), наблюдаемым у молодых поросят.

Впервые с этой болезнью столкнулись в Канаде в 1991 году.

Клинические проявления и патология были опубликованы в 1997 году (Clark et al. Proc. Am. Assoc. Swine. Pract, 1997: 499-501, Harding et al., Proc. Am. Assoc. Swine. Pract, 1997:503), и они включают прогрессирующую потерю веса, затрудненное дыхание, учащенное дыхание и временами иктерус и желтуху. Nayar et al., Can. Vet. J. Volume 38, июнь 1997 года, идентифицировали цирковирус свиней с клиническими симптомами PMWS и заключили, что PCV, отличный от известного PCV, который считался естественным организмом, населявшим PK-15 клетки, может быть связан с PMWS. Последующие публикации (Hamel et al., J. Virol., 72(6), 5262-5267, 1998; Meehan et al., J. gen. Virol., 79, 2171-2179, 1998) подтвердили эти наблюдения, и было предложено (Meehan et al., выше) обозначить новый патогенный PCV как PCV-2, в то время как исходный изолят из РК-15 клеток (Tischer et al., Nature 295, 64-66, 1982) как PCV-1.

PCV-1 и PCV-2 являются небольшими (17 нм) икосаэдрическими безоболочечными вирусами, имеющими геном из кольцевой одноцепочечной ДНК. Величина генома PCV-2 составляет около 1768 н.п. Изоляты PCV-2, происходящие из различных регионов мира, по-видимому находятся в близком родстве друг с другом и имеют от 95 до 99% нуклеотидную гомологию (Fenaux et al., J. Clin. Microbiol., 38(7), 2494-2503, 2000). ORF-2 PCV-2 кодирует предполагаемый капсидный белок вируса. ORF-2 PCV-2 кодирует белок из 233 аминокислот. ORF-2 всех изолятов PCV-2 имеют 91-100% нуклеотидной гомологии и 90-100% гомологии аминокислотной последовательности. Нуклеотидная гомология между генами ORF-2 PCV-1 и PCV-2 составляет лишь от 65 до 67%, а аминокислотная гомология от 63 до 68% (Fenaux et al., выше).

PDNS (синдром дерматита и нефропатии свиней) является еще одной проблемой для разводчиков свиней, которая появилась примерно в то же время, что и PMWS. Признаками PDNS являются красные/коричневые кольцевидные участки поражения кожи с гемморагиями, обычно на ушах, боках, ногах и бедрах. Обзор синдромов и заболеваний, связанных с PCV-2, представлен Chae C (2005) Vet. J. 169 326-336.

Существует необходимость в вакцине, которая защищает поросят от заболеваний, связанных с PCV-2, таких как PMWS и PDNS. Однако пока еще нет коммерчески доступной вакцины против заболеваний, связанных с PCV-2.

Обычно предполагают об общеупотребительной вакцине для свиней, основанной на инактивированном целом вирусе PCV-2. Однако в случае PCV-2 обстоятельства осложняются тем фактом, что PCV-2 не реплицируется в большом титре культуры клеток.

В качестве альтернативы вакцина может иметь в основе рекомбинантные антигены, происходящие из PCV-2. Белки PCV-2 уже были экспрессированы в различных системах экспрессии. Например, Liu et al. (Protein Expression and Purification, 21, 115-120 (2001)) экспрессировали слитый белок полноразмерного белка, кодированного ORF-2 PCV-2, связанный с MBP His-тагом, в E.coli. Liu et al. (J. Vet. Sci, 3(1), 19-23, 2002) экспрессировали ORF 1 и 2 PCV-2 в бакуловирусной системе экспрессии. Blanchard et al. (Vaccine, 21, 4565-4575, 2003) также экспрессировали ORF 1 и ORF 2 в бакуловирусной системе экспрессии и в клетках насекомых. Клетки насекомых, которые продуцировали белки PCV-2, лизировали и включали в состав вакцины, которую применяли для вакцинации поросят, не имеющих специфичных патогенов (SPF). Поросята получали либо один из белков в соответствии с первичной схемой иммунизации, где субъединичная вакцина следовала за ДНК вакцинацией, либо в другой группе поросят, поросята получали белки ORF 1 и ORF 2 двумя инъекциями. Тем не менее, эксперименты были проведены на свиньях SPF, которые не имеют патогенов и, следовательно, не имеют никаких материнских антител к PCV-2.

