4-циклоалкилзамещенные производные тетрагидрохинолина и их применение в качестве лекарств

Формула изобретения

Соединение формулы (I)



в которой R означает циклопентил или изопропил, а также их соли, сольваты и сольваты солей.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новому производному тетрагидрохинолина, способу его получения, его применению отдельно или в комбинациях для лечения и/или предотвращения заболеваний, а также к его применению для изготовления лекарств, в особенности в качестве ингибитора белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР) для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, в особенности гиполипопротеинемий, дислипидемий, гипертриглицеридемий, гиперхолестеринемий и артериосклероза.

Коронарные заболевания [заболевания венечных сосудов сердца], обусловленные артериосклерозом, относятся к основным причинам смерти в современном обществе. Многочисленные исследования показали, что низкий уровень холестерина ЛВП в плазме представляет собой важный фактор риска в развитии артериосклероза [Barter, Rye, Atherosclerosis 121. 1-12 (1996)]. ЛВП (липопротеины высокой плотности) - это, наряду с ЛНП (липопротеинами низкой плотности) и ЛОНП (липопротеинами очень низкой плотности), класс липопротеинов, важнейшая функция которых состоит в транспорте липидов в крови, например холестерина, эфиров холестерина, триглицеридов, жирных кислот и фосфолипидов. Высокий уровень холестерина ЛНП (более 160 мг/дл), а также низкий уровень холестерина ЛВП (ниже 40 мг/дл) существенно способствуют развитию артериосклероза [АТР III Guidelines, Report of the NCEP Expert Panel]. Помимо коронарных заболеваний сердца неблагоприятное соотношение ЛВП/ЛНП способствует возникновению заболеваний периферических сосудов, а также кровоизлияний в мозг. Новые методы повышения уровня холестерина ЛВП в плазме, следовательно, представляют собой рациональное дополнение в способах профилактики и лечения артериосклероза и связанных с ним болезней.

Белок-переносчик эфиров холестерина (СЕТР) является медиатором обмена эфирами холестерина и триглицеридами между различными липопротеинами в крови [Tall, J. Lipid Res. 34, 1255-74 (1993)]. Особо важен при этом перенос эфиров холестерина с ЛВП на ЛНП, ведущий к снижению уровня холестерина ЛВП в плазме. Следовательно, ингибирование СЕТР должно вести к повышению уровня холестерина ЛВП в плазме и снижению уровня холестерина ЛНП в плазме, положительно влияя терапевтически таким образом на липидный профиль плазмы [McCarthy, Medicinal Res. Rev. 13, 139-59 (1993); Sitori, Pharmac. Ther. 67, 443-47 (1995); Swenson, J. Biol. Chem. 264, 14318 (1989)].

Тетрагидрохинолины с фармакологической активностью известны из европейской заявки на патент ЕР-А-818448, международных заявок WO 99/14215, WO 99/15504, а также WO 03/028727. Замещенные тетрагидронафталины с фармакологической активностью известны из международной заявки WO 99/14174.

Задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в том, чтобы предложить новые вещества для борьбы с заболеваниями, в особенности с сердечно-сосудистыми заболеваниями, обладающие улучшенными терапевтическими свойствами.

Объектом настоящего изобретения являются соединения структурной формулы (I)

в которой R означает циклопентил или изопропил, а также их соли, сольваты и сольваты солей.

Объектом настоящего изобретения является особенно соединение с систематическим названием (5S)-4-циклогексил-2-циклопентил-3-{(S)-фтор[4-(трифторметил)фенил]метил}-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-5-ол и структурной формулой (Ia)

а также его соли, сольваты и сольваты солей.

Объектом настоящего изобретения также особенно является соединение с систематическим названием (5S)-4-циклопентил-3-{(S)-фтор[4-(трифторметил)фенил]метил}-2-изопропил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-5-ол и структурной формулой (Ib)

а также его соли, сольваты и сольваты солей.

Соединения с формулами (I) (Ia) и (Ib) в дальнейшем будут обозначены в единственном числе как «соединение согласно изобретению», но описание относится к обоим соединениям.

Соединение согласно изобретению может также быть представлено в других стереоизомерных формах (энантиомеры, диастереомеры). Настоящее изобретение относится ко всем энантиомерам, диастереомерам и их смесям в каждом случае. Из таких смесей энантиомеров и/или диастереомеров можно известным способом выделить отдельные стереоизомерные части. Предпочтительна отображенная формулой (I) конфигурация S на С-5 и на С-3'.

В качестве солей в рамках настоящего изобретения предпочтительны соли соединения согласно изобретению, не имеющие отрицательных физиологических свойств. Включены также соли, сами по себе не пригодные для фармацевтического применения, но которые, однако, можно применять, например, для выделения или очистки соединения согласно изобретению.

Соли соединения согласно изобретению, не имеющие отрицательных физиологических свойств, включают соли, получаемые при добавлении минеральных кислот, карбоновых и сульфоновых кислот, например соли хлороводородной кислоты, бромоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, бензосульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, молочной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, малеиновой кислоты, бензойной кислоты.

Соли соединения согласно изобретению, не имеющие отрицательных физиологических свойств, включают также соли обычных оснований, как, например, и предпочтительно соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, соли кальция и магния) и соли аммония, получаемые из аммиака и органических аминов с 1-16 атомами углерода, как, например, и предпочтительно этиламина, диэтиламина, триэтиламина, этилдиизопропиламина, моноэтаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина, дициклогексанамина, диметиламиноэтанола, прокаина (новокаин), дибензиламина, N-метилморфолина, аргинина, лизина, этилендиамина и N-метилпиперидина.

Сольваты в рамках настоящего изобретения обозначают такие формы соединения согласно изобретению, которые в твердом или жидком состоянии образуют комплекс благодаря координации с молекулами растворителя. Гидраты являются особой формой сольватов, при которой координация происходит с водой. Предпочтительными сольватами в рамках настоящего изобретения являются гидраты.

Кроме того, настоящее изобретение включает пролекарства соединения согласно изобретению. Термин «пролекарства» означает соединения, которые сами по себе могут обладать или не обладать биологической активностью, но только во время пребывания в теле превращаются в соединение согласно изобретению (например, метаболическим или гидролитическим способом).

(С₁-С₄)-алкил в рамках изобретения означает прямоцепочечный или разветвленный алкильный остаток с 1-4 атомами углерода. В качестве примеров и предпочтительных примеров следует назвать: метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил.

Также объектом изобретения является способ получения соединения согласно изобретению формулы (Iа), отличающийся тем, что соединение формулы (IIа)

сначала переводят асимметричным восстановлением в соединение формулы (IIIa)

которое затем либо

[А] введением гидроксильной защитной группы превращают в соединение формулы (IVa)

в которой

PG означает гидроксильную защитную группу, предпочтительно - остаток формулы - SiR¹R²R³, где

R¹, R² и R³ одинаковы или различны и означают алкил с 1-4 атомами углерода,

а затем диастереоселективным восстановлением превращают в соединение формулы (Va)

где PG имеет приведенное выше значение,

либо же с обратной последовательностью реакций

[В] сначала с диастереомерной селективностью восстанавливают до соединения формулы (VIa)

которое затем посредством региоселективного введения гидроксильной защитной группы превращают в соединение формулы (V),

затем соединение формулы (Va) превращают с помощью фторирующего агента в соединение формулы (VIIa)

где PG имеет приведенное выше значение,

а затем снова отщепляют гидроксильную защитную группу PG обычными методами с получением соединения формулы (Iа)

и переводят соединение формулы (Iа) в форму сольватов, солей и/или сольватов солей, при необходимости, с помощью соответствующих (i) растворителей и/или (ii) оснований или кислот.

Соединение формулы (IIа) можно синтезировать, проводя реакцию соединений формул (VIII), (IX) и (Ха)

между собой в трехкомпонентной реакции в присутствии протонной или кислоты Льюиса с получением соединения формулы (ХIа)

после чего окисляют последнее до соединения формулы (IIа).

Также объектом изобретения является способ получения соединения согласно изобретению формулы (Ib), характеризуемый тем, что соединение формулы (IIb)

сначала переводят асимметричным восстановлением в соединение формулы (IIIb)

которое затем либо

[А] введением гидроксильной защитной группы превращают в соединение формулы (IVb)

в которой

PG означает гидроксильную защитную группу, предпочтительно - остаток формулой - SiR¹R²R³, где

R¹, R² и R³ одинаковы или различны и означают алкил с 1-4 атомами углерода,

а затем диастереоселективным восстановлением превращают в соединение с формулой (Vb)

,

где PG имеет приведенное выше значение,

либо с обратной последовательностью реакций

[В] сначала с диастереомерной селективностью восстанавливают до соединения формулы (VIb)

которое потом посредством региоселективного введения гидроксильной защитной группы превращают в соединение формулой (Vb),

затем соединение формулы (Vb) превращают с помощью фторирующего агента в соединение формулы (VIIb)

,

где PG имеет приведенное выше значение,

а затем снова отщепляют гидроксильную защитную группу PG обычными методами с получением соединения формулы (Ib)

и переводят соединение формулы (Ib) в форму сольватов, солей и/или сольватов солей, при необходимости, с помощью соответствующих (i) растворителей и/или (ii) оснований или кислот.

Соединение с формулой (IIb) можно синтезировать, проводя реакцию соединений формул (VIII), (IX) и (Хb)

между собой в трехкомпонентной реакции в присутствии протонной или кислоты Льюиса с получением соединения формулы (ХIb)

после чего окисляют последнее до соединения формулы (IIb).

Соединения формул (VIII), (IX) и (Ха) и (Хb) представлены на рынке, известны из литературы, или же их можно синтезировать способами, аналогичными известным в литературе (ср. также международные заявки WO 99/14215 и WO 03/028727).

В качестве инертных растворителей для отдельных стадий способа применимы, например, эфиры, например диэтиловый, диизопропиловый эфиры, диоксан, тетрагидрофуран, гликольдиметиловый эфир или диэтиленгликольдиметиловый эфир, углеводороды, например бензол, толуол, ксилол, гексан, циклогексан или фракции нефти, или галогенуглеводороды, например дихлорметан, трихлорметан, тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан, трихлорэтилен или хлорбензол. Также можно применять смеси указанных растворителей.

