применение кальцитонина в качестве комбинированной терапии для лечения воспалительных болезненных состояний

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительной активностью, содержащая кальцитонин и глюкокортикоид в терапевтически эффективных количествах и фармацевтически приемлемый носитель.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где глюкокортикоид выбран из группы, состоящей из преднизона, преднизолона, дексаметазона, метилпреднизолона, будесонида, гидрокортизона, бетаметазона, триамцинолона и флудрокортизона.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно содержащая противоревматическое лекарственное средство.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно содержащая моноклональное антитело против рецептора фактора некроза опухоли (TNF-R), либо его фрагмент или производное.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4 для применения в лечении воспалительного заболевания или состояния.

6. Применение кальцитонина и глюкокортикоида в приготовлении лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания или состояния.

7. Применение по п.6, где глюкокортикоид выбран из группы, состоящей из преднизона, преднизолона, дексаметазона, метилпреднизолона, будесонида, гидрокортизона, бетаметазона, триамцинолона и флудрокортизона.

8. Применение по п.6, где лекарственное средство дополнительно содержит противоревматическое лекарственное средство.

9. Применение по п.6, где лекарственное средство дополнительно содержит моноклональное антитело против рецептора фактора некроза опухоли (TNF-R), либо его фрагмент или производное.

10. Набор для лечения воспалительного заболевания или состояния, включающий кальцитонин и глюкокортикоид, для раздельного, одновременного или последовательного введения субъекту, нуждающемуся в этом.

11. Набор для лечения воспалительного заболевания или состояния, включающий кальцитонин, глюкокортикоид и противоревматическое лекарственное средство, для раздельного, одновременного или последовательного введения субъекту, нуждающемуся в этом.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению кальцитонина в качестве комбинированной терапии для лечения воспалительных патологий и поражений кожи ревматического или подагрического происхождения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Глюкокортикоидные лекарственные средства (GCs) представляют собой мощные иммуносупрессивные и противовоспалительные агенты, которые терапевтически применяют при некоторых воспалительных патологиях. Длительная терапия GCs часто необходима для борьбы с симптомами ревматоидного артрита и других ревматических состояний. Недавние свидетельства показывают, что GCs могут обладать модифицирующим эффектом на заболевание в дополнение к их хорошо подтвержденным противовоспалительным воздействиям. Тем не менее, терапевтическое лечение длительных патологий с использованием GC часто связанно с группой нежелательных побочных эффектов, вовлекающих систему гипоталамус-гипофиз-надпочечники, сердечно-сосудистую систему, равно как и жировой обмен и метаболизм костей. В частности, вторичный остеопороз представляет собой одну из основных проблем, связанных с длительной терапией GC у пациентов с ревматоидным артритом. В вызываемом GC разрежении кости задействовано несколько механизмов, включая прямые эффекты на клетки костной ткани и модуляцию продуцирования цитокинов и факторов роста.

Кальцитонин (СТ или Ct) представляет собой пептидный гормон, лучше всего известный благодаря своей антиостеокластической активности, и является членом семейства белков, гомологи которых идентифицированы у большинства изученных на сегодняшний день видов. Кальцитонины (Cts) представляют собой пептидные гормоны из 32 аминокислотных остатков, которые стали известными, главным образом, за их гипокальциемический эффект и ингибирование резорбции кости. Кальцитонины терапевтически применяют для лечения остеопороза и других заболеваний, связанных с костными нарушениями. Было показано, что кальцитонин лосося (sCt) обладает наибольшей фармацевтической активностью в лечении болезненных состояний человека, в то время как гормон человека (hCt) обладает существенно меньшей активностью, когда его вводят в терапевтической ситуации. В результате, на сегодняшний день кальцитонин лосося (sCt) представляет собой главный Ct для терапевтического применения. Тем не менее, имеет место только 50% гомология последовательностей sCt и hCt, что представляет собой причину иммуногенных реакций у людей при лечении с использованием sCt.