PMWS и PDNS, вызываемые PCV-2, можно наблюдать с 4-недельного возраста до примерно 15-недельного возраста. По-видимому, до отъема поросята были в достаточной степени защищены от заболеваний, которые относятся к PCV-2, и только после отъема у поросят могут появляться клинические симптомы.

Как следствие, для защиты поросят посредством вакцинации поросята в идеале должны быть защищены при отъеме и в последующем, поскольку то, когда заболевания, связанные с PCV-2, начнут проявляться, является непредсказуемым.

Для достижения этой задачи при схеме вакцинации с двумя инъекциями поросята должны получить свою первую вакцинацию уже на первой неделе(ях) жизни с тем, чтобы получить повторную иммунизацию приблизительно в момент отъема и иметь полную защиту от инфекции PCV-2 сразу после отъема.

Вероятно, поросята имеют антитела материнского происхождения (MDA) к PCV-2. (Распределение титров MDA у поросят, которых применяли в экспериментах с вакциной по изобретению, даны в разделе «Примеры»). Однако хорошо известно, что наличие антител материнского происхождения влияет на вакцинирование.

У поросят могут быть разные титры MDA. Очень высокие титры пассивных MDA могут защитить поросят от инфекции PCV-2 (Merial: "PCV-2 Diseases: From research back to the field strain", 18 IPVS, Hamburg Germany, June 2004, page 99-101).

Однако поросята с более низкими титрами MDA не будут защищены от инфекции PCV-2 при достижении соответствующего возраста (т.е. после отъема).

У тех поросят, которые большинство времени проводят в поле, титры MDA могут быть слишком низкими для обеспечения защиты от инфекции PCV-2, хотя при этом достаточно высокими для того, чтобы влиять на вакцинацию, например, общепринятой инактивированной PCV-2 вакциной. В частности, поскольку инактивированная вакцина может содержать меньше антигена по причине того, что вирус не может быть размножен до высоких титров в культуре клеток (или в производство вакцины следует ввести усложненные и требующие времени процедуры концентрирования). В частности, для данной группы поросят установлено, что вакцина по изобретению обеспечивает адекватную защиту от PCV-2 инфекции.

Настоящее изобретение относится к вакцине, которая может использоваться в способе защиты поросят, даже если поросята являются позитивными по MDA к PCV-2, от инфекции PCV-2, и таким образом от заболевания, связанного с PCV-2, в особенности PMWS и PDNS.

Настоящее изобретение относится к вакцине против PCV-2, содержащей по меньшей мере 20 микрограмм/доза белка ORF-2 цирковируса свиней 2 типа (PCV-2).

Было установлено, что вакцина, содержащая по меньшей мере 20 микрограмм (мкг) белка ORF-2 PCV-2 в дозе, способна вызывать защитный иммунный ответ против

PCV-2 инфекции (и, следовательно, против заболеваний, связанных с PCV-2, таких как PMWS и PDNS) даже при наличии MDA. Предпочтительно вакцина содержит по меньшей мере 50 мкг в дозе и наиболее предпочтительно 80 мкг в дозе. Вакцины по настоящему изобретению могут быть получены даже с антигенной массой до 275 мкг в дозе, и такие вакцины сохраняют способность не вызывать местные реакции на месте инъекции. В дозу для вакцинирования вакциной по изобретению может быть помещено еще больше микрограмм антигена, но если защита, получаемая от такой вакцины, не усиливается при увеличении дозы, то рост количества антигена приводит лишь к удорожанию вакцины. Кроме того, рост дозы антигена может в конечном итоге привести к неприемлемым местным реакциям на месте инъекции, которые следует избегать. Способ измерения массы антигена предоставлен в экспериментальной части заявки.

Вакцина по изобретению может содержать рекомбинантный белок ORF-2, где указанный рекомбинантный белок предпочтительно получают путем экспрессии бакуловирусного экспрессионного вектора в клетках насекомых, указанный бакуловирусный экспрессионный вектор содержит последовательность гена ORF-2 PCV-2 под контролем подходящего промотора.