Восстановление на стадиях (II) (III), (IV) (V) и (III) (VI) проводят в общем случае с восстановителями, пригодными для восстановления кетонов до гидроксисоединений. К таковым относятся, в частности, комплексные алюмогидриды или боргидриды, как, например, боргидриды лития, натрия, калия, цинка, алюмогидрид лития, диизобутилалюмогидрид (DIBAH), натрий-бис-(2-метоксиэтокси)-алюмогидрид, алкилборгидриды или триалкоксиалюмогидриды лития, или борановые комплексы, как, например, боран-тетрагидрофурановый, боран-диметилсульфидный комплекс или комплекс боран-N,N-диэтиланилин.

Асимметричное восстановление на стадии (II) (III) осуществляют в присутствии каталитических количеств (0,01-0,3 моль-эквивалента) энантиомерно чистого (1R,2S)-1-аминоиндан-2-ола в качестве хирального индуктора. В качестве восстановителя при этом целесообразно использовать комплекс боран-N,N-диэтиланилин. В общем случае реакцию проводят в одном из вышеназванных эфиров или в толуоле, предпочтительно в тетрагидрофуране, в интервале температур от -80°С до +50°С, предпочтительно - от 0°С до +30°С.

В реакциях восстановления (IV) (V) и (III) (VI) в качестве восстановителя целесообразно использовать алюмогидрид лития или DIBAH. В общем случае реакции проводят в одном из вышеназванных эфиров или в толуоле, предпочтительно в тетрагидрофуране, в интервале температур от -80°С до +50°С, предпочтительно - от 0°С до +30°С в случае применения алюмогидрида лития и от -80°С до +30°С в случае DIBAH.

В качестве гидроксильной защитной группы на стадиях (III) (IV) или (VI) (V) целесообразно применять силильную группу, как, например, триметилсилил, триэтилсилил, триизопропилсилил или трет-бутилдиметилсилил. Особо предпочтителен трет-бутилдиметилсилил. Силильную группу вводят, как правило, с использованием одного из приведенных выше углеводородов, галоген-углеводородов, эфиров или в диметилформамиде в качестве растворителя в присутствии основания, например, триэтиламина, N,N-диизопропилэтиламина, пиридина, 2,6-лютидина или 4-N,N-диметиламинопиридина (DMAP).

На стадии (III) (IV) целесообразно использовать в качестве реагента силилирования трет-бутилдиметилсилилтрифторметансульфонат в комбинации с 2,6-лутидином в качестве основания. Целесообразно проводить реакцию в дихлорметане или толуоле в интервале температур от -40°С до +40°С, предпочтительно - от -20°С до +30°С.

На стадии (VI) (V) целесообразно использовать в качестве реагента силилирования трет-бутилдиметилсилилхлорид в комбинации с триэтиламином и DMAP в качестве оснований. Целесообразно проводить реакцию в диметилформамиде в интервале температур от 0°С до +100°С, предпочтительно - от +20°С до +80°С.

Фторирование на стадии (VI) (VII) проводят в общем случае в одном из приведенных выше углеводородов или галогенуглеводородов, или в ацетонитриле, предпочтительно - в толуоле или дихлорметане, с использованием диэтиламиносератрифторида (DAST) или морфолиносератрифторида как агента фторирования. Как правило, реакцию проводят в интервале температур от -80°С до +40°С, предпочтительно - от -60°С до +20°С.

Отщепление силильной защитной группы на стадии (VII) (I) в общем случае проводят с помощью кислот, например соляной или трифторуксусной кислоты, или с помощью фторидов, например фтороводорода или тетрабутиламмонийфторида (ТБАФ). Пригодные инертные растворители - это приведенные выше эфиры, спирты, например метанол или этанол, или смеси названных растворителей. Целесообразно проводить отщепление с ТБАФ в тетрагидрофуране в качестве растворителя. Как правило, реакцию проводят в интервале температур от -20°С до +60°С, предпочтительно - от 0°С до +30°С.

Реакцию конденсации (VIII) + (IX) + (X) (XI), как правило, проводят в одном из приведенных выше эфиров, в спиртах например, метаноле, этаноле, н-пропаноле или изопропаноле, в ацетонитриле или в смесях названных растворителей. Целесообразно использовать диизопропиловый эфир.

Пригодные для этой стадии способа протонные кислоты - это органические кислоты, как, например, уксусная кислота, трифторуксусная кислота, щавелевая кислота или п-толуолсульфоновая кислота, или неорганические кислоты, например соляная, серная или фосфорная кислота. Также пригодны кислоты Льюиса, например хлорид алюминия или хлорид цинка. Предпочтительна трифторуксусная кислота.

Как правило, реакцию проводят в интервале температур от 0°С до +120°С, предпочтительно - от +20°С до +80°С.

Окисление (дегидрирование) на стадии (XI) (II), как правило, проводят в одном из приведенных выше галогенуглеводородов или, при необходимости, в спиртах, например метаноле или этаноле, в ацетонитриле или в воде. В качестве окислителя можно использовать, например, азотную кислоту, церий (IV)-нитрат аммония, 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон (ДДХ), пиридинийхлорохромат (ПХХ), тетроксид осмия, оксид марганца или каталитическую дегидрирование с помощью диоксида платины или палладия на активированном угле. Предпочтительно окисление с ДДХ в дихлорметане в качестве растворителя. Окисление проходит, как правило, в интервале температур от -50°С до +100°С, предпочтительно - от 0°С до +40°С.

Отдельные стадии способа можно проводить при нормальном, повышенном или при пониженном давлении (например, от 0,5 до 5 бар). Как правило, работают при нормальном давлении.

Получение соединения согласно изобретению можно проиллюстрировать следующей схемой синтеза:

Схема

Схема

[Сокращения: tBu = трет-бутил; DAST = диметиламиносератрифторид; DDQ = 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон; Et = этил; Me = метил; Ph = фенил; TBAF = тетрабутиламмоний фторид; TBDMSOTf = трет-бутилдиметилсилил-трифторметансульфонат; ТФУ = трифторуксусная кислота].

Соединение согласно изобретению обладает неожиданно ценным спектром фармакологического действия. Оно, таким образом, пригодно к использованию в качестве действующего вещества лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний людей и животных.

Соединение согласно изобретению дает дополнительные возможности лечения и обогащает фармацевтику. По сравнению с известными и применявшимися до сих пор препаратами соединение согласно изобретению демонстрирует более благоприятный спектр действия.

Оно благоприятно отличается высокой специфичностью, хорошей переносимостью и меньшим побочным действием, а также пониженной токсичностью, особенно в отношении сердца и кровообращения и печени.

Преимущество соединения согласно изобретению - высокая активность в плазме крови человека. Еще одно преимущество соединения согласно изобретению - это меньший потенциал взаимодействия с метаболическими ферментами, в частности с ферментами цитохрома Р450 и особенно с ферментом цитохром Р450 3А4. Соединение согласно изобретению, кроме того, демонстрирует меньшую склонность к отложениям в жировой ткани.

Соединение согласно изобретению формулы (I) обладает ценными фармакологическими свойствами и может быть применено для предотвращения и лечения заболеваний. В частности, соединение согласно изобретению - высокоэффективный ингибитор белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР), оно стимулирует обратный транспорт холестерина. Оно вызывает повышение уровня холестерина ЛВП в крови. Соединение согласно изобретению целесообразно применять для лечения и первичной или вторичной профилактики коронарных заболеваний, например инфаркта миокарда. Соединение согласно изобретению можно, кроме того, использовать для лечения и предупреждения артериосклероза, рестеноза, кровоизлияний в мозг, а также болезни Альцгеймера. Также соединение согласно изобретению можно применять для лечения и профилактики гиполипопротеинемий, дислипидемий, гипертриглицеридемий, гиперлипидемий, гиперхолестеринемий, ожирения (Adipositas), тучности (Obesitas), панкреатита, инсулинзависимого и инсулиннезависимого диабета, поздних последствий диабета, например ретинопатии, нефропатии и нейропатии, комбинированных гиперлипидемий, а также метаболического синдрома.

Фармакологическое действие соединения согласно изобретению можно определить посредством теста ингибирования СЕТР, представленного ниже.

Объектом настоящего изобретения является также применение соединения согласно изобретению для лечения и/или профилактики заболеваний, в особенности заболеваний, приведенных выше.

Объектом настоящего изобретения является также применение соединения согласно изобретению для изготовления лекарства для лечения и/или профилактики заболеваний, в особенности заболеваний, приведенных выше.

Объектом настоящего изобретения является также способ лечения и/или профилактики заболеваний, в особенности заболеваний, приведенных выше, с применением эффективного количества соединения согласно изобретению.

Объектом настоящего изобретения являются также лекарственные средства, содержащие соединение согласно изобретению, а также одно или несколько других действующих веществ, для лечения и/или профилактики заболеваний. В качестве действующих веществ, с которыми возможны комбинации, целесообразно использовать, например:

- средства для борьбы с диабетом,

- вещества с антитромботическим действием,

- вещества, снижающие артериальное давление,

- вещества, изменяющие жировой обмен,

- вещества с противовоспалительным действием,

- вещества, стабилизирующие атеросклеротические бляшки.

Соединение согласно изобретению формулы (I) целесообразно комбинировать с одним или несколькими

- средствами для борьбы с диабетом, приведенными в регистре Rote Liste 2002/II, глава 12,

- средствами с антитромботическим действием, предпочтительно, например, из группы ингибиторов агрегации тромбоцитов или антикоагулянтов,

- действующими веществами, снижающими артериальное давление, предпочтительно, например, из группы антагонистов кальция, антагонистов ангиотензина All, ингибиторов АКФ, бета-блокаторов, ингибиторов фосфодиэстеразы, стимуляторов растворимой гуанилатциклазы, усилителей цГМФ, а также диуретиков, и/или

- действующими веществами, изменяющими жировой обмен, предпочтительно, например, из группы агонистов рецепторов щитовидной железы [тиреорецептор], ингибиторов синтеза холестерина, например ингибиторов ГМГ-СоА-редуктазы, ингибиторов скваленсинтазы, ингибиторов скваленэпоксидазы или оксидоскваленциклазы, ингибиторов АСАТ, ингибиторов микросомального белка-переносчика триглицеридов, агонистов PPAR, фибратов, ингибиторов липазы, ингибиторов адсорбции холестерина, ингибиторов реадсорбции желчной кислоты, полимерных адсорбентов желчной кислоты и антагонистов липопротеина(ов).

Под средствами для борьбы с диабетом предпочтительно подразумевают, например, инсулин и его производные, а также гипогликемические действующие вещества орального применения.

