способ получения лекарственного средства для профилактики и лечения гриппа

Формула изобретения

1. Применение экстракта из воздушных частей растений рода Cistus для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения гриппа.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт получен из Cistus incanus (ладанник волосистый).

3. Применение по любому из пп.1 и 2, отличающееся тем, что экстракт представлен в жидкой, сухой или полутвердой форме.

4. Применение по любому из пп.1 и 2, отличающееся тем, что экстракт представляет собой водный экстракт или спиртовой экстракт.

5. Применение по любому из пп.1 и 2 для профилактики и/или лечения гриппа птиц.

6. Применение по любому из пп.1 и 2, отличающееся тем, что экстракт вводят перорально или местно.

7. Применение по любому из пп.1 и 2, отличающееся тем, что экстракт распыляют.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к применению экстракта для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения гриппа.

Грипп, также известный как инфлюэнца, - инфекционное вирусное заболевание, распространяющееся по всему миру в форме сезонных эпидемий. Различают три типа вируса - А, В и С. В и С поражают только человека, в то время как тип А распространен также среди млекопитающих и птиц.

Всемирная Организация Здравоохранения, ВОЗ, предупреждает о возможности глобальной пандемии гриппа в ближайшие годы. Эпидемии и пандемии в основном вызывают вирусы гриппа типа А. Существенные генетические изменения генетического материала вирусов гриппа уже вызвали три пандемии в 20-м веке, причем инфицирующие агенты во всех случаях принадлежали к типу А.

В настоящее время особая опасность возникновения пандемии связана с вирусом гриппа птиц, также являющимся вирусом типа А. В последние годы он встречается все чаще, особенно в Юго-Восточной Азии. Его распространению способствуют дикие птицы, которые служат устойчивыми к заболеванию переносчиками заболевания. Эксперты опасаются, что может произойти скрещивание вируса гриппа птиц с инфекционным агентом гриппа человека. В принципе, это возможно в случае, если свинья или человек инфицированы одновременно гриппом птиц и инфекционным агентом гриппа человека. Это может привести к появлению вируса, обладающего высокой инфекционной способностью и смертельного для человека, который может стать причиной глобальной пандемии. До сих пор передача гриппа птиц к человеку происходила только в отдельных местах. Однако случаев передачи гриппа птиц от человека к человеку не выявлено.

Вакцинация является наиболее важным средством профилактики вирусных болезней. Однако для вакцинации в целях профилактики необходимо изготовление вакцины против конкретного вируса. А для этого необходимо, чтобы вирус уже существовал. Данное обстоятельство, а также длительное время, необходимое для разработки вакцины (примерно 4 месяца), приводит к существенному ограничению ее применения при глобальной пандемии. В подобном случае применение вакцин может обеспечить только предварительное и сопутствующее применение противовирусных агентов (Руководство ВОЗ по использованию вакцин и Противовирусных препаратов во время пандемий гриппа; Всемирная Организация Здравоохранения 2004; WHO Guidelines on the Use of Vaccines and Antivirals during Influenza Pandemics; World Health Organization 2004).

Противовирусные агенты, эффективные при лечении гриппа, включают амантадин, римантадин, занамивир, осельтамивир и рибавирин. Все перечисленные лекарственные средства имеют побочные эффекты, которые в ряде случаев могут быть серьезными. Например, осельтамивир, который продается под названием Tamiflu®, часто демонстрирует побочные эффекты в виде тошноты, рвоты и боли в желудке. Его использование показано только с 13-летнего возраста, так как в некоторых случаях у детей младше этой возрастной границы наблюдали серьезные побочные эффекты, такие как инфекции уха, пневмонии, инфекции носовых полостей, бронхиты, набухание лимфатических узлов и конъюнктивиты (Красный Список, Каталог лекарственных средств для Германии, 2004; Red List, Catalogue of Medication for Germany, 2004).

Противовирусные лекарственные средства эффективны при профилактике вирусных заболеваний, а также при их лечении. Обычное медицинское лечение вирусных заболеваний до сих пор не было успешным.

Далее, известно, что экстракт бузины (самбук, elderberry) в определенных условиях снижает продолжительность гриппа, но, однако, не демонстрирует заметного профилактического действия (Zakay-Rones, Z.; Varsano, N.; Zlotnik, M.; Manor, O.; Regev, L; Schlesinger, M.; Mumcuoglu, M. J. Altem. Complement. Med. 1995, 1 (4), 361-9).