Хотя в качестве способа получения вакцины по изобретению можно применить другие подходящие системы экспрессии, известные в данной области техники, было установлено, что применение бакуловирусной системы экспрессии приводит к большему выходу при получении вирусного антигена, который, кроме того, демонстрирует хорошую антигенность. Следовательно, применение бакуловирусной системы экспрессии устраняет необходимость в сложных и требующих времени процедур для концентрирования антигена до подходящего уровня, если он не может быть получен в высокой концентрации, например, из клеточной культуры, инфицированной вирусом.

Наиболее широко применяемым вектором бакуловирусной системы экспрессии является Autographa californica , который часто применяют на культурах клеток насекомых SF-9, SF-21 или клеток насекомых High five. SF-9 и SF-21 являются линиями клеток яйцеклеток от Spodoptera frugiperda, клетки High five происходят из клеток яиц от Trichoplusia ni. Ген PCV-2 ORF-2 следует поместить под контролем подходящего промотора. Наиболее распространенными применяемыми промоторами бакуловирусной экспрессионной системы являются промоторы гена полигедрина и промотор гена р10, что означает, что последовательность гена ORF-2 PCV-2 встраивают в сайт встраивания, либо в локусе полигедрона, либо в локусе р10 бакуловирусного генома. Также можно применять другие подходящие промоторы, либо гомологичные, либо гетерологичные, известные в области техники. Подробное описание всех аспектов бакуловирусной системы экспрессии даны в «Baculovirus Expression vectors» by D. R. O'Reilly, L. K. Miller, and V.A. Luckow (1992, W. H. Freeman & Co, New York). Более того, векторы экспрессии, полученные из бакуловирусов, и полноценные системы экспрессии коммерчески доступны от многих различных компаний.

Вакцина по изобретению также может содержать подходящий адъювант. В данной области техники известно много систем адъювантов, например широко применяются системы адъювантов «масло-в-воде». Можно применять любое подходящее масло, например минеральное масло, которое, как известно в области техники, можно применять в качестве адъюванта. Масляная фаза также может содержать подходящую смесь различных масел, либо минеральных, либо неминеральных. Подходящий адъювант также может содержать витамин Е, необязательно смешанный с одним или несколькими маслами. Водная фаза адъюванта вакцины с адъювантом из воды и масла будет содержать антигенное вещество. Подходящие композиции обычно содержат от 25-60 масляной фазы (40-75% водной фазы). Примеры подходящих составов могут содержать 30% водной фазы и 70% масляной фазы или по 50% каждой.

Вакцину по изобретению можно вводить подходящими путями, известными в данной области техники, такими как внутримышечный, внутрикожный или подкожный, где внутримышечное введение является предпочтительным.

Настоящее изобретение также относится к способу получения вакцины для защиты молодых поросят, которые позитивны на PCV-2 MDA, от PCV-2 инфекции, где указанная вакцина представлена в 20 мкг/доза белка ORF-2 цирковируса свиней 2 типа (PCV-2).

Вакцину (полученную способом) по изобретению можно применять в способе защиты молодых поросят от PCV-2 инфекции.

Вакцину по изобретению также можно применять в способе защиты молодых поросят, которые позитивны на антитела к PCV-2 материнского происхождения. Распределение титров MDA у молодых поросят, б льшую часть времени проводящих на поле ферм всей Европы, представлены в таблице 1, и защита, обеспеченная вакциной по изобретению, представлена в таблице 2.

Было показано, что вакцина по изобретению также может обеспечить адекватную защиту поросят от PCV-2 инфекции, у которых есть титры MDA, относятся к «группе 2», как определено в разделе «Примеры» (таблица 2). У поросят, относящихся к этой группе, титры MDA между 8 и 12 log2, который является высоким титром MDA.

Следовательно, вакцину по изобретению можно также применять в способе защиты молодых поросят, у которых титр MDA против PCV-2 составляет до 10 log2 или даже 12 log2 (при измерении способом, как указано в разделе «Примеры»).

Из таблицы 1 можно определить, что около 55% поросят различных ферм Европы относятся к этой группе 2 (при этом, безусловно, поросята, относятся к группе 1, у которых более низкий титр MDA и которые составляют 32% популяции, также защищены вакциной по изобретению). Таким образом, можно сделать вывод, что вакцина по изобретению обеспечивает защиту подавляющему большинству поросят, находящихся в поле, включая поросят с высокими титрами MDA.

