способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита

Формула изобретения

Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита, заключающийся во введении препарата, отличающийся тем, что в качестве препарата используют гиалуронидазу, которую вводят внутрибрюшинно в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в день в течение 2 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается способа лечения гепатита.

Заболевания печени и желчевыводящих путей являются весьма распространенными во всем мире и занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость данной патологии печени определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов фармакологической терапии и профилактики данных заболеваний.

Для лечения гепатитов используется большое количество медикаментозных и немедикаментозных способов [1, 2].

Известен способ терапии гепатита с помощью препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), основанный на активации механизмов компенсации «глубокого» резерва, связанных со стволовыми клетками [3]. Данный способ был выбран в качестве прототипа.

Однако использование данного препарата в эффективных дозах и по оптимальным схемам ограниченно вследствие достаточно высокой токсичности указанного средства [4]. Кроме того, при его применении не исключена возможность истощения «глубокого» резерва СК, определяемого их популяцией в «тканях-депо», в первую очередь в гемопоэтической ткани.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является расширение арсенала эффективных лекарственных средств для терапии хронического токсического гепатита.

Поставленная задача достигается техническим решением, заключающимся во внутрибрюшинном введении лабораторным животным препарата гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сут, в течение 2 дней.

Новым в данном изобретении является использование препарата гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сут, в течение 2 дней.

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников организма открыли возможность развития новой стратегии лечения многих заболеваний - с помощью стволовых клеток. При этом, согласно имеющимся представлениям, не вызывает сомнения возможность активации собственных стволовых клеток (СК) с помощью различных биологически активных веществ [5, 6]. При этом замещение погибших и быстрое увеличение числа зрелых, способных активно функционировать гепатоцитов является основной практической задачей терапии хронических гепатитов.

Известна способность гиалуронидазы модифицировать функции эндогенных СК и увеличивать их резерв в организме, не влияя на способность мигрировать из «тканей-депо» [7]. Указанные эффекты связаны с изменением свойств межклеточного матрикса в результате гидролизного расщепления гиалуроновой кислоты, низко- и среднемолекулярные формы которой обладают выраженной стимулирующей активностью в отношении клеточного деления [7]. Вместе с тем возможность повышения реализации ростового потенциала СК, сопровождаемого гепатопротекторным эффектом, с помощью гиалуронидазы при токсическом поражении печени, на сегодняшний день не известна.

Факт применения препарата гиалуронидазы при хроническом токсическом гепатите с достижением нового результата: создание эффективного способа терапии хронического токсического гепатита, для специалиста является не очевидным.

Используемый в предлагаемом изобретении препарат позволяет активировать механизмы «глубокого резерва» и обеспечить восстановление структуры печени путем стимуляции эндогенных паренхиматозных прогениторных клеток печеночной ткани.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют осуществлять эффективную терапию экспериментального хронического токсического поражения печени, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Лабораторному животному после окончания моделирования хронического токсического поражения печени в течение 2 дней 1 раз в день внутрибрюшинно вводят 1000 УЕ/кг препарата гиалуронидазы.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на беспородных крысах в количестве 46 штук, массой 250-300 г, и 42 мышах линии CBA/CaLac. Мыши 1 категории, все животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). У крыс гепатит моделировался внутрижелудочным введением 50% раствора CCl₄ (представляющем собой «классический» гепатотропный яд) на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз). У мышей поражение печени вызывали внутрижелудочным введением тетрахлоруглерода (ТХУ) в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь живого веса по той же схеме. Для оценки состояния печени у крыс оценивали их гибель, прирост массы тела, весовой коэффициент печени на 21-е и 40-е сут (отношение массы органа в мг к массе животного в г). Проводили биохимические исследования содержания в сыворотки крови аспартат-, аланин-аминотрасфераз (АсАТ, АлАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) на 7, 14, 21, 28 и 40-е сут, а так же морфологическое исследование печени на 21-е и 40-е сут [8]. Активность ферментов сыворотки крови определяли по общепринятым методам, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Cormay и стандартные наборы фирм Cormay и «Витал Диагностик» (г.Санкт-Петербург). Кровь для исследования получали через катетер, имплантированный в бедренную артерию с последующей перевязкой сосудов. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Г.Г.Автандилова [9], содержащей 25 тест-точек. В 20 полях зрения подсчитывали количество клеток инфильтрата, попадающих на тест-точки сетки. Относительную площадь инфильтрации высчитывали как отношение точек сетки, приходящихся на клетки инфильтрата, ко всем точкам сетки в 20 полях зрения (т.е. к 500 точкам). Площадь соединительной ткани определяли с помощью средств компьютерной обработки графических данных. Для этого на стандартной площади среза печени (последовательные микрофотографии 10 полей зрения, выполненные микровидеокамерой "Digital micro", с программой передачи изображения на компьютер фирмы «Элекард», Томск) измеряли площадь структур, окрашенных пикрофуксином, и вычисляли процентное отношение к выбранной стандартной площади. Для исследования участия стволовых клеток в процессах восстановления печени у мышей на 3, 7, 10, 14-е сут после последнего введения тетрахлоруглерода (ТХУ) методом клонирования печеночной ткани в культуральной среде (90% DMEM ("Sigma", США), 10% неинактивированной ЭТС ("HyClone", США), 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 8000 МЕ/л гепарина ("Biochemie", Австрия), 25 мг/л свиного многокомпонентного инсулина ("Novo Nordisk", Дания) и 10 нг/мл фактора стволовой клетки (SCF) ("Sigma", США)) определяли количество регионарных паренхиматозных клеток-предшественников в печени. Материал инкубировали в течение 10 суток в CO₂ инкубаторе («Jouan», Франция) при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха. После инкубации под инвертированным микроскопом подсчитывали число колоний. Под колонией подразумевали круглое либо неправильной формы образование, содержащее более 30 клеток. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

