способ определения приема эритропоэтина при допинговом контроле спортсменов

Формула изобретения

Способ определения приема эритропоэтина при допинговом контроле спортсменов путем анализа пробы мочи и выявления экзогенного эритропоэтина, отличающийся тем, что предварительно устанавливают группу риска, при этом пробы мочи спортсменов подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией и определяют содержание косвенных биохимических маркеров - L-аргинина, асимметричного диметиларгинина, симметричного диметиларгинина и цитруллина, и при отклонении содержания определяемых продуктов в пробе в пределах 0,9-1,2 от усредненной нормы спортсмена исключают из группы риска, а при превышении содержания указанных продуктов, по меньшей мере в 1,5 раза от усредненной нормы спортсмена включают в группу риска, и пробу мочи его далее подвергают изоэлектрофиксированию, двойному блоттингу и хемолюминисцентному анализу на экзогенный эритропоэтин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области исследования или анализа материалов, в том числе ксенобиотиков, путем разделения образцов материалов на составные части с использованием хроматографии и масс-спектрометрии, а точнее к способам идентификации и определения эритропоэтина, и может быть использовано в допинговом контроле.

Известен способ определения приема эритропоэтина при допинговом контроле путем определения содержания селена в плазме крови, клетках крови и в волосах головы [1].

Недостатком указанного способа является высокая вероятность получения ложноположительных результатов, поскольку содержание селена в организме человека может варьироваться в широких пределах и соответственно привносить искажающие реальную картину данные.

Известен также способ определения приема эритропоэтина при допинговом контроле путем определения содержания селена и креатининов в пробе мочи [2].

Недостатком данного способа также является высокая вероятность получения ложноположительных результатов по вышеуказанной причине.

Наиболее близким к заявляемому объекту по своей технической сущности и достигаемому техническому результату является способ допинг-контроля приема эритропоэтина прямым определением содержания экзогенного эритропоэтина в пробе мочи. По указанному способу пробу подвергают анализу, включающему последовательно изоэлектрофиксирование (электрофоретическую разгонку по белкам и их фракциям), двойной блоттинг и хемолюминисцентный анализ [3].

Указанный способ является весьма длительным (трое суток) и сложным, что безусловно сказывается на производительности процесса при массовом обследовании спортсменов и стоимости такового обследования.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение достоверности допингового контроля употребления эритропоэтина за счет определения содержания косвенных биохимических маркеров - L-аргинина, асимметричного диметиларгинина (АДМА), симметричного диметиларгинина (СДМА) и цитруллина в биологической жидкости при одновременном сокращении продолжительности проведения анализа и его удешевлении.

Поставленный технический результат достигается тем, что предварительно устанавливают группу риска, при этом пробы мочи спортсменов подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией и определяют содержание косвенных биохимических маркеров - L-аргинина, его метилированных производных и цитруллина и при отклонении содержания определяемых продуктов в пробе в пределах 0,9-1,2 от усредненной нормы спортсмена исключают из группы риска, а при превышении содержания указанных продуктов по меньшей мере в 1,5 раза от усредненной нормы спортсмена включают в группу риска и пробу мочи его далее подвергают изоэлектрофиксированию, двойному блоттингу и хемолюминисцентному анализу на экзогенный эритропоэтин.

Биохимические маркеры представляют собой биохимическую характеристику, которая является индикатором нормальных биологических процессов, а также физиологических реакций на терапевтическое вмешательство.

Авторами найдено неожиданное решение.

Метилированные аналоги L-аргинина - асимметричный диметиларгинин (АДМА) и симметричные диметиларгинины (СДМА) являются ингибиторами NO-синтезы. У здоровых людей в день вырабатывается до 60 мг АДМА и примерно 10 мг из них выводится почками. Энзиматический механизм регулируется ДДАГ - диметиларгининдиметиламиногидролазой и именно этот энзим ответственен за уровень концентрации АДМА в плазме. Таким образом, уменьшение активности ДДАГ приводит к увеличению концентрации АДМА, что в свою очередь приводит к ингибированию синтеза оксида азота (NO). Известно также, что ингибирование ДДАГ вызывается высокими концентрациями эритропоэтина и поэтому изменения в продуцентной системе АДМА-ДДАГ-NO-синтазы (содержание АДМА, СДМА, L-аргинина и цитруллина) могут быть косвенными биохимическими маркерами, указывающими на возможный прием спортсменами запрещенного препарата ЭПО. Авторы, основываясь на своих знаниях и опыте, утверждают, что определение уровня вышеуказанных веществ в биологической жидкости дает возможность косвенного допинг-контроля незаконного употребления спортсменами ЭПО.