Для обеспечения адекватной защиты вакцина предпочтительно вводится по схеме вакцинации с 2 инъекциями, где первая инъекция (первичная вакцинация) делается поросятам в возрасте с первой по четвертую недели, предпочтительно перед отъемом, например в возрасте первой недели. Вторая инъекция (повторная вакцинация) может быть сделана приблизительно через 3 недели. В таком случае поросята приобретут полную защиту от PCV-2 инфекции сразу после отъема, когда поросята особенно чувствительны к PCV-2 инфекции и, таким образом, становятся чувствительны к PMWS и PDNS.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Титры PCV-2 специфичных антител (определение имеющих материнское происхождение)

Титры антител против PCV-2 можно определить следующим образом.

Получали монослой клеток РК15 в 96-луночной культуральной чашке. При 80% конфлюэнтности клетки инфицировали полевым изолятом PCV-2 и далее инкубировали в течение 2 дней при 37°С в СО ₂ инкубаторе. После этого периода клетки фиксировали в этаноле и хранили при 2-8°С до применения. Чашки применяли для тестов, если приблизительно 20% клеток были инфицированы.

Для определения титра специфических антител к PCV-2 в данной сыворотке делали последовательные разведения и инкубировали на зафиксированных этанолом клетках. После 1 часа инкубации при 37°С чашки промывали водопроводной водой и связавшиеся антитела детектировали посредством инкубации с FITC-меченными кроличьими антителами против IgG свиней. Титр данных сывороток был представлен как обратное наивысшего разведения, при котором еще можно наблюдать ответ PCV-2 специфических антител.

Типичное распределение титров антител материнского происхождения к PCV-2 у поросят-сосунков представлено в таблице 1.

Сыворотки собирали у 232 поросят из различных стран по всей Европе.

Таблица 1 Распределение титров антител материнского происхождения в группе из 232 молодых поросят
Категории поросят с титрами (log2) антител, специфических к PCV-2, материнского происхождения в популяции	Процент поросят в категории	Процент поросят в группе
4	1,3	32
5	9,9
6	9,1
7	12,1
8	9,5	55
9	19,4
10	11,2
11	9,9
12	4,7
13	5,2	13
14	3,0
15	2,6
16	1,3
17	0,8

В таблице 1 можно выделить три группы: группа 1 - поросята с титрами меньше 8, группа 2 - поросята с титрами от 8 до 12, и группа 3 - поросята с титрами от 13 или выше. В группе 3 титры антител материнского происхождения настолько высокие, что, вероятно, поросята будут защищены в течение существенного возрастного периода (Merial: "PCV-2 Diseases: From research back to the field strain", 18 IPVS, Hamburg Germany, June 2004, page 99-101). Однако в группе 1 титры антител материнского происхождения настолько низкие, что поросят легко вакцинировать. Однако в группе 2 титры антител такой величины, что общепринятый подход к вакцинированию, возможно, потерпит неудачу при иммунизации большинства этой группы. Поскольку более половины поросят, по-видимому, относятся к этой группе, будет в высшей степени важно иметь возможность защитить поросят из этой группы при желании устранить PMWS на фермах.

В области техники хорошо известно, что вакцинированию при наличии титров антител материнского происхождения можно помочь посредством адъюванта и/или высокого содержания антигена. Остается неизвестным, какой адъювант или какое содержание антигена будет способно преодолеть титры антител материнского происхождения, направленных на данный патоген. Для этого в описанных экспериментах заявители пытались определить минимальное количество антигена, которое будет необходимо для защиты поросят из группы 2 от PCV-2 инфекции.

Пример 2. Получение рекомбинантоного бакуловируса, экспрессирующего PCV-2 ORF-2

PCV-2 вирус выделяли из ткани легкого поросенка на откорме, проявляющего клинические и патогистологические признаки PMWS, применяя свободные от PCV клетки семенников свиньи (ST). Вирус размножали посредством 5 пересевов на клетки РК15, свободные от PCV.

ДНК выделяли из препарата вируса PCV-2, очищенного из супернатанта клеток РК15. Для амплификации гена ORF-2 делали ПЦР, основанный на опубликованных последовательностях, применяя праймеры, содержащие рестриктные сайты BamH1 (прямой праймер: CGG GAT CCG TTT TCA GCT ATG ACG TAT, обратный праймер: CGG GAT CCT TTA TCA CTT CGT AAT GGT T). Получаемый ампликон несет полностью ген ORF-2, добавочно фланкированный BamH1 рестриктными сайтами.