Также известно бактерицидное действие экстрактов из растений рода Cistus (ладанники). Вид Cistus incanus (ладанник волосистый) и его подвид tauricus (крымский), широко распространенные в Средиземноморском регионе, используются в традиционной медицине этого региона. Cistus incanus используют в животноводстве как природное лекарственное средство, а также для общего улучшения состояния здоровья животных (Pieroni, A.; Howard, P.; Volpato, G.; Santoro, R.F. Vet. Res. Commun. 2004, 28 (1), 55-80). В северных частях Греции крымский подвид (ssp.tauricus) ладанника волосистого (Cistus incanus) традиционно использовали для лечения болезней кожи (Petereit F., Kolodziej H., Nahrstedt A. Phytochemistry 1991, 30 (3), 981-985).

Виды Cistus содержат, помимо прочего, флавоноиды и проантоцианиды (Petereit F., Kolodziej H., Nahrstedt A. Phytochemistry 1991, 30 (3), 981-985), которые могут действовать в организме как антиоксиданты (Attaguile, G.; Russo, A.; Campisi, A.; Savoca, F.; Acquaviva, R.; Ragusa, N.; Vanella, A. Cell Biol Toxicol. 2000, 16 (2), 83-90). Экстракты листьев Cistus incanus обладают антибактериальной и противогрибковой активностью (Bouamama, H. et al. Therapie 1999, 54 (6), 731-3).

В качестве профилактической меры в случае надвигающейся пандемии, которая может быть вызвана гриппом птиц, страны мирового сообщества рассчитывают на противовирусные лекарственные средства. Например, некоторые страны в качестве резерва на случай пандемии заказали значительные количества упомянутого выше лекарственного средства осельтамивира (Tamiflu®; Hoffman La Roche). Однако существует опасность, что в чрезвычайных обстоятельствах запасы этого лекарственного средства будут быстро израсходованы. К тому же, такой огромный спрос привел к затруднениям при производстве.

Дополнительно, применению (известных) противовирусных агентов все в большей степени угрожает тот факт, что они используются в животноводстве в качестве лекарственных средств широкого спектра действия. Несмотря на международные запреты, такая практика стала, например, в Китае причиной устойчивости некоторых штаммов гриппа птиц к этим агентам. К тому же, эти агенты часто вызывают побочные эффекты, которые в некоторых случаях могут быть тяжелыми. Далее, в некоторых случаях эти лекарственные средства показаны к применению только для определенных возрастных групп, например осельтамивир (Tamiflu®), который можно применять только после 13-летнего возраста.

Целью настоящего изобретения, следовательно, является создание противовирусного лекарственного средства для профилактики и/или лечения гриппа, которое может быть получено экономичным путем и которое не вызывает каких-либо побочных эффектов при применении.

Эта цель была достигнута путем применения экстракта из растений рода Cistus (ладанники) для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения гриппа.

Экстракт выделяют из растений рода Cistus. Известны 20 разновидностей (типов) рода Cistus:

С. albidus L.

С. chinamadensis Banares & Р. Romero

С. clusii Dunal

С. crispus L.

С. heterophyllus Desf.

С. incanus (известный также как С. creticus)

С. inflatus Pourr. Ex Demoly (известный также как С. hirsutus Lam. или С. psilosepalus Sweet)

С. ladanifer L.

С. laurifolius L.

С. libanotis L.

C. monspeliensis L.

C. munbyi Pomel

C. ochreatus Chr. Sm. ex Buch

C. osbeckiifolius Webb ex Christ.

C. panrviflorus Lam.

C. populifolius L.

C. pouzolzii Delile

C. salviifolius L.

C. sintenisii Litard. (известный также как С. albanicus E.F. с)

C. symphytifolius Lam.

Экстракт получают предпочтительно из вида С. incanus. C. incanus включает два подвида, С. incanus ssp. tauricus (крымский) и С. incanus ssp. undulatus (волнистый). Из этих двух подвидов для экстракции особенно предпочтительно применение С. incanus ssp.

Экстракт выделяют из воздушных частей растений. Преимущественно применяют воздушные побеги, отросшие в год применения. Части растений подвергали экстракции сразу после сбора, т.е. в необработанном состоянии. В качестве альтернативы части растений перед экстракцией высушивали. После этого листья растений измельчали подходящим способом, например путем растирания или разрезания.

