способ выявления микроорганизмов рода pasteurella и/или pseudomonas aeruginosa

Формула изобретения

Способ выявления микроорганизмов рода Pasteurella и/или Pseudomonas aeruginosa, включающий отбор биоматериала из внутренних органов, исследование на наличие геномной ДНК микроорганизмов группы Pasteurella и Pseudomonas aeruginosa в полимеразной цепной реакции, одновременно с двумя парами праймеров, отличающийся тем, что для выявления наличия в биологическом материале микроорганизмов рода Pasteurella используют олигонуклеотидные праймеры, комплементарные области гена 16 S рибосомальной РНК микроорганизмов рода Pasteurella, имеющие следующий нуклеотидный состав: 5'-TGCCATAAGATGAGCCCAAGT-3', 5'-GCCCTTTACGCCCAGTTA-3', a для определения наличия в биологическом материале Pseudomonas aeruginosa используют синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные области гена «putative protein» Pseudomonas aeruginosa, имеющие следующий нуклеотидный состав: 5'-GCTATCCCCCTGGTTCCATT-3' 5'-GACATCTCCATAGGGACCGC-3, продукты ПЦР разделяют методом горизонтального электрофореза в 2% агарозе, результаты ПЦР учитывают визуализируя окрашенный бромистым этидием ПЦР-продукт в ультрафиолетовом свете; при наличии в исследуемом биоматериале геномной ДНК микроорганизмов рода Pasteurella образуется ампликон размерами 360 п.н. а при наличии геномной ДНК Pseudomonas aeruginosa 283 п.н.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к способам определения геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) микроорганизмов.

Микроорганизмы рода Pasteurella, например Pasteurella multocida, Pasteurella galisepticum, Pasteurella haemolyticum, нередко локализуются в респираторной системе сельскохозяйственной птицы и животных. Возникновение псевдомоноза, вызванного Pseudomonas aeruginosa, также часто сопровождается патологией респираторной системы, поэтому, с одной стороны, существует потребность в дифференциальной диагностике пастереллеза и псевдомоноза, с другой стороны, необходим контроль носительства этих инфекций путем исследования проб биоматериала из респираторной системы. Таким образом, актуальна разработка более доступных достаточно точных методов молекулярной диагностики.

Известен способ обнаружения ДНК Pseudomonas aeruginosa с помощью полимеразной цепной реакции (Theodore Spilker, Tom Coenye, Peter Vandamme, and John J. LiPuma PCR-Based Assay for Differentiation of Pseudomonas aeruginosa from Other Pseudomonas Species Recovered from Cystic Fibrosis Patients / Journal of Clinical Microbiology, May 2004, p.2074-2079, Vol.42, No.5). Для проведения реакции используют праймеры PA-SS-F GGGGGATCTTCGGACCTCA, PA-SS-R TCCTTAGAGTGCCCACCCG, программа амплификации состоит из следующих этапов: 95°С - 40 сек; 58°С - 40 сек, 72°С - 40 сек (30 циклов).

Однако данный способ не позволяет одновременно выявлять геномную ДНК пастерелл, а также заявлен авторами как способ прямой детекции Pseudomonas aeruginosa у людей больных фиброзным циститом. Таким образом, данный способ не адаптирован для исследования организма птиц.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому и взятый за прототип является способ, основанный на мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). (Henrik Christensen, Magne Bisgaard, Jesper Larsen, and John Elmerdahl Olsen PCR-Detection of Hemophilus paragallinarum, Hemophilus somnus, Mannheimia (Pasteurella) hemolytica, Mannheimia spp., Pasteurella trehalosi, and Pasteurella multocida / Metods in molecular biology. PCR detection of microbial pathogens. Vol.216 p.259-273). В данном способе существует возможность одновременной детекции геномной ДНК нескольких видов микроорганизмов. Недостаток данного способа заключается в невозможности определения геномной ДНК P.aeruginosa одновременно с детекцией микроорганизмов рода Pasteurella.