Текущее состояние терапии ревматоидного артрита было существенно улучшено применением новейших биологических терапий, что снизило зависимость от стероидов и нестероидных агентов. Например, одна из наиболее широко применяемых терапий представляет собой Enbrel , конструкт рецептора TNF- , соединенный с иммуноглобулином. Тем не менее, вполне эффективные новейшие биологические терапии не подавили полностью, а только значительно смягчили симптомы. Более того, эти новые лекарственные средства очень дороги.

В силу этих причин глюкокортикоиды (GC) до сих пор наиболее широко применяют как мощные иммуносупрессивные и противовоспалительные агенты при всех формах хронического воспаления, включая ревматоидный артрит. Тем не менее, как установлено выше, длительные терапии GC связаны с вторичным остеопорозом, таким образом, полезное противовоспалительное воздействие GC может быть уменьшено усиливающим эффектом на эрозию кости.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно первому аспекту изобретения предложено применение кальцитонина в приготовлении лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания или состояния.

Кальцитонин может быть из любого подходящего источника, включая и выделенные естественные формы гормона, и синтетические, например, из рекомбинантного источника. Пептид кальцитонин может быть выбран из группы, состоящей из кальцитонина человека, лосося, свиньи, быка, угря или курицы или его активного фрагмента или производного. Кальцитониновые пептиды включают пептиды из следующих источников, но не ограничены ими:

Кальцитонины, применяемые по настоящему изобретению, также включают варианты, фрагменты и/или производные пептида кальцитонина.

Примером варианта по настоящему изобретению является слитый белок, содержащий пептид кальцитонин, как определено выше, за исключением замены одной или более чем одной аминокислоты на одну или более чем одну другую аминокислоту. Специалисту известно, то различные аминокислоты обладают похожими свойствами. Одна или более чем одна такая аминокислота вещества часто может быть заменена на одну или более чем одну другую такую аминокислоту без утраты желаемой активности этого вещества.

Таким образом, аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин часто могут быть заменены одна на другую (аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи). Из этих возможных замен предпочтительно, что глицин и аланин применяют для замены одного на другой (поскольку они имеют относительно короткие боковые цепи) и что валин, лейцин и изолейцин применяют для замены одного на другой (поскольку они имеют большие гидрофобные алифатические боковые цепи). Другие аминокислоты, которые часто могут быть заменены одна на другую, включают:

фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи), лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, имеющие основные боковые цепи), аспарагиновую и глутаминовую кислоты (аминокислоты, имеющие кислые боковые цепи), аспарагин и глутамин (аминокислоты, имеющие амидные боковые цепи), и цистеин и метионин (аминокислоты, имеющие серосодержащие боковые цепи).

Замены такого рода часто называют «консервативными» или «полуконсервативными» аминокислотными заменами.

Также могут быть сделаны аминокислотные делеции или инсерции по отношению к аминокислотной последовательности для названного выше слитого белка. Таким образом, например, аминокислоты, которые не оказывают существенного эффекта на активность полипептида или по меньшей мере не элиминируют такую активность, могут быть удалены. Такие делеции могут быть полезны, поскольку при еще сохраненной активности могут быть уменьшены общая длина и молекулярная масса полипептида. Это позволяет снизить количество полипептида, требуемое для конкретной цели, например могут быть снижены уровни доз.

Также могут быть сделаны аминокислотные инсерции по отношению к последовательности упомянутого выше слитого белка. Это может быть сделано, чтобы изменить свойства вещества по настоящему изобретению (то есть чтобы содействовать идентификации, очистке или экспрессии, как объяснено выше в отношении слитых белков).

Аминокислотные замены по отношению к данной выше последовательности могут быть сделаны с применением любой подходящей методики, например применением сайт-направленного мутагенеза или твердофазного синтеза.

Следует учесть, что аминокислотные замены или инсерции в пределах объема настоящего изобретения могут быть сделаны с применением встречающихся или не встречающихся в природе аминокислот. Независимо от того, используют ли встречающиеся в природе аминокислоты или синтетические аминокислоты, предпочтительно присутствие только L-аминокислот.

Некоторые предпочтительные замены могут представлять собой замены основных и/или кислых аминокислотных остатков на нейтральные аминокислотные остатки. Другие замены могут представлять собой замену С-концевого остатка на гомосерин (Hse).

