способ очистки антител

Формула изобретения

1. Способ отделения одного или более чем одного антитела от одного или более чем одного другого соединения в жидком образце, при котором подвижную фазу, содержащую указанный жидкий образец, приводят в контакт с мультимодальной разделительной матрицей с целью адсорбции одного или более соединений-мишеней, в то время как антитела остаются в свободном состоянии в подвижной фазе, где мультимодальная разделительная матрица содержит группы первого типа, способные взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами соединения(й)-мишени(ей), и группы второго типа, способные по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд, с указанным(и) соединением(ями)-мишенью(ями).

2. Способ по п.1, где мультимодальная разделительная матрица предложена в хроматографической колонке, подвижная фаза проходит через указанную колонку под действием силы тяжести и/или с помощью насоса, и антитела извлекают из потока, проходящего через колонку.

3. Способ по п.1, где жидкий образец содержит супернатант, полученный в результате ферментации клеток.

4. Способ по п.1, где контакту с мультимодальной разделительной матрицей предшествует стадия механического фильтрования и/или хроматографии.

5. Способ по п.1, где жидкий образец содержит неочищенный исходный материал.

6. Способ по п.5, где соединение(я)-мишень(и) представляет(ют) собой белки клетки-хозяина и по существу все указанные белки адсорбируют на мультимодальной разделительной матрице.

7. Способ по п.4, где жидкий образец содержит элюат с разделительной матрицы.

8. Способ по п.7, где разделительная матрица, с которой получают элюат, содержит белковые лиганды, предпочтительно лиганды на основе белка А или G.

9. Способ по п.1, где проводимость подвижной фазы находится в диапазоне от 0 до 25, например от 0 до 15 мСм/см.

10. Способ по п.1, где группы первого типа представляют собой четвертичные амины.

11. Способ по п.1, где группы второго типа представляют собой группы, образующие водородные связи.

12. Способ по п.1, где группы второго типа представляют собой гидрофобные группы, такие как группы, содержащие ароматическую(ие) или гетероароматическую(ие) кольцевую(ые) структуру(ы).

13. Способ по п.1, где разделительная матрица содержит группы первого и второго типа, связанные с одними и теми же лигандами.

14. Способ по п.1, где группа первого и группа второго типа отделены друг от друга углеводородной цепью из 1-3 атомов углерода.

15. Способ по п.1, где лиганды иммобилизованы на подложке посредством своих групп первого типа.

16. Способ по п.1, где разделительная матрица содержит группы первого и второго типа, связанные с разными лигандами.

17. Способ по п.1, где разделительная матрица представлена в форме частиц и содержит смесь частиц первого типа, на которых иммобилизованы лиганды, содержащие группы первого типа; и частиц второго типа, на которых иммобилизованы лиганды, содержащие группы второго типа.

18. Способ по п.1, где разделительная матрица представляет собой фильтр, на котором иммобилизована смесь лигандов первого типа, содержащих группы первого типа; и лигандов второго типа, содержащих группы второго типа.

19. Способ по п.1, где разделительная матрица содержит группы третьего типа, способные к взаимодействию третьего типа с соединением-мишенью.

20. Способ по п.1, где антитела представляют собой моноклональные антитела.

21. Способ по п.20, где антитела представляют собой гуманизированные антитела.

22. Способ по п.1, где мультимодальная разделительная матрица предложена в одноразовой хроматографической колонке.

23. Способ по п.22, при котором одноразовую колонку стерилизуют перед приведением в контакт с подвижной фазой.

24. Набор для очистки антител от одного или более чем одного другого компонента в жидкости, содержащий в разных ячейках первую хроматографическую колонку, заполненную первой разделительной матрицей; вторую хроматографическую колонку, заполненную мультимодальной разделительной матрицей, которая содержит группы первого типа, способные взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами соединений-мишеней, и группы второго типа, способные по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд, с указанными соединениями-мишенями; один или более буферов; и письменные инструкции по очистке антител из потока, проходящего через мультимодальную разделительную матрицу.

25. Набор по п.24, где в первой хроматографической колонке разделительная матрица содержит белковые лиганды, предпочтительно лиганды на основе белка А или G.

26. Набор по п.24, где первая и/или вторая хроматографические колонки являются одноразовыми колонками.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу очистки антител. Данный способ может быть, например, применен к неочищенному исходному материалу или в качестве стадии, следующей за аффинной хроматографией, для удаления оставшихся примесей и веществ, выходящих со смолы для аффинной хроматографии. Настоящее изобретение также включает набор для очистки антител.

Предшествующий уровень техники

Иммунная система состоит из большого числа независимых типов клеток, которые совокупно защищают организм от бактериальных, грибковых, вирусных инфекций, инфекций, вызываемых паразитами, и от роста опухолевых клеток. "Охранниками" иммунной системы являются макрофаги, которые постоянно блуждают по кровотоку их хозяина. На попадание в организм веществ в результате инфекции или иммунизации макрофаги отвечают поглощением "оккупантов", помеченных чужеродными молекулами, известными как антигены. Это событие, опосредованное хелперными Т-клетками, запускает сложную цепь ответов, результатом которых является стимуляция В-клеток. Эти В-клетки, в свою очередь, продуцируют белки, называемые антителами, которые связываются с чужеродным "оккупантом". В результате связывания антитела и антигена чужеродный "оккупант" метится для деструкции посредством фагоцитоза или активации системы комплемента. Существует несколько различных классов антител, известных также как иммуноглобулины, таких как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Они различаются не только по их физиологической роли, но и по их структуре. Со структурной точки зрения широко изучены IgG-антитела возможно ввиду того, что они играют основную роль в природном иммунном ответе. Поликлональные антитела получают в соответствии со стандартными способами иммунизации животного соответствующим антигеном. В ответ на это животное будет продуцировать антитела, являющиеся поликлональными. Однако для решения многих задач желательно иметь единичный клон конкретного антитела, известный как моноклональные антитела. Моноклональные антитела (mAb) продуцируются гибридными или слитыми клетками, образованными в результате слияния нормальной В-клетки, продуцирующей только единичное антитело, с аномальной опухолевой клеткой миеломы. Получающийся в результате гибрид, известный как гибридома, в наши дни используется в стандартных способах получения антител. Биологическая активность, которой обладают иммуноглобулины, в настоящее время применяется в ряде различных приложений в области диагностики, охраны здоровья и терапии людей и животных. Фактически в течение нескольких последних лет моноклональные антитела и рекомбинантные конструкции антител стали наиболее обширным классом белков, проходящих текущие исследования в рамках клинических испытаний и получающих одобрение FDA (Food and Drug Administration; Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США)) в качестве терапевтических и диагностических средств. В дополнение к разработкам систем экспрессии и стратегий производства для получения высокоочищенных антител простым и эффективным с точки зрения затрат способом необходима разработка эффективных протоколов очистки антител.

Традиционные способы выделения иммуноглобулинов основаны на избирательном обратимом осаждении белковой фракции, содержащей иммуноглобулины, при котором остальные группы белков остаются в растворе. Типичными агентами для осаждения являются этанол, полиэтиленгликоль, лиотропные соли, такие как сульфат аммония и фосфат калия, и каприловая кислота. Обычно применение таких способов осаждения приводит к получению продуктов очень низкой степени чистоты, при этом одновременно требует больших затрат времени и является трудоемким. Кроме того, добавление вызывающего осаждение агента к неочищенному материалу затрудняет использование супернатанта для других целей и создает проблему утилизации остатков, которая является особенно острой, когда речь идет о крупномасштабной очистке иммуноглобулинов.

Альтернативным способом выделения иммуноглобулинов является хроматография, которая включает в себя семейство близкородственных способов разделения. Характерной чертой, отличающей хроматографию от большинства других физических и химических способов разделения, является наличие двух взаимно несмешивающихся фаз, приведенных в контакт, причем одна фаза является неподвижной, а вторая подвижной. Смесь образцов, введенная в подвижную фазу, претерпевает ряд взаимодействий с неподвижной и подвижной фазами по мере ее переноса по системе подвижной фазой. Взаимодействия основываются на различиях в физических и химических свойствах компонентов образца. Эти различия влияют на скорость перемещения индивидуальных компонентов под влиянием подвижной фазы, движущейся через колонку, содержащую неподвижную фазу. Разделенные компоненты появляются на выходе в зависимости от возрастания силы взаимодействия с неподвижной фазой. В наименьшей степени удерживаемый компонент элюируется первым, наиболее сильно удерживаемый материал элюируется последним. Разделение достигается, когда один компонент удерживается в достаточной степени для того, чтобы предотвратить перекрытие с зоной соседнего растворенного вещества по мере того, как компоненты образца элюируются с колонки. Постоянно предпринимаются усилия для создания оптимальной неподвижной фазы для каждой конкретной цели разделения. Такая неподвижная фаза в общем случае содержит подложку или основную матрицу, к которой присоединен лиганд, содержащий функциональные группы, то есть группы, участвующие в связывании. Ссылка на каждый вид хроматографии, как правило, дается на основании используемого принципа взаимодействия, как, например, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий и аффинная хроматография.

В протоколах выделения иммуноглобулинов часто используется ионообменная хроматография. При анионообменной хроматографии отрицательно заряженные боковые цепи аминокислот иммуноглобулина будут взаимодействовать с положительно заряженными лигандами хроматографической матрицы. При катионообменной хроматографии, наоборот, положительно заряженные боковые цепи аминокислот иммуноглобулина будут взаимодействовать с отрицательно заряженными лигандами хроматографической матрицы.

Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) представляет собой другой способ, описанный и используемый в протоколах выделения иммуноглобулинов. Если задачей является получение высокоочищенного иммуноглобулинового продукта, в общем случае рекомендуется объединять HIC с одной или более дополнительными стадиями очистки. При HIC, для того чтобы иммуноглобулин эффективно связывался с HIC-матрицей, необходимо добавление лиотропных солей к подвижной фазе. Связанный иммуноглобулин далее высвобождают с матрицы посредством снижения концентрации лиотропной соли. Таким образом, недостатком этой процедуры является необходимость добавления лиотропной соли к неочищенному материалу, поскольку это может создавать проблемы и в результате повышать стоимость при крупномасштабном применении. Например, добавление лиотропных солей к таким неочищенным материалам, как сыворотка, плазма и яичный желток, будет во многих случаях затруднять крупномасштабные применения, поскольку соль может препятствовать любому экономически возможному использованию отделенного от иммуноглобулинов исходного материала. Дополнительной проблемой при крупномасштабных применениях будет утилизация нескольких тысяч литров отходов.

Аффинная хроматография основывается на специфических взаимодействиях между биомолекулой-мишенью и биоспецифическим лигандом по принципу узнавания "замок-ключ". Таким образом, мишень и лиганд будут составлять аффинную пару, такую как антиген/антитело, фермент/рецептор и так далее. Хорошо известны аффинные лиганды на основе белков, таких как белок А и белок G, аффинная хроматография с использованием которых является широко распространенным способом как выделения, так и очистки антител. Хорошо известно, что хроматография с использованием белка А обеспечивает выдающуюся специфичность, в особенности в отношении моноклональных антител, и вследствие этого получение высокой степени чистоты. Основанные на применении белка А способы, используемые в сочетании со стадиями ионного обмена, гидрофобного взаимодействия, очистки на гидроксиапатите и/или гельфильтрации, стали предметом выбора многих биофармацевтических компаний в качестве способов очистки антител, смотри, например, WO 8400773 и US 5151350. Однако ввиду наличия пептидных связей в белках матрицы с белком А являются в определенной степени чувствительными к щелочам. К тому же, когда матрицы с белком А используются для очистки антител из клеточной культуральной среды, клеточные протеазы могут вызывать утечку белка А или его фрагментов.

Попытка уменьшить утечку лиганда из матриц для аффинной хроматографии представлена в WO 03/041859 (Boehringer Ingelheim Pharma KG), где предлагается предварительно обрабатывать, например, матрицы с белком А по меньшей мере одним поверхностно-активным веществом для снижения утечки лиганда. Аффинная матрица может быть обработана, например, поверхностно-активным веществом в количестве 5-15 свободных объемов. Продолжительность контакта является критичной для эффективности процесса. Например, при комнатной температуре для снижения утечки требуется продолжительность контакта по меньшей мере 16 ч.

Альтернативный подход к решению проблемы утечки лиганда из матриц для аффинной хроматографии предложен в US 4983722 (Miles Inc.), где белок А избирательно выделяют из жидкости, содержащей антитело и белок А, посредством выдерживания их с анионообменным материалом. Оба компонента адсорбируются на анионообменном материале, а затем антитела и белок А элюируют друг за другом в условиях повышения ионной силы. Иллюстративным анионообменником является диэтиламиноэтил (DEAE) Trisacryl M или DEAE Sepharose .

WO 2004/076485 (Lonza Biologics Pic.) относится к очистке антител с использованием белка А и ионообменной хроматографии. Стадия ионного обмена включает нанесение антител, очищенных на белке А, на ионообменный материал в условиях, допускающих связывание белка А и осуществление сбора антител в проходящем потоке. Анионообменник представляет собой анионообменник на основе четвертичного амина, наиболее предпочтительно, Sepharose Q (Amersham Biosciences, теперь GE Healthcare).

US 5429746 (SmithKline Beecham Corp.) относится к способу, при котором антитела первоначально адсорбируют на связанной с белком А хроматографической подложке и элюируют; затем адсорбируют на катионообменной хроматографической подложке и селективно элюируют с нее; и окончательно адсорбируют на HIC-подложке и элюируют. Нанесенная на HIC-колонку смесь после аффинной и/или катионообменной хроматографии может содержать агрегаты иммуноглобулинов, неправильно изогнутые разновидности молекул, белки клетки-хозяина и остаточный материал со стадии аффинной хроматографии.

US 6498236 (Upfront Chromatography) направлен на решение конкретных проблем, вызываемых незначительной разницей в молекулярных массах у аффинных лигандов на основе белков по сравнению с иммуноглобулинами-мишенями. Так, описан способ выделения или очистки иммуноглобулинов из раствора, например супернатанта культивируемых гибридомных клеток, плазмы или сыворотки животных, который предложен в качестве альтернативы использования белка А, белка G, синтетических пептидов и других относительно высокомолекулярных лигандов. Твердофазные матрицы, использованные в этом описанном способе, определены формулой M-SP1-X-A-SP2-ACID, где М обозначает основу матрицы, SP1 обозначает спейсер, Х обозначает О, S или NH, А обозначает моно- или бициклическую, возможно замещенную ароматическую или гетероароматическую группировку, SP2 обозначает возможный спейсер и ACID обозначает кислотную группу. Утверждается, что решающее значение, будет ли матрица эффективно связывать иммуноглобулины, имеют конкретные заместители.

В US 5945520 (Burton и др.) описаны хроматографические смолы смешанного действия, которые демонстрируют гидрофобный характер при значениях рН, соответствующих связыванию, и гидрофильный и/или электростатический характер при значениях рН, соответствующих десорбции. Смола специально разработана для связывания соединения-мишени из водного раствора как при низких, так и при высоких значениях ионной силы. Таким образом, на стадии адсорбции используется HIC, в то время как десорбция основывается на отталкивании зарядов.

В US 6702943 (Johansson и др.) описан способ удаления субстанции-мишени из жидкости посредством ее адсорбции на матрице, несущей множество лигандов, содержащих анионообменные группы и имеющих гидрофобную структуру. Более конкретно, лиганды содержат ароматическое кольцо поблизости от положительно заряженных анионообменных групп. Утверждается, что включение других групп, способных участвовать в электронодонорно-электроноакцепторных взаимодействиях, может усиливать степень взаимодействия между субстанцией и адсорбентом. Утверждается, что желаемыми субстанциями являются клетки, части клеток и вещества, содержащие пептидные структуры. Емкость наполнения матрицы определяют по белкам сравнения, таким как бычий сывороточный альбумин и IgG. Описанные лиганды обозначаются как "высокосолевые лиганды" в силу их способности адсорбировать субстанции-мишени при высоких значениях концентраций соли, например 0,25 М NaCl.

Кроме того, в WO 01/38228 (Belew и др.) описан другой способ удаления отрицательно заряженной субстанции из жидкости посредством ее связывания с матрицей, содержащей анионообменные лиганды смешанной природы. Каждый лиганд содержит положительно заряженный азот и тиоэфирную связь на расстоянии 1-7 атомов от указанного заряженного азота. Аналогично сказанному выше, такие желаемые субстанции, как клетки, части клеток и вещества, содержащие пептидные структуры, адсорбируются при концентрациях солей в области 0,25 М NaCl.

Было высказано предположение, что керамический гидроксиапатит является полезным для стадии доочистки иммуноглобулинов. Более конкретно, сообщалось (Chromatography, tech note 2849; S.G. Franklin, Bio-Rad Laboratories, Inc., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547 USA), что IgG1 можно выделить из комплекса IgG1-белок А в нефракционированной среде на керамическом гидроксиапатите СНТ (Bio-Rad). Более конкретно, гидроксиапатит (Са₁₀(PO₄)₆(ОН)₂) представляет собой форму фосфата кальция, которая, как было показано, обладает уникальными свойствами разделения. Однако также известно, что матрицы на основе гидроксиапатита имеют ряд недостатков. Например, ввиду утечки Са они нестабильны при кислых значениях рН и чувствительны к хелатирующим агентам, таким как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). К тому же было показано, что трудно осуществить разработку и масштабирование надежного и воспроизводимого способа очистки с использованием матриц на основе гидроксиапатита, например, ввиду трудности при упаковке гидроксиапатита и поддержании рабочих характеристик колонок большого размера. Наконец, существует риск изменений свойств носителя, обусловленных примесью ионов металлов и обменом ионов кальция, которые вызывают серьезную обеспокоенность у распорядительных органов.

Johansson и др. (Journal of Chromatography A, 1016 (2003) 21-33: "Preparation and characterization of prototypes for multi-modal separation media aimed for capture of negatively charged biomolecules at high salt conditions") описывают скрининг прототипов мультимодальных лигандов для захвата отрицательно заряженных белков из подвижных фаз высокой проводимости. Было обнаружено, что неароматические мультимодальные анионообменные лиганды на основе слабых ионообменных лигандов (первичных и вторичных аминов) были оптимальными для захвата белков посредством адсорбции в условиях высоких концентраций солей.

Краткое описание изобретения

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ отделения антител от других компонентов жидкости, который требует меньших затрат времени и меньшего количества осуществляемых стадий, чем способы предшествующего уровня техники. Это может быть достигнуто способом, при котором жидкость, содержащую антитела, приводят в контакт с мультимодальной разделительной матрицей и существенно чистые антитела извлекают в несвязанной форме. Например, если эту жидкость наносят на хроматографическую колонку, содержащую указанную матрицу, то антитела легко извлекают из проходящего потока.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложен способ отделения антител от других компонентов жидкости с новыми специфическими особенностями по сравнению со способами предшествующего уровня техники.

Согласно следующему аспекту данного изобретения предложен способ отделения антител от других компонентов жидкости, при котором улучшена степень отделения от примесей, присутствующих в неочищенном исходном материале, таких как белки клетки-хозяина.

Дополнительные аспекты и преимущества изобретения будут очевидны из следующего далее подробного описания.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1a)-d) показана иллюстративная подборка мультимодальных анионообменных лигандов, полезных в способе по настоящему изобретению: N-бензил-N-метил-этаноламина, N,N-диметилбензиламина, 2-аминобензимидазола и тиомикамина.

На Фиг.2 показана хроматограмма, соответствующая отделению моноклональных антител на мультимодальных разделительных матрицах, содержащих N-бензил-N-метил-этаноламин, иммобилизованный на Sepharose 6 FF; N,N-диметилбензиламин, иммобилизованный на Sepharose 6 FF; и, для сравнения, на сильном анионообменнике Q Sepharose FF, как описано в Примере 1, приведенном ниже.

На Фиг.3а) и b) показаны хроматограммы моноклональных антител, нанесенных на разделительные матрицы, содержащие тиомикамин и 2-аминобензимидазол, иммобилизованные на Sepharose 6 FF с различной плотностью, как описано в Примере 3, приведенном ниже.

На Фиг.4а)-g) показаны результаты хроматографии смеси mAb1-rProtein A (рекомбинантный белок А), проведенной на прототипах.

На Фиг.5a)-h) показаны результаты аналитической эксклюзионной (гельпроникающей) хроматографии (SEC) образца, содержащего mAb1 и 1% рекомбинантного белка А, и собранных вместе фракций проходящего потока и собранных вместе фракций элюата с хроматографических разделений, показанных на Фиг.4.

На Фиг.6 показано отделение молекул моноклональных антител с использованием мультимодальной матрицы Q Phenyl Sepharose Fast Flow, как описано в Примере 5.

Определения

Термины "антитело" и "иммуноглобулин" используются в настоящем описании взаимозаменяемо.

Термин "разделительная матрица" используется в данном описании для обозначения материала, состоящего из подложки, с которой связаны один или более лигандов, содержащих функциональные группы.

Термин "мультимодальная" разделительная матрица относится к матрице, способной обеспечить наличие по меньшей мере двух различных, но действующих вместе сайтов, которые взаимодействуют с соединением, которое должно быть связано. Например, один из этих сайтов может давать тип взаимодействия заряд-заряд, вызывающий притяжение между лигандом и веществом, представляющим интерес. Другой сайт может давать электронодонорно-акцепторное взаимодействие и/или гидрофобные и/или гидрофильные взаимодействия. Электронодонорно-акцепторные взаимодействия включают такие взаимодействия, как образование водородных связей, - , катион- , с переносом заряда, диполь-диполь, индуцированный диполь и так далее. "Мультимодальные" разделительные матрицы также известны как разделительные матрицы "смешанного типа".

Термин "поверхность" означает в данном описании все внешние поверхности и включает, в случае пористой подложки, наружные поверхности, а также поверхности пор.

Фраза "электронодонорно-акцепторные взаимодействия" означает, что электроотрицательный атом со свободной парой электронов действует в качестве донора и связывается с электрондефицитным атомом, который действует в качестве акцептора для электронной пары данного донора (см., например Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973), page 42).

Термин "анионообменная группа" означает в данном описании группу, которая заряжена положительно или может быть заряжена положительно.

Термин "элюент" используется в его обычном значении в данной области техники, то есть для обозначения буфера с подходящим значением рН и/или ионной силы для высвобождения одного или более соединений с разделительной матрицы.

Термин "стадия захвата" в контексте жидкостной хроматографии относится к начальной стадии процедуры разделения. В самом общем смысле стадия захвата включает в себя осветление, концентрирование, стабилизацию и существенную очистку от растворимых примесей. После стадии захвата может следовать промежуточная очистка, в результате которой дополнительно снижается количество оставшихся примесей, таких как белки клетки-хозяина, ДНК, вирусы, эндотоксины, питательные вещества, компоненты клеточной культуральной среды, например противовспениватели и антибиотики, и ассоциированные с продуктом примеси, такие как агрегаты, неправильно изогнутые разновидности молекул и агрегатов.

Термин "стадия доочистки" в контексте жидкостной хроматографии относится к заключительной стадии очистки, на которой удаляются следовые количества примесей и остается активный безопасный продукт. Примеси, удаленные на стадии доочистки, часто представляют собой конформационные изомеры молекулы-мишени или подозрительные просачивающиеся продукты.

Термин "Fc-связывающий белок" означает белок, способный связываться с кристаллизующейся частью (Fc) антитела и включает, например, белок А и белок G или любой их фрагмент либо слитый белок, который сохраняет указанное свойство к связыванию.

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу отделения антител от одного или более чем одного другого соединения жидкого образца, при котором подвижную фазу, содержащую указанный жидкий образец, приводят в контакт с мультимодальной разделительной матрицей с целью адсорбции одного или более соединений-мишеней, в то время как антитела остаются в свободном состоянии в подвижной фазе, где мультимодальная разделительная матрица содержит группы первого типа, способные взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами соединения(ий)-мишени(ей), и группы второго типа, способные по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд, с указанным(и) соединением(ми)-мишенью(ями). Настоящее изобретение также охватывает способ, где в дополнение к группам первого и второго типа добавляют группы третьего или следующего типа.

В предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют с использованием принципов жидкостной хроматографии, то есть путем пропускания подвижной фазы через хроматографическую колонку, содержащую мультимодальную разделительную матрицу. Подложка может быть в форме пористых или непористых частиц, таких как по существу сферические частицы, в форме монолита, фильтра, мембраны, поверхности, капилляров или в любой другой обычно используемой форме. В альтернативном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют с использованием принципов хроматографии в увеличенном по объему слое, то есть посредством добавления подвижной фазы к увеличенному по объему слою разделительной матрицы в форме частиц, таких как по существу сферические частицы, содержащей наполнитель с высокой плотностью. В другом альтернативном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют с использованием периодического процесса, при котором разделительную матрицу добавляют в сосуд, содержащий жидкий образец.

Таким образом, в способе очистки антител в соответствии с данным изобретением одно или более нежелательных соединений адсорбируют на разделительной матрице, в то время как желаемые антитела остаются в подвижной фазе, не подвергаясь адсорбции. В контексте способа по настоящему изобретению понимают, что термин соединения-"мишени" относится к соединениям, адсорбируемым на разделительной матрице. Очевидно, что природа и особенности адсорбируемых соединений будут зависеть от происхождения жидкого образца. Примерами соединений-мишеней являются клетки и клеточный дебрис; белки и пептиды; нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК; эндотоксины и вирусы.

Согласно одному воплощению настоящего изобретения предложена мультимодальная разделительная матрица в хроматографической колонке, и подвижная фаза проходит через указанную колонку под действием силы тяжести и/или с помощью насоса, при этом антитела извлекают из потока, проходящего через колонку. Преимущество способа по настоящему изобретению состоит в том, что он не требует никакого элюирования антител с колонки. Отсутствие отдельной стадии элюирования является преимуществом рассматриваемого процесса, поскольку меньшее число стадий будет приводить к протоколу более быстрой очистки и, следовательно, снижать производственные издержки. К тому же антитела являются чувствительными к некоторым условиям, которые могут повредить их изогнутую картину либо вызвать их деградацию в результате воздействия на пептидные связи в них. Даже если условия элюирования для анионообменников в общем случае не включают никаких экстремальных химических реагентов, любое видоизменение соли и рН может воздействовать на чувствительное антитело, при этом воздействие изменяется от разновидности к разновидности в зависимости от рI, распределения заряда и так далее. Следовательно, другое преимущество способа по настоящему изобретению состоит в том, что удается избежать добавления элюента и применения условий элюирования к антителам.

Как упомянуто выше, в способе по настоящему изобретению соединения-мишени, от которых желательно отделить антитела, адсорбируются на мультимодальной разделительной матрице. Для достижения наиболее подходящих условий адсорбции соединений-мишеней жидкий образец объединяют с подходящим буфером или другой жидкостью, получая подвижную фазу. Способ по настоящему изобретению преимущественно проводят в условиях, традиционных для анионообменной хроматографии, которые обычно включают адсорбцию при относительно низкой концентрации соли. Таким образом, в одном воплощении способа по настоящему изобретению проводимость подвижной фазы находится в диапазоне от 0 до 25, например от 10 до 15 мСм/см. В одном воплощении рН подвижной фазы составляет приблизительно 5-6. Специалист в этой области техники может легко подобрать условия получения антител в проходящем потоке, например путем регулирования рН или проводимости, которые будут зависеть, например, от заряда и распределения заряда очищаемых антител. Если потребуется, то могут быть введены одна или более стадий промывки до любого или между любыми из таких стадий прохода потока. Если после этого желательно высвобождение адсорбированных соединений, например, для повторного использования матрицы, то может быть осуществлено элюирование при более высокой концентрации соли, например, путем использования возрастающего градиента концентрации соли. Для элюирования адсорбированных соединений можно также, или альтернативно, сдвигать значение рН, например, путем использования понижающего рН градиента.

Как упомянуто выше, мультимодальная разделительная матрица содержит группы первого типа, которые способны взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами соединений-мишеней, и группы второго типа, которые способны по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд, с указанными соединениями-мишенями. В этом контексте понятно, что на одно и то же соединение-мишень нацелены группы разделительной матрицы с различными типами взаимодействия, то есть каждое соединение-мишень в идеальном случае адсорбируется за счет двух или более типов взаимодействия. Мультимодальные лиганды, содержащие положительно заряженные или способные быть положительно заряженными анионообменные группы, известны в этой области техники, смотри, например, US 6702943 (Johansson et al), WO 01/38228 (Belew et al) и WO 02/053252 (Belew et al).

В одном воплощении группы первого типа, то есть анионообменные группы мультимодальной разделительной матрицы, представляют собой сильные анионообменники. В этом контексте под термином "сильные" анионообменники понимают группы, которые остаются заряженными в широком диапазоне рН. В преимущественном воплощении сильные анионообменные группы представляют собой четвертичные амины, также известные как группы Q. В альтернативном воплощении группы первого типа мультимодальной разделительной матрицы представляют собой слабые анионообменники. В этом контексте термин "слабые" анионообменники понимается как обозначающий группы, которые являются заряженными при определенных значениях рН, но могут терять заряд при изменении рН. В конкретном воплощении группы первого типа включают смесь анионообменных групп и дополнительных функциональных групп, например анионообменные и группы, образующие водородные связи. Таким образом, в этом воплощении группы первого типа могут представлять собой ТРИС (TRIS; трис(гидроксиметил)аминометан).

В одном воплощении группы второго типа мультимодальной разделительной матрицы включают ароматические группы и/или группы, образующие водородные связи. В одном воплощении указанные ароматические группы включают кольцевые системы, содержащие ароматические или гетероароматические структуры. В преимущественном воплощении группы второго типа включают фенильные группы. Альтернативно, группы второго типа могут включать смесь ароматических и неароматических гидрофобных групп, таких как алкильные группы. Таким образом, в конкретном воплощении, группы второго типа включают алкильные группы. Разделительная матрица, применяемая в соответствии с изобретением, может содержать две или более чем две функциональные группы одного и того же типа, например два или более разных типов гидрофобных групп; или два или более разных типов мультимодальных анионообменников.

Специалистам в данной области понятно, что функциональные группы разделительной матрицы, применяемой в способе по настоящему изобретению, могут быть представлены на одном и том же лиганде, в этом случае каждый лиганд является мультимодальным, или на разных лигандах, в этом случае мультимодальной является общая природа разделительной матрицы.

Так, в одном воплощении разделительная матрица содержит группы первого и второго типа, связанные с одними и теми же лигандами. Любая из групп первого и второго типа, рассмотренных выше, может быть использована в этом воплощении, например группы четвертичного амина и фенильные группы. В одном воплощении лиганды связаны с подложкой посредством своих групп первого типа, например через аминогруппы, что приводит к образованию четвертичных аминов. В одном воплощении группы первого и второго типа отделены друг от друга углеводородной цепью, содержащей 1-6, например 1-3, предпочтительно 1-2 атомов углерода. В конкретном воплощении лиганды выбраны из группы, состоящей из N-бензил-N-метил-этаноламина; N,N-диметилбензиламина; 2-аминобензимидазола; тиомикамина и Q-фенила (Q Phenyl).

В альтернативном воплощении разделительная матрица содержит группы первого и второго типа, связанные с разными лигандами. Любая из групп первого и второго типа, рассмотренных выше, может быть использована в этом воплощении, например группы четвертичного амина и фенильные группы. В этом воплощении, в случае разделительной матрицы в форме частиц, эти разные лиганды могут быть иммобилизованы на разных или на одних и тех же частицах по существу в одинаковых или разных количествах. Альтернативно или в дополнение к этому разделительная матрица в форме частиц может содержать разные виды групп первого типа или разные виды групп второго типа, иммобилизованные на разных частицах.

Мультимодальная хроматографическая матрица, применяемая в способе по настоящему изобретению, легко изготавливается специалистом в этой области. Кратко, матрица состоит из лигандов, связанных с подложкой (в этой области также известной как основа матрицы) напрямую либо опосредованно через общепринятый спейсер, обеспечивающий соответствующее расстояние между поверхностью подложки и взаимодействующими группами. Для получения высокой адсорбционной емкости подложка в предпочтительном случае является пористой, и тогда лиганды связываются с внешними поверхностями, а также с поверхностями пор. Способы иммобилизации лигандов на пористых или непористых поверхностях хорошо известны в данной области; смотри, например, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992. В одном воплощении плотность лигандов на поверхности подложки находится в диапазоне, близком к обычно используемому для традиционных ионообменных матриц. Лиганды могут быть непосредственно связаны с подложкой через линкерный элемент, образующийся в результате используемой химической реакции, или через более длинный элемент, известный как экстендер (extender), щупальце или гибкая рука; смотри, например US 6428707, включенный тем самым в данное описании посредством ссылки. Кратко, экстендер может быть в форме полимера, например гомо- или сополимера. Гидрофильные полимерные экстендеры могут иметь синтетическое происхождение, то есть быть с синтетическим каркасом, или биологическое происхождение, то есть быть биополимером с существующим в природе каркасом. Типичные синтетические полимеры выбраны из группы, состоящей из поливиниловых спиртов; полиакрил- и полиметакриламидов; и поливиниловых простых эфиров. Типичные биополимеры выбраны из группы, состоящей из полисахаридов, таких как крахмал; целлюлоза; декстран; и агароза.

Подложка может быть изготовлена из органического или неорганического материала. В одном воплощении подложка изготовлена из природного полимера, такого как перекрестно-сшитый углеводородный материал, например агароза, агар, целлюлоза, декстран, хитозан, konjac (конджак), каррагенан, геллан, альгинат и так далее. Природные полимерные подложки легко изготавливают и возможно осуществляют перекрестное сшивание в соответствии со стандартными способами, такими как обращенное суспензионное желатинирование (S. Hjertén: Biochim. Biophys. Acta 79(2), 393-398 (1964)). В особо предпочтительном воплощении подложка представляет собой вид относительно жесткой, но пористой агарозы, которая изготовлена способом, повышающим ее реологические свойства, смотри, например US 6602990 (Berg) или SE 0402322-2 (Berg и др.). В альтернативном воплощении подложка изготовлена из синтетического полимера или сополимера, такого как перекрестно-сшитые синтетические полимеры, например стирол или производные стирола, дивинилбензол, акриламиды, акрилатные сложные эфиры, метакрилатные сложные эфиры, виниловые сложные эфиры, виниламиды и так далее. Такие синтетические полимеры легко изготавливают и возможно осуществляют перекрестное сшивание в соответствии со стандартными способами, смотри, например "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R. Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)). Природные или синтетические полимерные подложки также доступны из коммерческих источников, таких как GE Healthcare (Uppsala, Sweden), например, в форме пористых частиц. В еще одном альтернативном воплощении подложка изготовлена из неорганического полимера, такого как диоксид кремния. Неорганические пористые и непористые подложки хорошо известны в этой области и их легко изготавливают в соответствии со стандартными способами.

Подходящие размеры частиц разделительной матрицы по настоящему изобретению могут находиться в диапазоне для диаметра 5-500 мкм, таком как 10-100 мкм, например 20-80 мкм. В случае по существу сферических частиц средний размер частиц может находиться в диапазоне 5-1000 мкм, например 10-500. В конкретном воплощении средний размер частиц находится в диапазоне 10-200 мкм. Специалист в этой области техники может легко выбрать подходящие размер и пористость частиц в зависимости от способа, который будет использован. Например, для крупномасштабного процесса по экономическим причинам может быть предпочтительна более пористая, но жесткая подложка, позволяющая обрабатывать большие объемы, особенно для стадии захвата. В хроматографии на выбор будут влиять такие параметры процесса, как размер и форма колонки. В способе с увеличенным по объему слоем матрица обычно содержит наполнители высокой плотности, предпочтительно наполнители из нержавеющей стали. Для других процессов на природу матрицы могут влиять другие критерии.

Антитела, отделяемые в соответствии с настоящим изобретением, могут происходить из любого обычно используемого источника, такого как клетки, культивируемые на поверхности, или из клеточной культуры, выращенной в ферментационных чанах или сосудах периодическим или непрерывным способом. Так, в одном воплощении жидкость представляет собой супернатант, приготовленный в результате ферментации клеток. Примерами адсорбируемых соединений являются белки, ДНК, вирусы, эндотоксины, питательные вещества, компоненты клеточной культуральной среды, такие как противовспениватели и антибиотики, и ассоциированные с продуктом примеси, такие как неправильно изогнутые разновидности молекул и агрегаты. Стадии приведения в контакт подвижной фазы и мультимодальной разделительной матрицы, то есть стадии адсорбции, может предшествовать стадия механического фильтрования, центрифугирования и/или хроматографии. Например, если жидкий образец представляет собой ферментационный бульон, то перед мультимодальной хроматографией предпочтительным является механическое удаление клеточного дебриса, целых клетков и других относительно больших компонентов.

В одном воплощении способа по настоящему изобретению протокол очистки включает стадию захвата. В конкретном воплощении жидкий образец представляет собой неочищенный исходный материал, который фильтруют перед приведением в контакт с мультимодальной хроматографической матрицей. Следовательно, это воплощение все еще будет включать стадию захвата, даже несмотря на то, что жидкий образец был предварительно очищен механическим способом. Как хорошо известно, клетки-хозяин, которые продуцируют антитела, также будут содержать ряд других белков, обычно известных как белки клетки-хозяина (НСР). Такие НСР включают такие ферменты, как протеазы и другие белки, продуцируемые клетками хозяина. В настоящем изобретении неожиданно было обнаружено, что белки клетки-хозяина могли адсорбироваться на мультимодальной разделительной матрице, в то время как антитела оставались свободными в подвижной фазе. Так, в одном воплощении по существу все белки клетки-хозяина жидкого образца адсорбировались на мультимодальной разделительной матрице.

В альтернативных воплощениях способ по настоящему изобретению применяют в качестве второй, третьей или даже четвертой стадии в протоколе очистки, например как промежуточную стадию очистки или стадию доочистки. Так, в одном воплощении подвижная фаза, наносимая на мультимодальную разделительную матрицу, содержит антителосодержащий элюат с разделительной матрицы. В одном воплощении жидкий образец представляет собой элюат с предшествующей аффинной хроматографической матрицы. В предпочтительном воплощении разделительная матрица, с которой получают элюат, содержит один или более Fc-связывающих белковых лигандов, таких как лиганды на основе белка А. В этом контексте термин "лиганды на основе белка А" включает в себя природный, а также рекомбинантный белок А или их функциональные фрагменты. В этом контексте термин "функциональный" фрагмент означает фрагмент, который сохраняет первоначальные свойства белка к связыванию. Такие аффинные матрицы имеются в продаже, например MabSelect от GE Healthcare. Следовательно, в этом воплощении адсорбируемыми соединениями могут быть одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из: высвобожденного белка А; комплексов, образованных между белком А и антителами, таких как комплексы белок А-MAb, которые могут содержать некоторое количество антител на молекулу белка А, например 2-4 молекулы антитела в комплексе с одной молекулой белка А; и агрегатов высвобожденного белка А или антител. Как будет очевидно специалисту в этой области техники, в зависимости от конкретных условий, использованных на предшествующей стадии, такой как аффинная хроматография, для элюата может потребоваться кондиционирование посредством подходящих добавлений или регулирования. Так, для приготовления подвижной фазы элюат объединяют с подходящим буфером или жидкостью. Следует отметить, что, если должен быть подвергнут очистке элюат с белок-А-содержащей колонки, то даже несмотря на то, что это может оказаться предпочтительным для практических целей, способ по настоящему изобретению не обязательно осуществляют сразу после аффинной хроматографии или даже на том же самом техническом оборудовании.

В конкретном воплощении способ по настоящему изобретению представляет собой многостадийный процесс, включающий стадию захвата на аффинной хроматографической матрице, такой как белок-А-содержащая хроматографическая матрица, и стадию доочистки на мультимодальной разделительной матрице, которая описана выше. Жидкий образец, наносимый на аффинную хроматографическую матрицу, может представлять собой клеточную культуральную жидкость или ферментационный бульон, который возможно был предварительно обработан, например фильтрованием и/или изменением условий путем подведения рН и/или изменения проводимости, для приготовления подвижной фазы. В этом процессе в результате проведения стадии захвата будут удалены один или более белков клетки-хозяина и остатков клетки-хозяина, таких как клеточный дебрис и белки, ДНК, эндотоксины и тому подобное. На последующей стадии доочистки в основном будут адсорбироваться соединения в форме остатков со стадии захвата, такие как агрегаты белок А-антитело.

Способ по настоящему изобретению является полезным для извлечения любого моноклонального или поликлонального антитела, такого как антитела, происходящие из млекопитающих-хозяев, например мышей, грызунов, приматов и людей, или антитела, происходящие из гибридом. В одном воплощении извлекаемые антитела представляют собой человеческие или гуманизированные антитела. В предпочтительном воплощении антитела представляют собой мономерные антитела. Антитела могут быть любого класса, то есть выбранными из группы, состоящей из IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В одном воплощении подвергаемые очистке антитела представляют собой антитела, способные к связыванию с белком А, или Fc-содержащие фрагменты антител или слитые белки. В конкретном воплощении извлекаемые антитела представляют собой иммуноглобулин G (IgG), такой как IgG1. В одном воплощении способ по настоящему изобретению применяют для очистки антител, имеющих pI в диапазоне 6-9, например в диапазоне 7-8. В конкретном воплощении pI очищенных антител равен приблизительно 9. В контексте настоящего изобретения следует понимать, что термин "антитела" также включает в себя фрагменты антител и любой слитый белок, который содержит антитело или фрагмент антитела. Таким образом, настоящее изобретение также включает очистку фрагментов любого из вышеупомянутых антител, а также слитых белков, содержащих такие антитела. В одном воплощении антитела представляют собой моноклональные антитела.

Как вытекает из сказанного выше, в способе по настоящему изобретению нежелательные соединения адсорбируют на мультимодальной разделительной матрице и получают по существу чистую фракцию неадсорбированных антител. В этом контексте термин "по существу чистый" понимается как означающий то, что по существу все не являющиеся антителами соединения удалены. Наиболее предпочтительно, чтобы по меньшей мере приблизительно 80%, например по меньшей мере приблизительно 95%, то есть в диапазоне 95-100%, например по меньшей мере приблизительно 98%, то есть в диапазоне 98-100%, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99%, то есть в диапазоне 99-100%, от суммарного количества примесей были удалены на мультимодальной разделительной матрице. Тем не менее, как понятно специалисту в этой области техники, возможные степени чистоты будут зависеть от концентрации антитела в жидком образце, наносимом на разделительную матрицу, а также и от других используемых условий. Таким образом, в одном воплощении антитела, отделяемые в соответствии со способом по настоящему изобретению, представляют собой антитела категории для терапевтического применения. Так, антитела, очищенные в соответствии с изобретением, являются полезными в научных исследованиях и также для приготовления лекарственных средств на основе антител, таких как mAb лекарственные средства. Альтернативным применением очищенных антител является диагностическое применение. Кроме того, очищенные антитела также являются полезными в продуктах питания, таких как пищевые добавки для людей. Например, бычьи антитела, очищенные в соответствии с настоящим изобретением, являются полезными в продуктах питания.

В конкретном воплощении способа по настоящему изобретению предложена мультимодальная разделительная матрица в виде одноразовой(ого) хроматографической(ого) колонки или фильтра. Преимуществом использования одноразовых продуктов в способе очистки терапевтических соединений, таких как антитела, является то, что посредством выбрасывания разделительной матрицы после использования исчезает риск взаимного загрязнения между двумя различными процессами. Для многих таких способов существует требование поддержания асептических условий. Так, в одном воплощении способа по настоящему изобретению мультимодальная разделительная матрица была простерилизована, и данная стерильная мультимодальная разделительная матрица предложена в виде стерильной(ого) заполненной(ого) хроматографической(ого) колонки или фильтра. В одном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют в виде периодического процесса, где одноразовую разделительную мультимодальную матрицу добавляют в сосуд, содержащий жидкость, из которой должны быть извлечены антитела. В предпочтительном воплощении одноразовая разделительная матрица далее состоит из высушенных частиц, таких как высушенные частицы агарозы, которые легко набухают при контакте с водной жидкостью. Выбирают продолжительность времени, подходящую для адсорбции соединений-мишеней на матрице, после чего жидкую фазу, содержащую антитела, удаляют из сосуда. Используемая матрица затем может быть удалена без высвобождения адсорбированных соединений, что опять может представлять собой преимущество с точки зрения безопасности, поскольку в дальнейшем не будет необходимости работать с такими соединениями, как эндотоксины; прионы и/или некоторые белки клетки-хозяина.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к набору для очистки антител от одного или более чем одного другого компонента в жидкости, содержащему в разных ячейках первую хроматографическую колонку, заполненную первой разделительной матрицей; вторую хроматографическую колонку, заполненную мультимодальной разделительной матрицей, которая содержит группы первого типа, способные взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами соединений-мишеней, и группы второго типа, способные по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд, с указанными соединениями-мишенями; один или более буферов; и письменные инструкции. В предпочтительном воплощении инструкции предназначены для обучения очистке антител из потока, проходящего через мультимодальную разделительную матрицу. Лиганды; подложка и другие составляющие мультимодальной разделительной матрицы могут быть такими, как они описаны выше. Инструкции предпочтительно описывают способ, как он определен выше. В одном воплощении набора первая разделительная матрица представляет собой матрицу для аффинной хроматографии и предпочтительно содержит белковые лиганды, такие как лиганды на основе белка А или G. В другом воплощении первая и/или вторая хроматографические колонки являются стерильными и/или одноразовыми колонками.

Наконец, настоящее изобретение также относится к одноразовой хроматографической колонке для очистки антител, которая содержит мультимодальную разделительную матрицу, содержащую группы первого типа, способные взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами мишеней, и группы второго типа, способные по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд. Лиганды, подложка и другие составляющие мультимодальной разделительной матрицы могут быть такими, как они описаны выше. В одном воплощении разделительная матрица способна адсорбировать белки, отличных от антител, из подвижной фазы, проводимость которой находится в диапазоне от 0 до 50, таком как от 0 до 25, например от 0 до 15 мСм/см. Альтернативным воплощением этого аспекта является одноразовый фильтр для очистки антител, содержащий группы первого типа, способные взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами мишеней, и группы второго типа, способные по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд, причем эти группы связаны с поверхностью фильтра. В конкретном воплощении фильтр по настоящему изобретению способен адсорбировать белки, отличные от антител, из подвижной фазы, проводимость которой находится в диапазоне от 0 до 50, таком как от 0 до 25, например от 0 до 15 мСм/см.

Подробное описание графических материалов

На Фиг.1 показаны а) мультимодальный лиганд прототипа 2-аминобензимидазол; b) мультимодальный лиганд прототипа тиомикамин; с) мультимодальный лиганд прототипа N-бензил-N-метил-этаноламин, иммобилизованный на подложке в форме гранулы, и d) мультимодальный лиганд прототипа N,N-диметилбензиламин. В экспериментальной части лиганды прототипа связывали с 6%-ной агарозной матрицей Sepharose 6 FF.

На Фиг.2 показана хроматограмма образца, содержащего 50 мг mAb1, нанесенного на мультимодальные разделительные матрицы, содержащие лиганды N-бензил-N-метил-этаноламин, иммобилизованный на Sepharose 6 FF (901035А); N,N-диметилбензиламин, иммобилизованный на Sepharose 6 FF (901035 В), и Q Sepharose FF в 25 мМ Bis-Tris, 100 мМ NaCl (приблизительно 12 мСм/см), рН 6,5. Элюирование осуществляли, используя 25 мМ Bis-Tris; 0,5 М NaCl, рН 6,5.

На Фиг.3а) и b) показаны хроматограммы образца, содержащего 20 мг mAb2, нанесенного на прототипы и матрицу сравнения, как описано ниже в Примере 3. Буферы представляли собой 25 мМ Bis-Tris, 100 мМ NaCl (приблизительно 12 мСм/см), рН 6,0, для уравновешивания и нанесения. Элюирующий буфер представлял собой 0,5 М Na-ацетат, рН 4,0. Фиг.3а) тиомикамин (1282004, зеленая), 65 мкмоль/мл, тиомикамин (1282002, синяя), 128 мкмоль/мл и Q Sepharose FF (черная); b) 2-аминобензимидазол (1282045, синяя), 65 мкмоль/мл, 2-аминобензимидазол (1282030, зеленая), 146 мкмоль/мл и Q Sepharose FF (черная).

На Фиг.4 а)-g) показаны результаты хроматографии, выполненной на прототипах, для смеси mAb1-рекомбинантный белок А (rPrA). А-буфер представлял собой 25 мМ Bis-Tris, 50 мМ NaCl, pH 6,0. Проводимость составляла приблизительно 7 мСм/см. В-буфер, 0,5 М Na-ацетат, pH 4,0, был использован для элюирования. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин (150 см/ч). Образец содержал 10 мг mAb1, 0,10 мг rPrA в концентрации 4 мг/мл mAb1 и 1% рекомбинантного белка А (масс./масс.). Фиг.4а) тиомикамин, 65 мкмоль/мл (1282004); b) тиомикамин, 128 мкмоль/мл (1282002); с) матрица сравнения Q Sepharose FF; d) 2-аминобензимидазол, 65 мкмоль/мл (1282045); е) 2-аминобензимидазол, 146 мкмоль/мл (1282032); f) N-бензил-N-метилэтаноламин, 146 мкмоль/мл (901035А), и g) N,N-диметилбензиламин, 175 мкмоль/мл (901035 В).

На Фиг.5 a)-h) показаны результаты аналитической эксклюзионной (гельпроникающей) хроматографии (SEC) образца, содержащего MAb1 и 1% рекомбинантного белка А, и собранных вместе фракций проходящего потока и собранных вместе фракций элюата из хроматографических разделений, показанных на Фиг.4. Синяя кривая соответствует фракциям проходящего потока (FT), а красная элюату. Более конкретно, на Фиг.5а) показан образец 4 мг/мл mAb1, 0,04 мг/мл rPrA, что дает 1% (масс./масс,); на 5b) показан FT и элюат с Фиг.4а) тиомикамин, 65 мкмоль/мл (1282004); на 5с) показан FT и элюат с Фиг.4b) тиомикамин, 128 мкмоль/мл (1282002); на 5d) показан FT и элюат с Фиг.4с) Q Sepharose FF; на 5е) показан FT и элюат с Фиг.4d) 2-аминобензимидазол, 65 мкмоль/мл (1282045); на 5f) показан FT и элюат с Фиг.4е) 2-аминобензимидазол, 146 мкмоль/мл (1282032); на 5g) показан FT и элюат с Фиг.4f) N-бензил-N-метилэтаноламин, 146 мкмоль/мл (901035А), и на 5h) показан FT и элюат с Фиг.4g) N,N-диметилбензиламин, 175 мкмоль/мл (901035 В).

На Фиг.6 показаны результаты приведенного ниже Примера 5. Более конкретно, показана хроматограмма образца, содержащего 50 мг MAb, нанесенного на Q Phenyl Sepharose 6 Fast Flow. Элюирование осуществляли, используя 25 мМ Tris, 0,5 M NaCl, pH 8,0. Из Фиг.6 видно, что молекулы моноклонального антитела не адсорбируются на Q Phenyl Sepharose Fast Flow, поскольку при градиентном элюировании на хроматограмме наблюдается только очень небольшой пик.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Настоящие примеры предложены только в иллюстративных целях и их никоим образом не следует интерпретировать как ограничивающие объем данного изобретения, который определен в прилагаемой формуле изобретения. Все ссылки, приведенные ниже и где-либо в другом месте настоящего описания, включены в данное описание изобретения посредством ссылки.

Последовательность действий

В условиях, не приводящих к связыванию, образец, содержащий приблизительно 50 мг mAb1, наносили на прототипы 901035 А (N-бензил-N-метилэтаноламин) и 901035 В (N,N-диметилбензиламин) при приблизительно 5 и 12 мСм/см. Собирали фракции проходящего потока (FT) при 5, 10 и 15 объемах колонки (CV). Фракции, соответствующие пику элюирования, объединяли. FT-фракции анализировали на содержание НСР и белка А.

Создавали прототипы с высокой и низкой плотностями лигандов для мультимодальных лигандов 2-аминобензимидазола и тиомикамина. Образец, содержащий 20 мг mAb1, наносили на колонки при pH 6,5 и приблизительно 5 и 12 мСм/см. Рабочие характеристики прототипов первоначально оценивали с использованием аналитической SEC. Отобранные фракции анализировали на содержание НСР и белка А. После скрининга фракций с использованием SEC отобранные фракции направляли для анализа НСР и белка А.

Для подтверждения того, что хроматографические рабочие характеристики не являются уникальными для одного конкретного mAb, хроматографические разделения повторяли, используя образец, содержащий mAb2, при pH 6,0 и приблизительно 12 мСм/см. Рабочие характеристики прототипов первоначально оценивали с использованием аналитической SEC. Отобранные фракции анализировали на содержание НСР и белка А. После скрининга фракций с использованием SEC отобранные фракции направляли для анализа НСР и белка Для более легкого определения какой из прототипов дает наилучшее отделение рекомбинантного белка А, mAb1 дополняли 1%-ным (масс./масс.) рекомбинантным белком А (rPrA). В каждый прототип вводили объем образца, соответствующий 10 мг MAb1, 1% рекомбинантного белка А, при рН 6,0 и проводимости приблизительно 7 мСм/см. Фракции проходящего потока и элюата собирали по отдельности и анализировали с использованием SEC.

Материалы/исследуемые образцы

Колонки и гели получали от GE Healthcare (Uppsala, Sweden)

HiPrep 26/10 для обессоливания	№ по кат.17-5087-01	CV=53,09 мл
(Desalting)
Tricorn 5/50	№ по кат.18-1163-09	CV=1 мл
HR 5/5	№ по кат.18-0338-01	CV=1 мл
Superdex 200 10/300 GL	№ по кат.17-5175-01	CV=23,56 мл

Приборы

Хроматографические системы:	ÄKTAExplorer 10
Спектрофотометр	Spectra MAX plus

Химические реактивы

Все использованные химические реактивы были аналитической чистоты. Использовали воду, отфильтрованную с применением MilliQ.

Хроматографические среды

Матрица сравнения представляла собой Q Sepharose Fast Flow (FF) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Прототипы мультимодальных разделительных матриц содержали лиганды, описанные ниже в Таблице 1.

Таблица 1
Мультимодальные анионообменные лиганды
Ссылка на прототип	Лиганд	Емкость по Cl-(мкмоль/мл)
901035А	N-бензил-N-метил-этаноламин	146
901035В	N,N-диметилбензиламин	175
1282002	тиомикамин	128
1282004	тиомикамин	65
1282032	2-аминобензимидазол (ABI)	146
1282045	2-аминобензимидазол (ABI)	65

Приготовление прототипа N-бензил-N-метилэтаноламин-Sepharose Fast Flow

А. Введение в матрицу аллильной группы

Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) активировали аллилглицидиловым простым эфиром следующим образом: 100 мл Sepharose 6 Fast Flow сушили отсасыванием, смешивали с 0,3 г (NaBH ₄, 12 г Na₂SO₄ и 35 мл 50%-ного водного раствора NaOH. Смесь перемешивали в течение 1 часа при 50°С. После добавления 100 мл аллилглицидилового простого эфира суспензию оставляли при 50°С с интенсивным перемешиванием на дополнительные 16 часов. После фильтрования смеси гель последовательно промывали 500 мл дистиллированной воды, 500 мл этанола, 200 мл дистиллированной воды, 200 мл 0,2 М уксусной кислоты и 500 мл дистиллированной воды.

После титрования получали степень замещения, равную 0,22 ммоль аллила на 1 мл геля.

В. Активация аллил-Sepharose 6 Fast Flow посредством бромирования

К перемешиваемой суспензии 50 мл аллилактивированной Sepharose 6 Fast Flow (0,22 ммоль аллильных групп на 1 мл высушенного геля), 1 г ацетата натрия и 15 мл дистиллированной воды добавляли бром до получения устойчивого желтого цвета. Затем добавляли формиат натрия до полного обесцвечивания суспензии. Реакционную смесь фильтровали, и гель промывали 500 мл дистиллированной воды. Затем активированный гель переносили непосредственно в реакционный сосуд и приводили в дальнейшее взаимодействие с N-бензил-N-метилэтаноламином.

С. Введение групп ВМЕА (N-бензил-N-метилэтаноламин) в активированную матрицу

Аминогруппы вводили в матрицу непосредственно через атом азота этих аминогрупп. Согласно типичной методике сочетание с матрицей осуществляли посредством бромирования аллильной группы и нуклеофильного замещения в щелочных условиях. 25 мл активированного бромом геля (0,22 ммоль аллильных групп на 1 мл высушенного геля) переносили в реакционный сосуд, содержащий раствор N-бензил-N-метилэтаноламина (16,0 мл). Добавляли 5 мл воды и с помощью раствора гидроксида натрия устанавливали рН реакционного раствора 12,0. Реакционную смесь оставляли на 16 часов с перемешиванием при 50°С. После фильтрования реакционной смеси гель последовательно промывали 3×10 мл дистиллированной воды, 3×10 мл водного 0,5 М HCl и, окончательно, 3×10 мл дистиллированной воды. Получали гель BMEA-Sepharose Fast Flow со степенью замещения 0,15 ммоль (амины/мл геля).

Прототипы с 2-аминобензимидазолом и тиомикамином с высокой и низкой плотностью лигандов получали в соответствии со стандартными методиками (смотри US 6702943 (Johansson et al), WO 01/38228 (Belew et al) и WO 02/053252 (Belew et al)).

Образцы

Использовали два различных гуманизированных IgG антитела, подкласс 1, обозначаемых MAb1 и MAb2, с коэффициентом экстинкции 1,46 и 1,50 соответственно. Оба антитела экспрессировали в культурах СНО (яичник китайского хомячка), а потом, перед проведением экспериментов по настоящему изобретению, очищали с использованием общепринятой аффинной хроматографии на белке А.

Смену буфера осуществляли на колонке для обессоливания HiPrep Desalting (GE Healthcare, Uppsala, Sweden), уравновешенной нужным буфером, посредством введения соответствующего объема (5-15 мл) с использованием Superloop (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Скорость потока составляла 5 мл/мин. Собирали фракции объемом 5 мл. Фракции, содержащие элюируемый пик, объединяли и в двух повторах определяли поглощение при 280 нм для того, чтобы рассчитать концентрацию в соответствии с уравнением 1:

A₂₈₀= ·C·I (Уравнение 1),

где А ₂₈₀ представляет собой поглощение при 280 нм;

(мл·мг^-1·см^-1) представляет собой коэффициент экстинкции для конкретного белка;

С (мг/мл) представляет собой концентрацию белка;

I (см) представляет собой длину пути.

Эксклюзионную (гельпроникающую) хроматографию (SEC) проводили на колонке Superdex 200 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) при скорости потока 0,5 мл/мин. В качестве буфера использовали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор): 10 мМ фосфат, 0,137М NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 7,4, приготовленный из таблеток (Sigma, P-4417).

Способ

Уравновешивание	2/0,1 CV;	2 CV первоначальное использование;	0,1 CV между разделениями
Введение образца	50 мкл
Изократическое элюирование	1,5 CV

Хроматография mAb на прототипах

А-буфер представлял собой 25 мМ Bis-Tris, рН 6,0 или 6,5. В зависимости от желаемой проводимости, приблизительно 5 или 12 мСм/см, в буфер включали 35 или 100 мМ NaCl. Для прототипов 901035А и 901035 В элюирующий буфер (В-буфер) представлял собой 25 мМ Bis-Tris, 0,5 М NaCl, рН 6,5. Для прототипов с тиомикамином и ABI в качестве лигандов элюирующий буфер (В-буфер) представлял собой 0,5 М Na-ацетат, рН 4,0. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин (150 см/ч).

Способ:	Уравновешивание	5CV	А-буфер
	Введение образца	5-25 мл	образец, содержащий 20 или 50 мг mAb
	Промывка	5CV	А-буфер
	Градиентное	10 CV	0-100%-ный В-буфер
	элюирование
	Элюирование	10 CV	100%-ный В-буфер
	Регенерация	5CV	А-буфер

Хроматография смеси MAb-рекомбинантный белок А на прототипах

А-буфер представлял собой 25 мМ Bis-Tris, pH 6,0. В результате добавления 50 мМ NaCl проводимость составляла приблизительно 7 мСм/см. В-буфер представлял собой 0,5 М Na-ацетат, pH 4,0. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин (150 см/ч). Концентрация образца составляла: 4 мг/мл для MAb1 и 0,04 мг/мл для rPrA, что соответствует 1% (масс./масс.).

Способ:	Уравновешивание	5CV	А-буфер
	Введение образца	2,5 мл	10 мг MAb, 1% rPrA
	Промывка	5CV	А-буфер
	Градиентное элюирование	10 CV	0-100%-ный В-буфер
	Элюирование	10 CV	100%-ный В-буфер
	Регенерация	5CV	А-буфер

Очистка на месте (CIP; cleaning in place)

После каждого хроматографического разделения прототипы и матрицу сравнения Q Sepharose FF подвергали следующей процедуре CIP:

30%-ный изопропанол	5 CV (объемов колонки)
H2 O	5CV
1,0 M NaOH	4 CV (включая 15-минутную паузу)
H2O	5CV
А-буфер	5CV
H 2O	5CV
20%-ный EtOH	5CV

Анализ белка А

Отобранные фракции смешивали с разбавителем образца SPA в пропорциях 800 мкл разбавителя образца SPA+200 мкл образца. После перемешивания фракции нагревали в нагревательном блоке при 99°С в течение 10 минут, затем опять перемешивали. Далее образцы анализировали на рекомбинантный белок А.

Анализ белков клетки-хозяина (НСР)

Образцы (минимально 600 мкл) анализировали на содержание НСР. Низший предел обнаружения составляет 10 нг/мл.

Пример 1

MAb1-содержащий образец, очищенный на прототипах с лигандами N-бензил-N-метилэтаноламином (901035A) и N,N-диметилбензиламином (901035 В)

В Примере 1 образец, содержащий 50 мг МАb1, наносили на N-бензил-N-метилэтаноламин, иммобилизованный на Sepharose 6 FF (901035A), N,N-диметилбензиламин, иммобилизованный на Sepharose 6 FF (901035B), и на матрицу сравнения Q Sepharose FF в 25 мМ Bis-Tris, 100 мМ NaCl (приблизительно 12 мСм/см), рН 6,5. Элюирование осуществляли с использованием 25 мМ Bis-Tris, 0,5 М NaCl, рН 6,5.

Хроматограммы Примера 1 показаны на Фиг.2, где изображены два прототипа N-бензил-N-метилэтаноламин-Sepharose 6 FF (901035A) и N,N-диметилбензиламин-Sepharose 6 FF (901035B) в сравнении с Q Sepharose FF. Фракции проходящего потока (FT), выбранные для анализа, указаны стрелками. Результаты по степени очистки от НСР и белка А, приведенные ниже в Таблицах 2 и 3, показывают, что прототипы превосходят Q Sepharose FF в этом отношении.

Таблица 2
Результаты анализа НСР
Колонка	рН	Старт	FT1	FT2	FT3
		(нг/мл)	(нг/мл)	(нг/мл)	(нг/мл)
Q Sepharose FF (сравнение)	6,5	890	160	200	180
N-бензил-N-метилэтаноламин,	6,5	890	10	20	35
146 мкмоль/мл (901035A)
N,N-диметилбензиламин,	6,5	890	27	39	45
175 мкмоль/мл (901035B)

Таблица 3
Результаты анализа белка А
Колонка	рН	Старт	FT1	FT2	FT3
		(нг/мл)	(нг/мл)	(нг/мл)	(нг/мл)
Q Sepharose FF (сравнение)	6,5	0,40	0,69	0,46	0,31
N-бензил-N-метилэтаноламин,	6,5	0,40	0	0	0
146 мкмоль/мл (901035A)
N,N-диметилбензиламин, 175 мкмоль/мл (901035 В)	6,5	0,40	0,11	0,10	0,08

Пример 2

MAb1-содержащий образец, очищенный на прототипах с лигандами тиомикамином и 2-аминобензимидазолом

В этом Примере образец, содержащий 20 мг MAb1, наносили на прототипы и разделительную матрицу сравнения. Буферы для уравновешивания и нанесения представляли собой 25 мМ Bis-Tris, 35 мМ NaCl (приблизительно 5 мСм/см), рН 6,5. Элюирующий буфер представлял собой 0,5 М Na-ацетат, рН 4,0. а) Тиомикамин, 65 мкмоль/мл (1282004), b) тиомикамин, 128 мкмоль/мл (1282002), с) Q Sepharose FF, d) 2-аминобензимидазол (ABI), 65 мкмоль/мл (1282045) и е) 2-аминобензимидазол (ABI), 146 мкмоль/мл (1282032). Результаты анализов НСР и белка А показаны ниже в Таблицах 4 и 5.

Таблица 4
Результаты анализа НСР
Колонка	РН	Старт	FT1	FT2
		(нг/мл)	(нг/мл)	(нг/мл)
Тиомикамин, 65 мкмоль/мл (1282004)	6,5	351	10	10
Q Sepharose FF	6,5	351	11	11
2-амино-бензимидазол (ABI), 65 мкмоль/мл	6,5	351	10	10
(1282045)

Таблица 5
Результаты анализа белка А
Колонка	рН	Старт	FT1	FT2
		(нг/мл)	(нг/мл)	(нг/мл)
Тиомикамин, 65 мкмоль/мл (1282004)	6,5	0,39	0,00	0,00
Q Sepharose FF	6,5	0,39	0,09	0,21
2-аминобензимидазол (ABI), 65 мкмоль/мл	6,5	0,39	0,00	0,00
(1282045)

Пример 3

MAb2-содержащий образец, очищенный на прототипах с лигандами тиомикамином и 2-аминобензимидазолом

Образец, содержащий 20 мг MAb2, наносили на прототипы и матрицу сравнения. Буфер представлял собой 25 мМ Bis-Tris, 100 мМ NaCl (приблизительно 12 мСм/см), рН 6,0. Элюирование осуществляли с использованием 0,5 М Na-ацетата, рН 4,0. Полученные хроматограммы показаны на Фиг.3.