У крыс гепатит моделировался внутрижелудочным введением 50% раствора CCl₄ на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз). У мышей поражение печени вызывали внутрижелудочным введением тетрахлоруглерода (ТХУ) в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь живого веса по той же схеме. Животным экспериментальной группы сразу после моделирования хронического токсического гепатита (на 19-е сут эксперимента) внутрибрюшинно 1 раз в день в течение 2 дней вводили 1000 УЕ/кг препарата гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ), растворенной в 0,5 мл физиологического раствора. Животным, получавшим лечение по способу-прототипу, подкожно 1 раз в день в течение 5 дней вводили 100 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (НИКТИ БАВ «Вектор», Новосибирск), растворенного в 0,5 мл растворителя. Животным контрольной группы в аналогичном режиме вводили физиологический раствор по 0,5 мл. Проведенные эксперименты показали, что гибель крыс во всех группах началась одновременно - после 3-го введения CCl₄ и к концу эксперимента в контрольной группе составила 21,2%, 15,1% - при назначении Г-КСФ и 14,8% при введении гиалуронидазы. На вскрытии у погибших животных печень была увеличена в размере, желтого цвета, глинистой консистенции с очагами кровоизлияний и макроскопическими признаками острой дистрофии печени. При этом при применении Г-КСФ и гиалуронидазы процент прироста массы тела крыс был достоверно выше, чем в контроле (табл.1). В то же время межгрупповых различий в весовом индексе печени не наблюдалось. Результаты биохимических исследований сыворотки крови показали повышение активности АлАТ, Ac AT и ЩФ на 7, 14, 21, 40-е сут опыта после начала введения ТХУ в контрольной группе. В то время как у крыс, получавших Г-КСФ и гиалуронидазу, концентрация данных ферментов в сыворотке крови на 28-е и 40-е сут опыта была достоверно ниже, чем у животных, которым вводили растворитель, и достигала уровеня фоновых значений (табл.2). При гистологическом исследовании печени крыс в контрольной группе отмечалось выраженное нарушение долькового строения печени: поля грануляционной ткани, новообразование сосудов и печеночных протоков, тельца Каунсильмена, выраженная крупнокапельная жировая дистрофия, жировые кисты (табл.3). Введение Г-КСФ и гиалуронидазы при моделировании CCl₄-гепатита сохраняло дольковое строение печени. При этом тельца Каунсильмена встречались лишь в единичных случаях, а жировая дистрофия гепатоцитов была преимущественно мелкокапельная. В то же время отмечалась, хотя и менее значительная, но все же существенная инфильтрация портальных трактов. Хотя инфильтрат, как правило, не проникал внутрь долек. В целом, при введении препаратов относительная площадь инфильтрации была достоверно ниже, чем в контрольной группе (более чем в два раза). Кроме того, препараты Г-КСФ и гиалуронидазы практически в 3 раза уменьшали площадь соединительной ткани (см. табл.3). Таким образом, биохимическое и морфологическое исследования состояния печени у крыс, получавших гиалуронидазу, на фоне моделирования хронического токсического гепатита выявило выраженную гепатопротекторную активность (противовоспалительное и антисклеротическое действие) данного препарата, сравнимую с таковой у Г-КСФ.

Дальнейшим этапом исследований с целью изучения механизмов гепатопротекторного действия препаратов в экспериментах на мышах было изучение влияния препарата на состояние пула регионарных паренхиматозных стволовых клеток в печени. Изучение содержания регионарных клеток-предшественников в печени при моделировании гепатита выявило значительное снижение их числа (см. табл.4), свидетельствующем о недостаточности и/или несостоятельности собственного регенераторного потенциала печени, в том числе ее прогениторных элементов при воздействии CCl₄. При этом введение препаратов приводило к существенному увеличению содержания регионарных клеток-предшественников в печеночной ткани (на 10-е и 14-е сут под влиянием Г-КСФ и на 3, 7, 10 и 14-е сут при введении гиалуронидазы) (см. табл.4).

