штамм amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini - продуцент антибиотика ристомицина
| Классы МПК: | C12P1/06 актиномицетов C07K14/355 из Nocardia (G) |
| Автор(ы): | Лапчинская Ольда Анастасьевна (RU), Погожева Валерия Владимировна (RU), Филичева Валентина Андреевна (RU), Преображенская Мария Николаевна (RU), Харитонова Лидия Александровна (RU), Пономаренко Валерий Иванович (RU), Лаврова-Балашова Майя Федоровна (RU), Катруха Генрих Степанович (RU), Федорова Галина Борисовна (RU) |
| Патентообладатель(и): | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН (ГУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН) (RU) |
| Приоритеты: |
подача заявки:
2008-05-07 публикация патента:
20.06.2010 |
Штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini 8765 получен в результате мутантного преобразования свойств штамма Proactinomyces fructiferi var. ristomycini 5339 в результате последовательного трехступенчатого воздействия метилнитрозогуанидина, ультрафиолетовых и гамма-лучей 60Со на исходный штамм и отбора оригинального мутантного штамма с повышенной антибиотической активностью. Полученный штамм отличается от известного по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения источников углерода (сахароза, крахмал, рамноза, манноза) и по способности образования пигмента и антибиотической активности, которая в 5 раз превосходит активность штамма Proactinomyces fructiferi var. ristomycini 5339 и составляет 2000 мкг/мл. Штамм депонирован в ВКПМ под коллекционным номером ВКПМ - S1085. Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности при производстве антибактериального антибиотика ристомицина, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми и некоторыми анаэробами. 3 табл.
Формула изобретения
Штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 - продуцент антибиотика ристомицина.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма - продуцента антибактериального антибиотика ристомицина из группы полициклических гликопептидов (далбагептидов).
Структура антибиотика ристомицина
Благодаря уникальной способности подавлять биосинтез пептидогликана клеточной стенки антибиотики этой группы эффективны в отношении многих патогенных грамположительных бактерий. Подобно ванкомицину и тейкопланину, ристомицин обладает мощным бактерицидным действием на стафилококков, энтерококков и пневмококков, в том числе метициллинустойчивых и некоторых анаэробов, вызывающих тяжелые септические заболевания. Ристомицин используется в качестве диагностикума при некоторых заболеваниях кроветворения, а также входит в состав ветеринарных препаратов.
Известен штамм Proactinomyces fructiferi var. ristomycini 5339 - продуцент антибиотика ристомицина [1], принятый в качестве прототипа. Недостатком известного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 400 мг ристомицина на 1 л культуральной жидкости).
Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм - продуцент ристомицина - в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, ультрафиолетовых и гамма-лучей 60Со на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и ванкомицин в качестве селективных агентов.
Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур «ГосНИИгенетика» под номером штамм ВКПМ-S1085.
Штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 обладает повышенной продуктивностью ристомицина (2,0 г в 1 л культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Культурально-морфологические признаки штамма ВКПМ-S1085
Температура 37°С; длительность выращивания - (7-12) суток. Посев на агаровые среды споровым материалом с (8-10)-дневной культуры, выращенной на гороховом агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица 1).
Морфологические признаки. Спороносцы прямые, споры продолговатые, поверхность спор гладкая. Гифы вегетативного мицелия септированы. Распадаются на фрагменты (2-3 мкм длины).
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб растет при (24-37)°С; оптимум роста 37°С, биосинтеза 28°С. Желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал не гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с лимоннокислым железом.
Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, глицерин, арабинозу, мальтозу; умеренно - сахарозу, крахмал, маннит, лактозу; слабо - рамнозу, не использует ксилозу.
Антагонистические свойства
При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре № 2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus, не действует на Escherichia coli и дрожжи Candida albicans. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.
Штамм-продуцент ристомицина поясняется следующим примером.
Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085, выращенной в течение (7-10) суток при 37°С на гороховом агаре, засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) и выращивают при 28°С в течение (18-24) ч на качалке при (220-240) об/мин.
Состав посевной среды, %:
| Глюкоза | 1,0 |
| Пептон | 0,5 |
| Бульон Хоттингера | 3,0 |
| Натрий хлористый | 0,5 |
| Вода | Водопроводная |
| рН до стерилизации | 6,8-7,0 |
Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,6 атм при 120°С.