Экстракцию выполняют подходящим растворителем. Подходящими растворителями являются вода, спирты, такие как метанол, этанол или изопропанол, либо хлорсодержащие растворители, такие как дихлорметан, а также ацетон, ацетилацетон, аммиак или кристаллизованная уксусная кислота. Можно также использовать смеси указанных растворителей. Преимущественно применяют смесь воды с метанолом или этанолом.

Экстракцию обычно проводили при комнатной температуре. Однако можно также выполнять экстракцию при повышенных температурах от 25°С до, если необходимо, точки кипения используемого растворителя. Экстракция при комнатной температуре является предпочтительной.

Далее, для экстракции можно применять жиры, такие как лярд (топленный свиной жир), воски, такие как пчелиный воск, или масла, такие как оливковое масло или миндальное масло. Предпочтительно применение миндального масла.

Чтобы достичь максимально высокого возможного выхода, можно экстрагировать растительный материал много раз. При этом на разных ступенях экстракции можно применять разные растворители, либо можно после экстракции растворителем провести экстракцию жиром, воском или маслом, и наоборот.

Путем экстракции получают жидкий или полутвердый сырой продукт, который можно использовать в таком виде для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения гриппа.

Сырой продукт можно также подвергнуть концентрированию, и/или сушке, и/или дальнейшей обработке перед использованием для получения лекарственного средства. Например, обработка может включать этапы очистки, известные специалистам в данной области, такие как центрифугирование, фильтрование и декантирование, с целью удалить из экстракта суспендированные вещества.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к сухому экстракту. Для получения сухого экстракта растворитель можно удалить растворитель из жидкого сырого экстракта, концентрированного экстракта или очищенного экстракта, например, путем сушки распылением, сушки замораживанием или сушки под вакуумом.

Описанный экстракт применяют для профилактики и/или лечения гриппа.

Инфекционные агенты гриппа - это вирусы типов А, В и С. Сезонные вспышки заболеваний гриппом у людей вызывает вирус гриппа типа А, имеющий подтипы Н1, Н2 и Н3, а также вирус гриппа типа В. Грипп птиц вызывают главным образом подтипы Н5, Н7 и Н9.

Описанный экстракт особенно подходит для профилактики и/или лечения гриппа птиц. В частности, этот экстракт можно применять для профилактики и/или лечения гриппа птиц, вызванного подтипом Н7.

Экстракт можно применять в любой галеновой форме применения, известной специалистам в данной области, например, в виде таблеток, покрытых пленкой таблеток (film tablets), капсул, порошка, гранул, драже, мазей, кремов, гелей, растворов или аэрозолей (спреев). Экстракт также можно применять в виде порошка для смешивания с пищей, в частности с пищей животных.

Согласно настоящей заявке экстракт можно обработать обычными вспомогательными галеновыми средствами, такими как связующие вещества для таблеток, наполнители, консерванты, разрушающие таблетки агенты, регуляторы текучести, умягчители, увлажняющие агенты, диспергирующие агенты, эмульгаторы, растворители, замедляющие вещества (retarding agents), антиоксиданты, загустители, агенты для улучшения проникающей способности и/или пропелленты (распылители).

Этот экстракт можно также смешивать другими растительными экстрактами, в частности с растительными экстрактами, обладающими аналогичным или синергическим действием.

Концентрация экстракта в лекарственной форме будет варьировать в зависимости от типа применения. Обычно количество экстракта составляет от 1 до 1000 мг на единицу дозирования для твердых лекарственных форм. Предпочтительно, количество экстракта составляет от 5 до 500 мг на единицу дозирования. В жидких лекарственных формах экстракт может присутствовать в концентрациях от 1 мкг/мл до 100 мг/мл, предпочтительно от 25 мкг/мл до 50 мг/мл. В полутвердых лекарственных формах содержание экстракта составляет от 1 до 90 мас.%, предпочтительно от 5 до 75 мас.%.

Экстракт предпочтительно вводить в форме таблеток, в которых экстракт присутствует в форме сухого экстракта.

Кроме того, предпочтительно введение экстракта в форме мазей или кремов для местного применения. В этом случае применяют экстракт, в котором активные агенты выделены из растения экстракцией в жире, воске или масле. Кроме того, предпочтительно, чтобы сухой экстракт был смешан с жиром, воском или маслом, либо растворен в них.

