полипептид со свойствами агониста рецептора гормона роста, кодирующая его нуклеиновая кислота, вектор для его экспрессии и продуцирующая его клетка

Формула изобретения

1. Полипептид, состоящий из двух связывающих рецептор полипептидов гормона роста, соединенных в тандем пептидной линкерной молекулой, которая по меньшей мере состоит из 1-4 копий аминокислотной последовательности А(ЕАААК)А, где указанный полипептид является агонистом рецептора гормона роста.

2. Полипептид по п.1, где линкерная молекула дополнительно включает по меньшей мере один гибкий неспиральный участок, состоящий из аминокислотной последовательности GGGGS и расположенный на ее аминотерминальном и/или карбокситерминальном конце.

3. Полипептид по п.2, где гибкий неспиральный участок локализован на аминотерминальном конце пептидной линкерной молекулы.

4. Полипептид по п.2, где гибкий неспиральный участок локализован на карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы.

5. Полипептид по п.2, где гибкий неспиральный участок локализован на амино- и карбокситерминальном концах пептидной линкерной молекулы.

6. Полипептид по п.1, где указанный пептидный линкер соединяет карбоксильный конец первого полипептида гормона роста с амино-концом второго полипептида гормона роста.

7. Полипептид по п.6, где пептидный линкер расположен между последним аминокислотным остатком С-концевой спирали первого полипептида гормона роста и первым аминокислотным остатком N-концевой спирали второго полипептида гормона роста.

8. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид со свойствами агониста рецептора гормона роста, которая имеет нуклеотидную последовательность, определяющую аминокислотную последовательность полипептида по п.1.

9. Вектор для экспрессии полипептида со свойствами агониста рецептора гормона роста, включающий нуклеиновую кислоту по п.8.

10. Выделенная клетка, трансформированная или трансфицированная вектором по п.9, которая продуцирует полипептид со свойствами агониста рецептора гормона роста.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к полипептидам, содержащим по меньшей мере два домена, способных связываться с рецептором цитокина, где данные домены соединены пептидной линкерной молекулой.

Группа факторов роста, именуемых цитокинами, участвует в целом ряде различных клеточных функций. Эти функции включают, в качестве примера, но не как ограничение, модуляцию иммунной системы, регуляцию энергетического метаболизма и контроль роста и развития. Цитокины опосредуют свои эффекты посредством рецепторов, экспрессируемых на клеточной поверхности клеток-мишеней. Рецепторы цитокинов можно разделить на три отдельные подгруппы. Рецепторы типа 1 (семейство гормона роста (GH)) характеризуются четырьмя консервативными остатками цистеина в аминоконцевой части их внеклеточного домена и присутствием консервативного мотива Trp-Sex-Xaa-Trp-Ser в С-концевой части. Повторяющийся Cys мотив также присутствует у типа 2 (семейство интерферона) и типа 3 (семейство фактора некроза опухолей).

Известно, что многие домены цитокинов взаимодействуют со своим распознающим рецептором через специфические сайты. Некоторые рецепторы цитокинов имеют как сайты связывания домена с высоким сродством, так и сайты связывания с низким сродством.

Например, известно, что одна молекула GH связывается с двумя молекулами рецептора (GHR) (Cunningham et al., 1991; de Vos et al., 1992; Sundstrom et al., 1996; Clackson et al., 1998). Это осуществляется через два уникальных рецептор-связывающих сайта на GH и общий карман связывания на внеклеточном домене двух рецепторов. Сайт 1 на молекуле GH имеет более высокое сродство, чем сайт 2, и полагают, что димеризация рецептора происходит последовательно, причем один рецептор связывается с сайтом 1 на GH, с последующим рекрутированием второго рецептора к сайту 2. Внеклеточный домен GHR существует в виде двух связанных доменов, причем каждый из них состоит приблизительно из 100 аминокислот. Именно конформационное изменение в этих двух доменах происходит при связывании гормона с образованием тримерного комплекса GHR-GH-GHR. После интернализации комплекса GHR-GH-GHR следует стадия рециклинга, посредством чего молекула рецептора регенерируется для дальнейшего использования в клетке.

Цитокины и другие домены часто образуют комплексы рецептор-домен при связывании. Рецепторы, участвующие в образовании комплексов, могут быть гомогенными или гетерогенными. Например, эритропоэтин и GH образуют тримерный комплекс рецептор-гормон-рецептор. Интерлейкин-4 образует тримерный комплекс рецептор-гормон-другой рецептор. Фактор некроза опухолей индуцирует сигнал через образование гомотипных тримеров клеточных трансмембранных рецепторов фактора некроза опухолей, TNF-1/p55 или TNF-2/p75. Другие цитокины, например лептин и GCSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), образуют тетрамерные комплексы рецептор-гормон-гормон-рецептор, а некоторые цитокины (например, интерлейкин 6) возможно образуют гексамерные комплексы, состоящие из двух растворимых рецепторных молекул, двух трансмембранных рецепторных молекул и двух молекул цитокина. В каждом случае существуют первичный сайт связывания с высоким сродством, который локализует цитокин в комплексе с рецептором, и дополнительные сайты, которые играют вторичную роль в изменении конформации или рекрутинге других молекул, инициируя, посредством этого, передачу сигнала.

Надсемейство цитокинов TNF (tumour necrosis factor, фактор некроза опухолей) активирует пути передачи сигнала для выживания клеток, их гибели и дифференциации, которые регулируют развитие, организацию и гомеостаз лимфоидной ткани, ткани молочной железы, нервной и эктодермальной ткани. Для TNF продемонстрирована его роль в защите хозяина, которая включает, например, дифференциацию клеток селезенки, полный lgG ответ и переключение изотипа, активацию макрофагов, генерацию оксида азота и радикалов активных форм кислорода. Однако при его сверхэкспрессии TNF также участвует в патогенезе. Доказательство такого участия обнаружили в следующих патологиях: бактериальный сепсис; реакция трансплантат против хозяина; церебральная малярия; ревматоидный артрит; гнездная алопеция / общее облысение; астма; рак; болезнь Крона; диабет; ожирение; псориаз и псориатический артрит; саркоидоз; склеродермия и токсический шок. Эти патологии считают установленными и/или потенциальными патологиями для применений анти-TNF агентов.

Сверхэкспрессия цитокинов является причиной целого ряда заболеваний человека, например акромегалии, гигантизма, дефицита GH, синдрома Тернера, почечной недостаточности, остеопороза, остеоартрита, сахарного диабета, рака, ожирения, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, гипертензии, анемии, аутоиммунных и инфекционных заболеваний, воспалительных расстройств, включая ревматоидный артрит.

Подходом для ингибирования действия цитокинов, например GH, пролактина или TNF, является введение антагонистов.

Одним примером антагониста GH является пегвисомант, который представляет собой модифицированную молекулу GH, покрытую полиэтиленгликолем (PEG). Пегвисомант имеет несколько полезных эффектов, включая, например, пониженную скорость клубочковой фильтрации, обусловленную повышенной эффективной молекулярной массой, что обеспечивает снижение дозы, требующейся для получения желательного эффекта [смотри Abuchowski et al J Biol Chem., 252, 3578-3581, (1977)]. Однако следствием пэгилирования является снижение сродства молекулы модифицированного GH к GHR.

Пример антагониста пролактина раскрыт в WO 03/057729 (которая включена в данное описание изобретения во всей ее полноте посредством ссылки и, более конкретно, последовательности белка и нуклеотидные последовательности, кодирующие указанный антагонист пролактина). Антагонист пролактина содержит модификацию аминокислотной последовательности пролактина человека, которая представляет собой замену остатка глицина в положении 129 остатком аргинина. Модифицированный белок пролактин действует как ингибитор активации рецептора пролактина.