Понятие «инсулин и его производные» здесь включает в себя как инсулины животного, человека или биотехнологического происхождения, так и их смеси.

Гипогликемические действующие вещества орального применения предпочтительно включают в себя, например, сульфонилмочевинные препараты, бигуадины, производные меглитинида, оксадиазолидиноны, тиазолидиндионы, ингибиторы глюкозидазы, антагонисты глюкагона, агонисты ГПП-1, вещества, повышающие чувствительность тканей к инсулину, ингибиторы печеночных ферментов, участвующих в глюконеогенезе и/или гликогенолизе, модуляторы всасывания глюкозы, а также активаторы, как, например, представленные в международных заявках WO 97/26265 и WO 99/03861.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с инсулином.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с сульфонилмочевинным препаратом, например предпочтительно толбутамидом, глибенкламидом, глимепиридом, глипизидом или гликлазидом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с бигуанидом, например предпочтительно метформином.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с производным меглитинида, например предпочтительно репаглинидом или нателглинидом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с агонистом PPAR-гамма, например, из класса тиазолидиндионов, например предпочтительно пиоглитазоном или розиглитазоном.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию со смешанным агонистом PPAR-альфа/гамма, например предпочтительно GI-262570 (фарглитазаром), GW 2331, GW 409544, AVE 8042, AVE 8134, AVE 0847, MK-0767 (KRP-297) или AZ-242.

Под средствами с антитромботическим действием подразумевают предпочтительно соединения из группы ингибиторов агрегации тромбоцитов, например, предпочтительно аспирин, клопидоргел, тиклопидин или дипиридамол, или антикоагулянтов.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором тромбина, например предпочтительно ксимелагатраном, мелагатраном, бивалирудином или клексаном.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с антагонистом ГП IIb/IIIa, например предпочтительно тирофибаном или абциксимабом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором фактора Ха, например предпочтительно DX 9065a, DPC 906, JTV 803 или BAY 59-7939.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с гепарином или низкомолекулярными (LMW) - производными гепарина.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с антагонистом витамина К, например предпочтительно кумарином.

Под средствами, снижающими артериальное давление, подразумевают, например, соединения из группы антагонистов кальция, например предпочтительно соединения нифедипин, амлодипин, нитрендипин, низолдипин, верапамил или дилтиазем, антагонисты ангиотензина АII, ингибиторы АКФ, бета-блокаторы, а также диуретики.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с антагонистом рецепторов альфа-1.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с резерпином, миноксидилом, диазоксидом, дигидралазином, гидралазином, а также веществами, высвобождающими оксид азота, например предпочтительно нитратом глицерина или нитропруссидом натрия.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с антагонистрм ангиотензина АII, например предпочтительно лозартаном, валзартаном, кандезартаном, телмизартаном, эмбузартаном, ирбезартаном, олмезартаном, тазозартаном или запризартаном.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором АКФ, например предпочтительно эналаприлом, каптоприлом, рамиприлом, делаприлом, фозиноприлом, хиноприлом, периндоприлом или трандолаприлом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с бета-блокатором, например предпочтительно пропанололом или атенололом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с диуретиком, например предпочтительно фуросемидом.

Под средствами, изменяющими жировой обмен, подразумевают, например, предпочтительно соединения из группы агонистов рецепторов щитовидной железы, ингибиторы синтеза холестерина, например ингибиторы ГМГ-СоА-редуктазы или ингибиторы синтеза сквалена, ингибиторов АСАТ, ингибиторов микросомального белка-переносчика триглицеридов, агонистов PPAR, фибратов, ингибиторов адсорбции холестерина, ингибиторов реадсорбции желчной кислоты, полимерных адсорбентов желчной кислоты и антагонистов липопротеина(ов).

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с агонистом рецепторов щитовидной железы, например предпочтительно D-тироксином, 3,5,3'-трийодтиронином (Т3), CGS 23425 или акситиромом (CGS 26214).

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором синтеза сквалена, например предпочтительно BMS-188494 или ТАК 475.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором АСАТ, например предпочтительно авазимибом, эфлуцимибом или CS-505.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение с формулой (I) вводят в сочетании с ингибитором адсорбции холестерина, как то предпочтительно эзетимибом, тиквезидом или памаквезидом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение с формулой (I) вводят в комбинацию с ингибитором реадсорбции желчной кислоты, например предпочтительно бариксибатом, AZD 7508, SC 435, SC 635, S-8921, 264W94 или НМ 1453.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором микросомального белка-переносчика триглицеридов, как то предпочтительно имплитапидом, BMS-201038 или Р-103757.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с агонистом РРАRальфа, как, например, фибратами - фенофибрат, клофибрат, безафибрат, ципрофибрат или гемфиброзил или как то предпочтительно GW 9578, GW 7647, LY-518674 или NS-220.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с агонистом РРАRдельта, как то предпочтительно GW 501516.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию со смешанным агонистом РРАRальфа/гамма, как то предпочтительно GI-262570 (фарглитазаром), GW 2331, GW 409544, AVE 8042, AVE 8134, AVE 0847, MK-0767 (KRP-297) или AZ-242.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию со смешанным агонистом РРА-Rальфа/гамма/дельта, как то предпочтительно МСС-555.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором липазы из группы эндотелиальных ингибиторов липазы, панкреатических, желудочных, гормончувствительных или печеночных ингибиторов липазы.

В особо предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором панкреатической липазы, предпочтительно из класса липостатинов, как, например, орлистатом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с полимерным адсорбентом желчной кислоты, например предпочтительно холестирамином, колестиполом, колезольвамом, холеста-гелем или колестимидом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с антагонистом липопротеина(а), например предпочтительно гемкабен-кальцием (СI-1027) или никотиновой кислотой.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с антагонистом рецепторов ниацина, например предпочтительно ниаспаном, аципимоксом или ницеритролом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с антиоксидантом, например предпочтительно пробуколом, AGI 1067 или Во 653.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с индуктором рецепторов ЛНП, как, например, лифибролом.

В предпочтительной форме исполнения изобретения соединение формулы (I) вводят в комбинацию с ингибитором ГМГ-СоА-редуктазы из класса статинов, например предпочтительно ловастатин, симвастатин, правастатин, флувастатин, аторвастатин, розувастатин, церивастатин или питавастатин.

Объектом настоящего изобретения являются также комбинации соединения формулы (I) с веществами, снижающими экспрессию гена ГМГ-СоА-редуктазы. Такими веществами могут быть, например, ингибиторы транскрипции или трансляции ГМГ-СоА-редуктазы. Ингибирование экспрессии гена ГМГ-СоА-редуктазы можно вызвать, например, ингибированием протеазы S1P (сайт-1) или снижением уровня SREBP (белка, связывающего стеролрегулируемый элемент).

Объектом настоящего изобретения являются также комбинации соединения формулы (I) с веществами, обладающими противовоспалительным действием и/или стабилизирующими атеросклеротические бляшки. Такими веществами могут быть, например, действующие вещества из класса НПВП, антагонистов ФАТ-ацетилгидролазы или антагонистов хемокиновых рецепторов, как, например, антагонисты рецептора IL-8 или антагонисты МСР.

Комбинации действующих веществ согласно изобретению обладают ценными фармакологическими свойствами и могут быть использованы для предотвращения и лечения заболеваний.

Комбинации действующих веществ согласно изобретению целесообразно применять для лечения и первичной или вторичной профилактики коронарных заболеваний сердца, например инфаркта миокарда. Их можно, кроме того, использовать для лечения и предупреждения артериосклероза, рестеноза, кровоизлияний в мозг, а также болезни Альцгеймера. Также приведенные комбинации можно применять для лечения и профилактики гиполипопротеинемий, дислипидемий, гипертриглицеридемий, гиперлипидемий, гиперхолестеринемий, ожирения (Adipositas), тучности (Obesitas), панкреатита, инсулинзависимого и инсулиннезависимого диабета, поздних последствий диабета, например ретинопатии, нефропатии и нейропатии, комбинированных гиперлипидемий, а также метаболического синдрома. Далее комбинации действующих веществ согласно изобретению можно применять для лечения повышенного артериального давления, сердечной недостаточности, стенокардии, ишемий, а также воспалительных заболеваний.

Объектом настоящего изобретения также являются лекарственные средства, содержащие соединение согласно изобретению, обычно вместе с одним или несколькими инертными, нетоксичными, фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, а также их применение с названными ранее целями.

Соединение согласно изобретению может действовать системно и/или местно. С этой целью его можно применять пригодным способом, например орально, парентерально, ингаляцией в легкие, назально, подъязычно, на язык, закладыванием за щеку, ректально, накожно, чрескожно, конъюнктивально, введением в ушной канал или как имплантат или стент.

Для применения с помощью этих способов введения соединение согласно изобретению могут вводить в соответствующих формах применения.

Для орального введения пригодны формы применения, действующие соответственно нынешнему уровню знаний, быстро и/или модифицированным образом высвобождающие соединение согласно изобретению, содержащие соединение согласно изобретению в кристаллической и/или аморфной и/или растворенной форме, например: таблетки (без оболочки или покрытые оболочкой, например устойчивой к желудочному соку, или с замедленным растворением или нерастворимой оболочками, контролирующей высвобождение соединения согласно изобретению), таблетки, быстро разрушающиеся в ротовой полости или пленки/облатки, пленки/лиофилизаты, капсулы (например, твердые или мягкие желатиновые капсулы), драже, грануляты, крупинки, порошки, эмульсии, суспензии, аэрозоли или растворы.

Парентеральное введение может происходить с исключением стадии резорбции (например, внутривенно, внутриартериально, внутрисердечно, интраспинально или интралюмбально) или с включением резорбции (например, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, чрескожно или внутрибрюшинно). Надлежащими формами применения для парентерального введения являются в т.ч. рецептуры для инъекций и инфузий в форме растворов, суспензий, эмульсий, лиофилизатов или стерильных порошков.

Для прочих способов введения пригодны, например, ингаляционные лекарственные формы (в т.ч. порошковые ингаляторы, распылители), капли, растворы и спреи для носа, таблетки для применения на язык, за щеку и под язык, пленки/облатки или капсулы, суппозитории, препараты для ушей или глаз, вагинальные капсулы, водные суспензии (лосьоны, примочки), лиофильные суспензии, мази, кремы, чрескожные терапевтические системы (например, пластыри), молочко, пасты, пены, пудры, имплантаты или стенты.

Предпочтительно оральное или парентеральное введение, в особенности оральное введение.

