способ получения биокатализатора для спиртового брожения

Формула изобретения

Способ получения биокатализатора для спиртового брожения, включающий приготовление водной суспензии дрожжей, добавление в нее альгината натрия, последующую обработку полученного технологического раствора сшивающим раствором хлористого кальция, отличающийся тем, что альгинат натрия предварительно выдерживают в водном растворе этилового спирта концентрацией 50-85 об.%, в полученную смесь добавляют экзополисахарид с молекулярной массой 0,5·10 ⁶-2·10⁷ Да, полученный из штамма бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 в массовом соотношении экзополисахарид:альгинат, равном 0,1-0,9:3,5-4,5, с последующим доведением pH смеси до значений 4,2-6,5.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе дрожжей для спиртового брожения для получения спирта, используемого, в частности, в качестве топлива.

Традиционным биокатализатором спиртового сбраживания солодового и виноградного сусла, виноматериалов, фруктовых, овощных и иных растительных соков, сахаро- и крахмалосодержащих материалов и т.д., с целью получения спиртосодержащих композиций, являются свободные дрожжевые клетки.

Необходимость в повышении технологичности процесса сбраживания потребовала разработки новых биокатализаторов, обеспечивающих, в частности, повышение длительности их использования в ферментационных процессах, упрощение стадии отделения биокатализатора от ферментационной среды, возможность регенерации и повторного использования отработанного биокатализатора, улучшение технологичности непрерывных процессов спиртового сбраживания.

Известен ряд запатентованных технических решений [например, JP 57150385, JP 60153794, JP 1067189, US 5079011, US 5334229, DE 3432923, FR 2320349, FR 2359202, FR 2601687, FR 2600673, FR 2586256, ЕР 388588, FR 2668081, ES 2192986], включающих в свой состав способы получения биокатализаторов спиртового брожения на основе дрожжей, частично решающих проблемы, возникающие при использовании свободных дрожжевых клеток при производстве вин, пива, шипучих напитков с различным содержанием алкоголя, а также шампанизации виноматериала.

Общим существенным признаком этих известных способов является иммобилизация методом включения свободных дрожжевых клеток матрицей гелевого носителя с образованием твердых, как правило, сферических частиц, причем отверждение исходного гелеобразующего материала (например, натриевых или калиевых солей альгиновой кислоты) осуществляют либо методом ионного обмена с использованием ионов двухвалентных или трехвалентных металлов (хлористые кальций, барий, стронций, алюминий), либо полимеризацией включенного в исходную дрожжевую суспензию мономера, например, акриламида, либо специфической обработкой исходной дрожжевой суспензии, включающей в свой состав полимер, например, поливиниловый спирт, с образованием, так называемых, криогелей.

Однако вышеприведенная технология получения биокатализаторов спиртового брожения предназначена для получения биокатализаторов для приготовления спиртосодержащих напитков, таких как вино, пиво, шампанское, шипучие напитки с различным содержанием алкоголя, и, согласно информации, приведенной в описаниях к вышеприведенным патентам, не может обеспечить получение высокоактивного, сохраняющего в течение длительного времени взаимодействия с ферментационной средой свои как биохимические, так и механические свойства, биокатализатора, предназначенного для промышленного получения этилового спирта.

Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является способ получения биокатализатора спиртового брожения, применяемый для получения этанола, описанный в патенте DE 3432923, характеризующийся следующей совокупность существенных признаков.

