способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота (варианты) и вакцина против блютанга крупного и мелкого рогатого скота
Классы МПК: | A61K39/12 вирусные антигены |
Автор(ы): | Колбасов Денис Владимирович (RU), Шурыгин Александр Иванович (RU), Малышева Вера Ивановна (RU), Чудин Олег Васильевич (RU), Зенов Николай Иванович (RU), Красуткин Сергей Николаевич (RU), Мельник Николай Васильевич (RU), Луницын Андрей Иванович (RU), Литенкова Ирина Юрьевна (RU), Рахманин Павел Петрович (RU), Крюков Сергей Вениаминович (RU), Тренев Василий Николаевич (RU), Соловьев Борис Васильевич (RU), Балашов Владимир Григорьевич (RU), Кузнецов Дмитрий Павлович (RU), Лозовой Дмитрий Анатольевич (RU), Охапкин Сергей Сергеевич (RU), Дорохин Владимир Васильевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Открытое акционерное общество "Институт биотехнологий ветеринарной медицины" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2008-12-29 публикация патента:
10.06.2010 |
Группа изобретений относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота по первому вариану включает приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта. В качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13. Инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/клетка. Культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 часов до содержания жизнеспособных клеток 7-10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин. К супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025%. 3атем при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%. Перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 часов при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С. Далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта. Концентрируют антиген до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см 3 и по способу получения вакцины по первому варианту добавляют к антигену адъювант в конечной концентрации 40-65%, а по способу получения вакцины по второму варианту к антигену добавляют сапонин в конечной концентрации 0,0001-0,0005%, или гидроокись алюминия, или смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000004-0,0000625, в конечной концентрации 8-25%. При производстве вакцины полностью исключается необходимость проведения трудоемких операций, связанных с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и многократной боксовой работы с каждым из них, увеличивается количество полноценного иммуногена с одного и того же объема вируссодержащей клеточной суспензии. Вакцина, приготовленная согласно изобретению, обладает большой иммуногенной потенцией и, следовательно, будет более надежно защищать животных от блютанга. 3 н. и 2 з.п. ф-лы.
Формула изобретения
1. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающий приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД 50/клетка, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 ч до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 ч при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 ч при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, концентрируют его до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см 3, к антигену добавляют адъювант в конечной концентрации 40-65%.
2. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота по п.1, отличающийся тем, что в качестве адъюванта используют адъювант «ISA 50» или адъювант «ISA 70».
3. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающий приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/клетка, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 ч до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 ч при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 ч при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, концентрируют его до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см3, к антигену добавляют сапонин в конечной концентрации 0,0001-0,0005% или гидроокись алюминия, или смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000004-0,0000625, в конечной концентрации 8-25%.
4. Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота по любому из пп.1 и 3, отличающийся тем, что в качестве пеногасителя используют пеногасители Пента-465П, или Пента-473П, или Пента-483П.
5. Вакцина против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, полученная по любому из пп.1 и 2 или по любому из пп.3 и 4.
Описание изобретения к патенту
Группа изобретений относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарной вирусологии и биотехнологии.
Известен способ изготовления вакцины универсальной против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающий приготовление посевного атериала вируса блутанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделением вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта (Патент RU 2077583 С1, 20.04.1997).
Способ включает приготовление посевного материала на основе вируса блютанга одного или смеси серотипов в различных комбинациях и культуры перевиваемых клеток ВНК-21/13, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию, очистку и приготовление целевого продукта с добавлением комплекса гидроокись алюминия с сапонином или масляным адъювантом.
Недостатком известного способа является его сложность, а вакцина, полученная по известному способу, имеет низкую инфекционную и иммуногенную активность.
Задачей заявленной группы изобретений является упрощение способа изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота и увеличение инфекционной и иммуногенной активности полученной вакцины.
Поставленная задача по первому варианту изготовления вакцины решается тем, что в способе изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающем приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, согласно изобретению в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/клетка, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-3 7,5°С в течение 48-72 часов до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание проводят в течение 1,5-2,0 часов при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, антиген концентрируют до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см 3, к антигену добавляют адъювант в конечной концентрации 40-65%.
Задача решается также тем, что в качестве адьюванта используют адъювант «ISA 50» или адъювант «ISA 70».