Соединение согласно изобретению может быть переведено в указанные выше формы применения. Это может происходить известным образом посредством смешивания с инертными, нетоксичными, фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. К таким вспомогательным веществам относятся в т.ч. носители (например, микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, маннит), растворители (например, жидкие полиэтиленгликоли), эмульгаторы или средства диспергирования или смачивания (например, додецилсульфат натрия, полиоксисорбитанолеат), вяжущие средства (например, поливинилпирролидон), синтетические и естественные полимеры (например, альбумин), стабилизаторы (например, антиоксиданты, например аскорбиновая кислота), красители (например, неорганические пигменты, например оксиды железа) и средства коррекции вкуса и/или запаха.

Для достижения ощутимого результата оказалось в общем случае целесообразным назначать при парентеральном введении количества от 0,001 до 1 мг/кг, преимущественно от 0,01 до 0,5 мг/кг массы тела. При оральном введении дозировка составляет от 0,01 до 100 мг/кг, преимущественно от 0,01 до 20 мг/кг и особо предпочтительно - от 0,1 до 10 мг/кг массы тела.

Тем не менее, может оказаться необходимым отклонение от названных количеств, в частности в зависимости от массы тела, способа введения, реакции конкретного человека к действующему веществу, лекарственной формы и времени или интервала применения. Так, в некоторых случаях может оказаться возможным обойтись количеством, меньшим, чем минимально названное, в то время как в других случаях необходимо превысить указанный верхний предел. В случае применения больших количеств может оказаться полезным распределить их на несколько отдельных приемов в течение дня.

Нижеследующие примеры исполнения разъясняют изобретение. Изобретение не ограничено этими примерами.

Под процентами в следующих тестах и примерах следует, если не указано иное, понимать массовые проценты, под частями - массовые части. Соотношения растворов, разведения и данные о концентрации растворов жидкостей в жидкостях относятся в каждом случае к объему.

А. Примеры

Сокращения и аббревиатуры:

ХЭ	эфир холестерина
СЕТР	белок-переносчик эфиров холестерина
DAST	диметиламиносератрифторид
ДХИ	десорбционная (прямая) химическая ионизация (МС)
ДДХ	2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон
de	избыток диастереомера
ДМФ	N,N-диметилформамид
ДМСО	диметилсульфоксид
от теор.	от теоретического (о выходе)
ЭДТА	этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота
ее	избыток энантиомера
экв.	эквивалент(ы)
ESI	ионизация в электроспрее (МС)
ч	час(ов)
ЛВП	липопротеин высокой плотности
ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
ЖХ-МС	тандем «жидкостная хроматография - масс-спектрометр»
ЛНП	липопротеин низкой плотности
мин	минута (минуты)
МС	масс-спектроскопия
ЯМР	ядерно-магнитно-резонансная спектроскопия
Rt	время задержки (при ВЭЖХ)
SPA	сцинтилляционный анализ близости
TBAF	фторид тетрабутиламмония
TBDMSOTf	трет-бутилдиметилсилил-трифторметансульфонат
ТФУ	трифторуксусная кислота
ТГФ	тетрагидрофуран

Методы ВЭЖХ и ЖХ-МС:

Метод 1: колонка: Chiralpak IA, 250 мм × 4.6 мм; элюент: изогексан/1-пропанол 97:3; поток: 1.0 мл/мин.; УФ-детектор: 254 нм.

Метод 2: аппарат: HP 1100 с диодо-матричным детектором; колонка: Kromasil RP-18, 60 мм × 2 мм, 3.5 µm; элюент А: 5 мл HClO₄ /I воды, элюент В: ацетонитрил; градиент: 0 мин 2% В 0,5 мин 2% В 4.5 мин 90% В 9 мин 90% В; поток: 0,75 мл/мин.; температура: 30°С; УФ-детектор: 210 нм.

Метод 3 (ЖХ-МС): прибор МС: Microma ZQ; прибор ВЭЖХ: HP серии 1100; УФ диодо-матричный детектор; колонка: Phenomenex Synergi 2µ Hydro-RP Mercury 20 мм × 4 мм; элюент А: 1 I воды + 0,5 мл 50%-ной муравьиной кислоты, элюент В: 1 I ацетонитрил + 0,5 мл 50%-ной муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 90% А 2.5 мин 30% А 3.0 мин 5% А 4.5 мин 5% А; поток: 0,0 мин 1 мл/мин 2.5 мин/ 3.0 мин/4.5 мин 2 мл/мин; печь: 50°С; УФ-детектор: 210 нм.

Исходные соединения и промежуточные продукты: (а)

Пример 1А

2-циклопентил-4-циклогексил-7,7-диметил-3-(4-трифторметилбензоил)-4,6,7,8-тетрагидро-1H-хинолин-5-он

15.0 г (53 ммоль, 1.2 экв.) 3-амино-3-циклопентил-1-(4-трифторметилфенил)-пропенона (представлен согласно международной заявке WO 03/028727, пример 4) помещают в 500 мл диизопропилового эфира и добавляют 6.80 мл (88 ммоль, 2.0 экв.) трифторуксусной кислоты и 6.19 г (44 ммоль, 1 экв.) 5,5-диметилциклогексан-1,3-диона. После перемешивания в течение 10 минут при комнатной температуре добавляют 7.1 мл (66 ммоль, 1.5 экв.) циклогексанкарбальдегида. Затем смесь нагревают в водоотделителе под флегмой в течение 15 часов. После охлаждения перемешивают в течение 30 минут на ледяной бане. Полученный осадок отсасывают и отмывают холодным диизопропиловым эфиром.

Выход: 3.13 г (14% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): =0,77-2.05 (m, 20H), 1.17 (s, 6H), 2.21 (m, 2H), 2.40 (2d, 2H), 3.48 (sept, 1H), 3.79 (d, 1H), 5.85 (s, 1H), 7.66 (d, 2H), 7.78 (d, 2H) ppm.

MC (ESI положит): m/z=500 [М+Н] ⁺.

Пример 2А

2-циклопентил-4-циклогексил-7,7-диметил-3-(4-трифторметилбензоил)-7,8-дигидро-6Н-хинолин-5-он

3.13 г (6.3 ммоль) соединения из примера 1А растворяют в 64 мл дихлорметана и добавляют при 0°С по порциям 1.42 г (6.3 ммоль) 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинона (ДДХ). Перемешивая, в течение 3 часов нагревают до комнатной температуры. Смесь концентрируют в ротационном испарителе и очищают остаток хроматографией (силикагель, растворитель: циклогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 5:1).

Выход: 3.07 г (98.6% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃ , 400 МГц): =1.01-1.22 (m, 2H), 1.10 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.35-2.00 (m, 16H), 2.50-2.69 (m, 3H), 3.07 (s, 2H), 3.35 (m, 1H), 7.75 (d, 2H), 7.94 (m, 2H) ppm.

MC (ESI положит.): m/z=498 [M+H]⁺.

Пример 3А

[(5S)-2-циклопентил-4-циклогексил-5-гидрокси-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3-ил](4-трифторметилфенил)-метанон

178 мг (1.2 ммоль, 0,08 экв.) (1R,2S)-1-аминоиндан-2-ола вводят в 400 мл ТГФ и добавляют при комнатной температуре 9.73 г (60 ммоль, 4 экв.) боран-N,N-диэтиланилинового комплекса. По окончании выделения газа охлаждают до 0°С и добавляют 7.42 г (14.9 ммоль, 1 экв.) соединения из примера 2А, растворенного в 400 мл ТГФ. При перемешивании доводят до комнатной температуры в течение 16 часов. По окончании реакции обмена в реакционную смесь добавляют 20 мл метанола, сгущают и очищают остаток хроматографией (силикагель, растворитель: градиент изогексана/этилового эфира уксусной кислоты).

Выход: 6.97 г (93.5% от теор.)

Избыток энантиомера, согласно методу 1, равен 97.6%.

¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): =0,90-2.10 (m, 27Н), 2.55 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.80-3.40 (m, 2H), 5.18 (br. s, 1H), 6.8 (m, 2H), 7.40-8.40 (br. m, 4H) ppm.

MC (ДХИ/NН₃): m/z=500 [M+H] ⁺.

Пример 4А

((5S)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-4-циклогексил-2-циклопентил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3-ил)[4-(трифторметил)фенил]-метанон

6.0 г (12.0 ммоль) соединения из примера 3А в атмосфере аргона помещают в 45 мл сухого толуола. Затем при комнатной температуре добавляют 5.15 г (48.0 ммоль, 4 экв.) 2,6-лютидина и охлаждают смесь до -16°С. К этому раствору по каплям добавляют 6.35 г (24.0 ммоль, 2 экв.) трет-бутилдиметилсилилового эфира трифторметансульфоновой кислоты в 15 мл толуола. Через 15 минут нагревают до 0°С и в течение 80 минут перемешивают реакционную смесь при этой температуре. Для разделения добавляют 0,1 Н соляную кислоту (186 мл) и после нагревания до комнатной температуры экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты. Водную фазу дополнительно трижды экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, объединенные органические фазы отмывают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным раствором поваренной соли, а эту водную фазу снова подвергают обратной экстракции этиловым эфиром уксусной кислоты. Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют в вакууме, а остаток очищают хроматографией (силикагель, растворитель: градиент изогексана/этилового эфира уксусной кислоты).

Выход: 5.96 г (80,8% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃ , 300 МГц): =0,13 (s, 3Н), 0,19 (s, 3H), 0,86 (s, 9H), 0.99-2.08 (m, 26H), 2.43-2.69 (m, 2H), 2.92-3.29 (m, 2H), 5.24 (шир. s, 1H), 6.8 (m, 2H), 7.48-8.03 (шир. m, 4H) ppm.

MC (ДХИ/NН ₃): m/z=614 [M+H]⁺.

Пример 5А

(S)-((5S)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-4-циклогексил-2-циклопентил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3-ил)[4-(трифторметил)фенил]-метанол

К раствору 5.72 г (9.3 ммоль) соединения из примера 4А в 116 мл сухого ТГФ по каплям добавляют при 0°С 10,25 мл 1 М раствора алюмогидрида лития (10,25 ммоль, 1.1 экв.) в ТГФ. В течение 6 часов, перемешивая, нагревают до комнатной температуры. Для разделения осторожно добавляют 120 мл насыщенного раствора тартрата натрий-калия. По окончании выделения газа трижды экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, объединенные органические фазы отмывают смесью раствора гидрокарбоната натрия и насыщенного раствора поваренной соли в отношении 1:1, а эту водную фазу снова подвергают обратной экстракции этиловым эфиром уксусной кислоты. Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографией и при этом отделяют диастереомеры продукта (колонка: Chiralpak AD, 500 мм × 40 мм, 20 pm; элюент: изогексан/изопропанол 97.5:2.5; поток: 50 мл/мин).