Разработали целый ряд терапевтических стратегий для ингибирования TNF на основе возможности: 1) ингибировать синтез TNF (например, используя ингибиторные цитокины, IL-10; талидомид, кортикостероиды, циклоспорин А; антисмысловые олигонуклеотиды); 2) ингибировать процессинг TNF (например, ингибиторы металлопротеаз (ТАСЕ, TNF- конвертирующий фермент)); 3) нейтрализовать TNF (например, используя растворимые рецепторы TNF или антитела к TNF).

Авторы данного изобретения описывают полипептиды, содержащие многочисленные лиганд-связывающие домены цитокиновых рецепторов и их применение в модуляции опосредованной рецептором активации цитокинов.

Согласно одному аспекту данного изобретения предложен полипептид, содержащий по меньшей мере два цитокиновых связывающих домена, способный связываться с цитокиновым рецептором, где данные домены соединены пептидной линкерной молекулой, которая содержит негибкий спиральный участок.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид действует как антагонист указанного(ых) цитокинового(ых) рецептора(ов). В качестве альтернативы, указанный полипептид действует как агонист.

Предпочтительно полипептид содержит домены, расположенные в тандемном порядке. В предпочтительных воплощениях изобретения данный полипептид содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 доменов в тандемном порядке.

В еще одном другом предпочтительном воплощении изобретения данный полипептид содержит более 10 доменов в тандемном порядке.

Предпочтительно негибкий спиральный участок содержит по меньшей мере одну копию мотива А(ЕАААК)_хА или ее функциональный вариант. Предпочтительно пептидная линкерная молекула содержит две копии мотива ЕАААК, причем длину молекулы данного пептидного линкера можно увеличить путем пошагового добавления по меньшей мере одной аминокислоты.

«Функциональный вариант» представляет собой линкерную молекулу, которая может отличаться в аминокислотной последовательности одной или более чем одной заменой, вставкой, делецией, но которая по существу сохраняет спиральную или неспиральную конформацию. Среди предпочтительных вариантов находятся варианты, которые отличаются от эталонной аминокислотной последовательности консервативными аминокислотными заменами. Такие замены представляют собой замены, при которых данная аминокислота заменяется другой аминокислотой со схожими характеристиками. Следующий неограничивающий список аминокислот рассматривают как консервативные замены (сходные): а) аланин, серин и треонин; б) глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота; в) аспарагин и глутамин; г) аргинин, лизин и гистидин; д) изолейцин, лейцин, метионин и валин и е) фенилаланин, тирозин и триптофан. Наиболее предпочтительными являются аминокислотные замены, которые по существу сохраняют гибкий или жесткий спиральный линкерный участок.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения линкерная молекула содержит по меньшей мере один гибкий неспиральный участок.

В то время как наличие негибкого спирального участка поддерживает пространственное разделение доменов, как описано выше, наличие гибкого неспирального участка позволяет доменам ориентироваться в связывающие сайты цитокинового(ых) рецептора(ов).

В одном воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на аминотерминальном конце молекулы пептидной линкерной молекулы или около него, тем самым делая возможной ориентацию связывающего домена, находящегося на аминотерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к его распознающему рецептору.

В другом воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы или около него, тем самым делая возможной ориентацию связывающего домена, находящегося на карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к его распознающему рецептору.

В еще одном другом воплощении данного изобретения гибкий неспиральный участок расположен на амино- и карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы или около них, тем самым делая возможной ориентацию связывающих доменов, расположенных, соответственно, на амино- и карбокситерминальном конце пептидной линкерной молекулы, по отношению к их распознающим рецепторам.

Предпочтительно гибкий неспиральный участок расположен рядом с по меньшей мере одним связывающим доменом. Еще более предпочтительно гибкий неспиральный участок образует соединение между связывающим доменом и негибким спиральным участком.

Еще более предпочтительно негибкий спиральный участок содержит по меньшей мере одну копию мотива А(ЕАААК) _хА. Длина негибкого неспирального участка может быть увеличена путем увеличения числа повторов этого мотива А(ЕАААК)_х А.

В предпочтительном воплощении данного изобретения «х» в мотиве А(ЕАААК)_хА составляет менее 10 копий. Еще более предпочтительно «х» составляет менее 5 копий. Еще более предпочтительно «х» выбран из 1, 2, 3, 4 или 5 копий.

В предпочтительном воплощении данного изобретения не существует гибких соединений между жесткими альфа-спиральными линкерами и связывающими доменами, но указанные связывающие домены непосредственно связаны негибким альфа-спиральным линкером.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные связывающие домены соединены соединительной молекулой, состоящей из негибкой альфа-спирали.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная спиральная линкерная молекула соединяет карбоксильный конец одного связывающего домена с аминоконцом второго связывающего домена.

В этом воплощении данного изобретения спиральный линкер является непрерывным между С-концевой спиралью молекулы первого цитокина и N-концевой спиралью молекулы второго цитокина, жестко связывая, таким образом, два цитокиновых связывающих домена в по существу фиксированной ориентации. Например, это может включать делецию короткого N-концевого и пост-спирального С-концевого участка из домена первого цитокина и короткого предспирального N-концевого участка из второго цитокина (например, остатков 182-190 из первого цитокина и остатков 1-5 из второго цитокина, так как они представляют собой короткие участки случайной кольцевой конформации после С-концевой спирали (например, спираль 4 на Фиг.1Б) в первом цитокине и перед N-концом (спираль 1' на Фиг.1Б) второго цитокина.

В различных конструктах эту фиксированную ориентацию (как трансляционную, так и ротационную) можно изменить либо путем вставки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дополнительных аминокислот, либо путем делеции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, чтобы получить молекулы с новыми свойствами, например с антагонистическими свойствами. Добавление дополнительной аминокислоты даст дополнительное относительное перемещение двух доменов приблизительно на 1,5 Å и относительное вращение двух доменов вокруг оси спирали примерно на +100°. Типично линкеры могут начинаться с двух единиц ЕАААК и будут удлиняться путем добавления последовательностей А, АА, ААА, АААА, ЕАААА и ЕАААК.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения связывающие домены полипептида являются одинаковыми или сходными друг с другом.

Кроме того, в других воплощениях данного изобретения полипептид содержит связывающие домены цитокинов, выбранных из группы, состоящей из гормона роста, лептина, эритропоэтина, пролактина, интерлейкинов (IL) IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, р35 субъединицы IL-12, IL-13, IL-15; гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF); гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF); цилиарного нейротрофического фактора (CNTF); кардиотрофина (СТ-1); фактора, ингибирубщего миграцию лейкоцитов (LIF); онкостатина М (OSM); интерферона, IFN и IFN ; фактора некроза опухолей (TNF) , TNF и лиганда RANK.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения по меньшей мере один домен содержит связывающий домен гормона роста.

В другом предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит по меньшей мере два связывающих домена гормона роста или варианта гормона роста.

Модифицированные варианты GH раскрыты в US 5849535, который включен в данное описание изобретения посредством ссылки. Модификации GH находятся как в связывающем сайте 1, так и в сайте 2. Модификации в сайте 1 продуцируют молекулу GH, которая имеет более высокое сродство к GHR по сравнению с GH дикого типа. Эти модифицированные молекулы GH действуют как агонисты. Также существует раскрытие модификаций сайта 2, которые приводят к созданию антагонистов GH. Дополнительные примеры модификаций GH для сайта 1, которые изменяют сродство связывания GH, раскрыты в US 5854026; US 6004931; US 6022711; US 6057292 и US 6136563, каждый из которых включен в данное описание изобретения посредством ссылки. Также описаны модификации сайта 2, в частности аминокислотного остатка G120 в GH, которые при модификации в любой из аргинина, лизина, триптофана, тирозина, фенилаланина или глутаминовой кислоты создают молекулу GH со свойствами антагониста.