Поставленная задача по второму варианту изготовления вакцины решается тем, что в способе получения вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающем приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, согласно изобретению в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД50/см3, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 часов до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 часов при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, антиген концентрируют до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД50/см 3, к антигену добавляют сапонин, взятый в конечной концентрации 0,0001-0,0005%, или гидроокись алюминия, или смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятые в массовых соотношениях 1:0,000004-0,0000625, в конечной концентрации 8-25%.
Задача решается также тем, что в качестве пеногасителя используют пеногасители Пента-465П, или Пента-473П, или Пента-483П.
Известно использование пеногасителей Пента-465П (ТУ 2257-001-40245042-98), Пента-473 П (ТУ 2229-062-40245042-2004), Пента-483 П (ТУ 2257-008-40245042-99) при производстве пищевых и кормовых дрожжей, а также на сахарном производстве.
Технический результат, полученный при реализации заявленной группы изобретений, заключается в том, что впервые предложена вакцина против блютанга крупного и мелкого рогатого скота с инфекционной активностью 6,5-7,5 lg ТЦД 50/см3. В настоящее время известны 24 серотипа возбудителя блютанга, которые вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых животных. Авторами впервые показано, что использование серотипов вируса блютанга 1, 2, 4, 8, 9, 12 и 14 при культивировании на культуре клеток ВНК-21/13 существенно повышает инфекционную и иммуногенную активность целевого продукта, снижая вакцинальную дозу с 4,0 мл до 2,0 мл (внутримышечно для крупного рогатого скота (КРС) и с 2,0 мл до 1,0 мл (внутримышечно для мелкого рогатого скота), что позволяет решить поставленную задачу.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,001 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH 2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-х суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют сапонин до конечной концентрации 0,0001%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 2. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3- Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют сапонин до конечной концентрации 0,00035%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 3. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,002 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют 10%-ный сапонин до конечной концентрации 0,0005% мг/мл, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 4. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,001 ТЦД 50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473 П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH 2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют гидроокись алюминия до конечной концентрации 8%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 5. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют гидроокись алюминия до конечной концентрации 14%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 6. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,002 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД50/см3.
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3 6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют гидроокись алюминия, взятого в конечной концентрации 25%. перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 7. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,001 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH 2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000004, взятых в конечной концентрации 8%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 8. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000005125, взятых в конечной концентрации 14,25%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 9. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,002 ТТЦД 50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,0000625, взятых в конечной концентрации 25%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 10. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 1 из расчета 0,001 ТЦД 50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,2 и температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,0%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД50/см3 .
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5 ч, затем каждые 8 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2 PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:8 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 70» в конечной концентрации 40%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 11. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 1 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,3 и температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,05 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3.
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 37°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 1 ч, затем каждые 9 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре 37°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 7,0 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 70» в конечной концентрации 47,5%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 3°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 12. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 1 из расчета 0,002 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,4 и температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД 50/см3.
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 37,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 1 ч, затем каждые 10 ч. С помощью 22%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:11 и выдерживают 22 мин при температуре 37,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 8 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 7,5 lg ТЦД50/см3 и добавляют адьювант «ISA 70» в конечной концентрации 65%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 13. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 2 из расчета 0,001 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,2 и температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,0%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%), перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД 50/см3.
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5 ч, затем каждые 8 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:8 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 50» в конечной концентрации 40%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 14. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 4 из расчета 0,0015 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,3 и температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,05 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД50/см3.
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 37°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 1 ч, затем каждые 9 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре 37°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 7,0 lg ТЦД50/см3 и добавляют адъювант «ISA 50» в конечной концентрации 47,5%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 3°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
Пример 15. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 8 из расчета 0,002 ТЦД50/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,4 и температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.
В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД 50/см3.
Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.
Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 37,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 1 ч, затем каждые 10 ч. С помощью 22%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH2PO4).
Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13.
Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:11 и выдерживают 22 мин при температуре 37,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 8 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.
Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.
Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 7,5 lg ТЦД50 /см3 и добавляют адъювант «ISA 50» в конечной концентрации 65%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.
При производстве вакцины полностью исключается необходимость проведения специальных операций для получения вирусного посевного материала, практически полностью исключается необходимость проведения трудоемких операций, связанных с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и многократной боксовой работы с каждым из них. Увеличивается количество полноценного иммуногена с одного и того же объема вируссодержащей клеточной суспензии.
Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологическом способе изготовления обладают большой иммуногенной потенцией и, следовательно, будут более надежно защищать животных от блютанга (катаральной лихорадки) крупного и мелкого рогатого скота.
Класс A61K39/12 вирусные антигены