биокатализатор для получения этанола из пентоз

Формула изобретения

Биокатализатор для получения этанола из пентоз, характеризующийся тем, что он содержит иммобилизованный мицелий микроскопического гриба, способного сбраживать пентозы в этиловый спирт, включенный в криогель на основе поливинилового спирта, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

мицелий микроскопического гриба	7,5÷20,0
поливиниловый спирт	2,5÷5,0
вода	до 100

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биокатализаторам на основе клеток мицелиальных грибов, включенных в матрицу полимерного гелевого носителя, катализирующих конверсию пентоз в этиловый спирт, и предназначено для повышения эффективности биотехнологического получения этанола из целлюлозосодержащего сырья.

В современных промышленных процессах этанол получают микробиологическим способом ферментацией глюкозы с использованием клеток дрожжей в качестве биокатализаторов. В качестве источника глюкозы используют химические или ферментативные гидролизаты крахмало- или целлюлозосодержащих продуктов, отходов сельскохозяйственного или промышленного производства. Помимо глюкозы, они содержат до 25 г/л пентоз (ксилоза, арабиноза и рибоза), не сбраживаемых традиционно применяемыми в промышленности спиртовыми расами дрожжей. Для повышения экономической привлекательности процесса получения этанола из целлюлозосодержащего сырья целесообразно использовать биокатализаторы, обеспечивающие получение этанола из пентоз.

В качестве таких биокатализаторов применяют природные штаммы мицелиальных грибов родов Rhizopus Aspergillus, Fuzarium и Mucor, способные сбраживать различные сахара, в том числе и пентозы, в этанол [Olsson L., Hahn-Hägerdal В. (1996) Fermentation of lignoellulosic hydrolysates for ethanol production. // Enzyme Microb. Technol., V.18, p.312-331]. Биокатализаторы, представляющие собой развитый метаболически активный мицелий гриба, получают культивированием спор в богатых питательных средах в аэробных условиях с последующим их применением для получения этанола из пентоз в анаэробных условиях. В качестве источника сбраживаемых сахаров могут быть использованы как растворы индивидуальных пентоз, так и среды, содержащие пентозы в составе сложных смесей сахаров, в частности химические и ферментативные гидролизаты целлюлозосодержащего сырья [Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Performance of Rhizopus, Rhizomucor, and Mucor in ethanol production from glucose, xylose, and wood hydrolyzates. // Enz. Microb. Technol., V.36, p.294-300].

Эффективность биокатализаторов, предназначенных для конверсии пентоз в этанол, удобно сравнивать по следующим показателям:

- длительность процесса конверсии (ч);

- выход этанола в расчете на исходный субстрат (%);

- продуктивность процесса или скорость конверсии (сбраживания), определяемая как концентрация целевого продукта - этанола, отнесенная к длительности процесса конверсии (г/л/ч).

Известен биокатализатор для получения этанола из пентоз, представляющий собой мицелий гриба Aspergillus terreus [Pushalkar S., Rao K.K. (1998) Short communication: Ethanol fermentation by a cellulolytic fungus Aspergillus terreus. II World J. Microbiol. Biotechn., V.14, p.289-291]. Для получения биокатализатора 10⁸ спор/мл вносят в питательную среду, содержащую 1% глюкозы и набор солей, необходимых для роста клеток, затем проводят культивирование клеток в аэробных условиях при 28°С при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Полученный биокатализатор в анаэробных условиях обеспечивает выход этанола из ксилозы 5,6% за 144 ч, а из арабинозы - 8% за 120 ч. Продуктивность процесса конверсии (скорость сбраживания) составляет соответственно 0,02 и 0,03 г/л/ч. Основным недостатком этого биокатализатора является крайне низкая продуктивность процесса, которую он обеспечивает.