Выход: 2.5 г (43.6% от теор.)

Чистота диастереомеров: 96.9% de, R_t=4.15 мин (метод 1).

¹H-ЯМР (CDCl₃ , 400 МГц): =0,18 (шир. s, 6H), 0,90 (s, 9H), 1.03-2.09 (m, 26H), 2.10-2.33 (шир. m, 1H), 2.37-3.06 (m, 3Н), 3.33 (m, 1H), 5.24 и 5.47 (2 шир. s, 1H), 6.49 и 6.64 (2 шир. s, 1H), 7.31-7.64 (m, 4H) ppm.

MC (ESI положит): m/z=616 [М+H]⁺.

син-диастереомер:

(R)-((5S)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-4-циклогексил-2-циклопентил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3-ил)[4-(трифторметил)-фенил]метанол

Выход: 3.56 г (61.2% от теор.)

Чистота диастереомеров: 98.6% de, R_t=2.77 мин (метод 1).

Пример 6А

(5S)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-4-циклогексил-2-циклопентил-3-{(S)-фтор[4-(трифторметил)фенил]метил}-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин

К раствору 9.96 г (16.2 ммоль) соединения из примера 5А в 300 мл сухого толуола по каплям при -55°С добавляют в атмосфере аргона 3.21 мл диэтиламиносератрифторида (24.3 ммоль, 1.5 экв.). Перемешивают в течение 1 часа при этой температуре, а затем еще 2 часов при комнатной температуре. Для разделения осторожно добавляют 120 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия. Всего проводят три экстракции этиловым эфиром уксусной кислоты. Объединенные органические фазы очищают насыщенным раствором поваренной соли, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Продукт очищают фильтрацией через силикагель (растворитель: циклогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 9:1).

Выход: 9.93 г (99.3% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): =0,20 (шир. s, 6H), 0,91 (s, 9H), 1.03-2.14 (m, 26H), 2.42-3.04 (m, 3Н), 3.35 (m, 1H), 5.26 и 5.52 (2 шир. s, 1H), 7.10-7.50 (m, 3Н), 7.62 (d, 2H) ppm.

MC (ESI положит): m/z=618 [M+H]⁺.

Примеры исполнения: (а)

Пример 1

(5S)-4-циклогексил-2-циклопентил-3-{(S)-фтор[4-(трифторметил)фенил]-метил}-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-5-ол

К раствору 9.91 г (16.0 ммоль) соединения из примера 6А в 200 мл сухого ТГФ по каплям добавляют при 0°С 40,1 мл 1 М раствора тетрабутиламмония фторида (40,1 ммоль, 2.5 экв.) в ТГФ. Нагревают до комнатной температуры и перемешивают при этой температуре в течение 16 часов. Для разделения разводят с помощью 100 мл этилового эфира уксусной кислоты и дважды отмывают в каждом случае 100 мл воды и 50 мл насыщенного раствора поваренной соли. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Продукт очищают фильтрацией через силикагель (силикагель, растворитель: изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 100:0 1:1).

Выход: 7.7 г (95.3% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): =1.02 (s, 3Н), 1.17 (s, 3Н), 1.08-2.15 (m, 21H), 2.59-3.00 (m, 3Н), 3.51 (m, 1H), 5.13 (m, 1H), 7.34 (d, 2H), 7.39 (d, 1H), 7.61 (d, 2H) ppm.

MC (ДХИ): m/z=504 [M+H] ⁺

ВЭЖХ (Methode 2): R_t=5.20 мин

В. Оценка фармакологической эффективности (а)

B-I. Тест ингибирования СЕТР

В-I.1. Получение СЕТР

СЕТР получают из плазмы крови человека в частично очищенном виде посредством дифференциального центрифугирования и колоночной хроматографии и используют для теста. Для этого плотность плазмы человека доводят бромидом натрия (NaBr) до 1.21 г/мл и центрифугируют 18 часов при 50.000 об/мин и 4°С. Донную фракцию (d>1.21 г/мл) переносят на фенилсефарозную колонку Sephadex^® 4В (фирма Pharmacia), отмывают 0,15 М NaCl / 0,001 М трис-HCl с рН 7.4, а затем элюируют дистиллированной водой. Фракции с СЕТР-активностью собирают в пул, диализуют против 50 мМ ацетата натрия с рН 4.5 и переносят на колонку CM-Sepharose ^® (фирма Pharmacia). Затем элюируют с линейным градиентом (0-1 М NaCl). Собранные в пул фракции СЕТР диализуют против 10 мм трис-НСl с рН 7.4, а затем еще раз очищают, пропуская через колонку Mono Q^® (фирма Pharmacia).

B-I.2. Флуоресцентный тест СЕТР

Измерение переноса флуоресцирующего эфира холестерина между липосомами, катализируемого СЕТР [согласно прописи Bisgaier et al., J. Lipid Res. 34, 1625 (1993), с изменениями]

Для изготовления донорских липосом в 600 мкл диоксана под ультразвуком при слабом нагреве растворяют 1 мг холестерил-4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-S-индацен-3-додеканоата (Cholesteryl BODIPY^® FL C₁₂, фирма Molecular Probes) с 5.35 мг триолеина и 6.67 мг фосфатидилхолина и при комнатной температуре, продолжая обработку ультразвуком, очень медленно добавляют к 63 мл системы из 50 мм трис-HCl / 150 мм NaCl / 2 мм ЭДТА-буфера с рН 7,3. Затем систему в атмосфере азота обрабатывают ультразвуком в ванне Branson в течение 30 мин при мощности ок. 50 Вт, причем поддерживают температуру ок. 20°С.

Липосомы-акцепторы изготовляют аналогично из 86 мг холестерилолеата, 20 мг триолеина и 100 мг фосфатидилхолина, растворенных в 1.2 мл диоксана и 114 мл вышеназванного буфера, путем 30-минутной ультразвуковой обработки при 50 Вт (20°С).

В-I.2.1. Флуоресцентный тест с обогащенным СЕТР

Для испытания используют смесь, состоящую из 1 части вышеназванного буфера, 1 части донорских липосом и 2 частей липосом-акцепторов.

К 50 мкл тестовой смеси добавляют 48 мкл обогащенной фракции СЕТР (1-3 мкг), полученной посредством гидрофобной хроматографии из плазмы человека, а также 2 мкл раствора исследуемого вещества в ДМСО и инкубируют 4 часа при 37°С.

Изменение флуоресценции при 485/535 нм - мера переноса ХЭ; определяют ингибирование переноса по сравнению с контрольным образцом без исследуемого вещества.

№ примера	IС 50 [нм] флуоресцентный тест
1	25

B-I.2.2. Флуоресцентный тест СЕТР с плазмой человека

К 42 мкл (86 об.%) плазмы человека (Sigma P9523) добавляют 6 мкл (12 об.%) донорских липосом и 1 мкл (2 об.%) раствора исследуемого вещества в ДМСО и инкубируют 24 часа при 37°С.

Изменение флуоресценции при 510/520 нм (ширина щели 2.5 нм) мера переноса ХЭ; определяют ингибирование переноса по сравнению с контрольным образцом без исследуемого вещества.

№ примера	IC 50 [нм] флуоресцентный тест в плазме человека
1	50

B-I.2.3. Флуоресцентный тест СЕТР Ex vivo

К 80 мкл тестовой смеси добавляют 10 мкл буфера и 2 мкл сыворотки и инкубируют 4 часа при 37°С.

Изменение флуоресценции при 485/535 нм - мера переноса ХЭ; определяют ингибирование переноса по сравнению с контрольным образцом без исследуемого вещества.

B-I.3. Получение ЛВП с радиоактивным мечением

Плотность 50 мл свежей плазмы человека с ЭДТА доводят бромидом натрия (NaBr) до 1.12 и центрифугируют при 4°С в роторе Ту 65 в течение 18 часов при 50.000 об/мин. Верхнюю фазу используют для получения холодных ЛНП. Нижнюю фазу трижды диализуют против 4 литров буфера PDB (10 мМ трис-НСl рН 7.4, 0,15 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,02% NаN₃). На 10 мл объема ретентата затем добавляют 20 мкл ³H-холестерина (Dupont NET-725; 1 мкКи/мкл, раствор в этаноле) и инкубируют 72 часа при 37°С в атмосфере азота.

Плотность образца доводят затем NaBr до 1.21 и центрифугируют в роторе Ту 65 в течение 18 часов при 50.000 об/мин и 20°С. Отбирают верхнюю фазу и очищают фракцию липопротеинов градиентным центрифугированием. Для этого плотность изолированной меченой фракции липопротеинов доводят NaBr до 1.26. По 4 мл этого раствора покрывают в центрифужных пробирках (ротор SW 40) 4 мл раствора с плотностью 1.21 и 4.5 мл раствора с плотностью 1.063 (плотностные растворы из буфера Puffer и NaBr), а затем центрифугируют в течение 24 часов при 38.000 об/мин, и 20°С в роторе SW 40. Промежуточный слой, расположенный между плотностями 1.063 и 1.21, содержащий меченные ЛВП, трижды диализуют против 100 объемов буфера PDB при 4°С.

Ретентат содержит ³H-ХЭ-ЛВП с радиоактивным мечением, которые после доведения до 5×106 имп/мин на мл используют для теста.

B-I.4. Тест CETP-SPA

Для исследования активности СЕТР измеряют перенос ³H-эфиров холестерина с липопротеинов ВП человека на биотинилированные липопротеины HП. Реакцию прекращают добавлением микрогранул со стрептавидином-SPA^® (фирма Amersham), а перенесенную радиоактивность определяют непосредственно в жидкостном счетчике сцинтилляции.

В тестовом образце инкубируют 10 мкл ЛВП-³Н-эфиров холестерина (ок. 50.000 имп./мин) с 10 мкл биотин-ЛНП (фирма Amersham) в 50 мМ HEPES /0,15 М NaCl / 0,1% бычьего сыворотчного альбумина (БСА) / 0,05% NaN₃ с рН 7.4 с 10 мкл СЕТР (1 мг/мл) и 3 мкл раствора исследуемого вещества в 10% ДМСО /1% БСА в течение 18 часов при 37°С. Затем добавляют 200 мкл раствора микрогранул SPA-стрептавидина (TRKQ 7005), инкубируют еще 1 час, встряхивая, а затем измеряют в счетчике сцинтилляции. В качестве контроля используют соответствующие 10 мкл буфера, 10 мкл СЕТР при 4°С, а также 10 мкл СЕТР, прошедшие инкубацию при 37°С.