Примеры производных включают формирование внутримолекулярных дисульфидных связей между остатками цистеина в пептиде или другими модификациями, так что образуется циклическая или кольцевая структура, но не ограничены ими. Могут быть сделаны другие посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование, гликозилирование, N-концевое амидирование и тому подобное. Гликозилирование может представлять собой добавление сахарного остатка, такого как группировка N-ацетил-D-глюкозамин.

Фрагменты пептида кальцитонина включают кальцитониновые пептиды, усеченные посредством делеции аминокислотных остатков с 1 по 9. Тем не менее, может быть предпочтительно, что остатки по меньшей мере с 17 по 21 присутствуют во фрагменте кальцитонина.

Последовательности фрагментов, усеченных посредством делеции остатков с 1 по 9, представляют собой следующие:

Предпочтительные для применения по настоящему изобретению пептиды представляют собой кальцитонин лосося (sCt), кальцитонин угря (eCt) и кальцитонин человека (hCt) из естественных или рекомбинантных источников или их активный фрагмент, например фрагмент (1-9), как описано выше.

Лечение воспалительного заболевания или состояния может включать профилактику, равно как и лечение заболевания. Субъектом лечения может быть человек или субъект, не являющийся человеком.

Воспалительное заболевание или состояние может включать ревматоидный артрит (RA), ювенильный ревматоидный артрит (JRA), остеоартрит, псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит (AS), красную волчанку, рассеянный склероз (MS), астму или иммуносупрессивную терапию (например, после операции трансплантации).

Кальцитонин, применяемый соответствии с этим аспектом изобретения, может быть изготовлен для применения любым подходящим способом. Лекарственное средство будут обычно поставлять как часть стерильной фармацевтической композиции, которая будет обычно включать фармацевтически приемлемый носитель. Эта фармацевтическая композиция может быть в любой подходящей форме (в зависимости от желаемого способа ее введения пациенту).

Она может быть предоставлена в виде стандартной лекарственной формы, будет обычно предоставлена в герметичном контейнере и может быть предоставлена как часть набора. Такой набор будет обычно (хотя и не обязательно) включать инструкции по применению. Он может включать множество указанных стандартных лекарственных форм.

Фармацевтическая композиция может быть адаптирована для введения любым подходящим способом, например пероральным (включая трансбуккальный или сублингвальный), ректальным, назальным, местным (включая трансбуккальный, сублингвальный или чрескожный), вагинальным или парентеральным (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный или внутрикожный) способом. Такие композиции могут быть приготовлены любым известным в фармацевтической области способом, например смешиванием активного ингредиента с носителем (носителями) или эксципиентом (эксципиентами) в стерильных условиях.

Фармацевтические композиции, адаптированные для перорального введения, могут быть представлены как дискретные единицы, такие как капсулы или таблетки, как порошки или гранулы, как растворы, сиропы или суспензии (в водных или неводных жидкостях, или как съедобные пены или кремы, или как эмульсии).

Подходящие эксципиенты для таблеток или твердых желатиновых капсул включают лактозу, кукурузный крахмал или их производные, стеариновую кислоту или ее соли.

Подходящие эксципиенты для мягких желатиновых капсул включают, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие высокомолекулярные спирты и тому подобное.

Эксципиенты, которые могут быть применены для приготовления растворов и сиропов, включают, например, воду, высокомолекулярные спирты и сахара. Для приготовления суспензий могут быть применены масла (например, растительные масла) для получения суспензий типа «масло в воде» и типа «вода в масле».

Фармацевтические композиции, адаптированные для чрескожного введения, могут быть представлены как дискретные пластыри для сохранения тесного контакта с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Например, активный ингредиент может быть доставлен из пластыря лекарственным электрофорезом, как, в общем, описано в Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986).