Известен биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Mucor indicus для получения этанола из пентоз, присутствующих в среде в качестве единственного источника сбраживаемых сахаров, или входящих в состав смесей сахаров в кислотных гидролизатах древесины [Sues A., Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Ethanol production from hexoses, pentoses, and dilute-acid hydrolyzate by Mucor indicus.11 FEMS Yeast Research, V.5, p.669-676]. Для получения биокатализатора 1 мл суспензии спор с концентрацией (5-6)×10⁶ спор/мл вносят в 150 мл питательной среды, содержащей 33 г/л глюкозы и необходимый набор солей и органических компонентов. Проводят культивирование клеток до формирования метаболически активного мицелия при 30°С в аэробных условиях при постоянном перемешивании в течение 24 ч. При конверсии индивидульных пентоз выход этанола составляет: из ксилозы 18% за 88 ч, из арабинозы 15% за 93 ч, что соответствует скорости сбраживания - 0,068 или 0,053 г/л/ч соответственно. Выход этанола при конверсии ксилозы, присутствующей в составе кислотных гидролизатов отходов переработки древесины хвойных пород, составляет 13,3%, а скорость сбраживания 0,025 г/л/ч. К недостаткам биокатализатора следует отнести невысокую скорость сбраживания пентоз и относительно невысокие выходы целевого продукта.

Применение аналогичного катализатора, полученного в условиях повышенной температуры (37°С) при контроле рН среды (5,0±0,7), позволяет повысить выход целевого продукта до 22% от внесенного субстрата, а скорость сбраживания до 0,11 г/л/ч. [Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Performance of Rhizopus, Rhizomucor, and Mucor in ethanol production from glucose, xylose, and wood hydrolyzates.// Enz. Microb. TechnoL, V. 36, p.294-300]. Однако использование повышенных температур и необходимость контроля рН технологически и экономически усложняет процесс. Повышение температуры способствует снижению продуктивности биокатализатора под действием накапливающегося этанола.

Известны биокатализаторы, представляющие собой клетки мицелиальных грибов Rhizopus javanicus или Rhizopus oryzae, предназначенные для получения этанола из ксилозы [Skory C.D., Freer S.N., Bothast R.J. (1997) Screening for ethanol-producing filamentous fungi. // Biotechn. Lett., V.19, p.203-206]. Для получения биокатализатора 10⁸ спор вносят в 20 мл питательной среды, содержащей 0,3% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,3% солодового экстракта и 50 г/л ксилозы. Проводят культивирование клеток до формирования метаболически активного мицелия в аэробных условиях при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Выход этанола составляет 23,4% (Rhizopus javanicus) и 21,6% (Rhizopus oryzae) от внесенного субстрата, а скорость сбраживания соответственно - 0,16 или 0,15 г/л/ч.

Общим недостатком всех описанных биокатализаторов является то, что все они рассчитаны на однократное применение. Невозможность повторного использования связана с быстрым ухудшением первоначальных характеристик биокатализатора под воздействием накапливающегося в среде этанола и вследствие снижения рН среды за счет растворения выделяющегося в процессе брожения СО ₂ и накопления побочных продуктов, в частности уксусной кислоты и других органических кислот. Невозможность повторного использования биокатализатора создает проблему постоянного наращивания свежей биомассы и утилизации отработанных клеток и делает процесс экономически неэффективным.

Улучшить характеристики биокатализатора и повысить его привлекательность для использования в промышленных процессах позволяет его получение в иммобилизованном виде.

Иммобилизация позволяет повысить устойчивость клеток мицелиальных грибов по отношению к отрицательным воздействиям вышеуказанных факторов и увеличить время, в течение которого биокатализатор сохраняет свою активность.

Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток обладают большей технологической и экономической привлекательностью за счет возможности их многократного использования, упрощения процедуры отделения биомассы клеток от среды культивирования, а также элиминирования необходимости утилизации отработанной биомассы после каждого рабочего цикла.

