мутантный вирус бычьей диареи

Формула изобретения

1. Вирус бычьей вирусной диареи, содержащий, по меньшей мере, одну аминокислотную мутацию геликазного домена, где NS3 не распознается моноклональным антителом к NS3, причем антитело к NS3 выбрано из группы, состоящей из 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 и 24.8, но где сохраняется репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

2. Вирус бычьей вирусной диареи (BVDV), содержащий, по меньшей мере, одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где мутация в геликазном домене NS3 приводит к утрате распознавания моноклональным антителом, генерируемым против NS3 вируса бычьей вирусной диареи дикого типа, но где сохраняется репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса, и где вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию в геликазном домене в петле IGR, и/или в петле KHP, и/или в петле SES.

3. Вирус бычьей вирусной диареи по п.1, содержащий одну аминокислотную мутацию геликазного домена.

4. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, содержащий мутацию геликазного домена в петле IGR в аминокислотном остатке 1841.

5. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, содержащий мутацию геликазного домена в петле IGR в аминокислотном остатке 1843.

6. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, содержащий мутацию геликазного домена в петле IGR в аминокислотном остатке 1845.

7. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, содержащий мутацию геликазного домена в петле KHP в аминокислотном остатке 1867.

8. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, содержащий мутацию геликазного домена в петле KHP в аминокислотном остатке 1868.

9. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, содержащий мутацию геликазного домена в петле KHP в аминокислотном остатке 1869.

10. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, содержащий мутацию геликазного домена в петле SES в аминокислотном остатке 1939.

11. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, содержащий мутацию геликазного домена в петле SES в аминокислотном остатке 1942.

12. Вирус бычьей вирусной диареи по п.2, где вирус содержит две, три или четыре аминокислотные мутации геликазного домена.

13. Вирус бычьей вирусной диареи по п.12, содержащий две мутации геликазного домена.

14. Вирус бычьей вирусной диареи по п.13, где две мутации геликазного домена находятся в петле IGR.

15. Вирус бычьей вирусной диареи по п.14, где две мутации геликазного домена в петле IGR находятся в аминокислотных остатках 1843 и 1845.

16. Вирус бычьей вирусной диареи по п.13, где две мутации геликазного домена находятся в петле SES.

17. Вирус бычьей вирусной диареи по п.16, где две мутации геликазного домена в петле SES находятся в аминокислотных остатках 1939 и 1942.

18. Вирус бычьей вирусной диареи по п.12, содержащий три мутации геликазного домена.

19. Вирус бычьей вирусной диареи по п.18, где три мутации геликазного домена находятся в петле IGR.

20. Вирус бычьей вирусной диареи по п.19, где три мутации геликазного домена в петле IGR находятся в аминокислотных остатках 1867, 1868 и 1869.

21. Вирус бычьей вирусной диареи по п.18, содержащий три мутации геликазного домена в петле IGR и петле SES в аминокислотных остатках 1845, 1868 и 1939.

Описание изобретения к патенту

Предшествующий уровень техники

Вирус бычьей вирусной диареи (вирус BVD или BVDV) представляет собой небольшой РНК-вирус рода Pestivirus, семейства Flaviviridae. Он является близкородственным вирусам, которые являются причинными факторами пограничной болезни овец и классической чумы свиней. Заболевание, вызываемое BVDV, является широко распространенным и может быть экономически разорительным. BVDV-инфекция может приводить к проблемам воспроизводства у крупного рогатого скота и быть причиной выкидышей или преждевременных родов. BVDV способен проникать в плаценту беременного крупного рогатого скота и может приводить к рождению хронически инфицированных (РI) телят, которые являются иммунотолерантными к вирусу и устойчиво заражены вирусом на протяжении всей их жизни (Malmquist J. Am. Vet. Med. Assoc. 152: 763-768 (1968); Ross, et at., J. Am. Vet. Med. Assoc. 188: 618-619 (1986)). Инфицированный крупный рогатый скот также может демонстрировать «вирусную диарею», характеризующуюся повышенной температурой, диареей, кашлем и изъязвлением слизистой оболочки пищеварительного тракта (Olafson, et al., Come // Vet. 36: 205-213 (1946); Ramsey, et al., North Am. Vet. 34: 629-633 (1953)). Такие хронически инфицированные животные являются источником распространения вируса в стаде с последующими вспышками вирусной диареи (Liess, et al., Dtsch. Tieraertztl. Wschr. 81: 481-487 (1974)) и сильно предрасположены к инфицированию микроорганизмами, ответственными за инициацию кишечных заболеваний или пневмонии (Barber, et al., Vet. Rec. 117: 459-464 (1985)).

BVD-вирусы относят к одному из двух биотипов. Вирусы «ср» биотипа индуцируют цитопатогенный эффект в культивируемых клетках, тогда как вирусы «ncp» биотипа не индуцируют его (Gillespie, et al., Cornell Vet. 50: 73-79 (1960)). Кроме того, распознаны два основных генотипа (тип 1 и 2), оба из которых, как было показано, вызывают целый ряд клинических синдромов (Pellerin, et al., Virology 203: 260-268 (1994); Ridpath, et al., Virology 205: 66-74 (1994)). Вирионы BVD составляют 40-60 нм в диаметре. Нуклеокапсид BVDV состоит из одной молекулы РНК и капсидного белка С. Нуклеокапсид окружен липидной мембраной с двумя гликопротеинами, закрепленными в ней, Е1 и Е2. Третий гликопротеин, E^rns, свободно ассоциирован с оболочкой. Геном BVDV составляет приблизительно 12,5 кб в длину и содержит одну открытую рамку считывания, расположенную между 5'- и 3'-нетранслируемыми участками (NTRs) (Collett, et al., Virology 165: 191-199 (1988)). Полипротеин приблизительно 438 кДа транслируется с этой открытой рамки считывания и расщепляется клеточными и вирусными протеазами на по меньшей мере одиннадцать вирусных структурных и неструктурных (NS) белков (Tautz, et al., J. Virol. 71: 5415-5422 (1997); Xu, et al., J. Virol. 71: 5312-5322 (1997); Elbers, et al., J.Virol. 70: 4131-4135 (1996); и Wiskerchen, et al., Virology 184: 341-350 (1991)). Геномный порядок BVDV представляет собой p20/N^pro, р14/С, gp48/E^rns , gp25/Е1, gp53/Е2, p54/NS2, p80/NS3, p10/NS4A, p32/NS4B, p58/NS5A и p75/NS5B. P20/N^pro (Stark, et al., J. Virol. 67: 7088-7093 (1993); Wiskerchen, et al., Virol. 65: 4508-4514 (1991)) является цис-активной папаиноподобной протеазой, которая сама отщепляется от остатка синтезированного полипротеина. Капсидный белок (С), также упоминаемый как р14, является основным протеином и выполняет функции компоновки геномной РНК и формирования вириона, заключенного в оболочку. Р14/С сохраняется у разных пестивирусов. Три оболочечных протеина, gp48/E^rns, gp25/Е1 и gp53/Е2, в значительной степени гликолизированы. E^rns образует гомодимеры, ковалентно связанные дисульфидами. Отсутствие гидрофобной мембранной якорной области позволяет предположить, что E ^rns свободно ассоциирован с оболочкой. E^rns индуцирует высокие титры антител у инфицированного крупного рогатого скота, но антисыворотка обладает ограниченной вирус-нейтрализующей активностью. Е1 обнаружен в вирионах, ковалентно связанных с gp53/Е2 посредством дисульфидных связей. Е1 содержит две гидрофобные области, которые служат для заякоривания белка в мембране и в качестве сигнального пептида для начала транслокации. Е1 не вызывает существенного антителогенеза у инфицированного крупного рогатого скота, что позволяет предположить, что он может не экспонироваться на поверхности вирионов. Аналогично Е1, Е2 также имеет мембранную якорную область на своем С-конце. Однако в отличие от Е1, Е2 является очень антигенным, являясь одним из наиболее иммунодоминантных белков BVDV. Связывание антител с Е2 может эффективно нейтрализовать вирусную инфекцию, что позволяет предположить, что он может быть вовлечен в проникновение вирусов. Область полипротеина ниже структурных белков кодирует неструктурные белки и расщепляется двумя вирусными протеолитическими ферментами. Соединение NS2-NS3 расщепляется цинк-зависимой протеазой, кодируемой в NS2. С-концевой участок полипротеина BVDV, кодирующий NS3, NS4A, NS4B и NS5B, расщепляется сериновой протеазой, кодируемой N-концевым доменом NS3. NS3 является еще одним основным BVDV-иммуногеном, так как инфицированный крупный рогатый скот развивает сильный гуморальный ответ к нему. Наоборот, в сыворотке BVDV-инфицированного крупного рогатого скота не обнаружены антитела к другим неструктурным белкам, и можно обнаружить только слабый гуморальный иммунный ответ на NS4A.

NS3 обнаружен исключительно в цитопатических изолятах BVDV, и, на основании сравнений среди подтипов BVDV и других пестивирусов, область, кодирующая белок, является одной из наиболее консервативных в геноме BVDV. С-концевой участок NS3 кодирует РНК-зависимую NTP-азу/геликазу и, на основании сравнений последовательностей высококонсервативных аминокислотных мотивов геликаз, геликазу BVDV классифицировали как геликазное надсемейство-2 (SF2). В рамки этого надсемейства входят аналогичные белки из поти-, флави- и пестивирусов, включая геликазу NS3 вируса чумы свиней (классическая чума свиней), и РНК-геликазы из других флавивирусов, таких как вирус западного Нила, вирус желтой лихорадки, вирус гепатита С (HCV) и вирус японского энцефалита. Молекулярная структура протеазных и геликазных доменов HCV NS3 была определена (Yao, et al., Nat Struct Biol. 4: 463-7 (1997); Jin and Peterson, Arch Bioxchem Biophys 323: 47-53 (1995)). Протеазный домен содержит двойную -цилидровую складку, которая обычно встречается среди членов семейства химотрипсиновых сериновых протеаз. Геликазный домен содержит два структурно близких - - субдомена и третий субдомен из семи спиралей и трех коротких -нитей, обычно упоминаемый как геликазный -спиральный субдомен. Нуклеозидтрифосфат (NTP) и РНК-связывающие центры, так же как геликазный активный центр, экспонированы на поверхности, в то время как протеазный активный центр не экспонирован на поверхности и ориентирован в направлении геликазного домена. Протеазные и геликазные домены ковалентно связаны короткой экспонированной на поверхности молекулярной цепочкой и взаимодействуют на большой площади поверхности . Геликазный активный сайт, однако, ориентирован в сторону от этой поверхности взаимодействия.

