экспрессия плазминогена и микроплазминогена в ряске

Формула изобретения

1. Способ получения высоких уровней стабильного плазминогена в ряске, где указанный плазминоген может быть активирован для получения полипептида, обладающего активностью сериновой протеазы, предусматривающий стадии:

(a) культивирования растения ряски, или клетки растения, или клубенька ряски, где указанное растение ряски, или клетка растения, или клубенек ряски стабильно трансформировано молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую плазминоген; и

(b) сбора указанного плазминогена из указанного растения ряски, или клетки растения, или клубенька ряски.

2. Способ по п.1, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая плазминоген, функционально связана с кодирующей последовательностью для сигнального пептида.

3. Способ по п.1, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая плазминоген, имеет по меньшей мере один признак, выбранный из группы, состоящей из:

(a) предпочтительных для ряски кодонов в кодирующей последовательности для указанного плазминогена;

(b) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей интрон растения, которая встроена против хода транскрипции от кодирующей последовательности; и

(с) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей лидерную последовательность, которая увеличивает трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей плазминоген.

4. Способ по п.3, где нуклеотидная последовательность, кодирующая плазминоген, содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

5. Способ по п.3, где указанный интрон растения происходит из гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы.

6. Способ по п.5, где указанный интрон растения состоит, по существу, из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.

7. Способ по п.3, где указанная лидерная последовательность происходит из гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы 5В Lemna gibba.

8. Способ по п.7, где указанная лидерная последовательность состоит, по существу, из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.

9. Способ по п.3, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая плазминоген, является нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3.

10. Способ по п.1, где указанный плазминоген является плазминогеном человека.

11. Способ по п.10, где указанный плазминоген имеет по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4.

12. Способ по п.1, где по меньшей мере 2% растворимого белка в растении ряски или в клетке растения ряски являются плазминогеном.

13. Способ по п.12, где по меньшей мере 3% растворимого белка в растении ряски или в клетке растения ряски являются плазминогеном.

14. Способ по п.13, где по меньшей мере 4% растворимого белка в растении ряски или в клетке растения ряски являются плазминогеном.

15. Способ получения высоких уровней стабильного микроплазминогена в ряске, где указанный микроплазминоген может быть активирован для получения полипептида, обладающего активностью сериновой протеазы, предусматривающий стадии:

(a) культивирования в среде для культивирования ряски культуры растений ряски, культуры клеток растений или клубеньков ряски, где указанная культура растения ряски, или культура клеток растений, или клубеньков ряски стабильно трансформирована молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую микроплазминоген, и функционально связанную кодирующую последовательность для сигнального пептида; и

(b) сбора указанного микроплазминогена из культуральной среды ряски.

16. Способ по п.15, где указанный микроплазминоген секретируется в культуральную среду ряски.

17. Способ по п.16, где указанная культуральная среда ряски содержит по меньшей мере 1 мг/л микроплазминогена, как определено количественным Вестерн-блоттингом.

18. Способ по п.16, где указанная культуральная среда ряски содержит по меньшей мере 2 мг/л микроплазминогена, как определено количественным Вестерн-блоттингом.

19. Способ по п.16, где указанная культуральная среда ряски содержит по меньшей мере 5 мг/л микроплазминогена, как определено количественным Вестерн-блоттингом.

20. Способ по п.19, где указанная культуральная среда ряски содержит по меньшей мере 10 мг/л микроплазминогена, как определено количественным Вестерн-блоттингом.

21. Способ по п.15, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая микроплазминоген, и функционально связанная кодирующая последовательность для сигнального пептида имеет по меньшей мере один признак, выбранный из группы, состоящей из:

(a) предпочтительных для ряски кодонов в кодирующей последовательности для указанного микроплазминогена;

(b) предпочтительных для ряски кодонов в кодирующей последовательности для указанного сигнального пептида;

(c) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей интрон растения, которая встроена против хода транскрипции от кодирующей последовательности; и

(d) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей лидерную последовательность, которая увеличивает трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей микроплазминоген.

22. Способ по п.21, где нуклеотидная последовательность, кодирующая микроплазминоген, содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

23. Способ по п.22, где нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

24. Способ по п.21, где указанный интрон растения происходит из гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы.

25. Способ по п.24, где указанный интрон растения состоит, по существу, из последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.

26. Способ по п.21, где указанная лидерная последовательность происходит из гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы 5В Lemna gibba.