Известен биокатализатор для получения этанола из ксилозы, представляющий собой клетки мицелиального гриба Mucor circinelloides АТСС 1216 В, распределенные в матрице белкового полимера поли-D-лизина [Lubbehusen T.L., Nielsen. J., Mclntyre M. (2004) Aerobic and anaerobic ethanol production by Mucor circinelloides during submerged growth.//Appl. Microbiol. Biotechnol, V.63, p.543-548]. Для получения биокатализатора в ячейку, представляющую собой два покрывных стекла (26 мм × 76 мм), разделенных между собой тонкой прокладкой и помещенных в металлический корпус с отверстиями для подвода субстрата и отвода культуральной жидкости, заливают 1 мл 0,1% раствора полимера поли-D-лизина, обладающего свойствами поликатионита. Далее в ячейку вносят споры до их конечной концентрации 50-80 спор в ячейке. Иммобилизация спор основана на адсорбции спор на стекле за счет множественных электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными химическими группами, находящимися на поверхности спор, и покрывающим стекло положительно заряженным белковым полимером. Далее через ячейку прокачивают со скоростью 3 мл/ч питательную среду, содержащую 20 г/л ксилозы, 4,83 г/л клейстеризованной рисовой муки, 60 г/л никотиновой кислоты, 60 г/л тиамина, 60 г/л Na₂HPO₄ 30 г/л KH ₂PO₄ 5 г/л NaCl, 10 г/л (NH₄)Cl. Культивирование клеток проводят при рН среды около 5,0 при 28°С в аэробных условиях в течение 40 ч до формирования метаболически активного мицелия. Такой биокатализатор обеспечивает в течение 40 ч получение 0,08 г/л этанола при конверсии 20 г/л ксилозы. Выход целевого продукта составляет 0,4% от внесенного субстрата, а скорость сбраживания - 0,002 г/л/ч. На арабинозе активность биокатализатора не исследована. В отличие от приведенных аналогов данный катализатор может быть использован в проточном реакторе, то есть многократно в объеме одного и того же реактора.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по типу биокатализатора, представляющего собой иммобилизованные клетки микроскопического гриба, способного сбраживать пентозы в этанол, принято за прототип.

Основным недостатком биокатализатора, принятого за прототип, является его низкая продуктивность, обусловленная следующими причинами:

1. Применяемый способ иммобилизации позволяет исходно ввести в биокатализатор очень низкую концентрацию спор, распределенных по поверхности носителя. Количество активных иммобилизованных клеток биокатализатора, определяющее его продуктивность, лимитировано геометрическими размерами реактора, поскольку иммобилизация осуществляется за счет электростатических взаимодействий спор с полимером, распределенным на поверхности стеклянных пластин. Вследствие этого возможность повышения продуктивности процесса ограничена возможностью увеличения геометрических размеров реактора. Это обстоятельство затрудняет масштабирование процесса.

2. Зависимость от рН прочности электростатического взаимодействия между иммобилизованными клетками и полилизином в составе биокатализатора. При сдвиге рН в кислую область в результате накопления метаболитов и частичного растворения образующегося при брожении СО₂ прочность электростатического комплекса уменьшается, часть иммобилизованных клеток выходит из биокатализатора, что приводит к снижению его продуктивности. Необходимость поддержания рН на постоянном уровне усложняет технологию и удорожает получение целевого продукта.

3. Функционирование биокатализатора рассчитано только на аэробные условия, в которых основная часть потребляемого субстрата используется клетками для накопления биомассы. Возможность функционирования данного биокатализатора в анаэробных условиях, являющихся, как известно, наиболее благоприятными для снижения скорости роста клеток и накопления целевого продукта [Шлегель Г. Общая микробиология. // М.: Мир, 1987, 567 с.], авторами разработки не предусмотрена.

Задачей предлагаемого изобретения является получение биокатализатора на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов для получения этанола из пентоз, длительно сохраняющего высокую продуктивность и пригодного для многократного использования в периодическом процессе.

Поставленная задача решается тем, что биокатализатор для получения этанола из пентоз содержит биомассу мицелия микроскопического гриба, способного сбраживать пентозы в этиловый спирт, включенную в гелевую матрицу полимерного носителя, при этом в качестве гелевой матрицы биокатализатор содержит криогель поливинилового спирта, при следующем соотношении компонентов (мас.%):

биомасса мицелия микроскопического гриба - 7,5÷20,0;

поливиниловый спирт - 2,5÷5,0;

вода - до 100.

В качестве биомассы мицелия микроскопического гриба может быть использована биомасса мицелия любых микроскопических грибов, способных к продуцированию этанола из пентоз.