В находящейся на одновременном рассмотрении заявке на патент WO 03/070765 авторов данного изобретения, которая включена в данное описание изобретения посредством ссылки, авторы изобретения описывают продукт слияния варианта GH с антагонистической активностью по отношению к активации рецептора GH. Данный вариант GH слит через гибкий линкер с внеклеточным доменом рецептора гормона роста. Этот химерный полипептид демонстрирует замедленный клиренс и антагонистическую активность. Предложение аналогичного химерного полипептида, но с негибким или частично гибким линкером также находится в пределах объема изобретения, раскрытого здесь.

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит по меньшей мере два связывающих домена пролактина или варианта пролактина.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид варианта пролактина содержит аминокислотную последовательность, которая модифицирована в положении 129 пролактина человека.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная модификация представляет собой аминокислотную замену. Предпочтительно указанная замена представляет собой замену остатка аминокислоты глицина остатком аминокислоты аргинина. Предпочтительно указанная модификация дополнительно содержит делецию по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминоконцевых аминокислотных остатков.

В альтернативном воплощении данного изобретения связывающие домены полипептида отличаются друг от друга.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит первый связывающий домен, который представляет собой связывающий домен гормона роста, и второй связывающий домен, который представляет собой связывающий домен пролактина.

Предпочтительно указанный полипептид состоит из связывающего домена гормона роста и связывающего домена пролактина.

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид содержит первый связывающий домен, который представляет собой модифицированный связывающий домен гормона роста, и второй связывающий домен, который представляет собой модифицированный связывающий домен пролактина.

Предпочтительно указанный полипептид состоит из модифицированного связывающего домена гормона роста и модифицированного связывающего домена пролактина.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный модифицированный связывающий домен гормона роста содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты глицина 120. Предпочтительно указанная модификация представляет собой замену глицина 120 аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина, лизина, триптофана, тирозина, фенилаланина или глутаминовой кислоты.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная модификация представляет собой замену глицина 120 остатком аминокислоты аргинин.

В дополнительном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный модифицированный связывающий домен пролактина содержит модификацию глицина 129. Предпочтительно указанная модификация представляет собой замену глицина 129 остатком аминокислоты аргинина. Предпочтительно указанная модификация дополнительно содержит делецию по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминоконцевых аминокислотных остатков.

В дополнительном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный полипептид дополнительно содержит лиганд-связывающий домен рецептора цитокина. Предпочтительно указанный рецептор представляет собой рецептор гормона роста. В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанный рецептор представляет собой рецептор пролактина.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный лиганд-связывающий домен может быть соединен с указанным связывающим доменом цитокина линкером, содержащим негибкий спиральный участок или состоящим из него.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид согласно данному изобретению.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор, адаптированный для экспрессии указанного полипептида.

Типично данная адаптация включает обеспечение последовательностей контроля транскрипции (промоторных последовательностей), которые опосредуют экспрессию, специфичную для клеток/тканей. Эти промоторные последовательности могут быть специфичными для клеток/тканей, индуцируемыми или конститутивными.

Промотор является признанным в данной области термином и, ради ясности, включает следующие особенности, которые приведены только в качестве примера. Энхансерные элементы представляют собой цис-действующие последовательности нуклеиновых кислот, часто находящиеся 5' по отношению к сайту инициации транскрипции гена (энхансеры также могут быть обнаружены 3' по отношению к последовательности гена или даже могут быть локализованы в интронных последовательностях и, следовательно, являются независимыми от положения). Функция энхансеров заключается в увеличении скорости транскрипции гена, с которым связан энхансер. Активность энхансера является чувствительной к транс-действующим факторам транскрипции (полипептидам), которые, как было показано, специфически связываются с энхансерными элементами. Связывание/активность транскрипционных факторов (пожалуйста, смотрите Eukaryotic Transcription Factors, by David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego) являются чувствительными к целому ряду стимулов среды, которые включают, например, промежуточные метаболиты (например, глюкоза), эффекторы окружающей среды (например, тепло).

Промоторные элементы также включают так называемые ТАТА-бокс и последовательности выбора инициации РНК-полимеразы (RIS), функция которых заключается в выборе сайта инициации транскрипции. Эти последовательности также связывают полипептиды, функция которых, среди прочего, состоит в облегчении выбора инициации транскрипции РНК-полимеразой.

Адаптации также включают обеспечение селектируемых маркеров и последовательностей автономной репликации, которые облегчают поддержание вектора в эукариотической или прокариотической клетке. Векторы, которые поддерживаются автономно, именуются эписомальными векторами.

Адаптации, которые облегчают экспрессию генов, кодируемых вектором, включают обеспечение последовательностей терминации транскрипции/полиаденилирования, что также включает обеспечение внутренних сайтов связывания рибосом (IRES), функция которых состоит в максимизации экспрессии генов, кодируемых вектором, организованных в бицистронные или мультицистронные кассеты экспрессии.

Эти адаптации являются хорошо известными в данной области. Существует значительное количество опубликованной литературы относительно конструкции векторов экспрессии и технологии рекомбинантных ДНК в целом. Пожалуйста, смотрите Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY и ссылки в данной публикации; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Для специалиста в данной области будет очевидным, что векторы согласно данному изобретению могут являться векторами генной терапии. Векторы для генной терапии обычно основаны на вирусах. Целый ряд вирусов обычно используют в качестве векторов для доставки экзогенных генов. Обычно используемые векторы включают рекомбинантно модифицированные ДНК и РНК вирусы с оболочкой или без оболочки, предпочтительно выбранные из baculoviridiae (бакуловирусы), parvoviridiae (парвовирусы), picornoviridiae (пикорновирусы), herpesviridiae (герпесвирусы), poxviridiae (поксвирусы), adenoviridiae (аденовирусы) или picornaviridiae (пикорнавирусы). Также можно использовать химерные векторы, которые эксплуатируют полезные элементы каждого свойства родительского вектора (смотрите, например, Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870). Такие вирусные векторы могут быть векторами дикого типа или могут быть модифицированы методами рекомбинантных ДНК так, чтобы быть дефицитными по репликации, условно реплицирующимися или компетентным по репликации.

Предпочтительные векторы происходят из аденовирусных, связанных с аденовирусными, и ретровирусных геномов. В наиболее предпочтительном осуществлении данного изобретения векторы происходят из генома аденовируса человека. Особенно предпочтительные векторы происходят из серотипов 2 или 5 аденовируса человека. Способность к репликации таких векторов можно ослабить (до точки, рассматриваемой как «дефицитная по репликации») путем модификаций или делеций в кодирующих областях Е1а и/или Е1b. Предпочтительными являются другие модификации вирусного генома для достижения конкретных особенностей экспрессии или обеспечения повторного введения, или меньшей иммунной реакции.

В качестве альтернативы, вирусные векторы могут быть условно реплицирующимися или компетентными по репликации. Условно реплицирующиеся вирусные векторы используют для достижения избирательной экспрессии в конкретных типах клеток, при избежании нежелательной инфекции широкого спектра. Примеры условно реплицирующихся векторов описаны в Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343; Russell, and S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30А(8):1165-1171. Дополнительные примеры избирательно реплицирующихся векторов включают те векторы, где ген, существенный для репликации вируса, находится под контролем промотора, который является активным только в конкретном типе клеток или при конкретном состоянии клеток так, что в отсутствие экспрессии такого гена данный вирус не будет реплицироваться. Примеры таких векторов описаны в Henderson et al., патент Соединенных Штатов № 5698443, выданный 16 декабря 1997, и Henderson et al., патент Соединенных Штатов № 5871726, выданный 16 февраля 1999, все идеи которых включены в данное описание изобретения посредством ссылки.

Дополнительно, вирусный геном можно модифицировать путем включения индуцируемых промоторов, которые обеспечивают репликацию или экспрессию только при определенных условиях. Примеры индуцируемых промоторов известны в научной литературе (смотрите, например, Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; and Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371.

Векторы также могут быть невирусными и доступными из целого ряда коммерческих источников, легко доступных специалисту в данной области. Например, данные векторы могут представлять собой плазмиды, которые могут быть эписомальными или интегрирующими.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложена клетка, трансформированная или трансфицированная нуклеиновой кислотой или вектором согласно данному изобретению.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанная клетка представляет собой эукариотическую клетку.

Предпочтительно указанная эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки грибов, например Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp; миксомицетов (например Dictyostelium spp); клетки насекомых (например Spodoptera frugiperda); растительной клетки или клетки млекопитающего (например клетка СНО (яичник китайского хомячка)).

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанная клетка представляет собой прокариотическую клетку.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ получения полипептида согласно данному изобретению, включающий стадии:

1) выращивания клетки согласно данному изобретению в условиях, приводящих к продуцированию полипептида согласно изобретению, и

2) выделения полипептида из клетки или из ее ростовой среды. В предпочтительном способе по данному изобретению указанный полипептид снабжен аффинной меткой.

Аффинные метки являются известными в данной области и включают белок, связывающий мальтозу, глутатион-S-трансферазу, белок, связывающий кальмодулин, и полученные при помощи генной инженерии полигистидиновые участки в белках, которые затем очищают путем аффинной очистки на матрицах, содержащих никель. Во многих случаях имеющиеся в продаже векторы и/или наборы можно использовать для слияния интересующего белка с подходящей аффинной меткой, с последующей его трансфекцией в клетку-хозяина для экспрессии и последующей экстракции и очистки на аффинной матрице.

В находящейся на одновременном рассмотрении заявке WO 03/034275 авторов данного изобретения, содержание которой включено в описание данного изобретения посредством ссылки, авторы изобретения описывают новую аффинную метку для полипептидов, которая использует домен, включающий сигнальную последовательность, которая направляет добавление гликозилфосфатидилинозитола к полипептиду. Полипептиды, которые включают гликозилфосфатидилинозитольную метку, предпочтительно встраиваются в липидные мембраны и могут обладать антагонистическим действием на активацию рецепторов цитокинов. Следовательно, изобретение, раскрытое здесь, охватывает полипептиды с присоединенной молекулой гликозилфосфатидилинозитола.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложен полипептид, содержащий первый цитокиновый связывающий домен, соединенный со вторым цитокиновым связывающим доменом, где указанный полипептид дополнительно содержит внеклеточный домен цитокинового рецептора.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй связывающие домены соединены гибкой линкерной молекулой.

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй домены связывания соединены пептидной линкерной молекулой, которая содержит негибкий спиральный участок.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные первый и второй связывающие домены соединены пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок и гибкий неспиральный участок.

Пептидные линкеры, которые содержат негибкие спиральные участки и комбинации негибких спиральных участков и гибких неспиральных участков, были описаны выше и являются применимыми к этому воплощению данного изобретения, как и определенные ранее цитокины и цитокиновые рецепторы.

В предпочтительном воплощении данного изобретения внеклеточный домен цитокинового рецептора соединен с первым или вторым цитокиновым связывающим доменом посредством линкерной молекулы. Предпочтительно указанная линкерная молекула содержит негибкий спиральный участок.

В альтернативном предпочтительном воплощении данного изобретения указанная линкерная молекула является гибкой.

Предпочтительно указанная линкерная молекула содержит негибкий спиральный участок и гибкий неспиральный участок.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанный связывающий цитокиновый домен представляет собой гормон роста или вариант гормона роста, и указанный внеклеточный домен является внеклеточным доменом гормона роста. Предпочтительно указанные домены являются человеческими.

Полипептид по данному изобретению может демонстрировать двойную функциональность. Во-первых, первый и второй домены, содержащие цитокины или их части, которые предпочтительно соединены пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок, способны связываться с рецепторами цитокинов поверхности клетки и стерически затруднять ассоциацию этих рецепторов в рецепторные комплексы, предотвращая, таким образом, последующую клеточную передачу сигнала. Во-вторых, предоставление третьего домена, содержащего рецепторы цитокинов или их части, обеспечивает способность функционирования в качестве растворимого рецептора, связывая, таким образом, любой цитокин перед его связыванием с рецептором поверхности клетки. Этот третий домен предпочтительно соединен с первым или со вторым доменом пептидной линкерной молекулой, содержащей негибкий спиральный участок. В альтернативном воплощении данного изобретения третий домен предпочтительно соединен с первым или вторым доменом пептидной линкерной молекулой, содержащей гибкий неспиральный участок.

В предпочтительном воплощении данного изобретения указанные пептидные линкерные молекулы дополнительно содержат аминокислотную последовательность, которая является чувствительной к протеолитическому расщеплению.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложено применение молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению в качестве фармацевтического средства.

Предпочтительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая молекулу полипептида или нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению. Предпочтительно указанная фармацевтическая композиция содержит носитель, эксципиент и/или разбавитель.

При введении терапевтические композиции по настоящему изобретению вводят в фармацевтически приемлемых препаратах. Термин «фармацевтически приемлемый» означает нетоксичное вещество, которое не оказывает вредного воздействия на эффективность биологической активности активных ингредиентов. Такие препараты традиционно могут содержать соли, буферные вещества, совместимые носители, консерванты и возможно другие терапевтические агенты.

При использовании в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми, однако фармацевтически неприемлемые соли можно с удобством использовать для получения фармацевтически приемлемых солей, и они не исключены из объема данного изобретения. Такие фармакологические и фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из следующих кислот: соляной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, муравьиной, малоновой, янтарной и тому подобных, но не ограничиваются ими. Также фармацевтически приемлемые соли можно получить в виде солей щелочных и щелочноземельных металлов, как, например, соли натрия, калия или кальция.

Данные фармацевтические композиции могут содержать подходящие буферные агенты, включающие уксусную кислоту в соли; лимонную кислоту в соли; борную кислоту в соли и фосфорную кислоту в соли.

Данные композиции можно объединять, если это желательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Термин «фармацевтически приемлемый носитель», в том виде, как он здесь используется, означает один или более чем один совместимый твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или инкапсулирующее вещество, которые подходят для введения человеку. Термин «носитель» означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединен активный ингредиент для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также способны совместно смешиваться с молекулами по настоящему изобретению и друг с другом таким образом, что отсутствует взаимодействие, которое существенно ухудшило бы желательную фармацевтическую эффективность.

Фармацевтические композиции с удобством могут быть представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть получены любым способом, хорошо известным в области фармации. Все способы включают стадию приведения активного агента в ассоциацию с носителем, который составляет один или более чем один вспомогательный ингредиент. В общем, данные композиции получают путем приведения активного соединения в однородную и тесную ассоциацию с жидким носителем, тонкоизмельченным твердым носителем или ими обоими и затем, если это необходимо, путем формовки данного продукта.

Данные фармацевтические композиции также возможно могут содержать подходящие консерванты, такие как бензалкония хлорид; хлорбутанол; парабены и тимеросал.

Фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить любым традиционным путем, включая инъекцию, или путем постепенной инфузии на протяжении определенного промежутка времени. Введение может быть, например, пероральным, внутривенным, интраперитонеальным, внутримышечным, внутриполостным, подкожным или чрескожным.

Композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, таблетки, лепешки, причем каждая из них содержит заданное количество активного соединения. Другие композиции включают суспензии в водных жидкостях или в неводных жидкостях, такие как сироп, эликсир или эмульсия.

Композиции по данному изобретению вводят в эффективных количествах. «Эффективное количество» представляет собой такое количество композиции, которое само по себе или совместно с дополнительными дозами дает желательную реакцию. В случае лечения конкретного заболевания, такого как рак, желательной реакцией является подавление развития заболевания. Это может включать только временное замедление развития заболевания, хотя, более предпочтительно, это включает перманентную остановку развития заболевания. Это можно отслеживать традиционными способами.

Такие количества будут, конечно, зависеть от конкретного состояния, которое лечат, от тяжести состояния, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физическое состояние, размер и массу, продолжительность лечения, от природы сопутствующей терапии (если таковая имеет место), конкретного пути введения и от подобных факторов, находящихся в пределах знаний и компетенции практикующего врача. Эти факторы хорошо известны обычным специалистам в данной области и могут быть изучены при помощи не более чем обычного экспериментирования. Обычно является предпочтительным, чтобы была использована максимальная доза отдельных компонентов или их комбинаций, то есть наивысшая безопасная доза, согласно правильному медицинскому решению. Обычным специалистам в данной области, однако, будет понятно, что пациент может настаивать на меньшей дозе или переносимой дозе по медицинским причинам, физиологическим причинам и, фактически, по любым другим причинам.

В другом аспекте данного изобретения предложено применение молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из акромегалии; гигантизма; дефицита GH; синдрома Тернера; почечной недостаточности; остеопороза; остеоартрита; сахарного диабета; рака (например, рака простаты, рака шейки матки, рака молочной железы, меланомы, гепатомы, рака почек, глиомы, рака мочевого пузыря, рака легкого, неврального рака, рака яичника, рака яичка, рака поджелудочной железы, рака желудочно-кишечного тракта, лимфомы); ожирения; резистентности к инсулину; гиперлипидемии; гипертензии; анемии; аутоиммунных и инфекционных заболеваний; воспалительных расстройств, включая ревматоидный артрит.

Согласно данному изобретению также предложен способ лечения человеческого или животного субъекта, включающий введение эффективного количества полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, фармацевтической композиции или лекарственного средства данному субъекту.

Во всем описании и формуле изобретения слова "включают" и "содержат" и вариации данных слов, например "содержащий" и "содержит", означают «включающий, но не ограничивающийся», и они не предназначены для того, чтобы исключить (и не исключают) другие группировки, добавки, компоненты, целые числа или стадии.

Во всем описании и формуле изобретения единственное число охватывает множественное, если контекст не требует иного. Конкретно, когда используется единственное число, данное описание следует понимать как рассматривающее множественность, а также единичность, если контекст не требует иного.

Свойства, целые числа, характеристики, соединения, химические группировки или группы, описанные в связи с конкретным аспектом, воплощением или примером данного изобретения, следует понимать, как применимые к любому другому аспекту, воплощению или примеру, описанному здесь, если это не является несовместимым с данным описанием изобретения.

Воплощения данного изобретения теперь будут описаны только в качестве примера и со ссылкой на следующие фигуры.

Фиг.1А. Цитокиновые домены (овалы) соединены альфа спиралью (заштрихованный прямоугольник). Гибкие линкеры (изогнутые стрелки) соединяют первый цитокиновый домен со спиралью и спираль - со вторым цитокиновым доменом; Фиг.1Б. Цитокиновые домены соединены альфа спиралью. Гибкие линкеры соединяют первый цитокиновый домен со спиральным линкером и спиральный линкер - со вторым цитокиновым доменом.

Фиг.2. Спиральный линкер не имеет гибких соединителей - вместо этого он продолжает С-концевую спираль (4) цитокина 1 и соединяет ее с N-концевой спиралью (1') цитокина 2 с образованием жесткого тандема, соединенного одиночной длинной спиралью: 4 - линкерная спираль 1'. Относительная ориентация двух цитокиновых доменов, следовательно, является фиксированной. Однако путем создания различных конструктов при помощи присоединения или удаления аминокислот из линкера можно генерировать серии жестких тандемов, в которых данные домены являются по-разному ориентированными.

Фиг.3 иллюстрирует карту и последовательность нуклеотидов/аминокислот для конструкта 1C1b.

Фиг.4 иллюстрирует обзор конструкций линкеров и праймеров, используемых для генерации тандемов со спиральными линкерами с гибкими концами.

Фиг.5 иллюстрирует А) конструкцию пограничных участков между доменами GH и линкером, чтобы позволить лигирование дуплексов праймеров с получением непрерывающихся спиральных линкеров между доменами; Б) праймеры, используемые для модификации 1C1b с получением 1С5.

Фиг.6 иллюстрирует карту конструкта 1С5 и последовательность линкерного участка.

Фиг.7 иллюстрирует обзор конструкции линкера и праймеров, используемых для генерации тандемов с жесткими спиральными линкерами.

Фиг.8 иллюстрирует схематическую диаграмму, показывающую стратегию конструирования 1L1.

Фиг.9 иллюстрирует нуклеотидную последовательность 1L1. Домены GH показаны серым цветом, домен GHR выделен жирным шрифтом и линкеры подчеркнуты.

Фиг.10 иллюстрирует аминокислотную последовательность 1L1. Домены GH показаны серым цветом, домен GHR выделен жирным шрифтом, и линкеры подчеркнуты.

Фиг.11 иллюстрирует схематическую диаграмму, показывающую стратегию клонирования для конструирования 1L1.

Фиг.12 иллюстрирует экспрессию 1L1.

Фиг.13 иллюстрирует предварительную очистку 1L1-His. 1L1-His очищали, используя Со²⁺-колонку.

Фиг.14 иллюстрирует, что 1L1 демонстрирует агонистическую активность.

Фиг.15 обобщает использованную номенклатуру по отношению к жестким и полужестким конструктам GH.

Фиг.16: а) представляет собой нуклеиновокислотную последовательность тандема GH, содержащего полужесткую линкерную последовательность; б) представляет собой аминокислотную последовательность тандема GH, содержащего полужесткую линкерную последовательность; в) иллюстрирует примеры полужестких линкеров, используемых в конструировании тандемов GH; г) иллюстрирует бактериальную экспрессию тандемов GH, содержащих полужесткие линкеры; и д) иллюстрирует биоактивность тандемов GH, содержащих полужесткие линкеры.

Фиг.17: а) представляет собой нуклеиновокислотную последовательность тандема GH, содержащую жесткую линкерную последовательность; б) представляет собой аминокислотную последовательность тандема GH, содержащую жесткую линкерную последовательность; в) иллюстрирует примеры жестких линкеров, используемых в конструировании тандемов GH; г) иллюстрирует бактериальную экспрессию тандемов GH, содержащих жесткие линкеры; и д) иллюстрирует биоактивность тандемов GH, содержащих жесткие линкеры.

Фиг.18А иллюстрирует очистку T1cEAK2+3his и анализ путем окрашивания кумасси и вестерн-блоттинга; Фиг.18Б и 18В иллюстрируют биоактивность T1cEAK2+3his; Фиг.18Г иллюстрирует очистку T1cEAK2+4his и анализ путем окрашивания кумасси и вестерн-блоттинга; и Фиг.18Д и 18Е иллюстрируют биоактивность T1cEAK2+4his.

Фиг.19 иллюстрирует ELISA для определения тандемов гормона роста.

Фиг.20 представляет собой схематическую иллюстрацию тандемов гормона роста, связанных гибким, полужестким и жестким линкерами.

Фиг.21 иллюстрирует примеры возможных комбинаций пролактина (PRL), гормона роста (GH) и их антагонистических мутантов.

Фиг.22 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности пролактина и одной из его антагонистических форм, мутанта G129R (подчеркнуто) с удаленными аминокислотами 1-14.

Фиг.23 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности гормона роста и его антагонистической формы, мутанта G120R (подчеркнуто).