Технической задачей заявляемого решения является одновременное выявление микроорганизмов рода Pasteurella и Pseudomonas aeruginosa с использованием олигонуклеотидных праймеров, позволяющих проводить ПЦР в дуплексном режиме.

Поставленная техническая задача решается тем, что в способе выявления микроорганизмов рода Pasteurella и/или Pseudomonas aeruginosa, включающем отбор биоматериала из внутренних органов, исследование на наличие геномной ДНК микроорганизмов рода Pasteurella и Pseudomonas aeruginosa в полимеразной цепной реакции с использованием двух пар праймеров, согласно изобретению, для выявления наличия в биологическом материале микроорганизмов рода Pasteurella используют олигонуклеотидные праймеры, комплементарные области гена 16 S рибосомальной РНК микроорганизмов рода Pasteurella, имеющие следующий нуклеотидный состав: 5'-TGCCATAAGATGAGCCCAAGT-3', 5'-GCCCTTTACGCCCAGTTA-3', а для определения наличия в биологическом материале Pseudomonas aeruginosa используют синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные области гена «putative protein» Pseudomonas aeruginosa, имеющие следующий нуклеотидный состав: 5'-GCTATCCCCCTGGTTCCATT-3' и 5'-GACATCTCCATAGGGACCGC-3, продукты ПЦР разделяют методом горизонтального электрофореза в 2% агарозе, результаты ПЦР учитывают визуализируя окрашенный бромистым этидием ПЦР-продукт в ультрафиолетовом свете; при наличии в исследуемом биоматериале геномной ДНК микроорганизмов рода Pasteurella образуется ампликон размерами 360 п.н., а при наличии геномной ДНК Pseudomonas aeruginosa 283 п.н.

Способ осуществляют следующим образом.

Материал: пробы патологического материала сельскохозяйственных животных или птицы.

Отбор материала: пробы внутренних органов (например, печени) отбирают любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом.

Традиционным способом производят выделение ДНК.

Для постановки ПЦР реакцию проводят по следующему температурному режиму (табл.1):

Таблица 1
этап	температура, °С	число циклов	время, мин
1	2	3	4
1	95	1	пауза
2	95	1	3
3	95	40	0,5
63	40	0.5
72	40	0,5

В реакции используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями:

5'-TGCCATAAGATGAGCCCAAGT-3',

5'-GCCCTTTACGCCCAGTTA-3'

5'-GCTATCCCCCTGGTTCCATT-3'

5'-GACATCTCCATAGGGACCGC-3.

Продукты ПЦР разделяют методом горизонтального электрофореза в 2% агарозе. Результаты ПЦР учитывают, визуализируя окрашенный бромистым этидием ПНР-продукт (ампликон) в ультрафиолетовом свете. В случае положительной реакции на Р. aeruginosa в электрофорезе появляется фрагмент ДНК размером 283 п.н., а в случае положительной реакции на микроорганизмы рода Pasteurella размер ампликона 360 п.н.

Для иллюстрации способа приведены примеры.

Пример 1. Для исследования отбирали материал от 10 голов птицы, павшей с признаками пневмонии (легкие).

Геномную ДНК выделяли стандартным силико-сорбционным методом.

ПЦР проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис-HCl (pH 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl₂; 0,01% Твин 20; 0,2 mM дНТФ; 0,5 mкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 5'-TGCCATAAGATGAGCCCAAGT-3', 5'-GCCCTTTACGCCCAGTTA-3', 5'- GCTATCCCCCTGGTTCCATT-3, 5'-GACATCTCCATAGGGACCGC-3. 1ED Taq-полимеразы и 5 мкл исследуемой пробы. Помимо проб ставили реакции с заведомо положительным и отрицательным контролями.

Поиск праймеров осуществляли с использованием программ «Vektor NTI Suit», «Pimer premier 5.0». Специфичность взаимодействия моделируют с использованием программы «Blast» на основе нуклеотидных последовательностей различных видов микроорганизмов, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html). Для исключения конкурентного ингибирования реакции праймерами и ампликонами дополнительно уделяли внимание подбору праймеров не образующих гетеродуплексы, имеющих близкие температуры отжига и формирующие ампликоны, различающиеся в длине, не менее чем на 20 п.н. и не более чем на 100 п.н.

Реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» с начальной денатурацией при 95°С 1 мин, далее в течение 45 циклов с денатурацией при 95°С 30 сек, отжигом при температуре 63°С в течение 30 сек и синтезом при 72°С 30 сек.

Продукты ПНР разделяли методом горизонтального электрофореза в 2% агарозе. Результаты ПЦР учитывали, визуализируя окрашенный бромистым этидием ПЦР-продукт (ампликон) в ультрафиолетовом свете. А в пробах был обнаружен фрагмент ДНК размером 283 п.н., что позволило установить факт инфицирования цыплят Р. aeruginosa.

Пример 2. С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, данную реакцию ставили с геномной ДНК различных микроорганизмов и вирусов, которые могут присутствовать в организме птицы (табл.2).

Таблица 2
№ пробы	Проба ДНК	Результат ПЦР
Наличие ампликона длинной 283 пн	Наличие ампликона длинной 360 пн
1.	2.	3.	4.
1	P. aerugenosa полевой изолят	+	-
2	Р. vulgaris полевой изолят	-	-
3	Р. vulgaris полевой изолят	-	-
4	Положительный контроль Р. aerugenosa из набора «биоком»	+
5	Биоматериал птицы	-	-
6	Биоматериал птицы	-	-
7	Е. coli ATCC 25922	-	-
8	Геномная ДНК птицы	-	-
9	Геномная ДНК птицы	-	-
10	Геномная ДНК птицы	-	-
11	Listeria monocitogenes	-	-
12	Геномная ДНК птицы	-	-
13	lersinia	-	-
14	Е. coli	-	-
15	Seratia marcescens	-	-
16	S. aureus	-	-
17	Pasteurella	-	+
18	Смесь микроорганизмов Pasteurella multocida и Р. aerugenosa	+	+
19	Отрицательный контроль (ТЕ буфер)	-	-

Таким образом, в приведенном примере видна достаточная специфичность предложенной нами реакции.

Пример 3. Для оценки чувствительности метода была проведена серия десятикратных разведений бактериальных суспензий Р aeruginosa и Р. multocida с исходной концентрацией 1*10 ⁶ КОЕ/мл. После этого с каждым разведением была поставлена ПЦР с использованием заявляемого способа и ПЦР приведенных в качестве аналога и прототипа (табл.3).

Таблица 3.
Концентрация Pasteurella multocida в пробе, КОЕ/мл	Концентрация Pseudomonas aeruginosa в пробе, КОЕ/мл	Наличие Р. multocida по результатам ПЦР заявлемого в нашем способе	Наличие Р. aeruginosa по результатам ПЦР заявлемого в нашем способе
1	2	3	4
1000	1000	Положительно	Положительно
100	100	Положительно	Положительно
10	10	Положительно	Положительно
1	1	Отрицательно	Отрицательно
0	0	Отрицательно	Отрицательно

Пример 4. Использование заявляемого способа для контроля динамики инфицированности микроорганизмами рода Pasteurella у птицы различного возраста показало, что в неблагополучных стадах 20%-ный уровень инфицированности достигается уже к 10 дневному возрасту. Однако проявление клинических признаков заболевания обнаруживается к 50 дню у несушки и к 40 дню у цыплят бройлеров. Как показывают наши исследования, при пастереллезах отмечается ярко выраженная возрастная манифестация болезни, т.е. молодняк не заболевает при заражении пастереллезом. Исследование инфицированности пастереллами клинически здоровой птицы показало, что инфицированность сохраняется в пределах 10% с 10 по 50 день.

Таким образом, заявляемый способ позволяет более точно и в более ранние сроки оценивать инфицированность сельскохозяйственной птицы и животных микроорганизмами группы Pasteurella и P.aeruginosa.