Криогель ПВС, формируемый при замораживании-оттаивании водного раствора поливинилового спирта, характеризуется хорошими эксплуатационными характеристиками, а также высокой пористостью образующейся гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов [Лозинский В.И. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения - полимерные криогели. // Известия РАН. Сер. Химическая, 2008, № 5, с.1-18]. Криогель ПВС химически стабилен при низких значениях рН среды, а также в присутствии этилового спирта и других микробных метаболитов, накапливающихся в процессе получения этанола.

Иммобилизация мицелиальных гиф в объеме криогеля ПВС приводит к их пространственному разобщению пористой структурой матрицы, что в отличие от прототипа позволяет создать в объеме реактора высокие концентрации клеток, равномерно распределенных и зафиксированных в носителе, и тем самым увеличить скорость накопления этанола в среде культивирования. Такое пространственное распределение клеток создает улучшенные условия для метаболизма, что обеспечивает увеличение выхода целевого продукта и повышение продуктивности процесса.

Заявляемый биокатализатор обеспечивает высокую продуктивность процесса в течение длительного времени, период полуинактивации составляет от 17 до 36 суток в зависимости от культуры.

Удобство отделения иммобилизованной биомассы от культуральной среды в сочетании со способностью сохранять высокую продуктивность в течение длительного времени позволяет использовать заявляемый биокатализатор многократно в периодических условиях для получения этанола из пентоз.

Количественные соотношения, в которых компоненты входят в состав заявляемого биокатализатора, найдены экспериментально.

Размер пор в формирующейся матрице зависит от количества в ней ПВС, которое предопределяется его концентрацией в исходной смеси со спорами, подлежащей замораживанию-оттаиванию. При содержании ПВС менее 2,5 мас.% происходит формирование слишком больших пор, через которые происходит вымывание спор из носителя, сопровождающееся снижением продуктивности биокатализатора и уменьшением его механической прочности. При содержании ПВС в биокатализаторе выше 5,0 мас.% повышается вязкость его исходных растворов в суспензии со спорами, что затрудняет равномерное диспергирование спор, а также приводит к заметному уменьшению размера пор. Последнее обстоятельство приводит к ухудшению массообменных условий внутри биокатализатора и снижению его продуктивности.

Нижний предел концентрации биомассы мицелия в заявляемом составе биокатализатора определяется тем, что при концентрации ниже 7,5 мас.% получаемый биокатализатор обладает недостаточно высокой продуктивностью, а верхний предел концентрации биомассы определяется тем, что при накоплении мицелия в порах полимерной матрицы свыше 20,0 мас.% происходит закупорка пор клетками метаболически активного мицелия, ухудшающая условия массообмена внутри гранул биокатализатора и снижающая эффективность действия биокатализатора. Таким образом, превышение указанного верхнего предела концентрации клеток нецелесообразно.

Заявляемый биокатализатор получают следующим образом: к водному раствору ПВС, содержащему рассчитанное количество полимера, прибавляют суспензию спор мицелиального гриба, перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования криогеля ПВС с одновременным включением спор в его пористую структуру путем замораживания этой массы, ее выдерживания в замороженном состоянии и последующего оттаивания. Для получения биокатализатора заявляемого состава полученный криогель ПВС помещают в питательную среду и проводят культивирование в аэробных условиях для прорастания спор внутри пор полимерной матрицы и формирования метаболически активного мицелия, способного в анаэробных условиях продуцировать этанол из пентоз.

Культивирование иммобилизованных спор осуществляют в стандартных питательных средах, содержащих компоненты, необходимые для роста мицелия по всему объему полимерной матрицы [Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник. // М.: Агропромиздат, 1990, 240 с.]. Споровый материал для иммобилизованного биокатализатора получают с применением известных биотехнологических приемов в соответствии с частными характеристиками культуры. После накопления спор проводят их смыв с поверхности плотных питательных сред с использованием традиционных микробиологических методов, применяемых для получения суспензии спор в водных растворах [Практикум по микробиологии. (Под ред. Нетрусова А.И.). // М.: Издат. Академия, 2005, 608 с.]. Культивирование спор, включенных в полимерную матрицу, с целью наращивания мицелия внутри пор носителя и формирования биокатализатора проводят в аэробных условиях при температуре, оптимальной для культивирования соответствующей культуры микроскопического гриба. Длительность культивирования предопределяется вышеуказанными предельными концентрациями накапливающейся в гранулах мицелиальной биомассы. Накопление мицелиальной биомассы контролируют по увеличению содержания сухих веществ в составе биокатализатора стандартным методом доведения образца до постоянной массы.