Фармацевтические композиции, адаптированные для местного введения, могут быть изготовлены как мази, кремы, суспензии, лосьоны, порошки, растворы, пасты, гели, распыляемые растворы, аэрозоли или масла. Для инфекций глаза или других наружных тканей, например рта и кожи, композиции предпочтительно применяют как местные мазь или крем. При изготовлении в виде мази активный ингредиент может быть применен с парафиновой или водорастворимой мазевой основой. Альтернативно, активный ингредиент может быть изготовлен в виде крема с основой типа крема «масло в воде» или типа «вода в масле». Фармацевтические композиции, адаптированные для местного введения в глаз, включают глазные капли, где активный ингредиент растворен или суспендирован в подходящем носителе, особенно водном растворителе. Фармацевтические композиции, адаптированные для местного введения в рот, включают лепешки, пастилки и жидкости для полоскания рта.

Фармацевтические композиции, адаптированные для ректального введения, могут быть представлены как суппозитории или клизмы.

Фармацевтические композиции, адаптированные для назального введения, где носитель представляет собой твердое вещество, включают крупный порошок, имеющий размер частиц, например, в пределах от 20 до 500 микрон, который вводят способом, которым принимают лекарственный порошок для вдыхания через нос, то есть быстрой ингаляцией через носовой ход из контейнера с порошком, удерживаемого близко к носу. Подходящие композиции для введения как распыляемый раствор для носа или капли для носа, где носитель представляет собой жидкость, включают водные или масляные растворы активного ингредиента.

Фармацевтические композиции, адаптированные для введения ингаляцией, включают тонкодисперсные порошки и аэрозоли, которые могут быть произведены посредством различных типов аэрозолей под давлением, небулайзеров или инсуффляторов с отмеренной дозой.

Фармацевтические композиции, адаптированные для вагинального введения, могут быть представлены как пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или распыляемые композиции.

Фармацевтические композиции, адаптированные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества и растворенные вещества, которые приводят композицию в состояние устойчивой изотоничности с кровью предполагаемого реципиента; водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты и загустители. Эксципиенты, которые могут быть применены для инъекционных растворов, включают, например, воду, спирты, высокомолекулярные спирты, глицерин и растительные масла. Композиции могут быть представлены в упаковках для однократного или многократного приема, например герметичных ампулах и флаконах, и их можно хранить в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед применением. Приготовленные для немедленного применения инъекционные растворы и суспензии могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток.

Фармацевтические композиции могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, отдушки, соли (вещества по настоящему изобретению могут сами по себе быть представлены в форме фармацевтически приемлемой соли), буферы, покрывающие агенты или антиоксиданты. В дополнении к веществу по настоящему изобретению они могут также содержать терапевтически активные агенты.

Дозы вещества по настоящему изобретению могут варьировать в широких пределах в зависимости от заболевания или расстройства, подлежащего лечению, возраста и состояния индивида, подлежащего лечению и тому подобного, и, в конечном счете, врач будет определять подходящие дозы для применения.

Эта доза может быть повторена так часто, как необходимо. При развитии побочных эффектов количество и/или частота доз могут быть снижены в соответствии с обычной клинической практикой.

Воплощения в соответствии с этим аспектом изобретения, таким образом, распространяются на способ лечения воспалительного заболевания или состояния, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кальцитонина.

По второму аспекту изобретения предложено применение кальцитонина, глюкокортикоида в приготовлении лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания или состояния.

Глюкокортикоид может представлять собой преднизон, преднизолон, дексаметазон, метилпреднизолон, будесонид, гидрокортизон, бетаметазон, триамцинолон или флудрокортизон. Преднизолон может представлять собой предпочтительный глюкокортикоид.

Преимущество этого аспекта изобретения состоит в том, что он позволяет снизить дозу глюкокортикоида (таким образом, снизить эффект вторичного остеопороза). Кальцитонин может эффективно действовать как функциональный антагонист вызываемого глюкокортикоидами разрежения кости. Комбинация кальцитонина и глюкокортикоида в лечении воспалительного заболевания или состояния обеспечивает синергетический эффект по сравнению с традиционным лечением с применением глюкокортикоидов самих по себе.

Воплощения в соответствии с этим аспектом изобретения, таким образом, распространяются на способ лечения воспалительного заболевания или состояния, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кальцитонина и глюкокортикоида.