Свободные дрожжевые клетки суспендируют в физиологическом растворе и смешивают с предварительно приготовленным стерильным водным раствором альгината натрия. Полученную суспензию раствора альгината натрия с клетками дрожжей подают в виде капель в ванну с раствором хлористого кальция. При попадании капель в ванну в результате обмена ионов Na⁺ на ионы Са ⁺⁺ образуются 3-х мм гелеобразные гранулы (жемчужины). Возникшие через ионотропное образование гелевые гранулы выдерживают в растворе хлористого кальция при постоянном перемешивании в течение 30 минут, отсеивают и многократно промывают проточной водой. Затем промытые гранулы в течение 15 минут при постоянном перемешивании полощут в растворе альгината натрия. Благодаря диффузии ионов Са⁺⁺ из гелевых гранул в раствор альгината натрия вокруг гранул образуется достаточно толстая оболочка из Са-альгината. Гранулы вновь промывают проточной водой и погружают на 1 час в раствор хлористого кальция, после выдержки в растворе хлористого кальция гранулы вновь подвергают многократной промывке проточной водой. Полученные гранулы биокатализатора стерилизуют облучением в течение 5 минут 6 Вт - лампой УФ.

Недостатком описанного способа получения биокатализатора спиртового брожения является сложность его приготовления, обусловленного плохой растворимостью сухого альгината на стадии приготовления технологического раствора, сложности предотвращения агломерации частиц альгината.

В известном способе получают биокатализатор, частицы которого окружены «достаточно толстым слоем» геля Са-альгинат, дополнительно отвержденного ионами Са⁺⁺, не содержащего в своем составе иммобилизованных дрожжевых клеток. Данный слой обеспечивает более длительный срок эксплуатации катализатора, затрудняя выход дрожжевых клеток из матрицы гелевого носителя, но затрудняя тем самым массоперенос между жидкой фазой питательной среды и гелевой фазой катализатора, содержащей, собственно, сам активный биокомпонент - дрожжевые клетки, что существенно снижает активность биокатализатора в целом.

Кроме того, недостаток известного способа заключается в наличии энергоемкой стадии стерилизации растворов, требующей использования сложного технологического оборудования.

Задача изобретения состоит в упрощении технологии процесса, повышении срока службы биокатализатора при сохранении высокой активности.

Поставленная задача достигается описываемым способом получения биокатализатора для спиртового брожения, включающим приготовление водной суспензии дрожжей, добавление в нее альгината натрия, последующую обработку полученного технологического раствора сшивающим раствором хлористого кальция, в котором, согласно изобретению, альгинат натрия предварительно выдерживают в водном растворе этилового спирта концентрацией 50-85 об.%, в полученную смесь добавляют экзополисахарид с молекулярной массой 0,5×10⁶-2×10⁷ Да, полученный из штамма бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ И-8617 в массовом соотношении экзополисахарид: альгинат, равном 0,1-0,9:3,5-4,5, с последующим доведением pH смеси до значений 4,2-6,5.

Используемый экзополисахарид получают из штамма бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 (RU 2322493, 2008).

Штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 характеризуется следующими признаками. В активной фазе клетки Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 представляют собой толстые короткие палочки размером 1-1,5÷1,5-2,0 мкм. Бактериальные клетки образуют колонии опалового цвета. Существует необходимость в дополнительных факторах роста (дрожжевой экстракт и пантотеновая кислота), растет на средах, содержащих метанол. Штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 не патогенен для мышей.

Указанный штамм размножается при 20-29°С; хранится при +4°С на скошенном глюкозо-картофельном агаре или сусло-агаре. Среду стерилизуют при 0,75 атм и температуре 110°С. Частота пересевов - 1 раз в 4-5 месяцев.

Культурально-морфологические признаки штамма Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617.

Клетки бактерий грамотрицательные, неподвижные. В логарифмической фазе культура представляет собой толстые короткие палочки, в стационарной - коккоиды, расположенные парами, реже - в коротких цепочках. Спор не образуют. Размножение клеток осуществляется путем бинарного деления.