Фиг.24 представляет собой схематическую иллюстрацию тандема пролактина.

Фиг.25. (А) Схема конструктов жесткого тандема GH с сайтами рестрикции, полученными при помощи генной инженерии, Notl и Nrul, что делает возможным соединение линкера непосредственно с концевыми спиралями соседних доменов и также облегчает изменение линкера. (Б) Схема жесткого конструкта PRL-линкер-СН с сайтами рестрикции, полученными при помощи генной инженерии, Notl и Nrul, которые имеют ту же самую функцию, что и в (А), сайт Notl находится в линкерных участках и, таким образом, просто может быть добавлен к усеченному гену RRL в домене А. (В) Схематическая диаграмма жесткого тандема PRL, уникальный сайт рестрикции нужно создать путем генной инженерии, используя вырожденный аминокислотный код, на границе между линкером и PRL в домене Б, чтобы сделать возможным легкий синтез и модификацию данного тандемного гена.

Материалы и методы

Модификацию линкера в тандеме GH инициировали от гена молекулы GH-(G₄S)-GH ( 1C1), которую модифицировали для удаления 30 аминокислот, избыточных на N-конце экспрессируемого белка, данный ген также субклонировали в модифицированный вектор рЕТ21(+) с получением рЕТ21: 1C1b (Фиг.3).

Для конструктов со спиральными линкерами с гибкими концами конструировали линкер путем лигирования друг с другом комплементарных олигонуклеотидов; эти олигонуклеотиды конструировали так, чтобы они кодировали желательный линкер и имели концы, которые лигировались бы в вектор, рЕТ21: 1C1b, который был расщеплен Notl и EcoRI. Обзор этих линкеров показан на Фиг.4.

Для жесткого линкера между доменами GH эти домены GH должны были быть модифицированы для удаления их С-конца (GH1) и N-конца (GH2) так, чтобы данные домены заканчивались на конце спиралей. Затем сконструировали сайты рестрикции, применяя технику вырожденных кодонов, что сделало бы возможным введение новых линкеров без какого-либо прерывания спирали, которая формировалась бы между двумя данными доменами (Фиг.5А). Праймеры сконструировали так, чтобы проводить эти модификации доменов GH GH-тандема (Фиг.5Б). Образующийся конструкт называли 1С5 (Фиг.6). Для генерации линкерного участка, фланкированного сайтами Notl и Nrul, использовали комплементарные олигонуклеотиды, затем лигировали их в рЕТ21: 1С5, который расщепляли Notl и Nrul. Обзор этих линкеров показан на Фиг.7.

Экспрессию конструктов осуществляют путем первоначальной трансформации вектора экспрессии рЕТ в штамм для экспрессии, E. coli BL21(DE3) CodonPlus RIPL. Экспрессию можно проводить при целом ряде различных условий, которые включают различные температуры инкубации (например, комнатную температуру, 37°С), различные среды (например, LB, 2YT, 5YT и прочее), различные точки индукции (т.е. OD₆₀₀, при которой индуцируют культуру), различные концентрации IPTG (изопропилтио- -D-галактопиранозид) (или другого индуктора), используемые для индукции культуры, и время, в которое собирают клетки после индукции.

К С-концу данного конструкта можно добавить His-метку, которая облегчит его очистку с использованием иммобилизованной аффинной хроматографии с ионами металла (с Ni ²⁺ или Со²⁺ колонками). Конструкты, которые не имеют His-метки, можно очистить, используя различные способы, такие как ионообменная хроматография, гидрофобные колонки и гель-хроматография. Для получения белка подходящей чистоты может требоваться одна или более чем одна из этих методик очистки.

Конструирование 1С5

Модифицированные домены GH генерировали, используя PCR (полимеразная цепная реакция) и релевантные праймеры. GH1 модифицировали, используя DiGHNcoGF и GH[AEA3]NotR, и GH2 модифицировали с Ecol-(Nru)GH-F и GH *-HR. Реакционные среды PCR состояли из: 1 мкл 100 пмоль/мкл прямого праймера, 1 мкл 100 пмоль/мкл обратного праймера, 1 мкл pTrcHisGHstop (разбавленного), 1 мкл 10 мМ dNTPs, 5 мкл 10х буфера для амплификации, 1 мкл 50 мМ MgSO₄, 0,5 мкл полимеразы Pfx, 39,5 мкл стерильной воды. PCR проводили на этих реакционных смесях, используя следующий температурный профиль: 95°С в течение 5 мин; 15×(95°С в течение 45 с, 55°С в течение 45 с, 72°С в течение 45 с); 72°С в течение 5 мин. Продукты PCR проверяли, используя агарозный гель, и очищали желательный продукт PCR. Модифицированный GH1 лигировали в рЕТ21: 1C1b между сайтами Ncol и Notl с получением рЕТ21: 1С4. Модифицированный GH2 лигировали в рЕТ21: 1С4 между сайтами EcoRI и HindIII с получением рЕТ21: 1С5. Обзор этого процесса показан на Фиг.8.

Изменение линкеров

Фосфорилирование праймеров

Когда для генерации линкера требовалось 2 или более чем 2 дуплекса праймеров, праймеры, содержащие внутренний 5'-конец, сначала фосфорилировали. Для каждого подлежащего фосфорилированию праймера готовили следующую реакционную смесь: 2 мкл 100 пмоль/мкл олигонуклеотидов, 2 мкл 10х киназного буфера, 2 мкл 10 мМ АТФ, 13 мкл стерильной воды, 1 мкл Т4 полинуклеотидкиназы (10 ед./мкл). Эти компоненты инкубировали при 37°С в течение 30 мин и затем при 70°С в течение 10 мин. Затем разводили пробы 1:10, используя буфер для отжига (10 мМ TRIS, 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 7,5-8,0), с получением раствора 0,1 пмоль/мкл. Эти компоненты затем могли быть использованы в реакции отжига, описанной ниже.

Отжиг дуплексов праймеров

Праймеры разбавляли до концентрации 0,1 пмоль/мкл, используя буфер для отжига (10 мМ TRIS, 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, рН 7,5-8,0). 10 мкл комплементарных праймеров смешивали в свежей пробирке. Данную пробирку затем инкубировали при 95°С в течение 2 мин и давали температуре упасть до 30°С в течение промежутка времени 40-60 мин. В случаях, когда требовалось более одного дуплекса праймеров, смешивали равные объемы дуплексов праймеров с получением раствора, содержащего все дуплексы праймеров, необходимые для образования желательного линкера. Затем хранили данные растворы на льду.

Лигирование и трансформация

Примерно 200 нг вектора, расщепленного релевантными рестрикционными ферментами (например рЕТ21: 1C1b, расщепленный Notl и EcoRI, или рЕТ21: с1С5, расщепленный Notl и Nrul), инкубировали с 4 мкл праймеров после отжига, 1 мкл лигазного буфера, 2 мкл Т4 ДНК-лигазы и доводили реакционную среду до 10 мкл стерильной водой. Эти компоненты инкубировали в течение ночи в лабораторном стакане со льдом, которому давали растаять за это время. 5 мкл продукта лигазной реакции, образовавшегося за ночь, затем добавляли к 50 мкл химически компетентных клеток E.coli SURE. Инкубировали их на льду в течение 1 часа, затем подвергали действию теплового шока при 42°С в течение 30 с. Добавляли к клеткам 450 мкл среды LB и затем инкубировали пробу в течение 30 мин при 37°С. Затем центрифугировали мини-культуру в течение 5 мин при 4000 об/мин, образующийся осадок ресуспендировали в 50 мкл среды LB и затем переносили на чашки LB, содержащие карбенициллин (100 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл) и глюкозу (0,3% мас./об.). Инкубировали их в течение ночи при 37°С. Образующиеся колонии затем подвергали скринингу для проверки того, было ли изменение линкера успешным.