В отличие от прототипа заявляемому биокатализатору может быть придана любая удобная форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, листов и др. Для этого суспензию спор в растворе полимера либо замораживают в соответствующей форме, либо используют предназначенное для этих целей оборудование (экструдеры, грануляторы и.т.п.). Возможность варьирования формы биокатализатора технически и технологически упрощает его практическое применение и масштабирование.

Получение этанола с помощью заявляемого биокатализатора проводят стандартным путем, а именно - в результате культивирования иммобилизованных клеток в анаэробных условиях в реакторах с жидкими питательными средами, содержащими пентозы. Контроль потребления сахаров и накопления этанола в среде осуществляют известными методами (хроматографическими и спектрофотометрическими) с привлечением стандартного аналитического оборудования.

Заявляемый биокатализатор для получения этанола из пентоз, представляющий собой мицелий микроскопического гриба, способного продуцировать этанол их пентоз, включенный в матрицу криогеля поливинилового спирта, при заявляемом соотношении компонентов является новым и обеспечивает получение технического результата, состоящего в повышении продуктивности процесса получения этанола из пентоз (повышении скорости конверсии пентоз в этанол) и повышении выхода целевого продукта - этанола. Дополнительный технический результат состоит в том, что заявляемый биокатализатор обеспечивает высокую продуктивность процесса конверсии в течение длительного времени, что позволяет его использовать многократно.

На Фиг.1 представлена динамика накопления этанола в периодических процессах сбраживания пентоз при многократном применении заявляемого биокатализатора на основе клеток различных мицелиальных грибов в различных средах, содержащих пентозы:

( ) на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus terreus F-1025 для получения этанола из ксилозы

( ) на основе клеток мицелиального гриба Mucor circinelloides F-1262 для получения этанола из арабинозы

( ) на основе клеток мицелиального гриба Fuzarium oxisporum F-931 для получения этанола из пентоз, входящих в состав ферментативного гидролизата кукурузных стеблей.

Нижеприведенные примеры иллюстрируют возможность практического осуществления заявляемого технического решения.

Пример 1. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus terreus F-1025 для получения этанола из ксилозы

Для получения биокатализатора к 30 г 11%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 3 мл суспензии спор мицелиального гриба Aspergillus terreus F-1025 с концентрацией 5×10⁶ клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования с помощью криогрануляционной установки [Патент РФ № 2036095] сферических гранул диаметром 1,5±0,2 мм. Гранулы замораживают при -20°С, выдерживают их в замороженном состоянии 16 ч, затем оттаивают при 8°С. Полученные гранулы криогеля поливинилового спирта (33 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (120 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), (NH ₄)₂SO₄ (3,0 г/л), MgSO₄ ×7H₂O (0,25 г/л), ZnSO₄×7H ₂O (0,25 г/л); NaCl (5,0 г/л), K₃HPO₄ (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 48 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 88,5 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 10,0; поливиниловый спирт - 3,7; вода - до 100.

Полученный биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 5,0), содержащей в качестве основного сбраживаемого субстрата ксилозу (45 г/л), а также соли MgSO₄×7H₂O (0,25 г/л); (NH₄)₂SO₄ (3,0 г/л); ZnSO ₄×7Н₂О (0,25 г/л); NaCl (5,0 г/л); K ₂HPO₄ (3,0 г/л). Процесс брожения проводят при 30°С без перемешивания. В течение 80 ч получено 20 г/л этанола, выход целевого продукта - 44,4% от внесенного субстрата, скорость сбраживания - 0,25 г/л/ч.