Кроме того, предпочтительным является применение экстракта в форме аэрозоля. Такой аэрозоль можно применять для дезинфекции объектов и помещений, контактировали или могут контактировать вызывающие грипп агенты, в частности животноводческие помещения, а также транспортные средства любого типа, в которых перевозят людей, животных и/или пищевые продуты. Например, можно опрыскать аэрозолем согласно настоящему изобретению самолет перед взлетом, чтобы предотвратить распространение гриппа птиц и таким образом минимизировать опасность инфицирования людей. Аэрозоль согласно настоящему изобретению также можно распылять в присутствии людей, например, в комнатах ожидания, так как он не оказывает какого-либо токсического действия на людей.

Следующий пример иллюстрирует настоящее изобретение.

Исследовали токсичность экстракта для клеток и его влияние на жизнеспособность клеток, а также его противовирусную активность в отношении вируса гриппа. С этой целью экстракт растворили в ФБР (стерильном) путем нагревания (1 час/100°С) (исходный (маточный) раствор 1 мг/мл). Дозы для in vitro исследований были 2, 10, 25 и 50 мкг/мл системы.

В качестве штаммов (isolates) вирусов служили вирус гриппа типа А A/Bratislava/79 (H7N7) (FPV) (птиц) и вирус гриппа типа A A/Puerto-Rico/8/34 (H1N1) (PR8) (человека).

В качестве клеток-хозяев для вирусов использовали следующие клеточные линии: клетки почки собаки Мадин-Дэрби (MDCK, Madin-Darby canine kidney), клетки эпителия почки собаки А549, а также клетки эпителия легкого человека.

Для определения характеристик экстракта использовали следующие методы исследования.

Микроскопические исследования.

В микроскопических исследованиях клетки эпителия легкого А549 и клетки эпителия почки собаки MDCK обрабатывали в течение различного времени (9 часов, 24 часа, 32 часа, 48 часов) различными концентрациями экстракта (2, 10, 25, 50 мкг/мл), после чего изучали методом световой микроскопии. Каждый эксперимент проводили в двух повторах с контролями.

Тесты на жизнеспособность

В тестах на жизнеспособность клетки эпителия легкого А549 и клетки эпителия почки собаки MDCK обрабатывали в течение различного времени (для различных временных точек, for different time points) (24 часа, 48 часов, 56 часов, 72 часа) различными концентрациями экстракта (2, 10, 25, 50 мкг/мл), после чего окрашивали йодидом пропидия, чтобы определить соотношение мертвых и живых клеток методом проточной цитометрии. Всего эти эксперименты выполнили четыре раза.

Изучение активации каспаз апоптоза.

Для изучения активации каспаз апоптоза, в дополнение к согласованным экспериментам, клетки А549 в течение 48 часов обрабатывали 25 и 50 мкг/мл экстракта. После этого клетки подвергли лизису, клеточные белки отделили путем гель-электрофореза и протестировали методом Вестерн-блота с анти-ПАРП антителом (ПАРП = поли(АДФ-рибоза)полимераза, субстрат каспазы) на способность каспаз апоптотически расщеплять этот белок. В качестве положительного контрольного стимула служил индуктор апоптоза стауроспорин. Эти эксперименты были выполнены в двух параллельных сериях.

Изучение противовирусной активности.

Для изучения противовирусной активности клетки эпителия легкого А549 и клетки эпителия почки собаки MDCK предварительно обрабатывали в различные моменты времени различными концентрациями экстракта (2, 10, 25, 50 мкг/мл) в течение 30 минут и затем в присутствии экстракта инфицировали штаммами вируса гриппа A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) и A/PR8/34 (H1N1). В различные моменты времени после инфицирования (8 или 9 часов, 24 часа, 36 часов или 48 часов) Брали пробы надосадочной среды и тестировали методом бляшек (plaque assay) на вновь образовавшиеся вирусы гриппа.

Изучение кинетики действия.

Для изучения кинетики действия клетки MDCK обрабатывали 50 мкг/мл экстракта в различные моменты времени (30 минут предварительной инкубации, непосредственно после инфицирования, либо через 2 часа, 4 часа и 8 часов после инфицирования). Через 24 часа тестировали надосадочную среду на наличие вторичных вирусов.

Исследование противовирусной активности после преинкубации вирусов с экстрактом.