Среди вакцин BVDV в настоящее время доступными являются те, которые содержат химически инактивированный вирус дикого типа (McClurkin, et al., Arch. Virol. 58: 119 (1978); Fernelius, et al., Am. J. Vet. Res. 33: 1421-1431 (1972); и Kolar, et al., Am. J, Vet. Res. 33: 1415-1420 (1972)). Обычно такие вакцины требуют введения многократных доз и генерируют кратковременный иммунный ответ; они также не защищают от эмбрионального переноса вируса (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11: 615-625 (1995)). У овец субъединичная вакцина, базирующаяся на очищенном белке Е2, описана у Bruschke, et al., Vaccine 15: 1940-1945 (1997). Несмотря на то что такая вакцина осуществляет защиту плода от инфицирования, защита ограничена только гомологичным штаммом вируса и нет корреляции между титрами антител и защитой.

Модифицированный живой вирус (MLV) вакцин BVDV получали, используя вирус, ослабленный повторным пассированием в бычьих или свиных клетках (Coggins, et al., Cornell Vet. 51: 539 (1961); и Philips, et al., Am. J. Vet. Res. 36: 135 (1975)), или химически индуцированными мутациями, что придает вирусу температурочувствительный фенотип (Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 45: 2498 (1984); и Lobmann, et al., Am. J. Vet. Res. 47: 557-561 (1986)). Доказано, что однократная доза вакцины MLV BVDV является достаточной для обеспечения защиты от инфекции, и длительность иммунитета у вакцинированного крупного рогатого скота может распространяться на многие годы (Coria, et al., Can. J.Con. Med. 42: 239 (1978)). Кроме того, описана перекрестная защита при использовании вакцин MLV (Martin, et al., In "Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases", 75: 183 (1994)). Однако соображения безопасности - включая перенос вакцинного штамма в плод - представляют собой главный вопрос при использовании таких модифицированных живых вирусных вакцин (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11: 615-625 (1995)).

На основании вышеизложенного становится понятно, что существует необходимость в новых и более эффективных вакцинах для контроля распространения вируса BVDV. Такая вакцина могла бы стать неоценимой в будущих национальных и региональных программах уничтожения вируса BVDV, a также ее можно было бы комбинировать с другими маркированными вакцинами, что представляло бы значительное улучшение в животноводстве. Одной из таких вакцин является «маркированная» вакцина. В такой вакцине отсутствует антигенная детерминанта, присутствующая в вирусе дикого типа. Животные, инфицированные вирусом дикого типа, генерируют иммунный ответ к «маркированной» иммуногенной детерминанте, в то время как неинфицированные, вакцинированные животные не генерируют его из-за отсутствия детерминанты в маркированной вакцине. Используя иммунологический анализ, направленный на маркированную детерминанту, инфицированных животных можно отделить от вакцинированных, неинфицированных животных. Путем выбраковки инфицированных животных стадо может со временем стать безвирусным в отношении вируса BVDV. Сертификация стада безвирусного в отношении BVDV, в дополнение к выгоде от исключения угрозы заболевания BVD, имеет прямые привилегии в плане торгово-экономических преимуществ.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение направлено на вирус бычьей вирусной диареи, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где мутация в домене NS3 приводит к утрате распознавания моноклональным антителом, генерированным на NS3 дикого типа, но где сохраняются репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

Настоящее изобретение также направлено на новую маркированную вакцину против бычьей вирусной диареи, содержащую вирус бычьей вирусной диареи, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где NS3 не распознается стандартным моноклональным антителом к NS3, таким как, например, 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 и 24.8, но где сохраняются репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

Настоящее изобретение также относится к анализу определения того, вакцинировано ли животное, или оно невакцинировано или инфицировано вирусом BVDV.

В одном воплощении настоящего изобретения предложен вирус бычьей вирусной диареи, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где мутация в геликазном домене приводит к утрате способности распознавания моноклональным антителом, генерированным против NS3 из вируса бычьей вирусной диареи дикого типа, но где сохраняется репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен вирус бычьей вирусной диареи, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в геликазном домене, где NS3 не распознается моноклональным антителом к NS3 и где антитело к NS3 выбрано из группы, состоящей из 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 и 24.8, но где сохраняется репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

В еще одном воплощении изобретения вирусная вакцина содержит одну аминокислотную мутацию геликазного домена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирусная вакцина содержит мутацию геликазного домена в пределах петли IGR.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотном остатке 1841.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотном остатке 1843.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотном остатке 1845.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли КНР.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли КНР в аминокислотном остатке 1867.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли КНР в аминокислотном остатке 1868.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли КНР в аминокислотном остатке 1869.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли SES.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли SES в аминокислотном остатке 1939.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит мутацию геликазного домена в пределах петли SES в аминокислотном остатке 1942.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит две, три или четыре аминокислотные мутации геликазного домена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит две мутации геликазного домена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи включает две мутации геликазного домена в пределах петли IGR.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит две мутации геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотных остатках 1843 и 1845.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит две мутации геликазного домена в пределах петли SES.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи включает две мутации геликазного домена в пределах петли SES в аминокислотных остатках 1939 и 1942.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит три мутации геликазного домена.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи содержит три мутации геликазного домена в пределах петли IGR.

В еще одном воплощении по настоящему изобретению вирус бычьей вирусной диареи содержит три мутации геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотных остатках 1867, 1868 и 1869.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирус бычьей вирусной диареи включает три мутации геликазного домена в пределах петель IGR и SES в аминокислотных остатках 1845, 1868 и 1939.

В одном особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложена маркированная вирусная вакцина против бычьей вирусной диареи, содержащая вирус бычьей вирусной диареи, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена, где мутация геликазного домена NS3 приводит к утрате распознавания моноклональным антителом, генерируемым против NS3 вируса бычьей вирусной диареи дикого типа, но где сохраняется репликация вирусной РНК и генерация инфекционного вируса.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен способ дифференциации животного, инфицированного вирусом бычьей вирусной диареи, от животного, вакцинированного вирусной вакциной против бычьей вирусной диареи. В этом воплощении вакцина против бычьей вирусной диареи представляет маркированную вакцину, содержащую по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена, и способ включает:

получение тестируемого образца от тестируемого животного;

обнаружение вируса бычьей диареи в тестируемом образце; и

определение, содержит ли вирус бычьей вирусной диареи мутацию.

В еще одном воплощении настоящего изобретения способ обнаружения вируса бычьей вирусной диареи включает применение по меньшей мере одного моноклонального антитела.

Предпочтительный способ включает аминокислотную мутацию геликазного домена маркированной вакцины в геликазном домене NS3.

Например, воплощение такого дифференциального анализа может включать следующие стадии:

добавление меченого антитела, способного обнаружить вирус бычьей вирусной диареи дикого типа или способного обнаружить мутантный вирус бычьей вирусной диареи в тестируемом образце, где тестируемый образец содержит биологическую жидкость от тестируемого животного; и

измерение аффинности связывания меченого антитела с вирусом бычьей вирусной диареи дикого типа или с мутантным вирусом бычьей вирусной диареи путем приведения в контакт по меньшей мере одного моноклонального антитела с вирусом бычьей вирусной диареи дикого типа или с мутантным вирусом бычьей вирусной диареи; и

определение статуса вакцинации тестируемого животного путем сравнения аффинности связывания посредством применения моноклонального антитела, направленного на вирус BVDV дикого типа по сравнению с вирусом BVDV с мутантным NS3.

Предпочтительный способ включает добавление меченого первого антитела, направленного на домен, отличный от мутантного NS3; и

добавление меченого второго антитела, направленного на мутантный участок NS3.

В одном воплощении этого способа первое антитело направлено на вирус дикого типа.

В еще одном воплощении этого способа второе антитело направлено на мутантный участок NS3.

В еще одном воплощении этого способа второе антитело направлено против NS3 и выбрано из группы, состоящей из 20.10.6; 1.11.3; 21.5.8 и 24.8.

В еще одном воплощении данного способа второе антитело направлено по меньшей мере на один мутантный участок NS3, выбранный из группы, состоящей из петли IGR, петли КНР и петли SES.

В еще одном воплощении способа вирус бычьей вирусной диареи содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена в пределах петли IGR в аминокислотном остатке, выбранном из группы, состоящей из 1841, 1843 и 1845.

В еще одном воплощении способа вирус бычьей вирусной диареи содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена в пределах петли KHP в аминокислотном остатке, выбранном из группы, состоящей из 1867, 1868 и 1869.

В еще одном воплощении способа вирус бычьей вирусной диареи содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена в пределах петли SES в аминокислотном остатке, выбранном из группы, состоящей из 1939 и 1942.

В еще одном воплощении способа вирус бычьей вирусной диареи содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию геликазного домена в пределах петли IGR и петли SES в аминокислотных остатках 1845, 1868 и 1939.

Краткое описание графических материалов

Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения проиллюстрированы посредством следующего описания, прилагаемой формулы изобретения и сопровождающих графических материалов.

На Фиг.1 изображены домены NS3.

На Фиг.2 показано выравнивание последовательностей геликазных доменов вирусов BVD и HCV.

На Фиг.3 показано изображение молекулярной модели геликазы BVDV.

На Фиг.4 показана локализация сканируемых мутантов.

На Фиг.5 показана карта домена полного полноразмерного предшественника BVDV и структура субвирусного репликона BVDV.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO.1 представляет полноразмерную пептидную последовательность, не обработанную полипротеином из вируса бычьей вирусной диареи. Нумерация остатков в данной последовательности соответствует описанным здесь мутациям. Например, мутация, описанная как «К1845А», означает, что остаток лизина в положении 1845 последовательности SEQ ID NO.1 был замещен остатком аланина.

SEQ ID NO.2 представляет собой фрагмент последовательности ДНК плазмиды, которая фланкирует 5'-конец сайта клонирования p15aDI для генерирования типичных мутантов.

SEQ ID NO.3 представляет собой последовательность фрагмента ДНК плазмиды, которая фланкирует 3'-конец сайта клонирования p15aDI для генерирования типичных мутантов.

SEQ ID NO.4 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации I1841А.

SEQ ID NO.5 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации I1841А.

SEQ ID NO.6 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации R1843A.

SEQ ID NO.7 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации R1843A.

SEQ ID NO.8 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации К1845А.