При росте на сусло-агаре или на скошенном глюкозо-картофельном агаре штамм образует выпуклые блестящие слизистые опаловые колонии правильной формы, 4-6 мм в диаметре. При росте на жидкой среде с этанолом, в качестве единственного источника углерода, образует высоковязкую тягучую суспензию светло-кремового цвета. При многократном рассеве на твердой богатой сахаросодержащей среде диссоциация штамма не была обнаружена. Стабильной является мукоидная форма бактериальных клеток, синтезирующая стабильный продукт со стабильных выходом. Колониально-морфологическая изменчивость - единообразие клеток.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Каталазоположительный, оксидазоотрицательный, кислотонеустойчивый. Имеется супероксидисмутаза, пероксидаза отсутствует. Температурный диапазон роста 10-42°С. Оптимальная температура роста 24-30°С, pH 5,5-8,0, оптимум pH 7,0. Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует. Молоко не сбраживает. Нитраты не восстанавливает, сероводород, индол и ацетоин не образует.

Штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 относится к микроорганизмам, не патогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных в Санитарных правилах СП 1.2.731-99.

Штамм культивируется в аэробных условиях. Оптимум pH 7,0. Растет на средах, содержащих углеводы. Использует неорганические и органические источники азота. Нуждается в дополнительных факторах роста.

Ниже приведен перечень компонентов питательной среды для культивирования Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 (мас.%).

KH2PO 4·3H2O	0,1-2
NaCl	0,05-1
NH4NO 3·2H2O	0,1-2
MgSO4·7H2O	0,01-1
FeSO4·7H2O	0,0001-0,01
CaCl2·2H2O	0,005-0,05
Пантотеновая кислота	0,0001-0,001
Дрожжевой экстракт	0,001-0,1
Глюкоза	0,5-5.

В качестве дополнительного источника углерода используют этанол в количестве от 0,5 до 2 об.% на 100 об.% питательной среды.

Возможно получение экзополисахарида с идентичными свойствами на альтернативной питательной среде, достоинством которой является ее дешевизна по сравнению с вышеуказанной.

Ниже приведен перечень компонентов альтернативной питательной среды для культивирования Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 (мас.%).

KH2PO 4·3H2O	0,1-2
NaCl	0,05-1
NH4NO 3·2H2O	0,01-0,5
MgSO4·7H2O	0,01-1
CaCl2·2H2O	0,005-0,1
Вода	до 100.

В качестве источников углерода и факторов роста использовались этанол в количестве 1,5 об.% и молочная сыворотка в количестве 30 об.%.

Культивирование Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 для получения экзополисахарида осуществляют в ферментаторе при температуре 28-40°С в условиях аэрации и перемешивания при концентрации растворенного кислорода 20-40%, pH среды - 7,0, в течение 24-48 часов. Продуктивность штамма в описанных выше условиях оптимальна и составляет по биомассе (5,5±0,8)×10⁸ клеток/мл, по количеству синтезируемого ЭПС - от 6 до 10 г/л.

Продуцируемый штаммом бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 экзополисахарид выделяли из культуральной жидкости и очищали нижеописанным способом. Культуральную жидкость, содержащую ЭПС, диализовали против дистиллированной воды в течение 5 дней. Затем разводили дистиллированной водой в 3 раза и отделяли клетки ультрацентрифугированием. Супернатант концентрировали в вакууме при небольшом подогреве до начального объема, после чего ЭПС осаждали добавлением изопропанола. Осадок ЭПС промывали чистым изопропиловым спиртом и высушивали при температуре 40°°С.

Выделенный описанным способом ЭПС представляет собой массу перепутанных коротких волокон (до 15 мм) от светло-желтого до белого цвета влажностью 10-12% и содержанием полисахарида 95-99%.

Экзополисахарид образован остатками глюкозы, галактозы, маннозы, рамнозы (соответственно 5:2:4:1), включает в свой состав глюкуроновую и пировиноградную кислоты, а также ацильные группы. Молекулярная масса экзополисахарида, определенная гель-фильтрацией на Sephadex G-200 (Швеция), лежит в 0,5×10⁶-2×10⁷ Д.

Экзополисахарид растворяется в воде и полярных органических растворителях, таких как диметилформамид и диметилсульфоксид, образуя высоковязкие истинные растворы. Водные растворы экзополисахарида обладают псевдопластичностью и тиксотропией. При увеличении концентрации водного раствора экзополисахарида до 0,1% резко возрастает его кинематическая вязкость.

