биопрепарат в виде водной суспензии для повышения почвенного плодородия

Формула изобретения

Биопрепарат для повышения почвенного плодородия, содержащий азотфиксирующие бактерии Azotobacter, консервант микроэлементы: цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор и воду, отличающийся тем, что в качестве азотфиксирующих бактерий используется штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 с содержанием живых бактерий не менее 1·10⁹ кл/мл в культуральной жидкости, а в качестве консерванта использована поваренная соль при следующем соотношении компонентов, мас.%:

штамм бактерий в культуральной жидкости	50-60
микроэлементы	0,2-0,3
поваренная соль	1,0-1,5
вода	остальное до 100%

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и, в частности, к производству бактериальных препаратов на основе азотфиксирующих бактерий, используемых в агротехнике для повышения плодородия почвы и урожайности.

Известно использование в сельском хозяйстве различных, в первую очередь минеральных, удобрений, которые вводят в почву в виде растворов, порошка или гранул. Недостатком известных удобрений следует признать их медленно оказываемое действие на растения, поскольку процесс освобождения питательных веществ из удобрений длителен и происходит в основном за счет сообщества микроорганизмов, присущего почве, в которую внесли указанное удобрение. Поэтому вносят вместе с удобрениями различные биодобавки, ускоряющие процесс высвобождения питательных веществ из различных удобрений, а также процесс усвоения высвобожденных веществ растениями. Кроме того, указанные биодобавки способствуют дополнительному накоплению питательных веществ в почве в легкоусвояемой растениями форме.

Известно, что основным источником азота для почвы является молекулярный азот атмосферы. Процесс его усвоения, перевод в доступную для растений форму осуществляется с помощью микроорганизмов азотфиксаторов. Почвенные микроорганизмы-азотфиксаторы при успешном развитии способны накапливать в почве значительные количества до 100 кг/га минерального азота, усвояемого растениями. При внесении в почву азотфиксирующих микроорганизмов значительно сокращается применение минеральных азотных удобрений. Микроорганизмы-азотфиксаторы, переводя молекулярный азот атмосферы в доступную для растений форму, улучшают азотное питание сельскохозяйственных растений.

В настоящее время применение бактериальных препаратов для повышения плодородия почвы является перспективным приемом агротехнологии, альтернативой возрастающему использованию минеральных удобрений. Это особенно актуально в условиях необходимости экологической безопасности.

Известно применение бактериальных удобрений на основе различных штаммов микроорганизмов или их метаболитов (авт. св. СССР № 1473345, пат. РФ. № 1806123, пат. РФ № 2041867).

Для повышения эффективности удобрения в них дополнительно вводят водные суспензии бактериальных культур (авт. свид. СССР № 589238), суспензии дрожжей и одноклеточных водорослей (авт. свид. СССР № 935501), предварительно ферментированный птичий помет и торф, консорциум бактерий Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Dactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus acidophilus (RU, патент 2055823, С05F 11/08, 1996).

Известно использование различных микроорганизмов: азотфиксирующие (Azotobacter chroococcum), фосфаторастворяющие (Bacillus mucilaginosus), молочнокислые в виде консорциума, содержащего Streptococcus thermophilus. Streptococcus bovis, Lactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus salivaries var salivarus, Lactobacillus acidophilus. Дополнительно могут быть внесены Trichoderma viride, Beauveria bassiana (патент РФ № 2081866).

Общими недостатками использования микроорганизмов являются сложность производства, а также наличие проблем при хранении и транспортировании и связанная с этим низкая стабильность препарата.

Известно большое количество микроорганизмов-азотфиксаторов, используемых для получения на их основе бактериальных препаратов: симбиотические и ассоциативные азотфиксаторы, свободноживущие азотфиксаторы. Давно известны и применяются препараты на основе свободноживущих азотфиксирующих бактерий рода Azotobacter: препарат «Азотобактерин» (сб. «Бактериальные удобрения», ред. Березовая Е.Ф., Доросинский Л.М., 1961 г., Ленинград). В основном для данных препаратов использовали бактерии Azotobacter chrorococum. Известны штаммы Azotobacter chrorococum для бактериального препарата (авт.св. СССР № 1316189). Данный штамм является несимбиотическим азотфиксатором для ячменя. Препарат на основе этого штамма имеет незначительный срок годности и слабую эффективность в полевых условиях, длительное время культивирования - около 130 часов. Также следует признать низкую продуктивность культуры при выращивании в предлагаемых условиях, использование дорогостоящего и дефицитного стимулятора роста - арахидоновой кислоты, а также низкую жизнеспособность культуры на кислых почвах (рН меньше 5,0) и в условиях низкой влажности (меньше 20%).

Использование Azotobacter позволяет повысить урожай в основном лишь овощных культур и кормовых трав (Мишустин Е.Н. и др. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М., 1973. Barber J.E. et al. Plant fnd Sil. 1979. 52. № 1).