В целом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что гиалуронидаза оказывает выраженный гепатопротекторный эффект при хроническом токсическом гепатите. Причем влияние данного фермента сопоставимо с гепатопротекторным эффектом Г-КСФ, механизмом действия которого является стимуляция и мобилизация СК костного мозга с их дальнейшим хомингом в печень [3]. Учитывая тот факт, что гиалуронидаза не способна вызывать мобилизацию СК из их «тканей-депо» [7], представляется очевидной зависимость фармакологического действия данного препарата от повышения реализации ростового потенциала эндогенных регионарных паренхиматозных СК печеной ткани, что позволяет предотвратить возможное истощение пула СК «глубокого резерва», которое может иметь место при использовании веществ, мобилизующих СК из «тканей-депо».

Предлагаемый способ позволяет проводить эффективную терапию хронического токсического гепатита, достигать быстрого восстановления функционально активной печеночной ткани путем стимуляции собственного регенераторного потенциала печени, определяемого резидентными паренхиматозными стволовыми клетками.

Цитируемая литература

1. Венгеровский А.И. Эффективность и механизм действия гепатопротекторов при экспериментальном токсическом повреждении печени: Дисс доктора мед. наук. - Томск, 1991. - С.4-57.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.1. - М: Медицина, 1996. - 624 с.

3. Патент (RU) на изобретение № 2295971 «Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита», 2007 г. (опубл. 27.03.2007 г., Бюл. № 9). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др.

4. de Wit R., Verweij J., Bontenbal M. et al. Adverse effect on bone marrow protection of prechemotherapy granulocyte colony-stimulating factor support // J. Natl. Cancer Inst. - 1996. - Vol.88. - № 19. - P.1393-1398.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.

6. Haas R., Murea S. The role of granulocyte colony-stimulating factor in mobilization and transplantation of peripheral blood progenitor and stem cells // Mol. Ther. - 1996.- V.2. - N.1. - P.136.

7. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов B.B., Симанина Е.В., Гурьянцева Л.А. Роль гиалуронидазы в регуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 2. - С.115-119.

8. Holtzer Н. Cell lineages, stem cells and the quantal cell cycle concept. / Stem cells and tissue homeostasis. Eds: B.I.Lord, C.S.Poten, R.J.Cole. - New York, Cambrige Unyversity Press, 1978. - P.1-28.

9. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия.- M.: Медицина, 1990. - 382 с.

Таблица 2
Биохимические показатели крови крыс-самцов после введения препаратов, X±m
Показатели, сроки опыта (сутки)	H2O (контроль)	Г-КСФ	Гиалуронидаза
АлАТ, мккат/л	7-е	2,78±0,09*	2,67±0,07*	2,65±0,06
14-е	2,8±0,07*	2,51±0,04*	2,56±0,03*
21-е	1,22±0,07*	0,96±0,09	0,87±0,08*
28-е	0,45±0,02*	0,37±0,01*#	0,39±0,01*
40-е	0,72±0,02*	0,54±0,03#	0,55±0,02#
АсАТ, мккат/л	7-е	3,10±0,35*	3,30±0,1*	3,27±0,2*
14-е	2,43±0,09*	2,51±0,06*	2,5±0,05*
21-е	0,71±0,08	0,74±0,02*	0,69±0,02*
28-е	0,40±0,01*	0,33±0,01*#	0,32±0,01*#
40-е	0,71±0,03*	0,60±0,01#	0,61±0,01 #
ЩФ, Ед./л	7-е	947,4±97,7*	907,0±39,2*	924,5±41,6*
14-е	1283,1±172,6*	1214,9±33,0*	1212,4±45,0*
21-е	1262,4±137,3*	1374,4±39,3*	1297,6±39,8*
28-е	407,7±8,45*	315,9±18,2#	310,7±12,6#
40-е	554,2±65,3*	306,1±44,2#	309,7±9,0#
* - отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при p 0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений p 0,05.

Таблица 3
Влияние препаратов на морфологию печени крыс с хроническим CCl 4-гепатитом
Сроки исследования	Относительная площадь инфильтрата (%)	Относительная площадь соед. ткани (%)
21 сутки	40 сутки	21 сутки	40 сутки
H2O (контроль)	27,48±4,67*	25,40±1,2*	6,43±1,22*	5,75±0,42*
Г-КСФ	10,0±1,16*#	11,66±0,7*#	1,89±0,32*#	1,44±0,17*#
Гиалуронидаза	8,7±0,97*#	13,4±1,2*#	1,56±0,29*#	1,12±0,09*#
* - отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при p 0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений при p 0,05.

Таблица 4
Содержание паренхиматозных стволовых клеток в печеночной ткани (КОЕ-Печ) (на 105 нуклеаров), X±m
Показатели, сроки опыта (сутки)	H2O (контроль)	Г-КСФ	Гиалуронидаза
КОЕ-Печ	фон	55,6±3,85
3-е	67,8±6,39	54,2±3,99	69,1±2,14*#
7-е	58,25±4,05	48,0±3,58	75,9±3,8*#
10-е	40,8±1,02*	93,4±3,78*#	99,4±4,1*#
14-е	102,0±5,46*	134,0±2,4*#	121,7±1,9*#
* - отмечена достоверность различия показателя от фоновых значений при p 0,05;
# - отмечена достоверность различия показателя от контрольных значений p 0,05.