Для изучения противовирусной активности после предварительной инкубации вирусов с экстрактом, инфицирующие растворы, содержащие вирусы (FPV), предварительно инкубировали с 50 мкг/мл экстракта в течение 2 часов. Эксперимент по инфицированию проводили на клетках А549 с использованием этого инфицирующего раствора в сравнении с необработанными вирусами и через 24 часа измеряли количество вновь образовавшегося вируса методом титрования вируса. В течение этого времени экстракт в надосадочной среде уже полностью отсутствовал. Кроме того, предварительно обработанные вирусы, которые использовали для инфицирования непосредственно исследовали на инфекционность в отношении клеток MDCK методом бляшек по сравнению с необработанными вирусами.

Иммунофлуоресцентные микроскопические исследования предварительно обработанных вирусов.

Инфицирующий раствор, содержащий вирус (FPV), подвергали предварительной инкубации с 50 мкг/мл экстракта в течение 30 минут или в течение ночи. Для сравнения служили необработанные вирусы, а также инфицирование предварительно обработанных клеток необработанными вирусами. Затем для сравнения выполнили эксперимент по инфицированию необработанными вирусами в высокой инфицирующей дозе (множественность инфекции, MOI=200), и через 1 час определяли количество инфицирующего вируса или вновь образовавшегося белка методом иммунофлуоресценции с применением специфических антител против белка вируса (нуклеопротеина (NP)). Такое раннее время определения и высокая инфицирующая доза также обеспечили возможность определить инфицирующие вирусы или вирусные агрегаты.

Результаты описанных выше исследований показаны графически на Фигурах с 1 по 9.

Пример

Получение экстракта из Cistus incanus ssp. tauricus (ладанник волосистый подвид крымский)

Для экстракции использовали свежеотросшие воздушные части растения (листья, лепестки, стебли). Растительное сырье сушили на открытом воздухе в тени при комнатной температуре до тех пор, пока содержание остаточной влаги не становилось меньше 10%. После этого части растений разрезали на кусочки размером не более 8 мм.

Разрезанные части растений подвергали перколяции при 95°С десятикратным количеством очищенной воды (по Европейской фармакопее) в течение от 4 до 5 часов. Полученный раствор концентрировали при температуре пара от 75 до 80°С до 18 до 19% первоначального объема с помощью пластинчатого испарителя. Содержание сухого вещества составляло примерно 45%.

Содержание сухого вещества увеличивали до 50-51% с помощью перемешивающего испарителя путем нагревания экстракта в течение 4 часов при температуре от 110 до 114°С и пониженном давлении (0,6 бар). После этого экстракт кипятили в течение 1 часа при 100,3°С, в результате чего получают содержание сухого вещества примерно 53%.

Наконец, проводили сушку на вакуумном конвейере при 16 мбар с понижающими градиенте температуры (140°С, 120°С, 90°С, 20°С). Содержание сухого вещества составило 92-93%. После этого экстракт размалывали. Затем из этого экстракта приготавливали исходный (маточный) раствор, описанный выше.

Микроскопические исследования

На изображениях, полученных с помощью микроскопа, не удалось обнаружить значительных изменений количества или морфологии клеток по сравнению с необработанными контрольными образцами для серий экспериментов с клетками MDCK и клетками А549 ни при каких концентрациях экстракта или изученных временных величинах.

Тест на жизнеспособность

Результаты теста на жизнеспособность показаны на Фиг.1 и 2, на которых для сравнения суммированы количества живых клеток в каждом из соответствующих образцов в виде средних по четырем проведенным измерениям. Из полученных результатов видно, что никакого отрицательного влияния экстракта на выживание клеток MDCK или клеток А549 на протяжении всего периода наблюдения 72 часа не обнаружено.

Изучение активации каспаз апоптоза

Результаты исследования активации каспаз апоптоза показаны на Фиг.3, которая иллюстрирует результаты анализа методом Вестерн-блот для определения активности каспаз. В то время как контрольный стимул стауроспорин (stauro) обеспечивает эффективное расщепление субстрата каспаз (поли(АДФ-рибоза)полимеразы, полоса расщепленного ПАРП), ни в необработанных (обработанных контрольным раствором, mock), ни в обработанных экстрактом (25 мкг/мл, 50 мкг/мл) клетках, активности такого рода не обнаружили. Контрольный блот против белка ERK2 служил в качестве контроля равномерности белковой нагрузки. В качестве результата можно сделать заключение, что обработка экстрактом растений не приводит к активации каспаз и индукции апоптоза при использованных концентрациях и длительности периода наблюдения.