Модификации общей стратегии

Генерация конструктов с жесткими линкерами с использованием рестрикционных ферментов Notl и Nrul для расщепления рЕТ21: 1С5, после трансформации генерировала большое число колоний на чашках с негативным контролем (отсутствует дуплекс праймеров в реакции лигирования), поэтому было сложно осуществить скрининг на позитивные клоны. Очищали их путем дефосфорилирования расщепленного вектора; 15 мкл рЕТ21: 1С5, расщепленного Notl и Nrul, смешивали с 2 мкл буфера CIAP 10х, 1 мкл CIAP (щелочная фосфатаза кишечника теленка) (10 ед./мкл) и 2 мкл стерильной воды. Эту смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа и затем при 80°С в течение 30 мин. Затем очищали ДНК из раствора, используя набор для очистки (например, Qiagen PCR Purification Kit). Все праймеры, использованные для создания дуплексов праймеров, фосфорилировали, используя способ, описанный выше. Фосфорилированные дуплексы праймеров затем лигировали в дефосфорилированный вектор, как описано выше.

Клонирование и экспрессия 1L1

1L1 состоит из двух доменов гормона роста GH с последующим одиночным внеклеточным доменом гормона роста, причем каждый из этих доменов в данный момент связан с линкером (Gly₄ Ser)₄ (Фиг.8). Нуклеотидная последовательность 1L1 показана на Фиг.9, и аминокислотная последовательность приведена на Фиг.10.

1L1 конструировали путем лигирования гена hGH, фланкированного сайтами Nhel и Xhol, в с1Е2 (GHRa-GH-GHRb); это давало 1К1. Домен GHR затем лигировали в 1К1 между сайтами EcoRI и HindIII с получением 1L1. Схематическая диаграмма этой процедуры показана на Фиг.11.

Ген 1L1 проверяли путем секвенирования и показали, что он является правильным. Экспрессию проводили, используя модифицированный вектор рЕТ21(+) в клетках E.coli BL21 (DE3) CodonPlus RIPL. Белок, экспрессируемый в среде LB через 4 часа после индукции 1 мМ IPTG (конечная концентрация) при OD₆₀₀ 0,5-0,6, был частично растворимым, и на вестерн-блоте, проанализированном на наличие GH (Фиг.12), наблюдали полосы с различными М.м. (молекулярные массы).

Версию 1L1 с С-концевой His-меткой очищали, используя Со²⁺ колонку (Фиг.13). В белковом препарате сохранялся целый ряд загрязняющих белков, и на вестерн-блоте все еще наблюдали полосы с различными М.м. Предварительные биоанализы этого белкового препарата показали, что он имел значительную агонистическую активность (Фиг.14).

Конструирование тандемов пролактина и тандемов пролактин:гормон роста

Конструкты тандемов PRL (пролактин) и GH генерировали, используя стандартные методики PCR с последующим лигированием и трансформацией полученного вектора. Линкер можно изменить путем лигирования и трансформирования олигонуклеотидных пар, подвергнутых отжигу, в полученные векторы. Ниже показаны три примера стратегий конструирования тандема PRL и GH.

Стратегия 1

Генерация PRL-(G ₄S)₄-PRL

1. PCR PRL между сайтами Ncol и Notl (прямой праймер = atatccatgggcTTGCCCATCTGTCC: обратный праймер = atatatatatatgggcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG).

2. Расщепление продукта PCR рестриктазами Ncol и Notl.

3. Расщепление реципиентного вектора Ncol и Notl рЕТ21(m) 1C1b (т.е. GH-(G₄S)₄-GH).

4. Лигирование продукта PCR в вектор с получением pET21(m)PRL-(G ₄S)₄-GH

5. PCR PRL между сайтами EcoRI и HindIIII (прямой праймер = atatgaattcTTGCCCATCTGTCC; обратный праймер = atataagcttGCAGTTGTTGTTGTGG).

6. Расщепление продукта PCR рестриктазами EcoRI и HindIII.

7. Расщепление реципиентного вектора EcoRI и HindIII pET21(m)PRL-(G₄S)₄-GH.

8. Лигирование продукта PCR в вектор с получением pET21(m)PRL-(G ₄S)₄-PRL.

Стратегия 2

Генерация PRL-A(EA₃K)₂A-GH

1. PCR PRL между сайтами Ncol и Notl (прямой праймер = atat ccatgggcTTGCCCATCTGTCC: обратный праймер = atatatatatatgg gcggccgccGCAGTTGTTGTTGTGG).

2. Расщепление продукта PCR рестриктазами Ncol и Notl.

3. Расщепление реципиентного вектора Ncol и Notl рЕТ21(m)Т1аЕАК2 (т.е. СН-А(ЕА₃К)₂ А-GH).

4. Лигирование продукта PCR в вектор с получением PRL-A(EA₃K)₂A-GH.

Стратегия 3

Генерация PPL-А(ЕА₃К) ₄А-PRL

1. Отжечь праймеры для генерации линкера А(ЕА₃К)₄А.

2. Расщепить реципиентный вектор рестриктазами Notl и EcoRI pET21(m)PRL-(G₄S)₄-PRL (из примера 1, приведенного выше).

3. Лигировать олигонуклеотидный димер в вектор с получением PRL-А(ЕА₃К)₄ А-PRL.

Приведенная выше стратегия проиллюстрирована на Фиг.24.

ПРИМЕР 1

Полужесткие тандемы

Клетки E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL выращивали в 10 мл среды LB, дополненной карбенициллином, тетрациклином и хлорамфениколом. Данные клетки выращивали на качалке при 37°С. Культуры индуцировали при OD₆₀₀, равной 0,4-0,7, используя IPTG в конечной концентрации 1 мМ. Данные культуры выращивали в течение дополнительных 4 ч перед сбором. Клетки лизировали, используя комбинацию лизоцима, дезоксихолата натрия и обработки ультразвуком. Растворимую фракцию затем выделяли центрифугированием. Гели PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле), окрашенные кумасси, не показывали явных полос экспрессии тандема.

Растворимую фракцию определяли посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), и 40 нг/лунку тандема загружали на 12%-ный гель PAGE. Белок переносили на PVDF (поливинилиденфторид) мембрану и подвергали вестерн-блоттингу с использованием кроличьего анти-GH антитела (первичного) и анти-кроличьего-HRP (конъюгированное с пероксидазой хрена) антитела (вторичного); смотрите Фиг.16 г. Биоактивность тандема GH, содержащего полужесткий линкер, показана на Фиг.16д.

ПРИМЕР 2

Жесткие тандемы

Клетки E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL выращивали в 10 мл среды LB, дополненной карбенициллином, тетрациклином и хлорамфениколом. Данные клетки выращивали на качалке при 37°С. Культуры индуцировали при OD₆₀₀, равной 0,4-0,7, используя IPTG в конечной концентрации 1 мМ. Данные культуры выращивали в течение дополнительных 4 ч перед сбором.

Клетки лизировали, используя комбинацию лизоцима, дезоксихолата натрия и обработки ультразвуком. Растворимую фракцию затем выделяли центрифугированием. Гели PAGE, окрашенные кумасси, не показывали явных полос экспрессии тандема.

Растворимую фракцию определяли посредством ELISA и 40 нг/лунку тандема загружали на 12%-ный гель PAGE. Белок переносили на PVDF мембрану и подвергали вестерн-блоттингу с использованием кроличьего анти-GH антитела (первичного) и анти-кроличьего-HRP антитела (вторичного); смотрите Фиг.17г. Биоактивность тандема GH, содержащего полужесткий линкер, показана на Фиг.17д.

