штамм streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini вкпм s-1084 - продуцент апрамицина и способ получения апрамицина

Формула изобретения

1. Штамм Streptomyces cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 - продуцент апрамицина.

2. Способ получения ампрамицина, предусматривающий культивирование штамма Streptomyces cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084, выделение ампрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н. аммиака, концентрацию в вакууме и осаждение в форме сульфата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается нового штамма-продуцента антибактериального антибиотика апрамицина из группы аминогликозидов и способа получения апрамицина сульфата.

Особое значение аминогликозидов в современной антибиотикотерапии бактериальных инфекций обусловлено их высокой активностью в отношении грамотрицательных микроорганизмов, удельный вес которых в этиологии гнойно-септических процессов постоянно возрастает

Известен штамм Streptoalloteichus cremeus var. tobramycini var. nov. 2242 - продуцент аминогликозидных антибиотиков небрамицинового комплекса [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания апрамицина в культуральной жидкости (не более 0,8 г апрамицина в 1 л культуральной жидкости), где он образуется наряду с другими антибиотиками аминогликозидного комплекса - карбамоилтобрамицином, карбамоилканамицином В в соотношении 2:1:1, соответственно.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент апрамицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия ультрафиолетовых лучей и нитрозометилбиурета на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и апрамицин в качестве селективных агентов.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКМП S-1084.

Штамм 1084 обладает повышенной продуктивностью - (4 г в 1 л культуральной жидкости) апрамицина, синтезирует антибиотик в виде монокомпонента и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма 1084. Температура (20-37)°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культурой штамма, выращенной на глицерин-нитратной агаровой среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (см.таблицу).

Культурально-морфологические признаки штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084
Агаровая среда	Рост воздушного мицелия*	Цвет мицелия	Растворимый пигмент
воздушного	субстратного
№ 1 Гаузе	+	Беловато-кремовый (К-2; К-3, Соо 6а)	Бесцветный	Нет
Овсяная	+	Беловатый (К-2, Coo 7а)	Бесцветный	Нет
Чапека	+	Беловатый (Д-1; Coo 7а)	Бесцветный	Нет
Глюкозо-аспарагиновая	-		Желтоватый (Г-5; Coo 4а)	Желтоватый (Ж-6)
Линденбайна (глицерин-нитратная)	+++	Беловато-кремовый (Д-1; Coo 7а)	Буроватый (б-4; Coo 4а)	Буроватый (б-4; Coo 4а)
Глюкозо-нитратная № 2 Гаузе	+++	Белый (Д-1; СОО 7а) до светло-кремового (б-б; Coo 5а)	Буроватый (б-4; Coo 4а)	Буроватый (б-4; Coo 4а)
Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом)	Меланоидные пигменты не образует
*/ (+++) - хороший; (++) - умеренный; (+) - слабый.

Морфологические признаки. Цепочки спор спиральные, спирали растянутые, с 2-6 оборотами, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С и в диапазонах значений pH (5,0-10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует фруктозу и инозитол, умеренно рамнозу и глюкозу, слабо использует сахарозу и лактозу, не использует раффинозу, арабинозу, манит, ксилозу и целлюлозу.

Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре № 2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов. Штамм фагоустойчив. Фаг в культуре отсутствует.

Штамм 1084 поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini 1084 выращивают в течение 7 дней при 37°С на глицерин-нитратной агаровой Линденбайна следующего состава, %:

Глицерин	3,0
K 2HPO4	0,1
MgSO 4	0,05
KCl	0,05
FeSO 4	0.001
NaNO3	0,2
Агар	2,0
Вода	Водопроводная
pH до стерилизации	7,0-7,2

Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 1,0 атм и 120°С.

Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на среду следующего состава, %:

Соевая мука	3,0
Глюкоза	3,0
NaCl	0,5
CaCO 3	0,5
Вода	Водопроводная
pH до стерилизации	7,0-7,2

Посевной материал выращивают при 37°С в течение 48 час в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки 200-240 об/мин. Количество посевного материала для инокуляции 5-7%.

Ферментация проводится на качалке при 37°С на среде (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) следующего состава, %:

Соевая мука	1,0
Глюкоза	0,4
Крахмал	1,5
(NH4)2SO4	0,3
CaCO 3	0,3
Вода	Водопроводная
pH до стерилизации	6,6

Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633.

Содержание апрамицина в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации (через 144 часа) составляет 4000 мкг/мл.

Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является способность к биосинтезу апрамицина в виде монокомпонента и в 5 раз повышенная продуктивность антибиотика, а именно содержание апрамицина в культуральной жидкости штамма-прототипа 800 мкг/мл в составе комплекса аминогликозидов, а в заявленном штамме - 4000 мкг/мл.

С целью выделения апрамицина проводят его сорбцию из нативного раствора (обработанной щавелевой кислотой и отфильтрованной от мицелия культуральной жидкости) с pH 6,7-6,9 на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом. Десорбцию апрамицина проводят путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н аммиака. Элюат концентрируют в вакууме, добавляют (24,0-25,2)%-ный раствор серной кислоты до pH 6,0 и апрамицина сульфат осаждают добавлением избытка ацетона.

Апрамицина сульфат, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini 1084, представляет собой белый порошок (допускается коричневатый оттенок), хорошо растворим в воде и нерастворим в органических растворителях. По своим физико-химическим свойствам (данные ¹³С-ЯМР, значения Rf при тонкослойной хроматографии и электрофоретическая подвижность при электрофорезе на бумаге в электролитах в области pH (1,7-2,5), антибактериальной активности (650 мкг/мг) и токсичности (LD₅₀ составляет 220 мг/кг при внутривенном введении мышам) полученный апрамицина сульфат полностью соответствует апрамицину, описанному в литературе. Брутто-формула: C₂₁ H₄₁N₅O₁₁. H₂SO ₄. Мол. масса = 637,6 а.е.м. Мол. масса основания (метод MALDI-TOF-MS)=540 (МН)⁺. [ ]²⁰ _D+174 (с 1,0, H₂O); ¹³ C-ЯМР (ppm): 101.59, 96.43, 95.32, 87.74, 78.40, 76.80, 74.17, 73.42, 71.70, 70.99, 67.99, 66.18, 62.31, 61.63, 53.06, 51.08, 50.23, 49.74, 36,51, 32.82, 32.76.

Выход целевого продукта 73,0% от его содержания в культуральной жидкости.

Таким образом, создан новый мутантный штамм Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084, отличающийся от известного по способности антибиотикообразования монокомпонентного апрамицина, которая в 4 раза превосходит активность штамма-прототипа 2242-ЛБ.

Антибиотическая активность нового штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 составляет 4000 мкг/мл. Использование нового штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 как продуцента для биосинтеза апрамицина позволяет увеличить выход целевого продукта при выделении апрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухкомпонентным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н аммиака, концентрацией в вакууме и осаждением в форме сульфата.

ЛИТЕРАТУРА

1. Синягина О.П., Лапчинская О.А., Лаврова-Балашова М.Ф., Нестерова Т.П., Пономаренко В.И. Получение мутантов, образующих тобрамицин, в культуре продуцента комплекса аминогликозидных антибиотиков Streptomyces cremeus var. tobramycini var. nov. 2242. // Антибиотики, № 12, С.891-894 (1980).