SEQ ID NO.9 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации К1845А.

SEQ ID NO.10 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации К1867А.

SEQ ID NO.11 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации К1867А.

SEQ ID NO.12 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Н1868А.

SEQ ID NO.13 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Н1868А.

SEQ ID NO.14 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Р1869А.

SEQ ID NO.15 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения мутации описанной здесь Р1869А.

SEQ ID NO.16 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Е1939А.

SEQ ID NO.17 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации Е1939А.

SEQ ID NO.18 представляет собой последовательность 5'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации R1942A.

SEQ ID NO.19 представляет собой последовательность 3'-праймера ДНК для введения описанной здесь мутации R1942A.

SEQ ID NO.20 представляет собой пептидную последовательность доменов 1 (геликаза) и 2 (NTPaзa) области NS3 транслированного BVDV.

SEQ ID NO.21 представляет собой пептидную последовательность доменов 1 (геликаза) и 2 (NTPaзa) области NS3 транслированного вируса гепатита С (HCV).

Определения

Следующие определения могут быть применены к терминам, используемым в описании воплощений по изобретению. Следующие определения заменяют любые противоречивые определения, содержащиеся в каждой индивидуальной ссылке, включенной в данное описание изобретения посредством ссылки.

Научные и технические термины, используемые в отношении настоящего изобретения, если они не определены здесь иначе, будут иметь значения, которые, как правило, являются понятными обычным специалистам в данной области техники. Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе будут включать в себя множественное число, и термины во множественном числе будут включать в себя единственное число.

Термин «аминокислота», при использовании здесь, относится к аминокислотам, к природным и синтетическим аминокислотам, а также к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые действуют аналогично природным аминокислотам. Природными аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые затем модифицированы, например гидроксипролин, карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Стереоизомеры (например, D-аминокислот) двадцати обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как и -двухзамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие необычные аминокислоты, также могут быть пригодными компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры необычных аминокислот включают: 4-гидроксипролин, -карбоксиглютамат, -N,N,N-триметиллизин, -N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, -N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты. Аминокислотные аналоги относятся к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и природная аминокислота, то есть углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и R-группу. Типичные аминокислотные аналоги включают, например, гомосерин, норлейцин, метионина сульфоксид и метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же самую основную химическую структуру, что и природная аминокислота. Аминокислотные миметики относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют аналогично природной аминокислоте.

Аминокислоты могут упоминаться здесь либо посредством хорошо известных трехбуквенных символов, либо посредством однобуквенных символов, рекомендованных Биохимической номенклатурной комиссией IUPAC-IUB.

Аминокислоты - Однобуквенные коды: Трехбуквенные коды: Полные названия

G:	Gly:	глицин
V:	Val:	валин
L:	Leu:	лейцин
А:	Ala:	аланин
I:	lie:	изолейцин
S:	Ser:	серин
D:	Asp:	аспарагиновая кислота
К:	Lys:	лизин
R:	Arg:	аргинин
H:	His:	гистидин
F:	Phe:	фенилаланин
Y:	Туr:	тирозин
Т:	Thr:	треонин
C:	Cys:	цистеин
M:	Met:	метионин
Е:	Glu:	глутаминовая кислота
W:	Trp:	триптофан
Р:	Pro:	пролин
N:	Asn:	аспарагин
Q:	Gln:	глутамин
X:	Xaa:	точно не
	установленная аминокислота

Подразумевается, что термин «животные объекты», при использовании здесь, включает любое животное, которое является восприимчивым к BVDV-инфекциям, такое как крупный рогатый скот, овца и свинья. Под «лечением» или «вакцинацией» подразумевается предупреждение или уменьшение риска инфицирования вирулентным штаммом BVDV, облегчение симптомов BVDV-инфекции или ускорение выздоровления от BVDV-инфекции.

BVD «вирусы», «вирусные изоляты» или «вирусные штаммы», при использовании здесь, относятся к вирусам BVD, которые состоят из вирусного генома, ассоциированных белков и других химических составляющих (таких как липиды). Обычно вирус BVD имеет геном в форме РНК. РНК может быть обратно-транскрибирована в ДНК для использования в клонировании. Таким образом, ссылки, сделанные здесь на нуклеиновую кислоту и вирусные последовательности BVD, охватывают как последовательности вирусной РНК, так и последовательности ДНК, полученные от последовательностей вирусной РНК. Для удобства геномные последовательности BVD, как показано в ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ниже, относятся к полипептидной последовательности и праймерным последовательностям ДНК, применяемым в создании типичных мутаций. Соответствующая последовательность РНК для каждой из них является совершенно очевидной для специалистов в данной области техники.

Целый ряд вирусов BVD 1 типа и 2 типа известны специалистам в данной области техники и доступными благодаря, например, Американской типовой коллекции культур.

Термин «консервативные аминокислотные замещения», применяемый здесь, означает то, что обычно имеет место в семействе аминокислот, что относится к их боковым цепям. В частности, как оно используется здесь, консервативное аминокислотное замещение представляет собой замещение, которое не оказывает влияние на распознавание антителом данного пептида по сравнению с пептидом, полученным от дикого типа. Генетически кодированные аминокислоты, как правило, подразделяют на четыре группы: (1) кислотные: аспартат, глутамат; (2) основные: лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные: аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные: глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин также одновременно классифицируются как ароматические аминокислоты.

Соответственно, применяемый здесь термин «неконсервативные аминокислотные замещения» означают, что они, вероятно, имеют другие свойства, особенно в отношении распознавания антителами. Таким образом, неконсервативное аминокислотное замещение будет инициировать отличительный иммунный ответ, такой как, например, утрата распознавания антителом, генерированным против пептида, полученного от дикого типа.

Термин «иммуногенный», используемый здесь, означает способность вируса BVD, мутантного или дикого типа, вызывать иммунный ответ у животного против вирусов BVD 1 типа или 2 типа или против обоих вирусов BVD и 1 типа, и 2 типа. Иммунный ответ может быть клеточным иммунным ответом, опосредованным главным образом цитотоксическими Т-клетками, или гуморальным иммунным ответом, опосредованным главным образом хелперными Т-клетками, которые в свою очередь активируют В-клетки, что приводит к продуцированию антител.

Применяемый здесь термин «голая ДНК» относится к плазмиде, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие агент по данному изобретению вместе с коротким промоторным участком для контроля за его продуцированием. Она называется «голой ДНК», потому что плазмиды не переносятся в каком-либо носителе для доставки. Когда такая ДНК-плазмида попадает в клетку-хозяина, такую как эукариотическая клетка, в клетке транскрибируются и транслируются белки, которые она кодирует.

Применяемый здесь термин «плазмида» относится к любой нуклеиновой кислоте, кодирующей экспрессируемый ген, и включает линейные или кольцевые нуклеиновые кислоты и нуклеиновые кислоты с двойной или одинарной нитью. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК, и может включать модифицированные нуклеотиды или рибонуклеотиды, и может быть химически модифицированной такими способами, как метилирование или включение защитных групп или кэп- или хвостовых структур.

Термин «вакцина», применяемый здесь, относится к композиции, которая предупреждает или уменьшает риск инфекции или которая облегчает симптомы инфекции. Защитные эффекты вакцинной композиции в отношении патогена обычно достигаются посредством индуцирования у субъекта иммунного ответа, либо клеточно-опосредованного, либо гуморального иммунного ответа или комбинации их обоих. Вообще говоря, аннулирование или уменьшенный процент BVDV-инфекции, облегчение симптомов или ускоренное удаление вирусов из инфицированного субъекта являются показателями защитных эффектов вакцинной композиции. Вакцинные композиции по данному изобретению обеспечивают защитные эффекты против инфекций, вызываемых вирусами BVD.

Термин «вектор», применяемый здесь, означает средство, которое обеспечивает или облегчает перенос нуклеиновой кислоты из одной среды в другую. Согласно настоящему изобретению и в качестве примера некоторые векторы, используемые в рекомбинантных ДНК-технологиях, позволяют переместить нуклеиновые кислоты, такие как участок ДНК (например, участок гетерологичной ДНК, например участок гетерологичной цДНК), в хозяина или клетку-мишень с целью репликации нуклеиновых кислот и/или экспрессирования белков, кодируемых нуклеиновыми кислотами. Примеры векторов, применяемых в рекомбинантных ДНК-технологиях, включают, без ограничения ими, плазмиды, хромосомы, искусственные хромосомы и вирусы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующее подробное описание изобретения представлено, чтобы помочь специалистам в данной области техники в осуществлении данного изобретения. Даже с учетом этого, данное подробное описание нельзя истолковывать как чрезмерно ограничивающее данное изобретение, так как модификации и вариации воплощений, обсуждаемых здесь, могут быть осуществлены специалистами средней квалификации в области техники без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения.

Содержание каждой указанной здесь ссылки, включая содержание ссылок, указанных в этих первичных ссылках, включены в данное описание изобретения посредством ссылки.

Для размножения и очистки плазмид, пригодных в данном изобретении, можно использовать стандартные методы. Предпочтительной прокариотической клеткой-хозяином для плазмидного размножения является клеточная линия E. coli GM2163, но также можно использовать некоторые другие типы клеток. РНК, транскрибируемая из плазмиды, может быть введена путем трансфекции в эукариотические клетки-хозяева, способные поддерживать продуцирование вируса, такие как клетки MDBK (клетки почек крупного рогатого скота). Вирус можно продуцировать в таких клетках-хозяевах и выделять оттуда в высокоочищенной форме, применяя известные методики разделения, такие как центрифугирование в градиенте плотности сахарозы.

В одном воплощении настоящего изобретения предложены иммуногенные композиции, в которые включен один или более из описанных выше мутантных вирусов BVD.

Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к изолированным геномным нуклеиновым молекулам мутантных вирусов BVD, как описано выше. Молекулы нуклеиновых кислот при использовании здесь включают как РНК, так и ДНК.

В данном воплощении изолированная геномная нуклеиновая молекула вируса BVD содержит геномную последовательность вируса 1 типа, где по меньшей мере участок домена NS3 мутирован в геликазном домене.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предложены векторы, в которые включена геномная нуклеиновокислотная последовательность вируса BVD, как описано выше. Такие векторы могут быть введены в подходящие клетки-хозяева либо для продуцирования больших количеств геномных нуклеиновокислотных молекул, либо для продуцирования потомства мутантных вирусов BVD. Векторы могут содержать элементы другой последовательности для облегчения размножения, выделения и субклонирования вектора, например селектируемые маркерные гены и точки начала репликации, которые обеспечивают возможность размножения и селекции в бактериях и в клетках-хозяевах. Особенно предпочтительным вектором по данному изобретению является p15aDI (смотри Фиг.5).