ЭПС осаждается из водных растворов спиртами (например, метанолом, этанолом, изопропанолом) и кетонами, например ацетоном. Добавление в водный раствор ЭПС неорганических солей (CaCl₂) приводит к выделению или так называемому высаливанию ЭПС.

Характерным свойством экзополисахарида является его способность к структурированию не только водных, но и углеводородсодержащих систем. При смешении водных растворов ЭПС (0,2-0,7%) с нормальными углеводородами (С₆-С₁₂), например, при объемном соотношении соответственно 1:9 образуется стабильная, не расслаивающаяся во времени эмульсия, характеризующаяся псевдопластичностью и тиксотропией. Динамическая вязкость таких эмульсий при скорости сдвига 3 с^-1 составляет 2500-4000 мПа·с.

Существенным для использования в ряде областей производства свойством продуцируемого штаммом бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 полисахарида является независимость динамической вязкости (при малых скоростях сдвига) его водных растворов от температуры раствора вплоть до 90°С. Реологические свойства водных растворов практически не изменяются и при неоднократном предварительном их нагревании вплоть до 130°С с последующим охлаждением до исходной температуры (обычно 20°С).

Примечательными свойствами данного полисахарида являются также его пленкообразующие и волокнообразующие свойства.

Уникальные структурирующие свойства этого экзополисахарида, а также его химический состав, позволяют при его смешении с водным раствором альгината натрия предварительно сформировать такую структуру раствора полисахаридов (за счет высокой вязкости исходного раствора экзополисахарида при малой его концентрации) для формирования последующей структуры матрицы включения в результате ионотропного обмена с ионами отверждающего агента, которая обеспечивает отсутствие протекания процесса агломерации образующимся на поверхности отверждающего раствора частицам биокатализатора. Кроме того, при эксплуатации биокатализатора (ИГД) в процессе спиртового сбраживания физическая структура и химический состав отвержденной гелевой матрицы обеспечивают ей свойство в течение длительного времени удерживать в своем составе иммобилизованные ею свободные дрожжевые клетки, предотвращая их вымывание при взаимодействии с ферментационной средой, и облегчают при этом массоперенос между жидкой фазой питательной среды и гелеобразной фазой частиц биокатализатора.

Кроме того, важным является свойство экзополисахарида, заключающееся в увеличении вязкости и упругости стабилизированных им водных систем при снижении значения pH этих систем.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для наращивания биомассы, культивирование дрожжей, например, рода Saccharomyces cerevisiae, осуществляют в ферментерах в условиях аэрации на питательной среде, включающей: глюкозу 15-20 г/л; (NH₄)₂ SO₄ 15-18 г/л; MgSO₄·7H₂ O - 4-5 г/л; K₂HPO₄ 5-6 г/л; дрожжевой экстракт - 1-1,5 г/л; вода - до 1 л. Оптимальная температура для роста поддерживается в интервале 28-32°С, оптимальное pH - от 3,5 до 6,5. Время культивирования 36-48 часов. Результатом осуществления культивирования названных бактерий является получение биомассы в виде суспензии свободных дрожжевых клеток, используемой далее в способе получения биокатализатора спиртового брожения по изобретению (ИГД).

Порошкообразный альгинат натрия выдерживают 2-5 часов в водном растворе этилового спирта концентрацией 50-85 об.%, растворяют в водной суспензии дрожжей, добавляют экзополисахарид в массовом соотношении экзополисахарид:альгинат, равном 0,1-0,9:3,5-4,5, с последующим доведением pH смеси до значений 4,2-6,5.