Пример 2. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Mucor circinelloides F-1262 для получения этанола из арабинозы

Для получения биокатализатора к 50 г 12%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба Mucor circinelloides F-1262 с концентрацией 1×10⁵ клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем разливают в 96-луночные иммунологические плашки с плоским дном (по 0,25 мл в лунку) для формирования гранул криогеля поливинилового спирта. Гранулы замораживают при -15°С, выдерживают их в замороженном состоянии 20 ч, затем оттаивают при 4°С. Полученные гранулы криогеля поливинилового спирта (55 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (100 г/л), дрожжевой экстракт (8 г/л), (NH ₄)₂SO₄ (3,5 г/л), MgSO₄ ×7Н₂О (0,2 г/л), ZnSO₄×7H ₂O (0,2 г/л); NaCl (3,0 г/л), K₂HPO₄ (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 30°С в течение 62 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 200 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 14,5; поливиниловый спирт - 3,0; вода - до 100.

Для получения спирта биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 5,0), содержащей арабинозу (45 г/л) в качестве основного сбраживаемого субстрата, а также соли MgSO₄×7H₂O (0,25 г/л); (NH₄)₂SO₄ (3,0 г/л); ZnSO ₄×7H₂O (0,25 г/л); NaCl (5,0 г/л), K ₂HPO₄ (3,0 г/л) и проводят процесс брожения при 28°С без перемешивания. В течение 46 ч получено 15,8 г/л этанола, выход целевого продукта - 35% от внесенного субстрата, скорость сбраживания - 0,34 г/л/ч.

Пример 3. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 для получения этанола из рибозы

Для получения биокатализатора к 10 г 12,5%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба Rhizopus oryzae F-814 с концентрацией 1×10⁶ клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем разливают в 96-луночные иммунологические плашки со сферическим дном (по 0,3 мл в лунку) для формирования гранул криогеля поливинилового спирта. Гранулы замораживают при -15°С, выдерживают их в замороженном состоянии 14 ч, затем оттаивают при комнатной температуре. Полученные гранулы криогеля поливинилового спирта (15 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 300 мл среды, содержащей глюкозу (100 г/л), дрожжевой экстракт (3 г/л), (NH ₄)₂SO₄ (3,0 г/л), MgSO₄ ×7H₂O (0,2 г/л), ZnSO₄×7H ₂O (0,2 г/л); NaCl (1,0 г/л), K₂HPO₄ (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 36 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 50 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 20,0; поливиниловый спирт - 2,5; вода - до 100.

Полученный биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 5,0), содержащей рибозу (45 г/л) в качестве основного сбраживаемого субстрата, а также соли MgSO₄×7H₂O (0,2 г/л); (NH ₄)₂SO₄ (2,5 г/л); ZnSO₄ ×7H₂O (0,2 г/л); NaCl (3,0 г/л); K₂ HPO₄ (3,0 г/л) и проводят процесс брожения при 28°С без перемешивания. В течение 63 ч получено 12,6 г/л этанола, выход целевого продукта - 28% от внесенного субстрата, скорость сбраживания - 0,20 г/л/ч.

Пример 4. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Fuzarium oxisporum F-931 для получения этанола из пентоз, входящих в состав ферментативного гидролизата кукурузных стеблей

Для получения биокатализатора к 100 г 10%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 1 мл суспензии спор мицелиального гриба Fuzarium oxisporum F-931 с концентрацией 1×10⁸ клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем выливают ровным слоем толщиной 0,3 см на противень, который помещают в морозильную камеру при -13°С, где выдерживают в замороженном состоянии 18 ч, оттаивание проводят при 4°С. Получают криогель поливинилового спирта в виде листового материала (100 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба, который с помощью шнекового экструдера и резака измельчают на гранулы произвольной формы с линейным размером не более 2,5 мм. Полученные гранулы помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей солодовое сусло (100 г/л), (NH ₄)₂SO₄ (3,0 г/л), MgSO₄ ×7Н₂О (0,25 г/л), ZnSO₄×7Н ₂О (0,1 г/л); NaCl (2,0 г/л), K₂HPO₄ (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 52 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 200 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 7,5; поливиниловый спирт - 5,0; вода - до 100.