После электрофореза в геле ампликон вырезали и очищали. Очищенный фрагмент ORF-2 PCV-2 потом разрезали BamH1 и лигировали в pAcAS3, разрезанный BamH1 (Vlak et.al. (1990) Virology 179 312-320). Эта плазмида содержит промотор р10 перед местом вставки, позволяя экспрессировать чужеродные гены под контролем промотора р10.

Бактерии ТОР 10F' (Invitrogen, Carlsbad, USA) трансформировали лигазной смесью, и клоны, содержащие правильный конструкт, отбирались на основе своей последовательности. Положительный клон наращивали и перенесенную плазмиду еще раз проверяли посредством секвенирования.

Перед трансфекцией вирус полиэдроза Autographa californica (AcNPV, описанный у Martens et.al. (1995) J. Virol. Methods 52 15-19) разрезали Bsu36I. Сайт Bsu36I в этом вирусе является уникальным рестриктным сайтом в локусе р10.

Клетки Spodoptera frugiperda (Sf9) затем трансфицировали переносимой плазмидой и порезанную Bsu36I ДНК бакуловируса AcNPV, применяя CellFectine (Life Technologies, Gaithersburg, USA). Супернатант от трансфекции собирали на 3 день после трансфекции и проводили очистку бляшек на клетках Sf9.

Бляшки наращивали, и скринировали получаемый вирус на наличие вставки гена ORF-2 PCV-2 посредством секвенирования выделенной вирусной ДНК, и проводили иммунофлуоресценцию на клетках Sf9, применяя anti-PCV-2 сыворотки кроликов и свиней.

Рассев полученного рекомбинантного бакуловируса BacPCV-2-ORF-2 назвали Masterseed . Masterseed и 5-й пассаж Masterseed на Sf9 клетках тестировали на стабильность вставки гена ORF-2 PCV-2 посредством секвенирования выделенной ДНК и иммунофлуоресценции на клетках Sf9.

Для определения количества инфекционного вируса в препаратах вируса проводили титрования. Титрования проводили на клетках Sf9 и считывали посредством наблюдения CPE специфическую и/или ORF-2 PCV-2 специфическую иммунофлуоресценцию, применяя поликлональную кроличью anti-PCV-2 иммунную сыворотку.

Было показано, что получили очищенный из бляшек Masterseed рекомбинантного AcNPV бакуловирус BacPCV-2-ORF-2. Этот конструкт стабильно экспрессировал белок PCV-ORF-2 под контролем р10 промотора в Sf9 клетках, если судить по секвенированию и иммунофлуоресценции Masterseed и 5-го пассажа Masterseed в клетках Sf9.

Пример 3. Получение антигена PCV-2

Для получения максимального количества экспрессированного продукта проводили пробные эксперименты для оптимизации условий получения рекомбинантного белка PCV-2 ORF-2. Все эксперименты проводили, применяя клетки Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) в суспензионной культуре при 28°С. Вирус

BacPCV-2-ORF-2 на уровне 4-го пассажа Masterseed применяли для инфекции. Для оптимизации получения плотность клеток в момент инфицирования была 1,4×10⁶ клеток/мл, множественность заражения (MOI) составляла 0,01 и культивирование продолжалось в течение 6 дней после инфицирования. Полученная смесь была названа сбором продукта экспрессии. Экспрессию в оптимизированных условиях проводили 5 раз в отдельных экспериментах в течение одногодичного курса.

Поскольку антиген находился в клетках, весь собранный материал, включающий как клетки, так и супернатант, озвучивали ультразвуком до такой степени, при которой по меньшей мере 90% клеток были разрушены. После этого живой рекомбинантный вирус в порциях озвученного препарата инактивировали 33 мМ бинарного этиленимина (BEI) при 37°С в течение 72 часов при постоянном помешивании при рН 7,5. После инактивации BEI нейтрализовали добавлением тиофосфата натрия в 1,6-кратном молярном избытке.

После нейтрализации клеточный дебрис и полигедрин удаляли посредством низкоскоростного центрифугирования при 600 g в течение 10 минут. Полученный супернатант назвали суспензией инактивированного вируса.

Продукты проверяли на стерильность и полноту инактивации. Полноту инактивации проверяли посредством пересева суспензии инактивированного вируса в Sf9 клетки в течение 2 недель и визуальной оценки на наличие специфичных к бакуловирусу CPE.