Полученную суспензию в виде капель с помощью насоса подают через откалиброванный капилляр диаметром от 0,5 до 5 мм с высоты 10-30 см (вертикально) в раствор сшивающего агента - 2-2,5%-ный водный раствор хлористого кальция, взятый в избытке. В результате взаимодействия капель суспензии раствора полисахаридов и дрожжевых клеток с раствором хлористого кальция в результате поверхностного обмена ионов натрия альгината натрия и ионов кальция из раствора сшивающего агента образуются гелевые гранулы сферической формы диаметром 1-4 мм (высота 10-30 см является оптимальной для образования сферических гранул). Образовавшиеся гелевые гранулы выдерживают в растворе хлористого кальция в течение 30-40 мин для окончательного их отверждения, после чего промывают 0,9% водным раствором NaCl. Полученные упругие белые полупрозрачные сферические гранулы диаметром 1-4 мм являются биокатализатором спиртового брожения (ИГД), которые используют в ферментационном сбраживании сахаров для получения этилового спирта как химического продукта, применяемого, в частности, в качестве топлива.

Гранулы биокатализатора (ИГД) включают в свой состав отвержденную в результате ионотропного обмена двухвалентными ионами кальция гелевую матрицу, состоящую из смеси экзополисахарида и Na-Са-альгината, и иммобилизованные отвержденной гелевой матрицей дрожжевые клетки.

Данный биокатализатор проявляет высокую сбраживающую активность в продолжительных бродильных процессах и высокую конверсию сахаров. Данный биокатализатор успешно может быть использован как в периодических, так и в непрерывных ферментационных процессах.

В условиях реального технологического процесса получения спирта с использованием биокатализатора, полученного известным способом, механические свойства последнего сохранить на протяжение 6 мес. и более не представляется возможным, поскольку жесткость и хрупкость поверхностного слоя гранул биокатализатора приводит к их механическому разрушению.

Гранулы биокатализатора, полученного описываемым способом, обладают эластичностью и упругостью и вследствие этого более устойчивы к механическим нагрузкам.

Испытания показали, что биокатализатор по изобретению в течение полугодового использования в процессах спиртового сбраживания для получения этанола как химического продукта, применяемого в качестве топлива, не претерпел существенных изменений не только в своих биокаталитических свойствах, но и в механических характеристиках. Гранулы биокатализатора сохраняют сферическую форму, а доля гранул неправильной формы составляет не более 3% от общего числа. Разброс значений диаметров гранул не превышает пределов 3-6 мм. Механическая прочность гранул на сдавливание составляет не менее 0,05 МПа. Их насыпная плотность варьирует в пределах 0,6-0,7 г/см³ . Истираемость гранул в ходе нормального технологического процесса не превышает 7%. Межрегенерационный пробег биокатализатора составляет не менее 6 месяцев. При этом этанол, получаемый с использованием биокатализатора, по своим характеристикам полностью соответствует требованиям ASTM D 5798-99 Standard Specification for Fuel Ethanol for Automotive Spark-Ignition Engines.

Сырьем для производства этилового спирта могут служить различные растительные материалы, содержащие в достаточном количестве сбраживаемые сахара или другие осахариваемые углеводы, в число которых входят традиционно используемые для этой цели крахмалсодержащие материалы - зерно (рожь, пшеница, кукуруза, ячмень, овес, просо) и картофель, сахаросодержащие материалы - меласса (отход сахарного и крахмало-паточного производства), дефектная сахарная свекла, а также древесина и отходы сельскохозяйственных растений.

Использование экзополисахарида в массовом соотношении экзополисахарида и альгината натрия, значений концентрации водного раствора этилового спирта и pH среды, выходящих за пределы указанных выше значений не приводит к получению биокатализатора желаемых характеристик.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют вариант заявленного изобретения, но не ограничивают его.

Пример 1

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae SL 100 выращивают в колбах в микроаэрофильных условиях (в стационарном режиме) на питательной среде следующего состава: Глюкоза - 20 г/л; (NH₄)₂SO₄ - 18 г/л; MgSO₄·7H₂O - 4 г/л; K ₂HPO₄ - 5 г/л; дрожжевой экстракт - 1 г/л; при температуре 30°С, pH - 5,5. Время культивирования 36 часов. Конечная концентрация сухой биомассы в 100 мл составляет 12,3 г. Клетки дрожжей находятся в экспоненциальной фазе роста.