Изучение противовирусной активности

На Фиг.4-7 показываны примеры результатов каждого из двух независимых экспериментов по многократному определению титра, проведенных при изучении противовирусной активности экстракта. Титры вируса показаны в сравнении с титрами в необработанных инфицированных образцах. В клетках А549, инфицированных FPV, даже более низкие концентрации вызывали значительное уменьшение титров вируса через 9 часов и 24 часа, при этом титры вируса при самых высоких концентрациях активного агента были снижены более чем в 100 раз. Благодаря высокой инфицирующей дозе, необработанные образцы через 48 часов находились в фазе плато роста вируса, поэтому ингибирующее действие уже нельзя продемонстрировать также наглядно. И все же, даже в этом случае наблюдали снижение титров вируса при самых высоких концентрациях активного агента. Максимальное снижение титров вируса также можно было обнаружить с тем же штаммом вируса в клетках MDCK при обработке образцов 25-50 мкг/мл экстракта, которая также давала ингибирование на много порядков по величине. Неожиданно, в некоторых сериях наблюдали небольшое увеличение титров вируса при низких концентрациях активного агента. Однако, поскольку увеличение титра не происходило систематически во всех образцах и, в частности, не наблюдалось в ходе самого длительного периода наблюдения продолжительностью 36 часов, можно считать, что оно является артефактом эксперимента.

Зависящее от концентрации ингибирование размножения вируса в клетках MDCK наблюдали также для используемого в качестве альтернативы штамма вируса человека PR8 при всех изученных временных интервалах. В этом случае также происходило уменьшение титров вируса при самой высокой концентрации активного агента 50 мкг/мл, что согласуется с предыдущими экспериментами.

В целом, можно утверждать, что наблюдали сильное ингибирующее действие на размножение различных вирусов гриппа в двух линиях клеток-хозяев, особенно при концентрациях экстракта 25 мкг/мл и 50 мкг/мл.

Исследование кинетики здействия

Результаты исследований противовирусной активности после предварительной инкубации вирусов с экстрактом показаны в графическом виде на Фиг.9 Это исследование кинетики действия относительных титров вируса показало, что сильно ингибирующее действие на размножение вируса обнаруживали только при предварительной инкубации клеток с экстрактом Экстракт не показал никакого дополнительного действия при добавлении позже 2 часов после инфицирования.

Исследование противовирусной активности после преинкубации вирусов с экстрактом

Провели эксперимент по инфицированию для сравнения с необработанным вирусом, в эксперименте использовали инфицирующий раствор, который подвергли предварительной инкубации с экстрактом в течение 2 часов; через 24 часа методом титрования определяли количество вновь образовавшегося вируса (Фиг.9В). Кроме того, предварительно обработанные вирусы непосредственно исследовали методом бляшек на их инфекционность по сравнению с необработанными вирусами (Фиг.9А). При прямом определении инфекционности методом бляшек оказалось, что предварительная инкубация уже оказывала действие. Это стало еще более очевидным, когда через 24 часа после инфицирования сравнили клетки, зараженные вирусами, обработанными экстрактом, с клетками, зараженными необработанными вирусами. В этом случае обнаружили, что титр снизился примерно на один порядок величины.

В целом, можно сказать, что предварительная инкубация вирусов с экстрактом сама по себе вносит вклад в значительное снижение инфекционности вирусов.

Иммунофлуоресцентные микроскопические исследования с предварительно обработанными вирусами

В иммунофлуоресцентных микроскопических исследованиях с предварительно обработанными вирусами уже через 1 час обнаруживали повышенную концентрацию нуклеопротеина (NP) в клеточном ядре. Это говорило о том, что основная часть вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих NP, уже мигрировала в клеточное ядро, либо что уже началось производство новых вирусных частиц. Хотя это распределение лишь немного отличалось в инфицированных клетках, которые предварительно обработали экстрактом, после предварительной инкубации вирусов, особенно после предварительной инкубации в течение ночи, обнаружили значительные изменения. В этом случае окрашивание вирусных частиц или агрегатов имело место только в определенных точках, и окрашивание клеточного ядра было едва заметно. Из этого можно заключить, что предварительно обработанные вирусы почти неспособны инфицировать клетки или проникать внутрь клеток.