Полученный биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 4,5), представляющей собой ферментативный гидролизат кукурузных стеблей, содержащий пентозы (ксилозу 7,9 г/л и арабинозу 0,1 г/л) и гексозы (глюкозу 2,4 г/л и галактозу 0,6 г/л), и проводят процесс брожения при 30°С без перемешивания. В течение 24 ч получено 5,5 г/л этанола из всех сахаров, присутствующих в среде, при этом выход целевого продукта из потребленных пентоз составляет 50%, скорость сбраживания - 0,23 г/л/ч.

Пример 5. Биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Aspergillus terreus F-2036 для получения этанола из пентоз, входящих в состав ферментативного гидролизата свекловичного жома

Для получения биокатализатора к 100 г 13%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 15 мл суспензии спор мицелиального гриба Aspergillus terreus F-2036 с концентрацией 2×10⁷ клеток/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем разливают в 96-луночные иммунологические плашки со сферическим дном (по 0,15 мл в лунку) для формирования гранул криогеля поливинилового спирта. Гранулы замораживают при -20°С, выдерживают их в замороженном состоянии 10 ч, затем оттаивают при 4°С. Полученные гранулы криогеля поливинилового спирта (115 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (120 г/л), дрожжевой экстракт (8 г/л), (NH₄)₂ SO₄ (3,0 г/л), MgSO₄×7H₂ O (0,25 г/л), ZnSO₄×7H₂O (0,25 г/л); NaCl (2,0 г/л), K₂HPO₄ (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 30°С в течение 32 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Сформированный таким образом биокатализатор общей массой 320 г имеет следующий состав (мас.%): биомасса мицелия - 12,8; поливиниловый спирт - 4,1; вода - до 100.

Полученный биокатализатор помещают в анаэробный реактор периодического действия (1 л), заполненный средой (рН 4,65), представляющей собой ферментативный гидролизат неосветвленных волокон свекловичного жома, содержащий пентозы (арабинозу 10,4 г/л и ксилозу 0,2 г/л) и гексозы (глюкозу 13,0 г/л и фруктозу 2,2 г/л), и проводят процесс брожения при 28°С без перемешивания. В течение 42 ч получено 12,2 г/л этанола из всех сахаров, присутствующих в среде, при этом выход целевого продукта из потребленных пентоз составляет 43,4%, скорость сбраживания - 0,29 г/л/ч.

Пример 6. Пример многократного использования заявляемого биокатализатора для получения этанола из пентоз в периодическом процессе.

При многократном использовании заявляемого биокатализатора в периодическом процессе после завершения одного цикла, осуществленного в условиях, описанных в соответствующих Примерах, содержащую целевой продукт культуральную жидкость сливают через установленный в реакторе сетчатый фильтр, после чего в реактор добавляют новую порцию субстратсодержащего раствора и проводят следующий цикл в аналогичных условиях.

На чертеже представлена зависимость конечной концентрации этанола, накапливающегося в среде к концу каждого рабочего цикла, осуществленного, как описано в Примерах 1 ( ), 2 ( ) и 4 ( ), при многократном использовании биокатализатора в периодическом процессе сбраживания пентоз. Представленные данные подтверждают возможность многократного использования заявляемого биокатализатора для получения этанола из пентоз в периодическом процессе, а также позволяют определить период полуинактивации биокатализаторов, приведенных в Примерах 1, 2 и 4, который составляет соответственно 869 ч, 810 ч и 405 ч.

Приведенные примеры показывают, что заявляемый биокатализатор может быть использован для получения этанола как однократно, так и многократно в периодических процессах для сбраживания различных пентоз (ксилозы, арабинозы, рибозы), взятых по отдельности или в смесях с другими сахарами, при этом он обеспечивает увеличение скорости конверсии до 0,34 г/л/ч и выхода целевого продукта до 50% от внесенного субстрата.

Таким образом, предлагаемое техническое решение может быть использовано для повышения эффективности биотехнологического получения этанола из целлюлозосодержащего сырья.