Еще одно воплощение настоящего изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые введена молекула геномной нуклеиновой кислоты мутантного вируса BVD по настоящему изобретению. При использовании здесь, «клетки-хозяева» включают любые прокариотические клетки, трансформированные молекулой геномной нуклеиновой кислоты мутантного вируса BVD, предварительно обеспеченной подходящим вектором. При использовании здесь, «клетки-хозяева» также включают любые эукариотические клетки, инфицированные мутантным вирусом BVD или иным способом несущие молекулу геномной нуклеиновой кислоты мутантного вируса BVD. Предпочтительной прокариотической хозяйской клеткой для плазмидного размножения является клеточная линия Е. coli GM2163, но также могут быть использованы другие клеточные типы. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают клетки млекопитающих, такие как MDBK клетки (АТСС CCL 22). Однако также могут быть использованы другие культивируемые клетки. Кроме того, изобретение включает потомство вируса, продуцируемое в таких клетках.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вирусы могут быть ослаблены химической инактивацией или серийным пассированием в клеточной культуре, прежде чем использовать их в иммуногенной композиции. Методы ослабления хорошо известны специалистам в данной области техники.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению также могут включать дополнительные активные ингредиенты, например другие иммуногенные композиции против BVDV, например которые описаны в одновременно находящейся на рассмотрении патентной заявке US 08/107908, патенте US 6060457, патенте US 6015795, патенте US 6001613 и патенте US 5593873, каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте.

Кроме того, иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут включать один или более чем один ветеринарно приемлемый носитель. При использовании здесь, «ветеринарно приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсную среду, оболочки, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, задерживающие адсорбцию, и тому подобное. Разбавители могут включать воду, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и, среди прочих, лактозу. Стабилизаторы включают, среди прочего, альбумин. Адъюванты включают, без ограничения ими, адъювантную систему RIBI (Ribi inc.), квасцы, гель гидроксида алюминия, эмульсии «масло в воде», эмульсии «вода в масле», такие как, например, среди многих других, полные и неполные адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), или другие сапониновые фракции, монофосфориллипид А, липид-аминный адъювант Авридин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или иной), холерный токсин, или мурамил-дипептид. Иммуногенные композиции могут также включать один или более чем один другой иммуномодулирующий агент, такой как, например, интерлейкины, интерфероны или другие цитокины.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в различных формах, в зависимости от пути введения. Например, иммуногенные композиции могут быть приготовлены в форме стерильных водных растворов или дисперсий, удобных для инъекционного применения, или в лиофилизированных формах с использованием методов лиофильной сушки. Лиофилизированные иммуногенные композиции обычно хранят примерно при 4°С и они могут быть переведены в стабилизированный раствор, например солевой или/и HEPES в присутствии и в отсутствие адъюванта.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут быть введены животным, чтобы индуцировать иммунный ответ против вирусов BVD. Соответственно, в еще одном воплощении настоящего изобретения предложены методы стимулирования иммунного ответа против вирусов BVD путем введения животному эффективного количества иммуногенной композиции по данному изобретению, описанной выше.

В соответствии со способами по настоящему изобретению предпочтительная иммуногенная композиция для введения животному включает мутантный вирус BVD. Иммуногенную композицию, содержащую мутантный вирус, предпочтительно ослабленный химической инактивацией или серийным пассированием в культуре, вводят крупному рогатому скоту предпочтительно парентеральным способом, хотя также можно использовать другие способы введения, такие как, например, пероральный, интраназальный, внутримышечный, в лимфатические узлы, интрадермальный, внутрибрюшинный, подкожный, ректальное или вагинальное введение или посредством комбинации путей.

Протоколы вакцинации могут быть оптимизированы с использованием способов, хорошо известных в области техники. Животным можно вводить однократную дозу, или, в качестве альтернативы, могут иметь место две или более прививки с интервалом от двух до десяти недель. Величина и природа иммунных ответов, индуцируемых у крупного рогатого скота, могут быть оценены при использовании различных методик. Например, сыворотка может быть собрана от вакцинированных животных и проверена на присутствие антител, специфических для вирусов BVD, например в обычном анализе нейтрализации вирусов. Определение реагирующих CTLs в лимфоидных тканях может быть выполнено в помощью таких анализов, как пролиферация Т-клеток, в качестве свидетельства индукции клеточного иммунного ответа. Релевантные способы хорошо описаны в данной области техники, например Coligan et al. Current Protocols in Immunology, Jonn Wiley&Sons Inc. (1994).

Еще одно воплощение по настоящему изобретению направлено на вакцинные композиции.

В одном воплощении вакцинная композиция по настоящему изобретению включает эффективное количество одного или более вышеописанных мутантных вирусов BVD. Очищенные мутантные вирусы можно использовать непосредственно в вакцинной композиции или мутантные вирусы могут быть дополнительно ослаблены посредством химической инактивации или серийных пассирований in vitro.

Обычно вакцина содержит от приблизительно 1×10 ⁶ до приблизительно 1×10⁸ вирусных частиц с ветеринарно приемлемым носителем в объеме от 0,5 до 5 мл. Точное количество вируса в вакцинной композиции, эффективное для обеспечения защитного эффекта, может быть определено квалифицированным ветеринаром. Ветеринарно приемлемые носители, пригодные для применения в вакцинных композициях, могут представлять собой любые из вышеописанных здесь.

В еще одном воплощении вакцинные композиции по настоящему изобретению включают молекулу нуклеиновой кислоты мутантного вируса. В вакцинах можно использовать либо молекулы ДНК, либо РНК, кодирующие полностью или частично геном вируса BVD. Молекула ДНК или РНК может присутствовать в «голой» форме или может быть введена вместе с агентом, облегчающим клеточный захват (например, липосомы или катионные липиды). Типичным путем введения будет внутримышечная инъекция примерно 0,1-5 мл вакцины. Общее содержание нуклеотидов в вакцине, как правило, должно быть от примерно 0,1 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл. Полинуклеотиды могут присутствовать как часть суспензии, раствора или эмульсии, но водные носители являются, как правило, предпочтительными. Вакцины и процедуры вакцинации с использованием нуклеиновых кислот (ДНК или мРНК) хорошо описаны в данной области техники, например в патенте US 5703055, патенте US 5580859, патенте US 5589466, все из которых включены в данное описание изобретения посредством ссылки.

Вакцинные композиции по настоящему изобретению также могут включать дополнительный активный ингредиент, такой как другие вакцинные композиции против BVDV, например описанные в патенте US 6060457, патенте US 6015795, патенте US 6001613 и патенте US 5593873.

Вакцинация может быть выполнена посредством однократной прививки или посредством многократных прививок. Если желательно, сыворотка может быть собрана от вакцинированных животных и проверена на присутствие антител к вирусу BVD.

В еще одном воплощении настоящего изобретения вышеуказанные вакцинные композиции по настоящему изобретению применяют в лечении инфекций BVDV. Соответственно, в настоящем изобретении предложены методы лечения инфекций, вызванных вирусами BDV, у животных путем введения животному терапевтически эффективного количества мутантного вируса BVD по настоящему изобретению.

Специалисты в области техники могут без труда определить, необходимо ли ослаблять генетически конструированный вирус перед введением. Мутантный вирус по настоящему изобретению может быть введен непосредственно животному без дополнительного ослабления. Количество вируса, которое является терапевтически эффективным, может меняться в зависимости от конкретного применяемого вируса, состояния крупного рогатого скота и/или степени инфицирования и может быть определено ветеринаром.

При практическом осуществлении методов по настоящему изобретению вакцинную композицию по настоящему изобретению вводят крупному рогатому скоту предпочтительно парентеральными путями, хотя также могут быть использованы другие способы введения, например такие как пероральный, интраназальный, внутримышечный, в лимфатические узлы, интрадермальный, внутрибрюшинный, подкожный, ректальное или вагинальное введение, или комбинацией способов. Могут потребоваться бустерные режимы, и режим дозирования может быть скорректирован, чтобы обеспечить оптимальную иммунизацию.

В дополнительном аспекте данного изобретения предусмотрены методы определения ослабленного вируса из предыдущей вакцинации как источника присутствия вируса BVD в животном субъекте.

Мутантные вирусы BVD по настоящему изобретению отличаются от штаммов вируса BVD дикого типа как геномным составом, так и экспрессируемыми белками. Такое различие позволяет различить вакцинированных и инфицированных животных и позволяет идентифицировать BVDV в случае предположительных вакцин-ассоциированных вспышек. Например, может быть выполнено определение, являются ли животные, положительно тестированные к BVDV в некоторых лабораторных тестах, носителями вирулентного или патогенного вируса BVD или просто носителями мутантного вируса BVD по настоящему изобретению, ранее введенного посредством вакцинации.

Для проведения данного определения можно использовать ряд анализов. Например, из животного субъекта, положительно тестируемого на вирус BVD, могут быть выделены вирусы, и анализы, основанные на нуклеиновых кислотах, могут быть использованы, чтобы определить присутствие генома мутантного вируса BVD, как указания на вирус BVD, используемый в предшествующей вакцинации. Анализы, основанные на нуклеиновых кислотах, включают анализ методом саузерн- или нозерн-блоттинга, ПЦР и секвенирования. Альтернативно можно использовать анализы, основанные на белках. В анализах, основанных на белках, клетки или ткани с предполагаемой инфекцией могут быть выделены из животного, положительно тестируемого на BVDV. Клеточные экстракты могут быть приготовлены из таких клеток или тканей и могут быть подвергнуты, например, вестерн-блоттингу, с использованием подходящих антител против вирусных белков, которые могут ясно идентифицировать присутствие ранее введенного при вакцинации мутантного вируса в противоположность присутствию вируса BVD дикого типа.

ФОРМЫ И ВВЕДЕНИЕ

Парентеральное введение

Соединения по изобретению также могут быть введены непосредственно в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Подходящие способы парентерального введения включают внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, интратекальное, интравентрикулярное, внутриуретральное, интрастернальное, интракраниальное, внутримышечное и подкожное. Подходящие средства для парентерального введения включают игольные (в том числе микроигольные) инжекторы, безыгольные инжекторы и инфузионные методики.