Исследования морфологии, жизнеспособности и активации каспаз клеток, обработанных экстрактом, показали, что концентрации экстракта вплоть до 50 мкг/мл не оказывают какого-либо значимого токсического действия на клетки-хозяева А549 и MDCK, использованные в этой работе, и не приводят к повышенной смертности клеток по механизму некроза или апоптоза. Более того, не было обнаружено значимого уменьшения количества клеток, и, следовательно, рост клеток под действием экстракта также не уменьшался. Итог результатов оценки противовирусной активности экстракта, принимая во внимание погрешности эксперимента, позволяет утверждать, что этот экстракт оказывает значимое и мощное противовирусное действие на размножение вирусов гриппа в клеточной культуре при концентрациях 25-50 мкг/мл.

Тестируемый экстракт растений продемонстрировал противовирусную активность в отношении вирусов гриппа в культуре клеток, не оказывая никакого значимого токсического действия на клетки-хозяева. На молекулярном уровне противовирусную активность, как предполагается, опосредует в большой степени прямое физическое взаимодействие компонентов экстракта с вирусной частицей, хотя нельзя исключить и других дополнительных воздействий экстракта на клетки.

В дальнейших исследованиях было изучено свойство ладанника (Cistus) ингибировать высокопатогенные вирусы гриппа подтипов H5N1 (азиатский грипп) и H7N7. В следующих исследованиях в качестве вирусных штаммов служили штаммы вирусов A/Thailand/1 (KAN-1)/2005 (H5N1) (человека) и вирус гриппа типа A A/Bratislava/79 (H7N7) (FPV) (птиц).

Ингибирование агглютинирующей способности высокопатогенных вирусов H5N1 и H7N7

Экстракт ладанника (Cistus) разбавляли до концентраций ¹/ ₂, ¹/₄, ¹/₈ , ¹/₁₆ и ¹/₃₂ от концентрации исходного раствора. Штаммы вирусов H5N1 и H7N7 разбавляли до конечной концентрации ¹/₆₄ от исходной концентрации. Каждый раствор ладанника (Cistus) смешивали в 96-луночном планшете с 50 мкл на ячейку раствора H5N1 (количество бляшкообразующих единиц - PFU: 4,5×10⁸) и раствора H7N7 (PFU: 5,7×10⁸) соответственно. Планшет инкубировали при 37°С в инкубаторе в атмосфере CO₂ в течение 1 часа, затем добавили в каждую ячейку по 50 мкл крови цыпленка, разбавленной до ¹/₂₀ и планшет вновь инкубировали в течение 30-45 минут в холодильнике. В качестве контроля эритроциты либо не обрабатывали, либо обрабатывали H5N1 и H7N7 соответственно, без добавления экстракта ладанника (Cistus).

В результате было обнаружено, что экстракт обладает способностью эффективно ингибировать слипание эритроцитов в присутствии штаммов вирусов H5N1 и H7N7. Таким образом, экстракты ладанника (Cistus) способны значительно уменьшать связывающую способность гемагглютинина по отношению к клеточным рецепторам для H5N1 и H7N7.

Ингибирование способности к размножению высокопатогенных вирусов H5N1.

Клетки А549 посеяли и позволили им расти в течение 24 часов. Затем клетки подвергли предварительной инкубации с экстрактом ладанника (Cistus) в течение 30 минут. Использовали концентрации экстракта 50 мкг/мл, 75 мкг/мл и 100 мкг/мл. Аналогично, вирус H5N1 подвергли предварительной инкубации с экстрактом (50 мкг/мл, 75 мкг/мл и 100 мкг/мл) в течение 30 минут при комнатной температуре. После преинкубации клетки инфицировали вирусом гриппа типа А подтипа H5N1 (MOI: 0,001) в течение 30 минут на качалке при 37°С в инкубаторе в атмосфере СО₂. После этого клетки промыли ФБР, чтобы удалить несвязанные вирусы и инкубировали с экстрактом ладанника (Cistus) (50 мкг/мл, 75 мкг/мл и 100 мкг/мл) в течение 20 часов в инкубаторе в атмосфере CO ₂ при 37°С. После 20 часов инкубации удалили надосадочную жидкость и измерили титр вируса методом бляшек. В качестве контроля использовали необработанные инфицированные образцы.

Результаты показаны на Фигуре 10, где за 100% был принят необработанный контроль. Были изучены два различных образца экстракта (А и В).

Как видно из Фигуры 10, экстракт значимо уменьшает количество вторичных (образованных)вирусов.