Порошкообразный альгинат натрия выдерживают 2 часа в водном растворе этилового спирта концентрацией 75 об.% растворяют в водной суспензии дрожжей, добавляют экзополисахарид в массовом соотношении экзополисахарид:альгинат, равном 0,1:4,5, с последующим доведением pH смеси до значения 6,0.

Полученную суспензию с помощью насоса через калиброванные капилляры с внутренним диаметром 1,5 мм со скоростью 5 мл/ч вертикально с высоты 20 см подают в реактор, заполненный 2 л 2,2%-го водного раствора хлористого кальция. Образовавшиеся при соприкосновении капелек суспензии с раствором отверждающего агента (CaCl₂) твердые сферические гранулы далее выдерживают в растворе хлористого кальция в течение 30 мин, после чего промывают 0,9% водным раствором NaCl. Биокатализатор (ИГД) представляет собой белые (иногда прозрачные) упругие сферические гранулы диаметром 1-4 мм.

Пример 2

Промытые гранулы биокатализатора (ИГД), полученные по примеру 1, загружают в реактор и добавляют 2 л стерильной питательной среды следующего состава: глюкоза - 150 г/л; (NH₄)₂SO_4-- 5,2 г/л; MgSO ₄·7H₂O - 0,55 г/л; K₂HPO ₄ - 1,5 г/л, вода - до 2 л. pH питательной среды 4,0. Температура культивирования 20°С. Процесс ферментации осуществляют с контролем pH, температуры и скорости выделения СО₂ (бродильная активность). После прекращения выделения СО ₂ (через 72 часа), что свидетельствует об окончании процесса сбраживания, определяют объемное содержания спирта в бражке и конверсию сахара.

Постферментационную жидкость отделяют от гранул биокатализатора и направляют на дистилляцию и ректификацию, а в реактор с оставшимся катализатором вновь подают питательную среду и осуществляют процесс сбраживания.

Дистилляцию и ректификацию постферментационной жидкости осуществляют любыми известными способами с получением этилового спирта необходимой плотности.

Ниже приведены основные характеристики ферментационного процесса по примеру 2.

В таблице приведены основные характеристики ферментационного процесса по примеру 2.

Вид биокатализатора	Максимальная бродильная активность, мл CO2/(л среды·час)	Конверсия сахара, %	Выход этанола, % от теоретического	Конечное содержание спирта, %
ИГД	956	95,4	92,3	7,3

Пример 3. Процесс проводят аналогично примерам 1,2, при этом порошкообразный альгинат натрия выдерживают 1,5 часа в водном растворе этилового спирта концентрацией 80 об.%, растворяют в водной суспензии дрожжей, добавляют экзополисахарид в массовом соотношении экзополисахарид:альгинат, равном 0,9:3,5, с последующим доведением pH смеси до значения 4,5.

Ниже приведены основные характеристики ферментационного процесса по примеру 3.

Вид биокатализатора	Максимальная бродильная активность, мл CO2/(л среды·час)	Конверсия сахара, %	Выход этанола, % от теоретического	Конечное содержание спирта, %
ИГД	960	96,0	92,0	7,8

Таким образом, способ согласно изобретению позволяет упростить технологию процесса за счет использования оригинального технологического приема обработки альгината в водном растворе этилового спирта указанной концентрации, позволяющего упростить процесс его растворения, получить более гомогенный раствор. Сочетание использования этого приема и низких значений pH среды при формировании гранул позволяет снизить количество посторонней микрофлоры до уровня, не влияющего на технологический процесс. Исключаются все технологические операции, направленные на обеспечение асептических свойств целевого биокатализатора. Описываемый способ позволяет повысить срок службы биокатализатора (более 6 мес.) при сохранении высокой активности вследствие отсутствия процесса агломерации. Кроме того, изменяются механические свойства гранул. Они становятся более эластичными, устойчивыми к механическому воздействию, вследствие чего также увеличивается срок эксплуатации катализатора.