Парентеральные композиции обычно представляют собой водные растворы, которые могут включать такие эксципиенты, как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно до рН от 3 до 9), но для некоторых применений они могут быть более удобно приготовлены в виде стерильного неводного раствора или в виде сухой формы для применения вместе с подходящим разбавителем, таким как стерильная апирогенная вода.

Приготовление парентеральных композиций в стерильных условиях, например путем лиофилизации, можно легко выполнять, используя стандартные фармацевтические методы, известные специалистам в данной области техники.

Растворимость соединений формулы I, применяемых в приготовлении парентеральных растворов, можно увеличить, используя соответствующие способы приготовления препаратов, такие как добавление агентов, увеличивающих растворимость.

Композиции для парентерального введения могут быть изготовлены в виде препарата с немедленным и/или модифицированным высвобождением. Композиции с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение. Соответственно, соединения по изобретению могут быть изготовлены в виде твердого вещества, полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантируемого депо, обеспечивающего модифицированное высвобождение активного соединения. Примеры таких препаратов включают покрытые лекарственным средством стенты и микросферы из поли(dl-сополимера молочной и гликолевой кислот) (PGLA).

Местное применение

Соединения по изобретению также могут быть введены местно на кожу или слизистую облочку, то есть дермально или трансдермально. Типичные препараты для этих целей включают гели, гидрогели, лосьоны, растворы, кремы, мази, опудривающие порошки, перевязочные материалы, пены, пленки, кожные пластыри, салфетки, имплантаты, губки, волокна, повязки и микроэмульсии. Также можно использовать липосомы. Типичные носители включают спирт, воду, минеральное масло, вазелиновое масло, медицинский вазелин, глицерин, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль. Могут быть включены усилители проникновения - смотри, например, Transdermal Penetration Enhancers: Applications, Limitations, and Potential J. Pharm Sci, 88 (10), 955-958, by Finnin and Morgan (октябрь 1999).

Другие средства местного введения включают доставку электропорацией, ионтофорезом, фонофорезом, сонофорезом и микроигольным или безыгольным (например, Powderject ^TM, Bioject^TM и т.д.) инжектором.

Композиции для местного введения могут быть изготовлены в виде препарата для немедленного и/или модифицированного высвобождения.

Композиции с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.

Ингаляционное/интраназальное введение

Соединения по изобретению также могут быть введены интраназально или посредством ингаляции, обычно в форме сухого порошка (либо сами по себе, в виде микстуры, например в сухой смеси с лактозой, либо в виде частиц из смеси компонентов, например смеси с фосфолипидами, такими как фосфатидилхолин) из сухого порошкового ингалятора или в виде аэрозольного спрея из контейнера под давлением, насоса, спрея, атомайзера (предпочтительно атомайзера с использованием электрогидродинамики для получения мелкодисперсного тумана) или небулайзера с использованием или без использования подходящего пропеллента, такого как 1,1,1,2-тетрафторэтан или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан. Для интраназального применения порошок может содержать биоадгезивный агент, например хитозан или циклодекстрин.

Контейнер под давлением, насос, спрей, атомайзер или небулайзер содержат раствор или суспензию соединения(й) по изобретению, содержащий, например, этанол, водный раствор этанола или подходящий альтернативный агент для диспергирования, солюбилизации или продления высвобождения активного компонента, пропеллент(ы) в качестве растворителя и, возможно, поверхностно-активное вещество, такое как сорбитантриолеат, олеиновая кислота или олигомолочная кислота.

Перед применением в сухом порошковом или суспензионном препарате лекарственный продукт измельчается до размера, пригодного для высвобождения посредством ингаляции (обычно менее 5 микрон). Это может быть достигнуто любым подходящим способом измельчения, таким как измельчение на мельнице со спиральным выбросом, с псевдоожиженным слоем, обработка сверхкритической жидкости с образованием наночастиц, гомогенизация при высоком давлении или сушка распылением.

Капсулы (изготовленные, например, из желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), блистеры и картриджи для применения в ингаляторе или инсуффляторе могут быть изготовлены в виде препарата, содержащего порошковую смесь соединения по изобретению, подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал, и модификатор эксплуатационных качеств, такой как I-лейцин, маннит или стеарат магния. Лактоза может быть безводной или в форме моногидрата, предпочтительно последнее. Другие подходящие наполнители включают декстран, глюкозу, мальтозу, сорбитол, ксилит, фруктозу, сахарозу и трегалозу.

Подходящий препарат в виде раствора для применения в атомайзере с использованием электрогидродинамики для получения мелкодисперсного тумана может содержать от 1 мкг до 20 мг соединения по изобретению на одно срабатывание, и объем при срабатывании может меняться от 1 мкл до 100 мкл. Обычная композиция может содержать соединение формулы 1, пропиленгликоль, стерильную воду, этиловый спирт и хлорид натрия. Альтернативные растворители, которые можно использовать вместо пропиленгликоля, включают глицерин и полиэтиленгликоль.

Подходящие ароматизаторы, такие как ментол и левоментол, или подсластители, такие как сахарин или сахарин натрий, могут быть добавлены к таким композициям по изобретению, предназначенным для ингаляционного/интраназального введения.

Композиции для ингаляционного/интраназального введения могут быть приготовлены в виде препарата для немедленного и/или модифицированного высвобождения, с использованием, например, PGLA. Композиции с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.

В случае сухих порошковых ингаляторов и аэрозолей единица дозировки определяется посредством клапана, который высвобождает отмеренное количество. Единицы по изобретению обычно устанавливают так, чтобы вводить отмеренную дозу или «пуф», содержащий от 10 нг до 100 мкг соединения формулы 1. Суммарная суточная доза обычно будет находиться в диапазоне от 1 мкг до 100 мг, которые можно вводить в однократной дозе или, более типично, в виде разделенных доз в течение дня.

Ректальное/интравагинальное введение

Соединения по изобретению могут быть введены ректально или вагинально, например в форме суппозитария, пессария или клизмы. Традиционной основой для суппозитория является кокосовое масло, но в качестве подходящих можно использовать различные альтернативные варианты.

Композиции для ректального/вагинального введения могут быть изготовлены для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Композиции с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.

Глазное/ушное введение

Соединения по изобретению также могут быть введены непосредственно в глаз или в ухо, обычно в форме капель микронизированной суспензии или раствора в изотоническом, со скорректированным рН, стерильном солевом растворе. Другие композиции, пригодные для глазного и ушного введения, включают мази, биоразлагаемые (например, абсорбируемые гелевые губки, коллаген) и бионеразлагаемые (например, силиконовые) имплантаты, пластинки, линзы и содержащие частицы или везикулярные системы, такие как ниосомы или липосомы. Полимер, такой как сшитая полиакриловая кислота, поливиниловый спирт, гиалуроновая кислота, целлюлозный полимер, например гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза или метилцеллюлоза, или гетерополисахаридный полимер, например гелановая камедь, могут включены вместе с консервантом, таким как хлорид бензалкония. Такие композиции также могут доставляться ионтофорезом.

Композиции для глазного/ушного введения могут быть изготовлены в виде препарата для немедленного и/или модифицированного высвобождения. Композиции с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее, контролируемое, нацеленное и программируемое высвобождение.

Набор компонентов

Так как может быть желательно вводить комбинацию активных соединений, например с целью лечения конкретного заболевания или состояния, в объем настоящего изобретения входят две или более фармацевтических композиции, по меньшей мере одна из которых содержит вакцину по изобретению, которые могут быть легко скомбинированы в форме набора, пригодного для совместного введения этих композиций.

Таким образом, набор по изобретению включает две или более отдельные фармацевтические композиции, по меньшей мере одна из которых содержит вакцину по изобретению, и средство для раздельного хранения указанных композиций, такое как контейнер, разделенный флакон или разделенный пакет из фольги. Примером такого набора является шприц и игла и тому подобное.

Набор по изобретению является особенно удобным для введения разных лекарственных форм, например пероральной и парентеральной, для введения отдельных композиций с разными интервалами дозирования или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. В помощь ветеринару набор обычно включает инструкции по введению.

Далее данное изобретение проиллюстрировано следующими примерами, но не ограничено ими.

Примеры

Пример 1. Картирование эпитопов доменов NS3

Способ картирования эпитопов применяли для идентификации специфических эпитопов, распознаваемых в белке NS3 панелью mAbs (моноклональные антитела). Этот метод подразумевает амплификацию ПЦР каждого тестируемого фрагмента, с последующей трансляцией усеченного белка in vitro, и в заключение тестирование его реакционной способности с различными mAbs. Для предварительной идентификации антигенных областей на NS3 амплифицировали набор из семи фрагментов ДНК, представляющих данную область (Фиг.1). Каждый фрагмент содержал в своем 5'-конце промоутер Т7, за которым следует стартовый кодон, и стоп-кодон на 3'-конце. Эти фрагменты ДНК использовали в качестве матрицы для генерации фрагментов S³⁵-меченного белка посредством транскрипции/трансляции in vitro, с использованием TnT® Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega; Madison, WI) и радиоактивно-меченного метионина и цистеина. Полученные в результате транслированные белковые фрагменты включали полноразмерный белок NS3, геликазу и протеазу, а также отдельные субдомены геликазы. (Границы протеазы, геликазы и субдоменов геликазы идентифицировали на основании выравнивания последовательностей белков NS3 BVDV и HCV.) Панель из 12 mAbs, распознающих BVDV NS3, включающая несколько применяемых диагностическими лабораториями для обнаружения инфекции BVDV у крупного рогатого скота, использовали для иммунопреципитации транслированных белков. Такие моноклональные антитела известны в области техники и описаны как «ранее полученные» в Deregt et al., Mapping of two antigenic domains on the NS3 proteins of the Pestivirus bovine viral diarrhea virus., Veterinary Microbiology (2005), 108 (1-2), 13-22. Иммунопреципитаты затем были анализированы посредством SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и флюорографии.