27. Способ по п.26, где указанная лидерная последовательность состоит, по существу, из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.

28. Способ по п.21, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая микроплазминоген, является нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:5.

29. Способ по п.15, где указанный микроплазминоген является микроплазминогеном человека.

30. Способ по п.29, где указанный микроплазминоген имеет по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6.

31. Способ по п.15, где указанный сигнальный пептид является полипептидом альфа-амилазы риса.

32. Способ по п.31, где кодирующая последовательность для сигнального пептида содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7.

33. Способ по п.15, где указанная последовательность сигнального пептида имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8.

34. Способ по п.1, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски происходит из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

35. Способ по п.15, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски принадлежит к роду, выбранному из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

36. Способ получения высоких уровней фрагмента стабильного плазминогена в ряске, где указанный фрагмент плазминогена, будучи активированным, сохраняет активность сериновой протеазы, предусматривающий стадии:

(а) культивирования в среде для культивирования ряски растения ряски, или клетки растения, или клубенька ряски, где указанное растение ряски, или клетка растения, или клубенек ряски стабильно трансформировано молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент плазминогена; и

(b) сбора указанного фрагмента плазминогена из по меньшей мере одного источника, выбранного из указанного растения ряски, указанной клетки растения ряски, указанного клубенька ряски или указанной культуральной среды ряски.

37. Способ по п.36, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент плазминогена, функционально связана с кодирующей последовательностью для сигнального пептида.

38. Способ по п.36, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент плазминогена, имеет по меньшей мере один признак, выбранный из группы, состоящей из:

(a) предпочтительных для ряски кодонов в кодирующей последовательности для указанного фрагмента плазминогена;

(b) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей интрон растения, которая встроена против хода транскрипции от кодирующей последовательности; и

(c) функционально связанной нуклеотидной последовательности, содержащей лидерную последовательность, которая увеличивает трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент плазминогена.

39. Способ по п.38, где нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент плазминогена, содержит 70-100% предпочтительных для ряски кодонов.

40. Способ по п.38, где указанный интрон растения происходит из гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы.

41. Способ по п.36, где указанный фрагмент плазминогена содержит по меньшей мере 80 смежных аминокислот аминокислотной последовательности зрелого плазминогена.

42. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски для получения высоких уровней стабильного плазминогена, где указанный плазминоген может быть активирован для получения полипептида, обладающего активностью сериновой протеазы, и где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски трансформировано молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую плазминоген.

43. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.42, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски происходит из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

44. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.43, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски является членом вида, выбранного из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis, и Lemna gibba.

45. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски для получения высоких уровней стабильного микроплазминогена, где указанный микроплазминоген может быть активирован для получения полипептида, обладающего активностью сериновой протеазы, и где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски трансформировано молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую микроплазминоген, и функционально связанную кодирующую последовательность для сигнального пептида, который направляет секрецию микроплазминогена из указанного растения ряски, клетки растения ряски или клубенька ряски.

46. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.45, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски происходит из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

47. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.46, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски является членом вида, выбранного из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis и Lemna gibba.

48. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски для получения высоких уровней фрагмента стабильного плазминогена, который, будучи активированным, сохраняет активность сериновой протеазы, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски трансформировано молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент плазминогена.

49. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.48, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски происходит из рода, выбранного из группы, состоящей из рода Spirodela, рода Wolffia, рода Wolfiella, рода Landoltia и рода Lemna.

50. Стабильно трансформированное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски по п.49, где указанное растение ряски, клетка растения ряски или клубенек ряски является членом вида, выбранного из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis и Lemna gibba.

51. Стабильно трансформированное растение ряски для получения высоких уровней стабильного плазминогена или микроплазминогена, где указанный плазминоген или микроплазминоген может быть активирован для получения полипептида, обладающего активностью сериновой протеазы, где указанная ряска содержит ДНК-конструкцию, содержащую следующие функционально связанные элементы: лидерную последовательность, промоторную последовательность, нуклеотидную последовательность, кодирующую плазминоген или микроплазминоген, и последовательность терминации транскрипции, где указанная лидерная последовательность, указанная промоторная последовательность и указанная последовательность терминации - все функционируют в ряске.

52. Растение по п.51, где указанная лидерная последовательность является последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, а последовательность, кодирующая плазминоген, представлена в SEQ ID NO:3.

Описание изобретения к патенту

Текст описания приведен в факсимильном виде.