Штамм Azotobacter mysorens-7 № 164 применяется для изготовления бактериального удобрения, повышающего урожайность злаковых кормовых трав (авт. свид. СССР № 1083531).

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому относится биопрепарат, который содержит ассоциацию азотфиксирующих бактерий Azotobacter chrorococum и Beijerinckia fluminensis, консервант, а также микро- и макроэлементы, например ионы магния, железа, марганца, цинка, молибдена, бора и кобальта (пат. РФ № 2148571).

Общим недостатком известных биопрепаратов является низкая жизнеспособность культуры на кислых почвах, низкая продуктивность культуры.

Техническая задача, решаемая посредством настоящего изобретения, состоит в разработке биопрепарата на основе штамма бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 для повышения почвенного плодородия, способствующего повышению урожайности культурных растений, увеличению срока хранения препарата и более простой и дешевой технологии получения препарата.

Поставленная цель достигается путем использования биопрепарата для повышения почвенного плодородия, содержащего азотфиксирующие бактерии, консервант и микроэлементы медь, цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор, при этом в качестве азотфиксирующих бактерий используется штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 с содержанием живых бактерий не менее 1×10⁹ кл/мл в культуральной жидкости, а в качестве консерванта используют поваренную соль, при следующем соотношении компонентов, мас.%

штамм бактерий в культуральной жидкости	50-60
микроэлементы	0,2 - 0,3
поваренная соль	1,0-1,5
вода	остальное до 100

Штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 является продуцентом экзополисахарида (патент РФ 2073712). Препарат получают простой и дешевой технологией получения препарата, а именно используют один штамм, что упрощает технологию и позволяет повысить технологическую стерильность.

Штамм Azotobacter vinelanlii (Lipman) выделен из почвы методом почвенных пластинок из нейтральной пахотной почвы АБС МГУ "Чашково". Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИгенетики", наименование штамма ФЧ-1, присвоенный номер при депонировании ВКПМ В-5933. Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах: МПА, агаризованном сусле, средах Эшби, Виноградского, Федорова. Культивирование на указанных средах осуществляется при 28-30°С в течение 2-2,5 суток при рН 6,8-7,2.

Для улучшения роста культуры и синтеза втор-метаболитов в состав сред вносится азот в виде аммонийных солей и органический азот в виде белково-витаминного концентрата (БВК). На вязкость раствора постферментационной жидкости рН в интервале 2-11 не влияет, система биологически стабильна.

Пример 1. Бактерия Azotobacter vinelandii (Lipman) ВКПМ В-5933 при росте на богатой органической среде (жидком сусле) в условиях аэрации при 20-30°С в течение 48 ч продуцирует экзополисахарид, превращая постферментационную жидкость в гель. Культивирование штамма осуществляли на жидкой минеральной среде, содержащей в 100 г воды К₂НРO₄ - 1,0 г; MgSO₄·7Н₂O - 0,5 г; FeSO₄ ·7Н₂O - 0,0005 г; Na₂МоO₄ ·2H₂О - 0,005 г.

В качестве источника углеродного питания использовали глюкозу в концентрации 1,5%. При культивировании на жидкой минеральной среде заявляемый штамм требует дополнительный фактор роста - ферментализат БВК в количестве 0,2 г на 100 г воды. Выращивание осуществляли при 28-30°С в условиях аэрации и перемешивании в колбах объемом 750 см ³ со 100 мл среды указанного состава в течение 48 ч на качалках (n 220 об/мин). При этом происходит подкисление среды до рН 4,7 за счет выделения органических кислот и СО в культуральную жидкость. Было установлено оптимальное значение рН для роста культуры Azotobacter vinelandii (Lipman) 6,8-7,0 и для синтеза экзополисахаридов 6,8-7,2.

Пример 2. Периодическое культивирование штамма Azotobacter vinelandii (Lipman) осуществляют в аппаратах типа АНКум объемом 10 л, рабочий объем 4 л. Использовали среду из примера 1. В качестве источника углеродного питания применяли этанол в количество 1 об. В качестве инокулята использовали штамм, полученный по примеру 1, в колбе на качалке. Количество инокулята 10-20%. Условия проведения процесса: температура 28-30°С, рН 6,8-7,2, подача воздуха 0,5 л/л среды в 1 мин, скорость перемешивания 300 об/мин, время культивирования 18-20 ч. Содержание живых бактерий в культуральной жидкости 1,3×10⁹ кл/мл. Процесс идет стабильно, ассоциация устойчиво сохраняет свои свойства в пяти последовательных ферментациях.