Было показано, что были получены титры бакуловируса 8,5 log₁₀ TCID ₅₀/мл, которые были полностью инактивированы после обработки BEI.

Пример 4. Определение количества антигена PCV-2

Препараты инактивированной суспензии до и после низкоскоростного центрифугирования и препарат супернатанта культур клеток родительского перенесенного вируса подвергали денатурирующему гель-электрофорезу в SDS-полиакриламидном геле по способу Laemmli (Laemmli, U. K. (1970). Nature 227,

680-685). Применяли 4-12% градиентный гель, который окрашивали Coomassie Brilliant Blue.

После выполнения вестерн-блоттинга белки из геля электрофоретически переносили на нейлонную мембрану, которую забивали обезжиренным молоком в PBS, и обрабатывали разведенной поликлональной сывороткой свиней, индуцированную к полевому изоляту PCV-2.

Как показатель содержания антигена в полученной суспензии инактивированного вируса, 1 микролитр (мкл) такой суспензии прогоняли на геле таким же способом, в то время как последовательные разведения бычьего сывороточного альбумина (Sigma, St.Louis, USA. cat.no. A-2153) одновременно прогоняли на этом же геле в качестве стандарта. Количественное определение продукта гена ORF-2 в суспензии инактивированного вируса проводили посредством сравнения плотностей БСА стандарта с образцом, содержащим PCV-2, посредством применения съемки на камеру и компьютерного анализа посредством Gene Tools (SynGene, Cambridge, UK. v.3.06.02).

Когда инактивированные продукты до и после низкоскоростного центрифугирования сравнивали на электрофоретическом разделении в SDS-ПААГ гелях относительно маркеров Precision Plus (Bio-Rad, Hercules, USA), материал до центрифугирования давал 2 преобладающие полосы примерно одинаковой плотности с приблизительными молекулярными массами (MW) 30 и 26,8 кДа, тогда как материал после центрифугирования содержал только нижнюю полосу. Когда родительский переносимый вирус прогоняли рядом с рекомбинантным вирусом, родительский переносимый вирус содержал только верхнюю из двух полос, показывая, что нижняя полоса соответствовала ORF-2 PCV, а верхняя полоса являлась полигедрином, который удалялся после центрифугирования.

Подлинность нижней 26,8 кДа полосы далее подтвердили посредством вестерн-блоттинга, где было показано, что эта полоса, но не полоса 30 кДа, реагировала с поликлональной сывороткой свиней, индуцированной к полевому изоляту PCV-2.

Уровни экспрессии ORF-2 PCV-2 определяли в 5 независимых экспериментах, и в каждом случае количество намного превосходило лимит определения, в частности находящийся в интервале от 40 до 550 микрограмм/миллилитр (мкг/мл) суспензии инактивированного вируса.

Пример 5. Влияние количества ORF-2 PCV-2 на результат вакцинирования поросят, позитивных по MDA

Вакцины с разным содержанием ORF-2 PCV-2 антигена готовили и применяли для вакцинирования молодых поросят с различными уровнями антител материнского происхождения (MDA) к PCV-2. Проводились две вакцинации с перерывом 3 недели. Серологический ответ на антиген измеряли 5-6 недель после первой вакцинации. С данного момента определяли влияние содержания антигена на результат вакцинирования при наличии MDA.

Делали различные разведения антител и смешивали 1:1 (об./об.) с водно-масляным адъювантом, например с общепринятым в области техники.

Далее в возрасте от 1 до 4 недель пометы разделяли на группы и внутримышечно вводили вакцины, содержащие различные количества белка PCV-2-ORF-2, или не вакцинировали. Вакцинации повторяли через 3 недели. Были образованы следующие группы: 114 поросят вакцинировали 1-14 мкг белка/доза ORF-2 PCV-2 (группа 1), 85 поросят вакцинировали 20 и 80 мкг/доза (группа 2).