Этот аспект изобретения, таким образом, также распространяется на набор, возможно, содержащий инструкции по применению, включающий кальцитонин и глюкокортикоид для раздельного, одновременного или последовательного введения субъекту, нуждающемуся в этом.

По третьему аспекту изобретения предложено применение по первому или по второму аспекту изобретения, где лекарственное средство дополнительно содержит противоревматическое лекарственное средство.

Противоревматическое лекарственное средство может представлять собой метотрексат или сульфасалазин.

Воплощения в соответствии с этим аспектом изобретения, таким образом, распространяются на способ лечения воспалительного заболевания или состояния, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кальцитонина, глюкокортикоида и противоревматического лекарственного средства.

Этот аспект изобретения, таким образом, также распространяется на набор, возможно, содержащий инструкции по применению, включающий кальцитонин, глюкокортикоид и противоревматическое лекарственное средство для раздельного, одновременного или последовательного введения субъекту, нуждающемуся в этом.

По четвертому аспекту изобретения предложено применение по первому или по второму аспекту изобретения, где лекарственное средство дополнительно содержит антитело.

Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антитела могут представлять собой человеческие или из нечеловеческого источника. Гуманизированные или полностью человеческие антитела могут быть предпочтительными согласно воплощениям изобретения, где субъект, подлежащий лечению, представляет собой человека.

Поликлональные антитела могут быть индуцированы стимуляцией их продукции у подходящего животного-хозяина (например, мыши, крысы, морской свинки, кролика, овцы, козы или обезьяны) инъекцией животному подходящего гаптена. При необходимости совместно с веществом по настоящему изобретению может быть введен адъювант. Антитела могут затем быть очищены посредством их связывания с веществом по настоящему изобретению.

Подходяще, гаптен представляет собой вещество, связанное с началом или прогрессированием воспалительного заболевания или состояния, такое как, например, TNF-рецептор (TNF-R).

Моноклональные антитела могут быть получены из гибридом. Они могут быть образованы слиянием клеток миеломы и клеток селезенки, продуцирующих желаемое антитело, с целью образования иммортализованной линии клеток. Это представляет собой хорошо известную методику Kohler & Milstein (Nature, 256 52-55 (1975)). Методики для получения моноклональных и поликлональных антител, которые связываются с определенным белком, сейчас хорошо развиты в этой области техники. Их обсуждают в стандартных руководствах по иммунологии, например в Roitt et al, Immunology second edition (1989), Churchill Livingstone, London. Альтернативно, может быть применена технология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); и как описано в WO 92/01047).

В дополнение к полным антителам термин "антитело" распространяется на их части, способные связывать гаптены. Таким образом, настоящее изобретение включает фрагменты и синтетические конструкты антител. Примеры фрагментов и синтетических конструктов антител даны Dougall et al в Tibtech 12 372-379(1994).

Фрагменты антител включают, например, фрагменты Fab, F(ab')₂ и Fv (см. Roitt et al [выше]). Fv-фрагменты могут быть модифицированы для получения синтетического конструкта, известного как одноцепочечная молекула Fv (scFv), одноцепочечный фрагмент антитела (scAb) или диатело, содержащее вариабельный домен тяжелой (V_H ) цепи, связанный с вариабельным доменом легкой (V_L ) цепи, который может быть бивалентным или биспецифичным. Такие фрагменты могут, таким образом, включать пептидный линкер, ковалентно связывающий области V_H и V_L, что способствует стабильности молекулы. Также могут быть применены меньшие пептидные фрагменты домена V_H и домена V_L.

Другие синтетические конструкты включают пептиды гипервариабельных участков (CDR). Это синтетические пептиды, содержащие детерминанты, связывающие антиген. Также могут быть применены пептидные миметики. Эти молекулы обычно представляют собой конформационно ограниченные органические кольца, имитирующие структуру CDR-петли и включающие боковые цепи, взаимодействующие с антигеном.