Активность, перенесенную СЕТР при 37°С в контрольных образцах, принимают за 100% переноса. Концентрации вещества, при которых этот перенос уменьшается вдвое, приводят в качестве величины IC₅₀ .

№ примера	IC 50 [нм] SPA-тест
1	7

В-II.1. Измерение активности ex vivo на трансгенных мышах hСЕТР

Для проверки ингибиторной активности СЕТР вещества с помощью желудочного зонда орально вводят трансгенным мышам hСЕТР собственной селекции [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)]. Для этого за день до начала эксперимента самцов разделяют на рандомизированные группы одинаковой численности, как правило, n=4. Перед введением вещества для определения базовой активности СЕТР в сыворотке у каждой мыши берут кровь из ретроорбитального венного сплетения (время Т1). Затем животным через желудочный зонд вводят исследуемое вещество. К определенному времени после введения исследуемого вещества у животных второй раз берут кровь (время Т2), как правило, по прошествии 16 или 24 часов после введения; при необходимости это, однако, можно осуществлять и в другое время.

Для оценки ингибиторной активности вещества в каждый момент, т.е. через 16 или 24 часа, использовали соответствующую контрольную группу, животные из которой получали только рецептурное средство без исследуемого вещества. У каждого из контрольных животных, так же, как и у таковых, получавших вещество, также дважды брали кровь, чтобы определить изменение активности СЕТР без ингибитора за время эксперимента (16 или 24 часа).

Образцы крови по окончании свертывания центрифугировали и пипеткой отбирали сыворотку. Для определения активности СЕТР измеряли транспорт эфиров холестерина на протяжении 4 часов. Для этого в тестовых образцах применяли, как правило, 2 мкл сыворотки; тест проводили, как описано в B-I.2.3.

Разницу в транспорте эфиров холестерина [рМ ХЭ/ч. (Т2) - рМ ХЭ/ч. (Т1)] рассчитывали для каждого животного и усредняли по группам. Вещество, снижавшее к одному из моментов транспорт на величину более 20%, считали эффективным.

№ примера	% ингибирования при 3 мг/кг
16 ч	24 ч
1	50	24

B-II.2. Измерение эффективности in vivo на переднеазиатских хомяках

Для определения действия ингибиторов СЕТР на липопротеины и триглицериды сыворотки при оральном введении использовали самок переднеазиатского хомяка массой 150-200 г собственной селекции (линия BAY:DSN). Животных собирали в группы по шесть в клетке и акклиматизировали в течение двух недель, снабжая кормом и водой без ограничений.

Непосредственно перед началом эксперимента и после введения вещества у животных брали из ретроорбитального венного сплетения кровь, из которой после 30 минут инкубации при комнатной температуре и 20 минут центрифугирования при 30.000 G получали сыворотку. Вещества растворяли в смеси из 20% солутола и 80% воды и вводили перорально с помощью желудочного зонда. Контрольные животные получали те же объемы растворителя без исследуемого вещества.

Определение триглицеридов, общего холестерина, холестерина ЛВП и ЛНП проводили с помощью анализатора COBAS INTEGRA 400 plus (фирма Roche Diagnostics) no указаниям изготовителя. Из результатов измерения для каждого параметра рассчитывали изменение, вызванное дачей вещества, для каждого животного и указывали его среднюю величину со стандартным отклонением на группу (n=6 или n=12). Если эффекты вещества оказывались значимы по сравнению с группой, получавшей растворитель, то с помощью t-критерия добавляли полученные величины р (*р 0,05; **р 0,01; ***р 0,005).

№ примера	% повышения ЛВП через 24 ч. (доза: 2×10 мг/кг)
1	23

B-II.3. Измерение эффективности in vivo на трансгенных мышах hCETP

Для определения действия на липопротеины и триглицериды при оральном введении трансгенным мышам [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] вводили через желудочный зонд исследуемое вещество. Перед началом эксперимента у мышей брали кровь из ретроорбитального пространства для определения холестерина и триглицеридов в сыворотке. Сыворотку получали, как описано выше в отношении хомяков, инкубацией при 4°С в течение ночи с последующим центрифугированием при 6.000 G. Через трое суток у мышей снова брали кровь для повторного определения холестерина и триглицеридов. Изменения измеренных параметров выражали в процентах от исходной величины.

№ примера	% повышения ЛВП через 3 суток (доза: 3×3 мг/кг)
1	91

С.Примеры исполнения фармацевтических составов (а)

Соединение согласно изобретению можно следующим образом перевести в фармацевтические составы

Таблетка:

Состав:

100 мг соединения согласно изобретению, 50 мг лактозы (моногидрат), 50 мг кукурузного крахмала (нативного), 10 мг поливинилпиролидона (ПВП 25) (фирма BASF, Людвигсхафен, Германия) и 2 мг стеарата магния.

Масса таблетки 212 мг. Диаметр 8 мм, радиус кривизны 12 мм.

Изготовление:

Смесь соединения согласно изобретению, лактозы и крахмала гранулируют 5%-ным раствором (масса) ПВП в воде. После сушки гранулят смешивают со стеаратом магния в течение 5 минут. Эту смесь прессуют обычным прессом для таблеток (формат таблетки см. выше). Ориентиром для прессования является сила в 15 кН.

Суспензия для орального применения:

Состав:

1000 мг соединения согласно изобретению, 1000 мг этанола (96%), 400 мг Rhodigel^® (ксантановая камедь Е-415, фирма FMC, Пенсильвания, США) и 99 г воды.

Однократной дозе в 100 мг соединения согласно изобретению соответствуют 10 мл суспензии для орального применения.

Изготовление:

Rhodigel суспендируют в этаноле, соединение согласно изобретению добавляют к суспензии. Перемешивая, добавляют воду. До окончания набухания Rhodigel перемешивают ок. 6 часов.

Раствор для орального применения:

Состав:

500 мг соединения согласно изобретению, 2.5 г полисорбата и 97 г полиэтиленгликоля 400. Однократной дозе в 100 мг соединения согласно изобретению соответствуют 20 г раствора для орального применения.

Изготовление:

Соединение согласно изобретению вводят, перемешивая, в смесь полиэтиленгликоля и полисорбата. Перемешивание продолжают до полного растворения соединения согласно изобретению.

Раствор для внутривенного применения:

Соединение согласно изобретению растворяют в физиологически приемлемом растворителе (например, изотоническом растворе поваренной соли, 5%-ном растворе глюкозы и (или) 30%-ном растворе PEG 400) в концентрации ниже насыщения. Раствор подвергают фильтрации в стерильных условиях и разливают в стерильные и свободные от пирогенов емкости для инъекций.

Исходные соединения и промежуточные продукты: (b)

Пример1А

4-циклопентил-2-изопропил-7,7-диметил-3-[4-(трифторметил)бензоил]-4,6,7,8-тетрагидрохинолин-5(1Н)-он

10,0 г (38.9 ммоль, 1.0 экв.) 3-амино-3-изопропил-1-(4-трифторметилфенил)-пропенона (представлен согласно международной заявке WO 03/028727, пример 2) помещают в 300 мл диизопропилового эфира и добавляют 2.99 мл (38.9 ммоль, 1.0 экв.) трифторуксусной кислоты и 5.45 г (38.9 ммоль, 1 экв.) 5,5-диметилциклогексан-1,3-диона. После перемешивания в течение 10 минут при комнатной температуре нагревают в водоотделителе под флегмой и добавляют 4.58 г (46.7 ммоль, 1.2 экв.) циклопентанкарбальдегида. Смесь нагревают в водоотделителе под флегмой в течение 15 часов. После охлаждения перемешивают в течение 45 минут на ледяной бане. Полученный осадок отсасывают, отмывают холодным диизопропиловым эфиром и освобождают от растворителя в вакууме высокого разрежения.

Выход: 4.15 г (23% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): =1.05 (d, 3H), 1.15 (s, 3H), 1.16 (s, 3H), 1.28 (d, 3Н), 1,24-1.61 (m, 7H), 2.30 и 2.51 (2d, 2H), 2.34 (s, 2H), 3.49 (sept, 1H), 3.81 (d, 1H), 5.96 (s, 1H), 7.66 (d, 2H), 7.77 (d, 2H) ppm.

MC (ДХИ/NН₃): m/z=460 [M+H]⁺ , 477 [M+NH₄]⁺.

Пример 2А

4-циклопентил-2-изопропил-7,7-диметил-3-[4-(трифторметил)бензоил]-7,8-дигидрохинолин-5(6H)-он

4.0 г (8.7 ммоль) соединения из примера 1А растворяют в 100 мл дихлорметана и добавляют при 0°С по порциям 2.17 г (9.6 ммоль, 1.1 экв.) 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинона (ДДХ). Нагревают при перемешивании в течение 3 часов до комнатной температуры. Смесь концентрируют в ротационном испарителе и очищают остаток хроматографией (силикагель, растворитель: изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 100:0 50:50).

Выход: 3.78 г (95.1% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): =1.09 (d, 3H), 1.11 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.19 (d, 3Н), 1.34-2.00 (m, 8H), 2.51-2.68 (m, 3H), 3.01 (m, 1H), 3.1 (s, 2H), 7.76 (d, 2H), 7.94 (m, 2H) ppm.

MC (ESI положит): m/z=458 [M+H]⁺.

Пример 3А

[(5S)-4-циклопентил-5-гидрокси-2-изопропил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3-ил][4-(трифторметил)фенил]метанон

140 мг (0,96 ммоль, 0,08 экв.) (1R,2S)-1-аминоиндан-2-ола вводят в 400 мл ТГФ и добавляют при комнатной температуре 7.80 г (47.8 ммоль, 4.0 экв.) боран-N,N-диэтиланилинового комплекса. По окончании выделения газа охлаждают до 0°С и добавляют 5.47 г (12 ммоль, 1 экв.) соединения из примера 2А, растворенного в 40 мл ТГФ. При перемешивании доводят до комнатной температуры в течение 28 часов. По окончании реакции обмена в реакционную смесь добавляют 20 мл метанола и концентрируют. Остаток распределяется между 150 мл воды и 150 мл этилового эфир уксусной кислоты. Водную фазу дважды экстрагируют в каждом случае 100 мл этилового эфира уксусной кислоты. Объединенные органические фазы отмывают 50 мл насыщенного раствора хлорида натрия, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Затем неочищенный продукт очищают хроматографией (силикагель, растворитель: изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 4:1).