Результаты иммунопреципитации суммированы в Таблице 1. Все 12 mAbs и поликлональная сыворотка (POLY) распознавали полноразмерный NS3 и один или более геликазных субдоменов, в то же время ни один из них не распознавал протеазный фрагмент. Три mAbs (1.11.3, 21.5.8 и 24.8) иммунопреципитировали и с полноразмерной геликазой, и фрагментом домен 1-домен 2 (d1-d2), но не фрагмент d2-d3, что означало, что эти три антитела распознают домен 1 геликазного белка. Оба mAbs 21.5.8 и 24.8 связывались с фрагментом d1, a mAbs 1.11.3 нет, что означало, что антитело 1.11.3 было более чувствительно к конформации эпитопа, чем любое из 21.5.8 и 24.8 mAbs. MAbs 2.32.5 распознавало как полноразмерную геликазу и до некоторой степени фрагмент d1-d2, но не фрагмент d2-d3, что означало, что оно также может распознавать домен 1. Слабое связывание фрагмента d1-d2 может указывать на то, что эпитоп, распознаваемый 2.32.5, отличается у фрагмента d1-d2 и полноразмерной геликазы. MAbs 4.11.4 и 16.1.5 связывали как полноразмерный NS3, так и геликазу, но лишь слабо связывали фрагменты d1-d2 и d2-d3, что означает, что они могли быть специфичными к эпитопам в рамках второго домена геликазы. Четыре mAbs 5.2.1, 9.10.4, 12.7.3 и 15.14.6 распознают как полноразмерный NS3, так и геликазу. Они также слабо связывают фрагмент d2-d3, но не связывают d1-d2, что означает, что они распознают эпитопы, расположенные в домене 3. То, что ни один из них не связывается с одиночным фрагментом d3, означает, что правильный фолдинг d3 может не происходить в отсутствие других субдоменов. MAb 19.7.6 связывается с NS3 и полноразмерной геликазой, но ни с одним из любых других фрагментов. Распознавание этим антителом может требовать присутствия интактного геликазного белка. MAb 20.10.6 очень хорошо связывается с NS3, полноразмерной геликазой и как d1-d2, так и d2-d3 фрагментами. Оно также хорошо распознавало одиночный фрагмент d2, что означает, что на эпитоп в домене 2, распознаваемый этим антителом, не влияет отсутствие доменов 1 и 3. То, что ни один из 12 mAbs не связывается с полноразмерной протеазой не вызывало удивления, так как даже полисыворотка (POLY) от BVDV-инфицированной коровы не распознавала протеазу в наших экспериментах, что настоятельно свидетельствует от том, что эта протеаза не является очень антигенной. Это согласуется как с молекулярной ориентацией белков протеазы, геликазы и NS4A (кофактор протеазы) в HCV, где ориентация протеазы между геликазой и белками NS4A оставляет очень маленькую часть его поверхностной структуры, доступной для связывания антитела. На основании этих результатов домен 1 является типичной мишенью для введения мутации(й), приводящих к маркированному вирусу.

Таблица 1
Иммунопреципитация субдоменов NS3
	1.11.3	2.32.5	4.11.4	5.2.1	9.10.4	12.7.3	15.14.6	16.1.5	19.7.6	21.5.8	24.8	20.10.6	POLY
NS3	+	++	++	++	++	+	++	+	+	++	++	++	++
Домен 1-3	++	++	++	++	++	++	++	+	+	++	++	++	++
Домен 1-2	++	+/-	+/-	-	-	-	-	+/-	-	++	++	++	++
Домен 2-3	-	-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-	-	-	-	++	++
Протеаза	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Домен 1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++	++	-	+/-
Домен 2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+
Домен 3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+/-
Эпитоп	d1	d1	d2-d3	d3	d3	d3	d3	d3	d2-d3	d1	d1	d2	NS3

Пример 2. Выравнивание последовательностей BVDV и HCV геликаз

Для того чтобы получить маркированный вирус на основе мутации в домене 1 BVDV геликазы, желательна дополнительная обработка эпитопов в этом домене. Желательно удалить иммунодоминантный эпитоп без значительного изменения функции геликазы. Чтобы облегчить идентификацию эпитопов-кандидатов для мутирования, молекулярная модель BVDV геликазы была бы очень полезной. Так как кристаллическая структура HCV геликазы известна, ее можно использовать в качестве матрицы для моделирования. Для начала процесса генерирования молекулярной модели домена 1 выравнивали аминокислотные последовательности домена 1 BVDV и HCV геликаз. Идентичность первичных последовательностей между ними составляет приблизительно 34%. Чтобы выяснить вторичную структуру BVDV геликазного домена 1, выравнивали 47 NS3 последовательностей, полученных из различных изолятов BVDV и других пестивирусов, используя Pileup program из пакета программ Genetics Computer Group (University of Wisconsin; Madison, WI) и штамм NADL BVDV в качестве прототипной последовательности. Из выравненных последовательностей генерировали файл нескольких последовательностей (MSF) и представляли его на сервер JPred (Cuff, et al., Bioinfofmatics, 14: 892-893 (1998)) для прогнозирования вторичной структуры с применением метод прогнозирования PHD (Rost and Sander, J. Mol. Biol. 235: 13-26 (1993)). A Silicon Graphics lndigo2 Impact 10000 рабочую станцию (Silicon Graphics; Mountain View, CA) использовали для всех исследований молекулярного моделирования. The Molecular Operating Environment (МОЕ) версия 2001.01 (Chemical Computing Group, Inc.; Montreal, Quebec) и программный пакет SYBYL 6.7 (Tripos Associates Inc.; St. Lois, МО) использовали для молекулярного моделирования и визуализации. Аминокислотные последовательности доменов 1 и 2 из HCV (SEQ ID NO.21) и BVDV (SEQ ID NO.20) белков NS3 выравнивали (Фиг.2), основываясь на гомологии первичной структуры и прогнозах вторичной структуры. Предварительную молекулярную модель доменов 1 и 2 NS3 BVDV затем генерировали, используя в качестве матрицы соответствующую область белка HCV. Как показано на Фиг.3, присутствие некоторых петель и изгибов между альфа-спиралями и бета-цепями, включая 1- 2 (петля IGR), 2- 3 (петля KHP), 4- 5 (DMA) и 3- 7 (SES), приводит к образованию поверхности, удаленной как от геликазного каталитического центра, так и от геликаза-протеазной интерактивной поверхности. Эта область может быть чрезвычайно антигенной зоной. Три из идентифицированных петель, петля KHP, петля IGR и петля SES, были выбраны в качестве мишеней для мутагенезного исследования.

Пример 3. Определение места сайтов связывания mAbs посредством сканирующего мутагенеза

Для дальнейшего определения эпитопов в домене 1, связываемых различными mAbs, применяли способ сканирующего мутагенеза. В кратком изложении, короткие сегменты последовательности домена 1 BVDV геликазы (SEQ ID NO.20) были заменены соответствующей последовательностью HCV (SEQ ID NO.21) с использованием ПЦР(полимеразная цепная реакция)-амплификации, с последующим расщеплением ферментом рестрикции и лигированием полученных фрагментов с образованием «сканированных мутантов», представленных на Фиг.4. Транскрипция и трансляция in vitro, также как и иммунопреципитация, была выполнена, как описано в Примере 1. Сводные данные по реакционной способности различных mAbs с мутантами показаны в Таблице 2.

Таблица 2
Реакционная способность сканированных мутантов с mAbs
mAbs	Скан.	Скан.	Скан.	Скан.	Скан.	Скан.	Скан.	Геликаза
1.11.3	++	-	++	-	-	-	+	+++++
21.5.8	++	-	+/-	-	+/-	+	++	+++++
24.8	++	+	-	-	-	+/-	++	+++++
20.10.6	++++	+++	+++++	++	++	++	++	+++++
Полисыворотка	+++++	++++	+++++	++	++	++	+++	+++++
СА72 негатив	-	-	-	-	-	-	-	-

Пример 4. Подробный анализ мест связывания mAbs посредством аланин-заменяющего мутагенеза

Для дополнительного определения эпитопов в домене 1, связываемых различными mAbs, и для идентификации критических остатков в этих зонах в отношении связывания антител все шестнадцать мутантов с единственной замещенной аминокислотой (аланин) в трех зонах I1841-R1846, K1867-S1872 и S1938-I1941 генерировали и тестировали на связывание антител. Координаты аминокислотных остатков соответствуют SEQ ID NO.1. Так, «I1841А» представляет собой замещение изолейцина на аланин в положении 1841, как пронумеровано в SEQ ID NO.1. Конечно, в других изолятах BVDV могут присутствовать разные конкретные аминокислоты в определенных положениях типичной последовательности. Следовательно, мутация в одинаковом локусе геликазного домена вариантного BVD-вируса или плазмиды, сконструированной, чтобы экспрессировать вариантный BVD-вирус, приведет к эквивалентной потере распознавания антителами, генерируемыми против вариантного немодифицированного вирусного пептида. Замещенные мутанты конструировали, используя метод клонирования перекрывающихся продуктов ПЦР, известный в данной области техники (смотри, например, Но et al., Gene, 77 (1) : 51-9 (1989)). В кратком изложении, ПЦР использовали, чтобы генерировать аланин-замещенные фрагменты, каждый из которых кодировал домен 1 и 2 геликазы. Каждый фрагмент кодировал Т7 промоторную последовательность и кодон инициации трансляции на 5'-конце и стоп-кодон на 3'-конце. Сначала проводили две раздельные реакции, чтобы генерировать перекрывающие фрагменты, кодирующие 5'- и 3'-частей области замещения. Внутри области перекрывания одиночную аланиновую мутацию вводили в последовательность обоих фрагментов при помощи мутагенных олигонуклеотидных праймеров, используемых в ПЦР. Продукты каждой ПЦР разделяли электрофорезом в агарозном геле и их каждой реакционной смеси очищали одну полосу нужного размера. Очищенные фрагменты ДНК смешали и использовали в качестве матрицы для второй ПЦР, чтобы генерировать один замещенный фрагмент. Такой полный процесс повторяли, чтобы генерировать каждый из желаемых замещенных фрагментов. Последовательность каждого фрагмента подтверждали посредством секвенирования ДНК. Белковые фрагменты, меченные S³⁵ , генерировали, используя эти фрагменты в качестве матрицы посредством транскрипции/трансляции in vitro, как описано выше. Иммунопреципитацию с использованием mAbs, с последующим анализом SDS-PAGE, применяли, чтобы определить, распознаются ли по-прежнему мутантные эпитопы антителами.