Авторами были установлены новые свойства штамма бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933. Указанная культура обладает рядом ценных характеристик: возможность развития на кислых почвах (рН меньше 5,5), в условиях пониженной влажности (12-14%), на почвах, бедных органикой. Культура накапливает значительные количества витаминов (табл.1). При определенных условиях культура синтезирует значительное количество полисахаридов-альгинатов, которые играют важную роль в выживаемости и адаптационных процессах при внесении препарата в почву. Температурный режим +12+40°С.

При выращивании культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 на плотных средах культура образует так называемую полисахаридную капсулу, что способствует устойчивости биопрепарата при хранении и в почве.

При разработке состава препарата с использованием культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 было проверено влияние микроэлементов: кобальта, молибдена, бора, магния, марганца, цинка. Результаты испытаний отражены в табл.3. При использовании заявленного препарата с микроэлементами установлено экспериментально положительное влияние микроэлементов на азотфиксацию и выживаемость штамма Azotobacter vinelandii при хранении и внесении в почву.

Биопрепарат эффективен по азотфиксации, обладает способностью к синтезу биологически активных веществ в защищенном и открытом грунте в широком диапазоне рН и влажности, удобен в применении, проявляет свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям, улучшает показатели фитосанитарного состояния посевов.

Пример 3.

Биопрепарат готовили в аппарате с мешалкой. Для приготовления препарата использовали культуру Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933, выращенную в условиях примера 2.

Взяли 50 г культуральной жидкости, содержащей Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933. Дополнительно внесли в культуральную жидкость смесь микроэлементов: цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор в равных долях из расчета 0,22 г смеси микроэлементов, в качестве консерванта внесли соль поваренную (ГОСТ Р 51574 - 2000) 1 г. Добавили воду до 100 г, перемешали. Товарная форма препарата - водная суспензии.

Таким образом, предлагаемый препарат имеет следующий состав, из расчета на 100 г препарата:

культуральная жидкость Azotobacter vinelandii
ВКПМ В-5933	50 г
микроэлементы	0,22 г
поваренная соль	1 г
вода	48,78

Срок хранения препарата 12 месяцев.

Используемые составы биопрепарата в последующих опытах приведены в табл.1.

Экспериментально была установлена способность культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 синтезировать и выделять витамины, играющие важную роль в нормальном обмене веществ и жизнедеятельности растений (табл.2).

Полученный препарат использовали для обработки овощей защищенного грунта (помидоры, огурцы) и открытого грунта (картофель). Результаты применения приведены в табл.3.

Было определено влияние биопрепарата на урожайность ячменя и пшеницы при применении в фазе кущения. Опытно-производственные обработки полей ячменя и пшеницы проведены с помощью аэрозольного генератора регулируемой дисперсности. Результаты приведены в табл.4.

В условиях 2006 года на яровой пшенице биопрепарат проявил высокую эффективность, увеличивал урожайность культуры в пределах 13-18% и проявлял свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям. Показатели фитосанитарного состояния посевов были более благополучными на вариантах с используемым препаратом. Снижалось развитие корневых гнилей на 15-20% и бурая ржавчина развивалась менее интенсивно на 5-10% по сравнению с контролем.

Предложенный препарат, кроме накопления фиксированного азота, проявляет свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям, улучшает показатели фитосанитарного состояния посевов, снижает интенсивность развития корневых гнилей и бурой ржавчины, что позволяет сохранить урожай при существенном сокращении использования для данных целей различных ядохимикатов.

Таким образом, применение предложенного препарата позволяет сократить внесение азотных минеральных удобрений, повысить урожайность и получить более качественную, содержащую большое количество белка, углеводов, витаминов продукцию при существенном сокращении содержания в продукции нитратов, нитритов, вредных ядохимикатов.

Таблица 1
Культуральная жидкость Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933, мас.%	Микроэлементы, мас.%	Консервант, мас.%	Срокхранения, месяц	Прибавка урожая огурцов, кг/м2
50	0,2	1,0	12	4,4
60	0,3	1,5	12	4,7
55	0,25	1,2		4,5
Штамм по прототипу (пат.2148571) 50%	0,22	1	4,5	3,8

Таблица 2
Наименование витаминов	Содержание витаминов в мкг на 1 г сухого вещества в клетках Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933
Тиамин	90
Рибофлавин	356
Никотиновая кислота	395
Биотин	5,1

Таблица 3
Культура	Урожайность различных культур, кг/м2
Контроль (без добавления препарата)	С добавлением биопрепарата	С добавлением биодобавки по прототипу
Томаты	17,2	23,1	21,7
Огурцы	13,5	17,8	16,5
Картофель	11,4	17,3	17,3

Таблица 4
Культура	Площадь, га	Урожай, ц/га	Прибавка
опыт	контроль	опыт	контроль	ц/га	%
Ячмень «Ача»	120	34	28,8	22,6	6,2	27
Пшеница
Новосибирская 20	4,9	56,1	31,6	27,4	4.4	15
Пшеница Новосибирская 15	34,5	7,5	24,4	19,9	4,5	18