Выход: 4.97 г (90,5% от теор.)

Избыток энантиомера, согласно методу 1, равен 92.5% ее.

Энантиомеры разделяют хроматографией на хиральной фазе (колонка: Chiralpak AD, 500 мм × 40 мм, 20 мкм; элюент: изогексан/изопропанол 97.5:2.5; поток: 50 мл/мин):

Выход: 4.46 г (81.2% от теор.)

Избыток энантиомера, согласно методу 1, равен 98.1% ее;

R_t (Метод 1)=7.09 мин.

¹ H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): =0,94-1.30 (m, 12H), 1.31-2.03 (m, 11H), 2.53 (m, 1H), 2.72 (d, 1H), 2.95-3.12 (m, 1H), 3.29 (m, 1H), 5.18 (m, 1H), 7.73 (d, 2H), 7.93 (m, 2H) ppm.

MC (ДХИ): m/z=460 [M+H]⁺.

Пример 4А

((5S)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-4-циклопентил-2-изопропил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3-ил)[4-(трифторметил)фенил]метанон

3.65 г (7.95 ммоль) соединения из примера 3А в атмосфере аргона помещают в 80 мл сухого толуола. Затем при комнатной температуре добавляют 3.41 г (31.8 ммоль, 4 экв.) 2,6-лутидина и охлаждают смесь до -18°С. К этому раствору по каплям добавляют 3.65 мл (15.9 ммоль, 2 экв.) трет-бутилдиметилсилилового эфира трифторметансульфоновой кислоты. Через 20 минут нагревают до 0°С и в течение 55 минут перемешивают реакционную смесь при этой температуре. Для разделения добавляют насыщенный раствор хлорида аммония (100 мл) и после нагревания до комнатной температуры экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты. Водную фазу дополнительно дважды экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, объединенные органические фазы отмывают насыщенным раствором поваренной соли. Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографией (силикагель, растворитель: изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 9:1).

Выход: 4.65 г (количественно)

¹H-ЯМР (CDCl₃, 400 МГц): =0,09 (s, 3Н), 0,18 (s, 3Н), 0,86 (s, 9H), 0,92 (s, 3Н), 1.04 (d, 3Н), 1.22 (d, 3Н), 1.24 (s, 3Н), 1.27-1.86 (m, 9H), 1.93-2.02 (m, 1Н), 2.50 (m, 1H), 2.58-3.23 (m, 2H), 3.32 (m, 1H), 5.20 (m, 1H), 7.73 (d, 2H), 7.83-8.00 (m, 2H) ppm.

MC (ESI положит): m/z=574 [M+H]⁺.

Пример 5А

(S)-((5S)-5-{[трет-бутил-(диметил)силил]окси}-4-циклопентил-2-изопропил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3-ил)[4-(трифторметил)фенил] метанол

К раствору 4.59 г (8.0 ммоль) соединения из примера 4А в 80 мл сухого ТГФ по каплям добавляют при 0°С 12.0 мл 1 М раствора алюмогидрида лития (12.0 ммоль, 1.5 экв.) в ТГФ. В течение 16 часов, перемешивая, нагревают до комнатной температуры. Для разделения осторожно добавляют 120 мл насыщенного раствора тартрата натрий-калия. По окончании выделения газа дважды экстрагируют этиловым эфиром уксусной кислоты, объединенные органические фазы отмывают насыщенным раствором поваренной соли, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографией и при этом отделяют диастереомеры продукта (силикагель, растворитель: изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 95:5).

Выход: 2.29 г (49.8% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): =0,13 (s, 3Н), 0,20 (s, 3H), 0,64-1.00 (m, 18H), 1.09-2.23 (m, 14H), 2.59 (d, 1H), 2.89 (m, 1H), 3.00 (m, 1H), 3.71 (m, 1H), 5.21 (t, 1H), 6.22 (br. s, 1H), 7.43 (d, 2H), 7.59 (d, 2H) ppm.

МС (ESI положит): m/z=576 [M+H]⁺

R_f=0,26 (изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 9:1).

син-диастереомер:

(R)-((5S)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-4-циклопентил-2-изопропил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-3-ил)[4-(трифторметил)фенил]метанол

Выход: 2.48 г (53.9% от теор.)

R _f=0,34 (изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 9:1).

Пример 6А

(5S)-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-4-циклопентил-3-{(S)-фтор[4-(трифторметил)фенил]метил}-2-изопропил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин

К раствору 2.38 г (4.1 ммоль) соединения из примера 5А в 40 мл сухого дихлорметана по каплям при -10°С добавляют в атмосфере аргона 0,82 мл диэтиламиносератрифторида (6.2 ммоль, 1.5 экв.). Перемешивают далее в течение 200 минут при этой температуре. Для разделения, охлаждая льдом, осторожно добавляют 40 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия. Всего проводят три экстракции этиловым эфиром уксусной кислоты. Объединенные органические фазы затем очищают насыщенным раствором поваренной соли, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Продукт очищают фильтрацией через силикагель (растворитель: циклогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 9:1).

Выход: 1.92 г (80,3% от теор.)

ЖХ-МС (Methode 3): R_t=3.85 мин.

МС (ESI положит): m/z=578 [М+Н]⁺

R_f=0,66 (изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 9:1).

Примеры исполнения: (b)

Пример 1

(5S)-4-циклопентил-3-{(S)-фтор[4-(трифторметил)фенил]метил}-2-изопропил-7,7-диметил-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-5-ол

К раствору 1.92 г (3.3 ммоль) соединения из примера 6А в 20 мл сухого ТГФ по каплям добавляют при 0°С 13.3 мл 1 М раствора тетрабутиламмония фторида (13.3 ммоль, 4.0 экв.) в ТГФ. Реакционную смесь перемешивают 4 часа на водяной бане. Для разделения разводят с помощью 100 мл этилового эфира уксусной кислоты и дважды отмывают в каждом случае 100 мл воды и 50 мл насыщенного раствора поваренной соли. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме. Продукт очищают хроматографией (силикагель, растворитель: изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 9:1 2:1).

Выход: 1.18 г (76.4% от теор.)

¹H-ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): =0,70 (d, 3Н), 1.03 (s, 3H), 1.13 (d, 3H), 1.19 (s, 3Н), 1.32-2.20 (m, 11H), 2.63-2.97 (m, 3H), 3.86 (m, 1H), 5.15 (m, 1H), 6.94 (d, 1H), 7.34 (d, 2H), 7.61 (d, 2H) ppm.

МС (ДХИ): m/z=464 [M+H]⁺

R_f =0,13 (изогексан/этиловый эфир уксусной кислоты 4:1).

Дальнейшее отделение диастереомеров, содержащихся в продукте, осуществляют с помощью хроматографии (колонка: Chiralpak AD, 500 мм × 40 мм, 20 мкм; элюент: изогексан/изопропанол 97.5:2.5; поток: 50 мл/мин).

Выход: 0,35 г (22.9% от теор.).

В. Оценка фармакологической эффективности (b)

B-I. Тест ингибирования СЕТР

В-I.1. Получение СЕТР

СЕТР получают из плазмы крови человека в частично очищенном виде посредством дифференциального центрифугирования и колоночной хроматографии и используют для теста. Для этого плотность плазмы человека доводят бромидом натрия (NaBr) до 1.21 г/мл и центрифугируют 18 часов при 50.000 об/мин и 4°С. Донную фракцию (d>1.21 г/мл) переносят на фенил-сефарозную колонку Sephadex^® 4 В (фирма Pharmacia), отмывают 0,15 М NaCl / 0,001 М трис-HCl с рН 7.4, а затем элюируют дистиллированной водой. Фракции с СЕТР-активностью собирают в пул, диализуют против 50 мМ ацетата натрия с рН 4.5 и переносят на колонку CM-Sepharose ^® (фирма Pharmacia). Затем элюируют с линейным градиентом (0-1 М NaCl). Собранные в пул фракции СЕТР диализуют против 10 мм трис-НСl с рН 7.4, а затем еще раз очищают, пропуская через колонку Mono Q^® (фирма Pharmacia).

В-I.2. Флуоресцентный тест СЕТР

Измерение переноса флуоресцирующего эфира холестерина между липосомами, катализируемого СЕТР [согласно прописи Bisgaier et al., J. Lipid Res. 34, 1625 (1993), с изменениями]:

Для изготовления донорских липосом в 600 мкл диоксана под ультразвуком при слабом нагреве растворяют 1 мг холестерил-4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен-3-додеканоата (Cholesteryl BODIPY^® FL C₁₂, фирма Molecular Probes) с 5.35 мг триолеина и 6.67 мг фосфатидилхолина и при комнатной температуре, продолжая обработку ультразвуком, очень медленно добавляют к 63 мл системы из 50 мм трис-HCl / 150 мм NaCl / 2 мм ЭДТА-буфера с рН 7,3. Затем систему в атмосфере азота обрабатывают ультразвуком в ванне Branson в течение 30 минут при мощности ок. 50 Вт, причем поддерживают температуру ок. 20°С.

Липосомы-акцепторы изготовляют аналогично из 86 мг холестерилолеата, 20 мг триолеина и 100 мг фосфатидилхолина, растворенных в 1.2 мл диоксана и 114 мл вышеназванного буфера, путем 30-минутной ультразвуковой обработки при 50 Вт (20°С).

В-I.2.1. Флуоресцентный тест с обогащенным СЕТР

Для испытания используют смесь, состоящую из 1 части вышеназванного буфера, 1 части донорских липосом и 2 частей липосом-акцепторов.

К 50 мкл тестовой смеси добавляют 48 мкл обогащенной фракции СЕТР (1-3 мкг), полученной посредством гидрофобной хроматографии из плазмы человека, а также 2 мкл раствора исследуемого вещества в ДМСО и инкубируют 4 часа при 37°С.

Изменение флуоресценции при 485/535 нм - мера переноса ХЭ; определяют ингибирование переноса по сравнению с контрольным образцом без исследуемого вещества.