В качестве усредненной нормы содержания L-аргинина, асимметричного диметиларгинина (АДМА), симметричного диметиларгинина (СДМА) и цитруллина принимают обработанные статистические данные содержания указанных веществ в моче здоровых индивидуумов с учетом суточных колебаний содержания определяемых веществ.

В качестве стандартных определяемых веществ используют L-аргинин, асимметричный диметиларгинин (АДМА), симметричный диметиларгинин (СДМА) и цитруллин с содержанием основного компонента 99% (Sigma-Aldrich, ФРГ).

В качестве внутренних стандартов (ISTD) используют синефрин с содержанием основного компонента 99% (Sigma-Aldrich, ФРГ).

В качестве экзогенного эритропоэтина используют эритропоэтин ЕРОкрин® (r-HuEPO, 2000 ME, ЕРОэтин альфа) производства ГосНИИ особо чистых пр-тов (С-Петербург, Россия).

Стандартные растворы аналитов (1 мг/мл) готовят растворением точных навесок в точном объеме метанола. Рабочие растворы получают разбавлением. Хранят рабочие растворы при -20°С.

Элюент готовят с использованием метанола «для хроматографии» (Chromasolv®, Merck, Германия), ацетата аммония и муравьиной кислоты (Fluka, Швейцария).

Подвижную фазу готовят на основе воды деионизированной, полученной на установке Milli-Q plus (Millipore, Франция).

В качестве аппаратуры для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектроскопией (ВЭЖХ-МС/МС) используют хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum (фирма Thermo Finnigan, США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором (фирма Thermo Finnigan, США).

Для хроматографического разделения используют колонку Eclipse XDB-C8, 150×4.6 мм с размером частиц 5 мкм при размере пор 100 (фирма Agilent, США).

В качестве подвижной фазы используют 0.05% раствор муравьиной кислоты с 20 мМ раствором ацетата аммония (рН 3.0) (А) и метанол (В). Скорость потока подвижной фазы поддерживают постоянной.

Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов.

Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM).

Обработку данных проводят с применением программного обеспечения Xcalibur версии 1.3 (фирма Thermo Finnigan, США).

Для определения усредненного значения содержания L-аргинина, асимметричного диметиларгинина (АДМА), симметричного диметиларгинина (СДМА) и цитруллина были проанализированы образцы мочи от 150 здоровых индивидуумов в суточном режиме в спокойном состоянии, 35 спортсменов от разных видов спорта в спокойном режиме и при интенсивных тренировках в режиме состязаний, а также 18 добровольцев после приема экзогенного эритропоэтина и по найденным значениям установлено усредненное содержание L-аргинина, АДМА, СДМА и цитруллина. Значения усредненного содержания определяемых веществ представлены в Таблице 1.

Таблица 1
Определяемые вещества	Здоровые индивидуумы (мкг/мл)	Спортсмены при интенсивных тренировках	Индивидуумы после приема эритропоэтина
АДМА	10,0-30,0	20,0-39,0	40,0-120,0
СДМА	10,0-30,0	20,0-39,0	40,0-120,0
L-аргинин	2,5-7,0	3,8-9,6	12,5-35,0
Цитруллин	2,5-7,0	3,8-9,6	12,5-37,0

Уровень концентраций АДМА, СДМА, аргинина и цитруллина был повышен в 3,0-5,0 раза после внутривенного или внутримышечного введения ЭПО (разовая внутривенная инъекция экзогенного эритропоэтина в дозировке 2000 МЕ).

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Готовят растворы веществ-эталонов в органических растворителях и раствор внутреннего стандарта.

Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения) и полученные результаты вводят в программное обеспечение, например Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США.

Далее проводят пробоподготовку, при которой в образец исследуемой мочи вводят раствор внутреннего стандарта, содержащего синефрин, ацетонитрил и деионизированную воду. Осажденные белки центрифугируют и определенный объем центрифугата вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики определяемых веществ в пробе (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого определяемого вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения) и полученные результаты вводят в программное обеспечение, например Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США.