Синтетические конструкты включают химерные молекулы. Таким образом, например, гуманизированные (или приматизированные) антитела или их производные входят в объем настоящего изобретения. Пример гуманизированного антитела представляет собой антитело с каркасными областями человека, но гипервариабельными участками грызуна. Синтетические конструкты также включают молекулы, содержащие ковалентно связанную группировку, которая обеспечивает молекулу некоторыми желаемыми свойствами, в дополнение к связыванию антигена. Например, группировка может представлять собой метку (например, флуоресцентную или радиоактивную метку) или фармацевтически активный агент.

В предпочтительном воплощении антитело представляет собой этанерцепт. Этанерцепт (ENBREL®) представляет собой димерный слитый белок, состоящий из внеклеточной связывающей лиганд области человеческого рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) массой 75 килодальтон (р75), связанной с Fc-областью человеческого IgG1. Fc-компонент этанерцепта содержит домен СН2, домен СH3 и шарнирный участок, но не домен СН1 IgG1. Этанерцепт получают с помощью рекомбинантной ДНК-технологии в системе экспрессии клеток млекопитающих яичника китайского хомячка (СНО). Он состоит из 934 аминокислот и имеет кажущуюся молекулярную массу приблизительно 150 килодальтон.

Этанерцепт описан в ЕР 939121, ЕР 418014, ЕР 471701, ЕР 464533, ЕР 1132471, ЕР 417563, ЕР 620739, ЕР 670730, ЕР 1239043, WO 91/03553, WO 94/06476, WO 93/19777 и US 5605690.

Воплощения в соответствии с этим аспектом изобретения, таким образом, распространяются на способ лечения воспалительного заболевания или состояния, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества кальцитонина, глюкокортикоида и антитела.

Этот аспект изобретения, таким образом, также распространяется на набор, возможно, содержащий инструкции по применению, включающий кальцитонин, глюкокортикоид и антитело для раздельного, одновременного или последовательного введения субъекту.

По предпочтительному воплощению изобретения предложено применение, как описано выше, кальцитонина в приготовлении агента для лечения воспалительного заболевания или состояния, где кальцитонин представляет собой кальцитонин лосося или кальцитонин угря и лекарственное средство дополнительно включает глюкокортикоид, подходяще преднизолон, в лечении ревматоидного артрита.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предложено введение и применение до настоящего времени неизвестного противовоспалительного эффекта кальцитонина. Кальцитонин является противовоспалительным как одиночный агент, но даже более существенно эффективен с другими противовоспалительными агентами, такими как глюкокортикоиды. Кальцитонин действует синергетически с преднизолоном. Последний эффект достаточно силен для того, чтобы снизить требуемую дозу преднизолона по меньшей мере пятикратно и, таким образом, потенциально избежать вредных побочных эффектов высоких доз стероидов (например, вызываемого глюкортикоидами (GC) остеопороза).

Были проведены тесты, как описано ниже, с введением кальцитонина в животной модели ревматоидного артрита в комбинации с преднизолоном, стандартным лечением в этой модели. Фокусом кальцитонина было снизить увеличенную остеокластную резорбцию в периартикулярной кости, что связано с тяжелым ревматоидным артритом. Тем не менее, неожиданно было обнаружено, что кальцитонин обладает сильным противовоспалительным эффектом в этой модели, особенно при совместном введении с преднизолоном, когда кальцитонин усиливал противовоспалительный эффект низкой дозы преднизолона.

Предпочтительные признаки для второго и последующих аспектов изобретения представляют собой такие, как для первого аспекта с соответствующими изменениями.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение будет сейчас также описано путем иллюстрации только со ссылкой на следующие примеры, которые не следует интерпретировать как ограничение изобретения. В примерах также сделаны ссылки на некоторые графические материалы, где:

на Фиг.1 показана взаимосвязь между CIA и припухлостью лап (физикальный симптом, связанный с разрушением суставов);

на Фиг.2 показано влияние массы тела на лечение;

на Фиг.3 показаны клинические показатели;

на Фиг.4 показан уровень заболеваемости в различных группах;

на Фиг.5 и 6 приведены те же данные, что на Фиг.1 и 3, показывая только группы СТ и Pred+CT;

на Фиг.7 показана противовоспалительная активность кальцитонина самого по себе.

Эксперимент 1: Изучение эффекта лечебного протокола на экспериментально вызванный артрит

Артрит, вызываемый коллагеном II типа (CIA). Самок крыс Lewis (масса тела 150±20 г; Harlan UK Ltd Bicester, Oxfordshire, England) кормили стандартным гранулированным кормом, и животные имели свободный доступ к воде, и содержали животных на циклах 12 ч свет/темнота. Работу на животных проводили по лицензии от Home Office в соответствии с Animals (Scientific Procedures) Act (1986). Бычий назальный коллаген II типа (4 мг/мл; Sigma-Aldrich Ltd, Poole, UK) растворяли в уксусной кислоте (0,01 М), затем эмульгировали таким же объемом ледяного неполного адъюванта Фрейнда (Sigma-Aldrich). На 0 день крыс анестезировали галотаном, брили основание хвоста и внутрикожно инъецировали суспензию коллаген II типа/адъювант (400 мкг коллагена II типа на крысу). Первые признаки артрита были очевидны на 11 и 13 дни, причем максимальное воспаление наблюдали на 18-21 дни.

Вызванное СIА воспаление включало голеностопные суставы и подушечки лап задних конечностей (в тяжелых случаях с вовлечением пальцев). Голеностопные суставы задних конечностей клинически оценивали по условной шкале, ранжированной от 0 (отсутствие воспаления) до трех (тяжелое воспаление, вовлекающее голеностопные суставы, подушечки лап и пальцы). В дополнение, с 0 по 18 дни измеряли объемы задних лап с применением плетизмометра (Ugo Basile, Milan, Italy) и значения усредняли для измерения воспаления для каждого животного.

СТ лосося растворяли в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS) с 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и давали ежедневно в дозе 2 мкг/кг на крысу. Преднизолон (преднизолон 21-гемисукцинат, натриевая соль), сам по себе или с СТ, растворяли в PBS с 0,1% BSA и вводили внутрибрюшинно (i.p.) в дозах 0,6 и 3 мг/кг (соответственно 1,2 и 6,2 мкмоль/кг). Контрольные лечения состояли из PBS с 0,1% BSA.

На Фиг.1 показано, что CIA характеризовался заметным увеличением припухлости лап (физикального симптома, связанного с разрушением суставов). Лечение СТ или низкой дозой преднизолона (Pred) не изменяло припухлость лап. Тем не менее, комбинация СТ + низкая доза преднизолона приводила к заметному ослаблению припухлости лап (черные ромбы). Этот эффект более не наблюдали, когда применяли полную противовоспалительную дозу GC. Эффекты, описанные на Фиг.1, не были вторичными по отношению к изменению состояния здоровья животных, поскольку масса тела не различалась при разных лечениях (Фиг.2). На Фиг.3 показано, что изменения припухлости лап были также отражены в изменениях в клинических показателях. В заключение, на Фиг.4 проиллюстрирован уровень заболеваемости в различных группах. Вновь, защитный эффект СТ + низкой дозы преднизолона заметен. Во всех этих графических материалах величины представлены как среднее ± стандартная средняя ошибка (s.e.mean) при n=10 крыс на группу. Статистическое различие с Р-критерием, меньшим чем 0,05, было достигнуто двумя группами с высокой дозой преднизолона (с СТ или без него), равно как и группой СТ + низкая доза преднизолона (черные ромбы). На Фиг.5 и 6 приведены те же данные, что Фиг.1 и 3, показывая только группы СТ и Pred+CT.

В предшествовавших более ранних экспериментах лечение кальцитонином (0,5 мкг/крыса) оказывало мягкое противовоспалительное действие само по себе (см. Фиг.7).

Заключение

Эти результаты показывают, что комбинированное лечение кальцитонином с GC обладает противовоспалительными свойствами в модели вызываемого коллагеном артрита и позволит снизить эффективную дозу GC. Также следует отметить противовоспалительные эффекты, вызванные этой дозой СТ, которая ингибировала от 5 до 20% артритического ответа.