№ примера	IC 50 [нм] флуоресцентный тест
1	25

B-I.2.2. Флуоресцентный тест СЕТР с плазмой человека

К 42 мкл (86 об.%) плазмы человека (Sigma P9523) добавляют 6 мкл (12 об.%) донорских липосом и 1 мкл (2 об.%) раствора исследуемого вещества в ДМСО и инкубируют 24 часа при 37°С.

Изменение флуоресценции при 510/520 нм (ширина щели 2.5 нм) мера переноса ХЭ; определяют ингибирование переноса по сравнению с контрольным образцом без исследуемого вещества.

№ примера	IC 50 [нм] флуоресцентный тест в плазме человека
1	84

B-I.2.3. Ex vivo-CETP-Fluoreszenztest

Флуоресцентный тест СЕТР Ex vivo

К 80 мкл тестовой смеси добавляют 10 мкл буфера и 2 мкл сыворотки и инкубируют 4 часа при 37°С.

Изменение флуоресценции при 485/535 нм - мера переноса ХЭ; определяют ингибирование переноса по сравнению с контрольным образцом без исследуемого вещества.

B-I.3. Получение ЛВП с радиоактивным мечением

Плотность 50 мл свежей плазмы человекас ЭДТА доводят бромидом натрия (NaBr) до 1.12 и центрифугируют при 4°С в роторе Ту 65 в течение 18 часов при 50.000 об/мин. Верхнюю фазу используют для получения холодных ЛНП. Нижнюю фазу трижды диализуют против 4 литров буфера PDB (10 мМ трис-НСl рН 7.4, 0,15 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,02% NаN ₃). На 10 мл объема ретентата затем добавляют 20 мкл ³H-холестерина (Dupont NET-725; 1 мкКи/мкл, раствор в этаноле) и инкубируют 72 часа при 37°С в атмосфере азота.

Плотность образца доводят затем NaBr до 1.21 и центрифугируют в роторе Ту 65 в течение 18 часов при 50.000 об/мин и 20°С. Отбирают верхнюю фазу и очищают фракцию липопротеинов градиентным центрифугированием. Для этого плотность изолированной меченой фракции липопротеинов доводят NaBr до 1.26. По 4 мл этого раствора покрывают в центрифужных пробирках (ротор SW 40) 4 мл раствора с плотностью 1.21 и 4.5 мл раствора с плотностью 1.063 (плотностные растворы из буфера Puffer и NaBr), а затем центрифугируют в течение 24 часов при 38.000 об/мин, и 20°С в роторе SW 40. Промежуточный слой, расположенный между плотностями 1.063 и 1.21, содержащий меченные ЛВП, трижды диализуют против 100 объемов буфера PDB при 4°С.

Ретентат содержит ³H-ХЭ-ЛВП с радиоактивным мечением, которые после доведения до 5×106 имп/мин на мл используют для теста.

B-I.4. Тест CETP-SPA

Для исследования активности СЕТР измеряют перенос ³H-эфиров холестерина с липопротеинов ВП человека на биотинилированные липопротеины НП. Реакцию прекращают добавлением микрогранул со стрептавидином-SPA^® (фирма Amersham), а перенесенную радиоактивность определяют непосредственно в жидкостном счетчике сцинтилляции.

В тестовом образце инкубируют 10 мкл ЛВП-³Н-эфиров холестерина (ок. 50.000 имп./мин) с 10 мкл биотин-ЛНП (фирма Amersham) в 50 мМ HEPES /0,15 М NaCl / 0,1% бычьего сыворотчного альбумина (БСА) / 0,05% NаN₃ с рН 7.4 с 10 мкл СЕТР (1 мг/мл) и 3 мкл раствора исследуемого вещества в 10% ДМСО /1% БСА в течение 18 часов при 37°С. Затем добавляют 200 мкл раствора микрогранул SPA-стрептавидина (TRKQ 7005), инкубируют еще 1 час, встряхивая, а затем измеряют в счетчике сцинтилляции. В качестве контроля используют соответствующие 10 мкл буфера, 10 мкл СЕТР при 4°С, а также 10 мкл СЕТР, прошедшие инкубацию при 37°С.

Активность, перенесенную СЕТР при 37°С в контрольных образцах, принимают за 100% переноса. Концентрации вещества, при которых этот перенос уменьшается вдвое, приводят в качестве величины IC₅₀ .

№ примера	IC 50 [нм] SPA - тест
1	12

В-II.1. Измерение активности ex vivo на трансгенных мышах hCETP

Для проверки ингибиторной активности СЕТР вещества с помощью желудочного зонда орально вводят трансгенным мышам hCETP собственной селекции [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)]. Для этого за день до начала эксперимента самцов разделяют на рандомизированные группы одинаковой численности, как правило, n=4. Перед введением вещества для определения базовой активности СЕТР в сыворотке у каждой мыши берут кровь из ретроорбитального венного сплетения (время Т1). Затем животным через желудочный зонд вводят исследуемое вещество. К определенному времени после введения исследуемого вещества у животных второй раз берут кровь (время Т2), как правило, по прошествии 16 или 24 часов после введения; при необходимости это, однако, можно осуществлять и в другое время.

Для оценки ингибиторной активности вещества в каждый момент, т.е. через 16 или 24 часа, использовали соответствующую контрольную группу, животные из которой получали только рецептурное средство без исследуемого вещества. У каждого контрольных животных, так же, как и у таковых, получавших вещество, также дважды брали кровь, чтобы определить изменение активности СЕТР без ингибитора за время эксперимента (16 или 24 часа).

Образцы крови по окончании свертывания центрифугировали и пипеткой отбирали сыворотку. Для определения активности СЕТР измеряли транспорт эфиров холестерина на протяжении 4 часов. Для этого в тестовых образцах применяли, как правило, 2 мкл сыворотки; тест проводили, как описано в В-I.2.3.

Разницу в транспорте эфиров холестерина [рМ ХЭ/ч. (Т2) - рМ ХЭ/ч. (Т1)] рассчитывали для каждого животного и усредняли по группам. Вещество, снижавшее к одному из моментов транспорт на величину более 20%, считали эффективным.

№ примера	% ингибирования при 3 мг/кг
16 ч	24 ч
1	49	39

B-II.2. Измерение эффективности in vivo на переднеазиатских хомяках

Для определения действия ингибиторов СЕТР на липопротеины и триглицериды сыворотки при оральном введении использовали самок переднеазиатского хомяка массой 150-200 г собственной селекции (линия BAY:DSN). Животных собирали в группы по шесть в клетке и акклиматизировали в течение двух недель, снабжая кормом и водой без ограничений.

Непосредственно перед началом эксперимента и после введения вещества у животных брали из ретроорбитального венного сплетения кровь, из которой после 30 минут инкубации при комнатной температуре и 20 минут центрифугирования при 30.000 G получали сыворотку. Вещества растворяли в смеси из 20% солутола и 80% воды и вводили перорально с помощью желудочного зонда. Контрольные животные получали те же объемы растворителя без исследуемого вещества.

Определение триглицеридов, общего холестерина, холестерина ЛВП и ЛНП проводили с помощью анализатора COBAS INTEGRA 400 plus (фирма Roche Diagnostics) no указаниям изготовителя. Из результатов измерения для каждого параметра рассчитывали изменение, вызванное дачей вещества, для каждого животного и указывали его среднюю величину со стандартным отклонением на группу (n=6 или n=12). Если эффекты вещества оказывались значимы по сравнению с группой, получавшей растворитель, то с помощью t-критерия добавляли полученные величины р (*р 0,05; **р 0,01; ***р 0,005).

№ примера	% повышения ЛВП через 24 ч (доза: 2×10 мг/кг)
1	20

B-II.3. Измерение эффективности in vivo на трансгенных мышах hСЕТР

Для определения действия на липопротеины и триглицериды при оральном введении трансгенным мышам [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] вводили через желудочный зонд исследуемое вещество. Перед началом эксперимента у мышей брали кровь из ретроорбитального пространства для определения холестерина и триглицеридов в сыворотке. Сыворотку получали, как описано выше в отношении хомяков, инкубацией при 4°С в течение ночи с последующим центрифугированием при 6.000 G. Через трое суток у мышей снова брали кровь для повторного определения холестерина и триглицеридов. Изменения измеренных параметров выражали в процентах от исходной величины.

№ примера	% повышения ЛВП через 3 суток (доза: 3×3 мг/кг)
1	85

С. Примеры исполнения для фармацевтических составов (b)

Соединение согласно изобретению можно следующим образом перевести в фармацевтические составы.

Таблетки:

Состав:

100 мг соединения согласно изобретению, 50 мг лактозы (моногидрат), 50 мг кукурузного крахмала (нативного), 10 мг поливинилпиролидона (ПВП 25) (фирма BASF, Людвигсхафен, Германия) и 2 мг стеарата магния.

Масса таблетки 212 мг. Диаметр 8 мм, радиус кривизны 12 мм.

Изготовление:

Смесь соединения согласно изобретению, лактозы и крахмала гранулируют 5%-ным раствором (масса) ПВП в воде. После сушки гранулят смешивают со стеаратом магния в течение 5 минут. Эту смесь прессуют обычным прессом для таблеток (формат таблетки см. выше). Ориентиром для прессования является сила в 15 кН.

Суспензия для орального применения:

Состав:

1000 мг соединения согласно изобретению, 1000 мг этанола (96%), 400 мг Rhodigel^® (ксантановая камедь Е-415, фирма FMC, Пенсильвания, США) и 99 г воды.

Однократной дозе в 100 мг соединения согласно изобретению соответствуют 10 мл суспензии для орального применения.

Изготовление:

Rhodigel суспендируют в этаноле, соединение согласно изобретению добавляют к суспензии. Перемешивая, добавляют воду. До окончания набухания Rhodigel перемешивают ок. 6 часов.

Раствор для орального применения:

Состав:

500 мг соединения согласно изобретению, 2.5 г полисорбата и 97 г полиэтиленгликоля 400. Однократной дозе в 100 мг соединения согласно изобретению соответствуют 20 г раствора для орального применения.

Изготовление:

Соединение согласно изобретению вводят, перемешивая, в смесь полиэтиленгликоля и полисорбата. Перемешивание продолжают до полного растворения соединения согласно изобретению.

Раствор для внутривенного применения:

Соединение согласно изобретению растворяют в физиологически приемлемом растворителе (например, изотоническом растворе поваренной соли, 5%-ном растворе глюкозы и/или 30%-ном растворе PEG 400) в концентрации ниже насыщения. Раствор подвергают фильтрации в стерильных условиях и разливают в стерильные и свободные от пирогенов емкости для инъекций.