Е1939А и R1942A полностью нарушают связывание с mAbs 1.11.3, что означает, что эти два остатка являются ключевыми для связывания антител. То, что эти две аминокислоты находятся на той же 3- 7 (SES) петле (Фиг.3), означает, что эпитоп, распознаваемый этим антителом, формируется этой петлей. Два другие мутанта, I1841А и К1867А, которые расположены на двух отдельных областях молекулы геликазы (петли 1- 2 (IGR) и 2- 3 (KHP)), демонстрируют значительно ослабленное связывание с mAbs 21.5.8, но не с другими антителами. Вывод, который может быть сделан из этих результатов, это то, что эпитоп, распознаваемый этим mAb, может охватывать две разные петли, которые располагаются в непосредственной близости в нативной молекуле. Это согласуется с молекулярной моделью, показанной на Фиг.3. Мутант R1843A разрушал связывание с mAb 24.8, но не оказывал эффекта на связывание с другими антителами. Снова это может означать, что этот остаток является частью ключевого эпитопа, расположенного на 1- 2 (IGR) петле. Частичное воздействие мутанта R1942A на связывание с mAb 24.8 означает, что 3- 7 (SES) петля вместе с 1- 2 (IGR) петлей составляют эпитоп, распознаваемый этим антителом. В заключение, эпитопы, распознаваемые тремя mAbs, были точно картированы в домене 1 BVDV геликазы. Ключевые остатки в этих эпитопах были идентифицированы, как расположенные в рамках трех отдельных участков первичной последовательности, но в непосредственной близости в третичной конформации. Функция этих эпитопов была дополнительно исследована в контексте BVDV субвирусного репликона.

Таблица 3
Иммунопреципитация аланин-замещенных мутантов
	mAb 1.11.3	mAb 21.5.8	mAb 24.8	Полисыворотка
I1841A	+	+	++	++
R1843A	++	+	-	++
Н1844А	++	+	++	++
К1845А	+	+	++	++
R1846A	++	+	++	++
S1938A	++	+	++	++
Е1939А	-	+	++	++
S1940A	++	+	++	++
I1941А	+	+	++	++
R1942A	-	+	+/-	+
К1867А	++	+	++	++
Н1868А	+	+	++	++
Р1869А	++	+	+	++
S1870A	++	+	++	++
I1871А	++	+	++	++
S1872A	++	+	++	++

Пример 5. Конструирование мутаций домена 1 геликазы в контексте субвирусного репликона BVDV

Конструирование субвирусного репликона

Желательным свойством для производства удачной вирусной вакцины является возможность получить выходы вируса с высоким титром. Следовательно, маркированная мутация не должна значительно влиять на репликацию вируса. Так как активность геликазы является существенной для репликации РНК BVDV, авторы изобретения хотели оценить все точечные мутанты по домену 1, полученные не только для потери распознавания антителом, но также и для сохранения каталитической геликазной активности. Амплификация и генетическое манипулирование с полноразмерным провирусным молекулярным клоном BVDV в Escherichia coli (E. coli) затруднены, так как плазмида является нестабильной при воспроизведении. Поэтому был создан p15aDI, который содержит укороченный субвирусный репликон, экспрессирующий NS3 и поддерживающий репликацию вирусной РНК, к тому же с отсутствием вирусных структурных генов, чтобы облегчить скрининг мутантов. p15aDI получали из инфекционной провирусной родительской плазмиды (pNADLp15a), содержащей полноразмерный BVDV-геном. Более подвержена манипулированию, ввиду отсутствия структурных генов и NS2 кодирующей области, единственная последовательность, расположенная выше NS3, состоит из слияния участка белка N и бычьего убиквитина (Фиг.5). Белок NS3, экспрессируемый из этого репликона, детектируется иммуногистохимически, только когда эффективная репликация РНК приводит к амплификации транскриптов, что ведет к увеличению экспрессии вирусного белка. Таким образом, детекция NS3 служит косвенным подтверждением эффективной репликации РНК и каталитической геликазной активности.

Генерация мутантов по домену 1 BVDV геликазы

Совокупность двенадцати разных мутантов по домену 1 геликазы генерированы в контексте субвирусного репликона и анализировали в отношении репликации вирусной РНК и потери распознавания эпитопа. Восемь из этих мутантов содержали только одну аминокислотную замену и включали: в петле IGR, I>А (аминокислотный остаток 1841), R>A (1843) и К>А (1845); в петле KHP, К>А (1867), Н>А (1868) и Р>А (1869); в петле SES, Е>А (1939) и R>A (1942). Два мутанта имели замены двух аминокислот: в петле IGR, R>A (1843) и К>А (1845) и в петле SES, Е>А (1939) и R>A (1942). Два содержали три замены: К>А (1867), Н>А (1868) и Р>А (1869), все в пределах петли IGR и К>А (1845), Н>А (1868) и Е>А (1939), затрагивающие различные петли. Хотя в типичных мутациях для удобства использовали аланин, неконсервативные аминокислотные замены можно было использовать в качестве подходящих мутаций. Каждый мутант генерировали, применяя стратегию перекрывающейся ПЦР, описанную выше. Конкретная совокупность перекрывающихся праймеров была сконструирована для каждой желательной мутации (Таблица 4). Для целей скрининга каждая совокупность праймеров также содержала дополнительные молчащие нуклеотидные замены, которые приводили к созданию уникального нового сайта расщепления ферментом рестрикции рядом с сайтом мутации. Перекрывающиеся ПЦР-фрагменты служили в качестве матриц во втором цикле амплификации, осуществляемом с использованием только двух внешних праймеров. Чтобы генерировать фрагменты, содержащие многочисленные аминокислотные замены, реакцию амплификации повторяли, используя предыдущий мутантный фрагмент в качестве матрицы. Полностью мутантный фрагмент затем клонировали в остов субвирусного репликона посредством двух сайтов (Bsm B1 и Sma 1) уникальных ферментов рестрикции, созданных в процессе ПЦР. Мутантный ПЦР-фрагмент и остов субвирусного репликона расщепляли Bsm B1 и Sma, обрабатывали щелочной фосфатазой (NEB, Inc.), очищали электрофорезом в агарозном геле и лигировали в течение ночи при 16°С, используя Т4 ДНК-лидазу (New Ingland Biolabs, Inc., Beverly, MA). Клетки E. coli STBL2 (Invitrogen; Carlsbad, CA) трансформировали с аликвотой реакционной смеси для лигирования и высевали на селективную среду. Колонии отбирали путем очистки плазмидной ДНК, с последующим расщеплением ферментами рестрикции. Плазмиды нужного размера затем подтверждали при помощи анализа последовательностей.

Пример 6. Характеристика мутантных субвирусных репликонов

Транскрипция in vitro и РНК-трансфекция

РНК-транскрипты синтезировали in vitro, используя РНК-полимеразу Т7 и MEGAscript^TM (Ambion; Austin, TX). Матрицы ДНК были линеаризованы Ksp I и обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой, чтобы удалить «липкий» 3'-конец. Продукты реакции транскрипции перед трансфекцией анализировали электрофорезом в агарозном геле. 1-5 мкг РНК добавляли к 200 мкл Opti-MEM (Invitrogen), содержащей 6 мкг Lipofectin (Invitrogen) и инкубировали в течение 10-15 минут при комнатной температуре. Одновременно монослои (50-60% слияние) Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) клеток, выращенные в шестилуночных платах (диаметр 35 мм), дважды промывали не содержащим РНКазы PBS (фосфатный буферный раствор) и один раз Opti-MEM. После последнего промывания трансфекционные смеси добавляли в каждую лунку, затем инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с легким покачиванием. Затем в каждую лунку добавляли 1 мл Opti-MEM и планшеты инкубировали еще 3 часа при 37°С. Затем во все лунки добавляли 3 мл Opti-MEM, содержащего 2-3% плодовой телячьей сыворотки.

Анализ репликации РНК и распознавания антителами

После инкубации в течение 24-28 часов при 37°С трансфицированные клетки фиксировали 80%-ным ацетоном и подвергали иммуногистохимическому анализу (IHC), применяя набор Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories; Birlingame, CA) согласно инструкциям производителя. Моноклональное антитело 20.10.6, которое распознает геликазный домен 2, использовали, чтобы визуализировать клетки, положительные в отношении NS3, в качестве индикатора эффективной репликации РНК. Клетки, трансфицированные РНК вируса BVDV дикого типа, также как и многие мутантные репликоны, показали сильное окрашивание с mAb 20.10.6, свидетельствующее, что такие индивидуальные мутантные вирусные геликазы поддерживают эффективную репликацию вРНК. Только мутант К1867А/Н1868А/Р1869А не продуцировал детектируемый белок NS3, что означает, что эта совокупность мутаций значительно влияет на репликацию вирусной РНК.

Все клетки, трансфицированные дикого типа или мутантными репликонами, также тестировали с mAbs 1.11.3, 21.5.8 и 24.8 (Таблица 5). Оказалось, что каждая из петель распознается одним из этих трех антител, так как мутации в каждой петле привели к потере распознавания одним из трех антител. В частности, мутации остатков R1843A и К1845А в петле IGR, отдельно или вместе, приводили к полной потере распознавания mAb 24.8. В то же время распознавание mAb 20.10.6, 1.11.3 и 21.5.8 не было затронуто. В петле KHP мутация К1867А аннулировала распознавание mAb 21.5.8, не затрагивая распознавание другими тремя антителами. Также обе точечные мутации в петле SES ведут к потере распознавания mAb 1.1.3, как в двойном мутанте. Кроме того, тройной мутант (К1845А/8Н1868А/Е1939А) привел к потере распознавания обоими mAb 1.11.3 и 24.8, хотя распознавание mAb 20.10.6 и 21.5.8 не было затронуто.

Итак, были идентифицированы некоторые мутации в трех петлях геликазы, которые приводили к аннулированию mAb распознавания и связывания. Кроме того, было обнаружено, что является осуществимым одновременное разрушение сайтов распознавания для двух антител, с сохранением геликазной функции. Таким образом, каждая из этих отдельных мутаций или их комбинация могут служить в качестве маркированной BVDV-вакцины, содержащей мутацию(и) в геликазной области.