ПРИМЕР 3

Очистка тандемов

Конструкты T1cEAK2+3His и T1cEAK2+4His включали в окончательный список для дальнейшего исследования на основании их первоначальных сверхмаксимальных активностей в биоанализе. Экспрессионной плазмидой трансформировали клетки E.coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIPL и проводили экспрессию в 1 л порционных культур. Очистку проводили на фракции растворимого белка, используя комбинацию Ni-хелатной аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными ионами металлов (IMAC), и ионообменной хроматографии. IMAC представляла собой первую стадию очистки, первоначально элюцию осуществляли, используя градиент рН (от рН 8 до рН 3); однако обнаружили, что большое количество белка терялось в промывках колонки. Поэтому авторы вернулись к использованию элюции имидазолом (от 0 до 0,5 М имидазола) и с модификациями в стратегии очистки авторы добились более чем 70%-ной чистоты. Затем использовали ионообменную колонку (Resourse Q) для дальнейшей очистки белка до более чем 90%-ной чистоты. Это проиллюстрировано на Фиг.18.

Количественная оценка на основе результатов ELISA: T1cEAK2+3His (RQ13/4)=215 мкг/мл; T1cEAK2+3His (RQ14/4)=177 мкг/мл.

Каждый полученный 1 мл, следовательно, давал общий выход 392 мкг. Получение осуществляли из 2 литров культуры выход на литр=~200 мкг.

Активность T1cEAK2+3His достигает более многократной индукции, чем rhGH, при более высоких концентрациях белка. Аналогичный результат получается, когда тандем тестируют на молярной основе, смотрите Фиг.18Б и 18В. Аналогичный анализ проводили в отношении T1cEAK2+4His. Очистка и биоактивность проиллюстрированы на Фиг.18Г, 18Д и 18Е.

Количественная оценка, основанная на результатах ELISA T1cEAK2+4His (RQ13/4), составляет 550 мкг/мл. Каждый полученный 1 мл, следовательно, давал общий выход 550 мкг. Получение осуществляли из 2 литров культуры выход на литр = ~275 мкг. Активность T1cEAK2+4-His достигает более многократной индукции, чем rhGH, при более высоких концентрациях белка. Аналогичный результат получается, когда тандем тестируют на молярной основе.

ПРИМЕР 4

Концентрацию 1C3 измеряли, используя анализ по Брэдфорду (Bradford's). rhGH (~1 мг/мл) измеряли параллельно для подтверждения достоверности данных, полученных из анализа по Брэдфорду. Затем использовали 1С3 для прямой замены стандартов GH в биоанализе на GH с получением стандартной кривой тандема. Пробы очищенного и неочищенного тандема и rhGH измеряли относительно стандартной кривой GH и стандартной кривой тандема, затем измеряли концентрацию белка из каждого планшета ELISA. GH ELISA дает приблизительно две третьих фактического значения тандемов при измерении посредством этих ELISA. Это проиллюстрировано на Фиг.19.

ПРИМЕР 5

Тандемы пролактин/GH

Тандемы пролактина и/или GH с их соответствующей антагонистической мутацией или без нее можно синтезировать, используя PCR для введения подходящих сайтов рестрикции в каждый конец гена, чтобы сделать возможным лигирование в тандемный ген.

Гибкие тандемы

Тандемный ген конструируют путем связывания двух белковых доменов гибким линкером на основе последовательности (G₄S)n; на каждом конце белковых доменов и линкера есть уникальные сайты рестрикции (Фиг.20).

Следовательно, два белковых домена в данном тандеме можно изменять путем лигирования в различных доменах. Например, пролактин (PRL), мутант пролактина G129R с удаленными аминокислотами 1-14 ( 1-14PRL.G129R), гормон роста (GH) и антагонистический мутант гормона роста G120R (GH.G120R) можно объединять в тандемном гене множеством способов (Фиг.Б). Фиг.22 и 23 показывают нуклеотидные последовательности и последовательности белков для этих доменов.

Для генерации генов с желательным белковым доменом, фланкированным подходящими сайтами для эндонуклеаз рестрикции, можно использовать стандартный PCR. Расщепление продукта PCR и реципиентного вектора этими эндонуклеазами рестрикции с последующим лигированием и трансформацией генерирует тандем с желательными белковыми доменами. Этот процесс можно проводить на любом белковом домене или на линкере (Фиг.24), которые были бы замещены, используя олигонуклеотидный димер, как уже было описано.

Полужесткие тандемы

Тандемный ген конструируют путем связывания двух белковых доменов со спиральным линкером на основе последовательности А(ЕА₃К)_nA; на каждом конце белковых доменов и линкера есть уникальные сайты рестрикции (Фиг.20).

Следовательно, два белковых домена в данном тандеме можно изменять путем лигирования в различных доменах. Например, пролактин (PRL), мутант пролактина G129R с удаленными аминокислотами 1-14 ( 1-14PRL.G129R), гормон роста (GH) и антагонистический мутант гормона роста G120R (GH.G120R) можно объединять в тандемном гене множеством способов (Фиг.21). Фиг.22 и 23 показывают нуклеотидные последовательности и последовательности белков для этих доменов.

Для генерации генов с желательным белковым доменом, фланкированным подходящими сайтами эндонуклеаз рестрикции, можно использовать стандартный PCR. Расщепление продукта PCR и реципиентного вектора этими эндонуклеазами рестрикции с последующим лигированием и трансформацией генерирует тандем с желательными белковыми доменами. Этот процесс можно проводить на любом белковом домене или на линкере (Фиг.24), которые были бы замещены, используя олигонуклеотидный димер, как уже было описано.

Жесткие тандемы

Два домена тандема нужно связать непосредственно через С-конец -спирали домена А и N-концевую -спираль домена Б. Следовательно, гены для данных белков (Фиг.22 и 23) в домене А и Б нужно урезать так, чтобы спиральный линкер [А(ЕА₃К)_nA] соединялся непосредственно с этими спиралями.

Следовательно:

Белок	Усечение домена А	Усечение домена Б
GH	184-191	1-6
PRL	191-199	1-14

Тандемный ген конструируют путем связывания двух белковых доменов со спиральным линкером на основе последовательности А(ЕА₃К) _nA; на каждом конце белковых доменов и линкера есть уникальные сайты рестрикции (Фиг.20). Уникальный сайт Notl сконструировали в N-терминальном конце линкерного участка, и уникальный сайт Nrul сконструировали в С-терминальном конце GH (Фиг.5 и 6); это делает возможной модификацию линкерного участка в тандемах GH.

N-концевую последовательность линкера, включающую сайт Notl, можно непосредственно добавить к гену PRL в положении домена А, позволяя сконструировать конструкты на основе матрицы PRL-линкер-GH (Фиг.25). Однако в случаях, когда домен Б представляет собой PRL (Фиг.25), на границе между линкером и доменом Б необходимо ввести уникальный сайт рестрикции.

Следовательно, два белковых домена в данном тандеме можно изменять путем лигирования в различных усеченных доменах. Например, пролактин (PRL), мутант пролактина G129R с удаленными аминокислотами 1-14 ( 1-14PRL.G129R), гормон роста (GH) и антагонистический мутант гормона роста G120R (GH.G120R) можно объединять в тандемном гене множеством способов (Фиг.21). В зависимости от их положения в домене А или в домене Б белковые домены нужно будет урезать, как описано выше.

Для генерации генов с желательным белковым доменом, фланкированным подходящими сайтами эндонуклеаз рестрикции, можно использовать стандартный PCR. Расщепление продукта PCR и реципиентного вектора этими эндонуклеазами рестрикции с последующим лигированием и трансформацией будет генерировать тандем с желательными белковыми доменами. Этот процесс можно проводить на любом белковом домене или на линкере, и он является аналогичным методологии, использованной для гибких и полугибких линкеров (Фиг.24).