Выросшим мицелием в количестве (3-5) % от объема среды засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) следующего состава, %:
| Глицерин | 2,0 |
| Соевая мука | 0,5 |
| | |
| Натрий хлористый | 0,3 |
| Мел | 0,5 |
| Вода | Водопроводная |
| рН до стерилизации | 6,8 |
Ферментацию проводят при 28°С в течение (120-144) ч на качалке при (220-240) об/мин. Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis ATCC 6633. Содержание ристомицина в культуральной жидкости к концу ферментации составляет 2000 мкг/мл.
Препарат, полученный на основе нового штамма-продуцента путем сорбции на ионно-обменных смолах и многоступенчатой химической очистки [2], по своим физико-химическим показателям, антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует стандартному образцу ристомицина.
Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является способность к биосинтезу с высокой продуктивностью гликопептидного антибиотика ристомицина.
Таким образом, создан новый мутантный штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini BKПM-S1085, отличающийся от прототипа по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения иточников углерода (рамноза, сахароза, крахмал, манноза), по способности образования пигмента и антибиотической активности, которая в 5 раз превосходит активность штамма-прототипа и составляет 2000 мкг/мл (Таблицы № № 2 и 3).
ЛИТЕРАТУРА
1. Гаврилина Г.В., Рохленко С.Г. Образование ристомицина на синтетических средах. В сб. «Ристомицин и его применение в клинике», Изд-во «Медицина», Москва, 1965, с.7-13.
2. Бражникова М.Г., Ломакина Н.Н., Лаврова М.Ф., Юрина М.С. и Клюева Л.М. Выделение и свойства ристомицина // Антибиотики, № 5, с.392 (1963).
| Таблица 1 | ||||
| Культурально-морфологические признаки штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 | ||||
| Агаровая среда | Рост воздушного мицелия* | Цвет мицелия | Растворимый пигмент | |
| Воздушного | Субстратного | |||
| № 1 Гаузе | +- | Желтовато-белый, Соо6а, скудный | Буроватый (Д-3) | Нет |
| Овсяная | + | Белый (Д-3) до светло-кремового (б6) | Бесцветный | Нет |
| Чапека | + | Белый (Д-3) | Светло-бурый (Д-4) | - |
| Глюкозо-аспарагиновая | + | Белый (Д-3) | Желтоватый (Соо4в) | - |
| Линденбайна (глицерин-нитратная) | +++ | Белый (Д-3) до светло-песочного (Соо6а) | Светло-бурый (Д-4) | |
| Глюкозо-нитратная № 2 Гаузе | ++ | Белый (Д-3) | Желтоватый (Соо4в) | - |
| Треснера (с пептоном и лимоннокислым железом) | +- | Белый (Д-3) | Бесцветный | Нет |
| */++ - умеренный; + - слабый. |
| Таблица 2 | ||
| Сравнительные культурально-морфологические свойства нового штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini BKПM-S1085 и штамма-прототипа 5339 | ||
| Агаровая среда | Рост, мицелий и пигмент | |
| Новый штамм | Штамм-прототип | |
| № 1 Гаузе | Скудный, субстратный мицелий буроватый б3 | Умеренный, субстратный мицелий красноватый б1 |
| № 2 Гаузе | Скудный, субстратный мицелий белый Д3 | Умеренный, субстратный мицелий буроватый б3, растворимый пигмент |
| Чапека с сахарозой | Хороший, воздушный мицелий белый Д3 до песочного Соо6а | Умеренный, воздушный мицелий розоватый 4б, субстратный мицелий оранжево-коричневый в1, пигмент сиреневого цвета |
| Таблица 3 | ||
| Сравнительные культурально-морфологические свойства нового штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 и штамма-прототипа 5339 | ||
| Агаровая среда | Рост, мицелий и пигмент | |
| | Новый штамм | Штамм-прототип |
| Усвоение источников | ||
| углерода: | ||
| Сахароза | Умеренно | Хорошо |
| Крахмал | Умеренно | Хорошо |
| Рамноза | Слабо | Не утилизует |
| Маннит | Хорошо | Слабо |
| Водорастворимый пигмент | Нет | Образует |
| Антибиотическая активность, | 2000 | 400 |
| мкг/мл | ||
| Диапазон изменчивости | 1000-3000 | 200-600 |
| активности, мкг/мл |
Заявитель-патентообладатель:
ГУ научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской академии медицинских наук (ГУ НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН)