олигопептид, стимулирующий пролиферацию фолликулярных клеток щитовидной железы

Формула изобретения

Олигопептид общей формулы I:



где X1 представляет собой Trp или Tyr;

Х2 представляет собой Gly или Gln, или Glu, или Asp,

Х3 представляет собой Tyr или Trp,

стимулирующий пролиферацию фолликулярных клеток щитовидной железы.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии и медицины, а именно к биологически активным веществам пептидной природы, модулирующим активность некоторых факторов роста по отношению к стимуляции пролиферации тироксинпродуцирующих фолликулярных клеток щитовидной железы, и может найти применение в медицине и экспериментальной биохимии.

Щитовидная железа производит два тироидных гормона, отличающихся лишь наличием или отсутствием одного дополнительного атома йода в молекуле - тироксин (T₄) и трийодтиронин (Т₃). При этом тироксин является, фактически, прогормоном, так как перед тем как оказать действие на клетки органов-мишеней, большая часть тироксина непосредственно в клетках конвертируется в биологически активную форму - трийодтиронин. При недостаточной секреции тироксина развивается гипотериоз - заболевание, связанное с недостаточностью гормонов щитовидной железы в организме, которое ведет к тяжелым функциональным нарушениям центральной нервной системы, эндокринной, сердечно-сосудистой, пищеварительной и других систем, а также к дистрофии и своеобразному слизистому отеку различных тканей и органов.

В зрелой щитовидной железе среди гормонопродуцирующих клеток наибольшее количество принадлежит Т₄-продуцирующим фолликулярным клеткам, которые происходят преимущественно из небольшого участка энтодермальных клеток, расположенных в основании языка [1]. Так как в щитовидной железе эпителиальные клетки составляют 70%, то их миграцию, пролиферацию и дифференцировку стимулируют соответствующие факторы роста, основными из которых являются фактор роста фибробластов, трансформирующий фактор роста и эпидермальный фактор роста, в то время как пролиферацию тироидных фолликулярных клеток стимулирует специфический регулятор - тиротропный гормон, или тиротропин [2].

Тиротропный гормон (ТТГ) представляет собой гликопротеин с альфа-, бета-димерной структурой и молекулярной массой около 30 кДа. Подобно другим гормонам данной группы он связывается с рецепторами плазматических мембран и стимулирует пролиферацию тироцитов через аденилатциклазный путь [2]. Кроме того, ТТГ активирует аденилатциклазу и фосфорилазу С. Активация фосфорилазы С приводит к образованию диацилглицерина (ДАГ) и инозитол-трифосфата. ДАГ активирует протеинкиназу С, а инозитол-трифосфат увеличивает внутриклеточную концентрацию ионизированного кальция, стимулируя тем самым клеточную пролиферацию [2]. Сам ТТГ достаточно большой белок, выделение которого представляет достаточные трудности.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала биологически активных веществ пептидной природы.

Основной технический результат, который может быть получен при осуществлении настоящего изобретения, заключается в создании нового олигопептида, модулирующего активность тиротропного гормона по отношению к стимуляции пролиферации тироксинпродуцирующих фолликулярных клеток щитовидной железы

Данный результат достигается за счет создания олигопептида общей формулы

где Х1 представляет собой Тrp или Тyr;

Х2 представляет собой Gly, или Gln, или Glu, или Asp;

Х3 представляет собой Тyr или Тrp.

В формуле: Тrp - триптофан, Тyr - тирозин, Gly - глицин, Gln - глутамин, Glu - глутаминовая кислота, Asp - аспарагиновая кислота.

Полученные низкомолекулярные синтетические олигопептиды имеют высокую чистоту и доступны в синтезе. Их активность несколько ниже целого ТТГ, но последний недостаток компенсируется вводимой концентрацией олигопептида.

Формула заявляемого олигопептида была выявлена по результатам компьютерного конструирования участков связывания ( 2 адренорецептора с его антителами, которые высокогомологичны рецептору тиротропного гормона (гомология 46%). Выравнивание первичных структур рецептора тиротропного гормона и 2 адренорецептора проводили с использованием общедоступной программной реализации стандартных алгоритмов BLAST и ALIGN консорциума UniProt [3]. Данные первичных структур белков, подвергаемых скринингу, импортировали из общедоступной базы данных GenomNet [4]. Компьютерное конструирование участков связывания 2 адренорецептора с его антителами проводили с помощью программного комплекса [5], осуществляющего компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул и дизайн низкомолекулярных соединений, ответственных за биологическую функцию белка.

Нижеследующие чертежи составляют часть описания настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять путем обращения к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.1 представлена пространственная структура комплекса 2 адренорецептор/антитела к 2 адренорецептору [8].

На фиг.2 представлена пространственная структура комплекса 2 адренорецептор/антитела к 2 адренорецептору с идентифицированным функциональным сайтом белка Г-КСФ (функциональный сайт выделен зеленым цветом).

Пример 1. Поиск белков, высокогомологичных тиротропному гормону

Для поиска соединений, высокогомологичных рецептору тиротропного гормона, использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные структуры белков, импортированные из общедоступной базы данных GenomNet [4]. В базе данных банка осуществляли скрининг первичных структур белков и их клеточных рецепторов, используя общедоступную программную реализацию стандартных алгоритмов BLAST и ALIGN консорциума UniProt [3]. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру комплекса 2 адренорецептор/антитела к 2 адренорецептору [6] (фиг.1), в котором 2 адренорецептор имеет с рецептором тиротропного гормона гомологию 46%.

Пример 2. In silico конструирование функционального сайта ТТГ на основе пространственной структуры комплекса 2 адренорецептор/антитела к 2 адренорецептору с учетом гомологии ТТГ и антител к 2 адренорецептору

Для осуществления конструирования функционального сайта ТТГ использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [7]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры комплекса 2 адренорецептор/антитела к 2 адренорецептору. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру комплекса Г-КСФ/рецептор [6] (фиг.1).

Далее проводили компьютерное моделирование, которое позволило идентифицировать аминокислотные остатки антител к 2 адренорецептору, принимающие участие в их взаимодействии с 2 адренорецептором (фиг.2).

Из представленных на фиг.2 данных, по результатам компьютерного моделирования можно сделать вывод, что заявляемый олигопептид представляет собой функциональный сайт тиротропного гормона, принимающий участие в связывании с его клеточными рецепторами и стимулирующий пролиферацию пролиферации фолликулярных клеток щитовидной железы. Данное соединение может найти применение в медицине и в экспериментальной биохимии.

Пример 3. Химический синтез заявляемых соединений

Всего было получено методами классической пептидной химии в растворе последовательным наращиванием с N-конца аналогично методикам, описанным в [8, 9, 10], 16 трипептидов:

1. W-G-Y

2. W-Q-Y

3. W-E-Y

4. W-D-Y

5. W-G-W

6. W-Q-W

7. W-E-W

8. W-D-W

9. Y-G-Y

10. Y-Q-Y

11. Y-E-Y

12. Y-D-Y

13. Y-G-W

14. Y-Q-W

15. Y-E-W

16. Y-D-W

Пример 4. Биологические испытания заявляемых олигопептидов

В соответствии с методиками, описанными в работе [11], были исследованы синтезированные вещества 1-16. Выбраны были 16 опытных групп и одна контрольная. В каждой группе находилось по 5 беспородных белых крыс весом от 225-250 г. Эксперимент проводился в течение 21 дня. Пептидные соединения вводились в объеме 3 мл внутрибрюшинно в концентрации 10 мг/мл в первый день начала эксперимента. Контрольная группа - водился физиологический раствор в таком же объеме. Животные содержались в типовых условиях вивария. На 3, 7, 14 и 21 сутки у них производился забор венозной крови. С помощью РИА наборов, производства ХОП ИБОХ РБ, исследовалось содержание тироксин (Т ₄) и трийодтиронин (Т₃), а методом, описанным в [11], определяли количество пролиферации фолликулярных клеток щитовидной железы.

В результате было установлено, что полученные аналоги природного гормона стимулировали достоверно (p<0,05) рост 150-200% исследуемых параметров - тироксин (Т ₄) и трийодтиронин (Т₃), а пролиферации фолликулярных клеток на 450-500%.

Результаты биологических испытаний представлены в таблице.

№ соед-я	Результаты введения пептидных аналогов по отношению к контролю, %
Начало Эксперимента	3 сутки, Т3/T4	7 сутки, Т3/T4	14 сутки, Т3/Т4	21 сутки, Т3/T4	Пролиферации фолликулярных клеток
1	100	100/100	100/100	115/150	145/200	450
2	100	100/100	100/100	120/170	150/210	460
3	100	100/100	105/110	125/190	150/250	500
4	100	100/100	105/110	125/190	150/250	495
5	100	100/100	105/110	125/190	150/250	450
6	100	100/100	105/110	115/150	145/240	460
7	100	100/100	105/110	135/180	150/250	460
8	100	100/100	105/110	115/150	145/215	460
9	100	100/100	100/100	115/150	145/215	480
10	100	100/100	100/100	110/150	145/215	475
11	100	100/100	100/100	105/150	145/240	455
12	100	100/100	100/100	115/150	145/240	500
13	100	100/100	105/110	125/190	145/200	495
14	100	100/100	105/110	115/150	150/210	460
15	100	100/100	105/110	115/160	150/250	500
16	100	100/100	105/110	115/160	150/250	495

Статистический разброс данных по Т₃ и Т₄ составлял +/- 5-8%, а для количества фолликулярных клеток +/- 10-12%.

Источники информации

1. Vliet, Van G. Development of the thyroid gland: lessons from congenitally hypothyroid mice and men / Van G. Vliet // Clin. Genet. - 2003. - Vol.63, № 6. - P.445-455.

2. Дедов И.И. Молекулярно-генетические аспекты новообразований щитовидной железы / И.И.Дедов [и др.] // Проблемы эндокринологии. - 2000. - Т.46, N2. - С.22-30.

3. The UniProt Consortium // Nucleic Acids Research. 2008. Vol.36. P. D190-D195.

4. Kanehisa M. // Trends Biochem. Sci. 1997. Vol.22. P.442-444.

5. Шутова И.В. Компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул / И.В. Шутова, Л.М. Чемитова, В.П. Голубович // Химия, структура и функция биомолекул: Тез. докл. - Мн., 2006. - С.PR-162.

6. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=2R4R.

7. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.

8. Гринштейн Дж. Химия аминокислот и пептидов / Дж.Гринштейн, M.Винниц; под ред. М.М.Шемякина. - Москва: Мир, 1965. - 882 с.

9. Гершкович А.А. Синтез пептидов. Реагенты и методы / А.А.Гершкович, В.К.Киберев. - Киев: Наук. Думка, 1987. - 264 с.

10. Шредер Э. Пептиды./ Э.Шредер, К.Любке; под ред. М.М.Шемякина, Ю.А.Овчинникова. - Москва: Мир, 1967.

11. Hood A., Liu Ya Ping, Gattone II V., Klaassen C.D. //Toxicological Sci. 1999, Vol.49. - P.263-271.