3а) Тиомикамин (1282004, зеленая), 65 мкмоль/мл, Тиомикамин (1282002, синяя), 128 мкмоль/мл и Q Sepharose FF (черная); b) 2-аминобензимидазол (1282045, синяя), 65 мкмоль/мл, 2-аминобензимидазол (1282030, зеленая), 146 мкмоль/мл, и Q Sepharose FF (черная). Для анализа НСР и белка А в отобранных фракциях использовали аналитическую SEC, как показано ниже в Таблицах 6 и 7.

Таблица 6
Результаты анализа НСР
Колонка	РН	Старт (нг/мл)	FT1 (нг/мл)	FT2 (нг/мл)
Тиомикамин, 65 мкмоль/мл (1282004)	6,0	170	10	10
Q Sepharose FF	6,0	170	66	55

Таблица 7
Результаты анализа белка А
Колонка	рН	Старт (нг/мл)	FT1 (нг/мл)	FT2 (нг/мл)
Тиомикамин, 65 мкмоль/мл (1282004)	6,0	5,42	0,00	0,24
Q Sepharose FF	6,0	5,42	3,90	4,93

Пример 4

Очистка MAb1 из образца, содержащего MAb1 и рекомбинантный белок А (rPrA), на прототипах с лигандами N-бензил-N-метилэтаноламином. N,N-диметилбензиламином, тиомикамином и 2-аминобензимидазолом

В этом Примере проводили хроматографию образца, содержащего mAb1-рекомбинантный белок А, на прототипах. А-буфер представлял собой 25 мМ Bis-Tris, 50 мМ NaCl, pH 6,0. Проводимость составляла приблизительно 7 мСм/см. В-буфер представлял собой 0,5 М Na-ацетат, pH 4,0. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин (150 см/ч). Образец содержал 10 мг mAb1, 0,10 мг rPrA в концентрации 4 мг/мл mAb1 и 1% рекомбинантного белка А (масс./масс.). Результаты показаны на Фиг.4.

В конце проводили аналитическую SEC образца, содержащего mAb1 и 1% рекомбинантного белка А, и собранных вместе фракций проходящего потока и собранных вместе фракций элюата из хроматографических разделений, соответствующих Фиг.4. Результаты показаны на Фиг.5. На Фиг.5а заштрихованный пик представляет собой комплекс MAb1-белок А. Синяя кривая соответствует фракциям проходящего потока (FT), а красная элюату.

Пример 5: Очистка антител на Q Phenyl Sepharose 6 Fast Flow

Последовательность действий

В условиях, не приводящих к связыванию, образец, содержащий приблизительно 50 мг mAb, наносили на прототип Q Phenyl Sepharose 6 Fast Flow. Фракции проходящего потока (FT) собирали при 5, 10 и 15 объемах колонки (CV). Анализировали фракции с пика элюирования.

Q Phenyl Sepharose 6 Fast Flow была приготовлена посредством присоединения Q-групп (-N(СН₃)₃) к Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (45 мкмоль фенильных групп на мл геля) в соответствии со стандартной методикой (смотри ниже). Ионообменная емкость Q Phenyl Sepharose 6 Fast Flow составляла 108 мкмоль на мл геля. При pH 7,0 или 8,0 образец, содержащий 50 мг mAb (очищенный на MabSelect), наносили на колонку и рабочие характеристики Q Phenyl Sepharose 6 Fast Flow оценивали, анализируя отобранные фракции проходящего потока на содержание белков клетки-хозяина (НСР) и белка А.

Материалы/исследуемые образцы

Колонки и Phenyl Sepharose 6 Fast Flow получали от GE Healthcare (Uppsala, Sweden)

HR 5/5

№ по кат.18-0338-01

CV=1 мл

Приборы

Хроматографические системы: ÄKTAExplorer 10

Спектрофотометр: Spectra MAX plus

Химические реактивы

Все использованные химические реактивы были аналитической чистоты. Использовали воду, фильтрованную с применение MilliQ.

Получение Q Phenyl Sepharose 6 Fast Flow

В одном из способов для получения разделительной матрицы по изобретению, который показан в виде примера ниже, в качестве исходного материала использовали поперечно-сшитый агарозный гель (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub (высокая степень замещения)), GE Healthcare, Uppsala, Sweden).

Введение группы Q в Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)

Группы Q (-N(СН ₃)₃) вводили в Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub) путем взаимодействия с хлоридом глицидил-триметиламмония (G-MAC) следующим образом: 15 г высушенной отсасыванием Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub) смешивали с 5 мл воды, 5 мл 50%-ного водного раствора NaOH, 0,02 г NaBH₄ и 40 мл G-MAC. Смесь перемешивали в течение 16 часов при 30°С. После фильтрования смеси гель последовательно промывали 100 мл дистиллированной воды. 100 мл этанола и 100 мл дистиллированной воды.

После титрования получали степень замещения, равную 0,11 ммоль амины/мл геля.

Образцы

Используемые моноклональные антитела экспрессировали в культурах СНО, а потом, перед проведением экспериментов по настоящему изобретению, очищали с использованием общепринятой аффинной хроматографии на белке А.

Определение концентрации mAb

Образец mAb разбавляли в десять раз буфером. Раствор образца в двух повторах измеряли при А280. Для расчета концентрации в соответствии с законом Ламберта-Бэра использовали среднюю величину:

С=А/(I× ),

где С представляет собой концентрацию IgG;

А представляет собой поглощение при 280 нм;

I представляет собой длину пути;

представляет собой коэффициент молярной экстинкции для mAb, мг^-1 мл=1,46.

Хроматография на Q Phenyl Sepharose 6 Fast Flow

Отделение mAb от белков клетки-хозяина и белка А тестировали в условиях, не приводящих к связыванию. Наносимый на колонки образец представлял собой mAb, очищенные на MabSelect. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин (150 см/ч). Поглощение при 280 нм детектировали на протяжении всех разделений. Тестировали два различных буфера (смотри ниже). Перед каждым разделением производили замену буфера на А-буфер. В зависимости от объема образца использовали колонки HiPrep desalting и HiTrap desalting.

Буферы: А-буфер: 25 мМ Tris/HCl, pH 8,0

В-буфер: 25 мМ Tris/HCl, 0,5 М NaCl, pH 8,0

А-буфер: 25 мМ фосфатный буфер, pH 7,0

В-буфер: 25 мМ фосфатный буфер, 0,5 М NaCl, pH 7,0.

Способ: в качестве исходного материала использовали элюат с MabSelect с установленным значением pH.

Уравновешивание		5CV	А-буфер
Введение образца	16 CV	(50 мг mAb)
Промывка		5CV	А-буфер
Градиент	5CV	100%-ный В-буфер
Очистка после градиента	5CV	А-буфер

Во время введения образца, промывки и элюирования собирали фракции по 1 мл.

После каждого разделения проводили CIP (очистку на месте) с использованием 1 М NaOH. Время обработки составляло приблизительно 25 минут.

Анализ белка А

Отобранные фракции смешивали с разбавителем образца SPA в пропорциях 800 мкл разбавителя образца SPA+200 мкл образца. После перемешивания фракции нагревали в нагревательном блоке при 99°С в течение 10 минут, затем опять перемешивали. Далее образцы анализировали на рекомбинантный белок А.

Анализ белков клетки-хозяина (НСР)

Образцы (минимально 600 мкл) анализировали на содержание НСР. Низший предел обнаружения составляет 10 нг/мл.

Результаты

В условиях, не приводящих к связыванию, приблизительно 50 мг mAb наносили на колонку HR 5/5, заполненную Q Phenyl Sepharose Fast Flow, при двух различных значениях рН (рН 7,0 и 8,0). Собирали фракции проходящего потока при 5, 10 и 15 объемах колонки (CV) согласно Фиг.1. В Таблицах 8 и 9 представлены результаты анализа белка А и НСР во фракциях проходящего потока. Никакого остаточного белка А не смогли зафиксировать в данных фракциях. Кроме того, не было зафиксировано никаких белков клетки-хозяина в FT1 и FT2, когда использовали образец с рН 8,0. Небольшие количества белков клетки-хозяина наблюдали, когда использовали образец с рН 7,0, но содержание НСР уменьшалось приблизительно в 50 раз по сравнению с содержанием НСР в образце. Фиг.6 также показывает, что молекулы моноклональных антител не адсорбируются на Q Phenyl Sepharose Fast Flow, поскольку при градиентном элюировании на хроматограмме наблюдается только очень небольшой пик (Фиг.6).

Таблица 8
Результаты анализа белка А
Колонка	рН	Старт (нг/мл)	FT1 (нг/мл)	FT3 (нг/мл)	Элюат (нг/мл)
Q Phenyl Sepharose FF	8,0	6,98	0,00	0,00	48,25
Q Phenyl Sepharose FF	7,0	5,03	0,00	0,00	36,15

Объем образца составлял 16 мл, а фракции FT1-FT3 составляли по 1 мл. Собранные объемы элюирования составляли 2 мл.

Таблица 9
Результаты анализа белков клетки-хозяина
Колонка	PH	Старт (нг/мл)	FT1 (нг/мл)	FT2(нг/мл)	FT3 (нг/мл)	Элюат (нг/мл)
Q Phenyl Sepharose FF	8,0	1100	<10	<10	12	4900
Q Phenyl Sepharose FF	7,0	1200	16	23	26	5100

Объем образца составлял 16 мл, а фракции FT1-FT3 составляли по 1 мл. Собранные объемы элюирования составляли 2 мл.