Следует отметить, что заявляемый способ определения приема эритропоэтинов позволяет сократить продолжительность допинг-контроля группы спортсменов и существенно сократить затраты на проведение допинг-контроля.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1

А. Получение масс-спектров, определение характеристических ионов, времени удержания и пределов детектирования L-аргинина, АДМА, СДМА и цитруллина.

Готовят стандартные растворы аналитов (1 мг/мл): в метаноле, далее получают рабочие растворы разбавлением стандартных растворов до содержания 1,0 мкг/мл. Приготовленные таким образом рабочие растворы вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС (хромато-масс-спектрометр с тройным квадрупольным анализатором TSQ Quantum фирмы Thermo Finnigan (США), соединенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом модели Surveyor, оснащенным автосамплером, насосом высокого давления и дегазатором фирмы Thermo Finnigan (США). Анализ ведут при скорости потока подвижной фазы 0.2 мл/мин. Определяемые вещества разделяют градиентным элюированием при условиях: 0 мин - 40% В; 8-9 мин - 90% В; 12-18 мин - 40% В, общее время анализа с учетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляет 18 мин. Ионизацию при атмосферном давлении осуществляют электрораспылением в режиме регистрации отрицательных и положительных ионов. Напряжение на капилляре 3.8 кВ; температура капилляра 245°С; скорость потока осушающего газа (азот) 0.45 л/мин; скорость потока газа (аргон) в камере соударения 0.075 л/мин; температура в камере ионизации 200°С; давление на распылителе 2 атм. Детектирование определяемых веществ проводят в режиме регистрации селективных реакций (SRM). Ширина пика для прекурсор-ионов и соответствующих характерных ионов на первом квадруполе (Q1) и третьем квадруполе (Q3) составляет 0.5 а.е.м. (на половине высоты), время задержки 5 мс. Обработку полученных данных (масс-спектры, характеристические ионы, время удержания и пределы детектирования исследуемых веществ) проводят с применением программного обеспечения Xcalibur версии 1.3 фирмы Thermo Finnigan, США (см. Таблицу 2)

Таблица 2
№	Определяемое соединение	Время удержана (мин)	Мол. масса	Прекурсор-ион	Характеристич. ионы	Нижн. предел обнаруж. нг/мл
1	АДМА	6,08	202	203 [М+Н]+	46,116	25
2	СДМА	6,08	202	203 [M+H] +	172,116	25
3	L-аргинин	6,00	174	175 [M+H] +	70,116	25
4	Цитруллин	6,51	175	176 [М+Н] +	70,113	25

Б. Подготовка пробы и анализ исследуемой мочи.

К образцу мочи (50 мкл) добавляют 10 мкл раствора внутренннего стандарта, содержащего синефрин (50 нг/мкл), 100 мкл ацетонитрила и 840 мкл деионизированной воды. Осажденные белки центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и 5 мкл центрифугата вводят в систему ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Анализ ведут как в части «А» и при тех же параметрах процесса.

Примеры 2-4

Анализ исследуемых образцов мочи ведут как в Примере 1, часть «Б», за исключением того, что исследуют образцы, полученные от разных индивидуумов. Результаты анализов приведены в Таблице 3

Таблица 3
№ №	АДМА	СДМА	L-аргинин	Цитруллин	Примечание
2	14,8	14,2	4,8	4,1	Вне группы риска
3	54,1	56,1	14,6	16,1	В группе риска
4	28,7	28,5	5,6	7,3	Вне группы риска

Из примера 3 видно, что содержание определяемых веществ в пробе для АДМА, СДМА, L-аргинина и цитруллина составляет 54,1; 56,1; 14,6; и 16,1 мкг/мл соответственно, что существенно превышает средневзвешенные значения 10,0-30,0 и 2,5-7,0. По указанным результатам спортсмен попадает в группу риска и пробу биологической жидкости по Примеру 3 далее подвергают изоэлектрофиксированию, двойному блоттингу и хемолюминисцентному анализу на эндогенный и экзогенный эритропоэтины.

Как видно из описания и примеров конкретного осуществления, заявляемый способ определения приема кортикотропинов позволяет существенно сократить продолжительность допинг-контроля группы спортсменов и существенно сократить затраты на его проведение.

Источники информации, принятые во внимание

1. RU № 02129271 С1, G01N 33/48, опубл. 1999 г.

2. RU № 02174234 С1, G01N 33/70, опубл. 2002 г.

3. Anal. Biochem. 2002. V.311. № 2. P.119-126 - прототип.