Забирали кровь на момент первой вакцинации и через 5-6 недель. Сыворотку получали и анализировали на антитела к PCV-2 посредством иммунофлуоресценции. С этой целью монослой РК15 клеток в 96-луночной культуральной чашке инфицировали полевым изолятом PCV-2. После 2 дней культивирования, когда приблизительно

20-30% клеток были инфицированы, монослои фиксировали в этаноле и хранили при 2-8°С до применения. Для определения титра последовательные разведения исследуемой сыворотки инкубировали с клетками в течение 1 часа при 37°С и после промывания чашек связавшиеся антитела детектировали посредством 1-часовой инкубации с FITC-меченными кроличьими антителами против IgG свиней (Nordic, Tilburg, The Netherlands). Титры определяли как обратные наивысшего разведения, при котором еще можно наблюдать PCV-2 специфическую флуоресценцию. Для всех животных определяли уменьшение титра антител между первым и вторым кровопусканием. Если за данный период титр антител не уменьшился или повысился, это расценивали как результат вакцинирования. Однако если титр антител, специфичных к PCV-2, уменьшался, это расценивали как неудачное вакцинирование и результата от вакцинирования не было.

Соотнося результаты вакцинирования различными дозами с титром антител материнского происхождения на время вакцинирования, можно определить минимальную массу антигена, необходимую для вакцинирования достаточного количества поросят. Результаты этого анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2 Процент результативности вакцинирования при различных титрах MDA и концентрации антигена
Категории поросят с титрами (log2) антителами материнского происхождения, специфичных к PCV-2, на момент вакцинирования	Группа 1: 1-14 мкг/доза	Группа 2: 20-80 мкг/доза
Число поросят в категории/число поросят, которым вводили вакцину	Процент результативного вакцинирования на группу	Число поросят в категории/число поросят, которым вводили вакцину	Процент результативного вакцинирования на группу
4	3/3	90%	1/1	100%
5	0/0	3/3
6	15/13	5/5
7	2/2	3/3
8	12/8	17%	4/4	76%
9	12/5	11/10
10	6/0	13/10
11	21/0	15/10
12	26/0	7/4
13	15/0	0%	6/1	4%
14	2/0	11/0
15	0/0	4/0
16	0/0	1/0
17	0/0	1/0
Всего	114/31	27%	85/51	60%
Всего защищенных*	114/48	42%	85/73	86%
* общее число защищенных поросят приводится как число поросят, которым вводили вакцины, к числу поросят с титром ниже 13 и поросят, которые уже имеют титр 13 или выше.

В данной таблице «результативное вакцинирование» означает, что вакцинирование поросенка приводило к титру PCV-2 специфических антител на первой неделе после повторной вакцинации, который равен или превышает PCV-2 специфический титр после первичной вакцинации. Во всех подобных случаях было показано, что вакцина индуцировала активный серологический ответ на PCV-2, и в этих случаях поросят можно считать устойчивыми к PCV-2 инфекции. Однако у поросят, у которых титр на первой неделе после повторной вакцинации был ниже, чем после первичной вакцинации, вакцинирование не способно оказать иммунный ответ, и наблюдался естественный спад антител материнского происхождения, который со временем сделает поросят восприимчивыми к PCV-2 инфекции. В таблица показано, что при применении доз вакцинирования, равных или менее 14 микрограмм, в группе 1 (титры MDA 7) 90% животных пройдут сероконверсию благодаря вакцинации и могут, таким образом, быть рассмотрены как защищенные. Однако в группе 2 (титры MDA >7 и <13) только 17% животных, вакцинированных дозой, меньшей или равной 14 микрограмм, прошли сероконверсию и были защищены. В группе из 17 животных, у которых титры 13 или больше и которые, следовательно, были уже защищены естественно приобретенными антителами материнского происхождения, специфичными к PCV-2. Таким образом, можно сделать вывод, что в этой группе из 114 поросят только 48 (42%) были защищены; 17 поросят с уже высокими титрами антител материнского происхождения плюс 31 поросенок с сероконверсией в группах 1 и 2.

В группе вакцинированных 20 микрограммами в дозе или более значительно больше животных были защищены; все животные в группе 1 и 76% животных в группе 2 прошли сероконверсию к PCV-2 и, следовательно, были защищены, прибавляя к этому поросят с титрами MDA 13 или более, было установлено, что 88% поросят в этой группе были защищены.

Поскольку защита стада достигается, когда около 80% или более животных защищены, можно сделать вывод, что масса антигена в вакцине, направленной против PCV-2, должна содержать по меньшей мере 20 мкг антигена или более для того, чтобы эффективно защищать стадо от последствий PCV-2 инфекции.