Таблица 5
Иммунореактивность mAbs с геликазными мутантами
Моноклональное антитело
Мутация	20.10.6	1.11.3	21.5.8	24.8
WT/DI	+++	++/+++	++/+++	+++
Петля IGR
I1841А	+++	++/+	+/-	+++
R1843A	+++	++	++	-
К1845А	+++	++/+	++	-
RK1843/45A	+++	++/+	+++	-
А
Петля KHP
К1867А	+++	++	-	+
Н1868А	+++	++	++	++/+
Р1869А	+++	++/+++	+++	+++
КНР1867/68/69А	-
А
Петля SES
Е1939А	+++	-	++	+++
R1942A	+++	-	++	+++
ER1939/42A	+++	-	+/-	++/+++
Сложные петли
К1845А-Н1868А-Е1939А	+++	-		-
K1845A-KHP1868FAC-ER1939A			+/++

Пример 7. Генерация и анализ маркированных вирусов

Чтобы оценить эффект(ы) направленных мутаций в белке NS3 на вирусную репликацию и инфективность, необходимо было переместить мутации в провирусную плазмиду, содержащую полноразмерную последовательность BVDV (pNADLp15A). Были выбраны для дополнительного изучения три мутантные последовательности: К1845А-Н1868А-Е1939А, R1942A и Е1939А. Фрагмент ДНК, содержащий каждую интересующую соответствующую мутантную последовательность, клонировали в pNADLp15A, снова используя уникальные сайты рестрикции Bsm BI и Sma I. Лигационные смеси трансформировали в клетках E. coli GM2163 (New England Biolabs, Inc.; Beverly, MA) и затем помещали на селективную среду. После инкубации в течение ночи колонии отбирали на присутствие плазмиды, содержащей правильную последовательность. Выбирали один клон, представляющий каждую мутацию (R1942A; Е1939А и К-Н-Е), и из этих клонов готовили вирусную РНК, как описано в Примере 6. Клетки MDBK трансфицировали каждым препаратом РНК и инкубировали при 37°С в течение 64 часов. Для каждого мутанта выполняли двойные трансфекции RD клеток (АТТС; Rockville, MD). Одну совокупность трансфицированных клеток фиксировали для окрашивания IHC, как описано в Примере 6, и клетки из второй серии соскребали из посевных колб и хранили при -80°С в качестве исходных материалов для будущих размножений.

Для дополнительной оценки вируса, продуцируемого тремя клонами, культуральные жидкости, собранные из трансфекционного эксперимента, пассировали на свежие монослои RD клеток. После адсорбции и инкубации в течение ночи клетки фиксировали для IHC анализа. Результаты этого анализа представлены в Таблице 6. Вирусы как дикого типа, так и мутантные распознавались mAb 20.10.6 (контрольное антитело). Вирус дикого типа также распознавался mAbs 1.11.3 и 24.8. Мутант Е1939А связывался mAb 24.8, но не 1.11.3. Мутант К-Н-Е распознавался только mAb 20.10.6 и не распознавался 1.11.3 или 24.8. Мутант R1942A демонстрировал реактивность с mAB 24.8, но не с 1.11.3.

Таблица 6
IHC анализ клеток, инфицированных маркированными вирусами
Моноклональное антитело
Мутация	20.10.6	1.11.3	21.5.8	24.8
Петля 2
К1867А	Нет роста вируса
Петля 3
Е1939А	+++	-	++	+++
R1942A	+++	-	++	+++
Сложные петли
К1845А-Н1868А-	+++	-	+/++	-
Е1939А

Также оценивали кинетику роста каждого маркированного вируса. Титры исходного вируса для каждого предварительно определяли, используя стандартный протокол титрования вируса. В исследовании зависимости от времени новые монослои RD клеток высевали в колбы для тканевой культуры, инкубировали в течение ночи и на следующий день инфицировали предварительно определенным количеством каждого вируса. После адсорбции и промывания собирали исходную совокупность образцов (час «0»). Затем образцы собирали в 14, 19, 24, 39, 43, 47 и 65 часов после инфицирования. Титры вирусов определяли, применяя метод Спермана-Карбера (Hawkes, R.А. In Е.Н. Lennette (ed.), Diagnostic Procedures for Вирусный, Rickettsial and Chlamydial Infections, p.33-35; 7th ed. American Public Health Association Publications, Washington, D.С.) и выражали как TCID₅₀ /мл (средняя инфекционная доза в тканевой культуре для 50% инокулированных пробирок на мл). В сравнении с диким типом (родительским) вируса BVD, все мутанты выращивали в режиме подобном или, в некоторых случаях, несколько лучшем, чем дикий тип (Таблица 7).

Таблица 7
Сравнительные титры вирусов дикого типа и мутантных BVD-вирусов (TCID50/мл)
Часы	Дикий тип NDAL	К-Н-Е#9	R1942A#73	E1939A#84
0	0	4	4	2,5	0	0	0	0
14	2,5е+3	1,6е+3	1,0е+1	2,5е+1	2,5е+2	4,0е+2	6,3е+2	2,5е+3
19	6,3е+3	6,3е+3	1,0е+3	4,0е+3	1,6е+3	4,0е+3	4,0е+3	6,3е+3
24	1,6е+4	4,0е+4	N/D	N/D	1,6е+3	6,3е+3	2,5е+4	2,5е+4
39	4,0е+5	N/D	N/D	N/D	6,3t+4	1,0е+5	1,0е+6	4,0е+5
43	2,5е+5	6,3е+5	6,3е+4	6,3е+4	1,6е+5	1,6е+5	1,0е+6	2,5е+6
47	1,6е+5	5,0е+5	1,6е+5	2,5е+5	2,5е+5	4,0е+5	1,6е+6	4,0е+6
65	1,6е+5	2,8е+5	4,0е+5	2,5е+5	2,5е+6	2,5е+6	6,3е+6	1,0е+7

Некоторые из генерированных мутаций приводили к изменению специфических иммунологически отличных эпитопов, как определено при помощи панели моноклональных антител. Аналогичные результаты были получены, когда распознавание антителами анализировали в контексте инфекционной вирусной частицы. Клоны, содержащие мутации, которые не затрагивали генерацию инфекционного вируса и, кроме того, приводили к потере распознавания антителами mAb, представляли собой новые штаммы, которые служили в качестве эффективных штаммов маркированной BVDV-вакцины.

Пример 8. Тестирование эффективности вакцины на модели молодого теленка

Готовили здоровых BVDV-отрицательных телят, случайным образом распределенных в исследуемые группы, и содержали их под наблюдением обслуживающего ветеринара. Тестируемую вакцину комбинировали со стерильным адъювантом и вводили посредством либо внутримышечной (ВМ), либо подкожной (ПК) инъекции. Вводили две дозы вакцины с интервалом 21-28 суток. Потом животных провокационно заражали на 21-28 сутки после последней вакцинации штаммом BVDV 1 типа или 2 типа. Провоцирующий инокулят дается интраназально в 4 мл разделенной дозе, по 2 мл в каждую ноздрю. Также поддерживали в течение исследования контрольные группы, состоящие из невакцинированных, незараженных животных и/или невакцинированных, зараженных животных.

Ежедневно контролируют клинические параметры, включая ректальную температуру, депрессию, анорексию и диарею. Титры нейтрализации сыворотки определяют при помощи констант-вирусного с ослабленной сывороткой анализа бычьей клеточной культуры, используя последовательные разбавления сыворотки в комбинации со штаммом BVDV 1 типа или 2 типа. Предпринято выделение BVDV из периферической крови после заражения в культуре бычьих клеток. BVDV-положительная культура клеток определяется посредством непрямой иммунофлуоресценции. Чтобы продемонстрировать защиту после заражения, следует продемонстрировать уменьшение частоты возникновения инфекции в вакцинированных группах по сравнению с контрольными группами.

Пример 9. Тестирование эффективности вакцины в модели стельная корова-теленок

BVDV-отрицательные коровы и телки в возрасте полового созревания были отобраны и случайным образом распределены в вакцинированную тестируемую группу или группу-плацебо (контрольную). Коров инокулируют дважды посредством внутримышечной (ВМ) или подкожной (ПК) инъекции либо вакциной, либо плацебо, с интервалом 21-28 дней. После второй вакцинации все коровы получают внутримышечную инъекцию простагландина, чтобы синхронизировать период течки. Коров, которые демонстрируют течку, оплодотворяют путем искусственного осеменения сертифицированной BVDV-негативной спермой. Приблизительно при 60-суточной беременности статус стельности коров определяют посредством ректальной пальпации. Спустя приблизительно 6 недель коров с подтвержденными беременностями случайным образом выбирают из каждой тестируемой группы. Каждую из этих коров заражают посредством интраназальной инокуляции BVDV 1 или 2 типа. Образцы крови собирают в день заражения и неоднократные интервалы после заражения с целью выделения BVDV.

Через 28 дней после заражения выполняют левостороннюю лапаротомию и от каждой коровы извлекают амниотическую жидкость. Непосредственно до оперативного вмешательства собирают образец крови от каждой коровы для анализов нейтрализации сыворотки. После кесаревого сечения собирают образец крови от каждого плода. Затем плоды подвергают эвтаназии, и ткани асептически собирают для выделения BVDV. В случаях самопроизвольного прерывания беременности образцы крови берут из матки, когда обнаружен аборт, и через две недели. Парные образцы крови и абортированные плоды подвергают серологическому тестированию и выделяют из них вирус. Эффективность вакцины демонстрирует отсутствие инфицирования плода и аборта на поздних сроках.

Пример 10. Диагностические анализы маркированных BVDV-вакцин

Крупный рогатый скот разного возраста можно вакцинировать либо живой ослабленной, либо инактивированной NS3-мутантной (маркированной) BVDV-вакциной согласно предложенным инструкциям. Образцы сыворотки могут быть собраны через 2-3 недели после вакцинации или позднее. Чтобы отличить крупный рогатый скот, который получил маркированную BVDV-вакцину, от инфицированного полевым (дикий тип) штаммом BVDV, образцы сыворотки можно тестировать с помощью разных диагностических анализов. Белок NS3 с эпитоп-специфическими аминокислотными мутациями может, когда он присутствует у крупного рогатого скота в контексте маркированной вакцины, вызывать продуцирование специфических антител, которые будут связываться с мутантными зпитопами белка NS3, а не с немутантными эпитопами, присутствующими у вируса дикого типа. В контексте вируса дикого типа верно обратное - специфические антитела могут распознавать эпитопы дикого типа на белке NS3, но не мутантной формы. Методы оценки аффинности и специфичности связывания антител хорошо известны в данной области техники и включают, без ограничения ими, иммунологические форматы, такие как ELISA (твердофазный иммуносорбентный анализ), конкурентные иммунологические анализы, радиоиммуноанализы, вестерн-блоттинги, непрямые иммунофлуоресцентные анализы и тому подобное.

Конкурентный ELISA может быть прямым или непрямым анализом. Один из примеров прямого конкурентного анализа описан здесь. Целые антигены вируса дикого типа или их части, включающие белок NS3 (природный или полученный синтетически), можно использовать в качестве источника антигена. После покрытия ELISA планшета антигеном в щелочные условия образцы сыворотки крупного рогатого скота и разведения добавляют вместе с оптимизированным разведением эпитоп-специфического mAb и инкубируют в течение 30-90 минут. Либо пероксидазу хрена, либо щелочную фосфатазу конъюгировали с mAb, чтобы обеспечить колориметрическую детекцию связывания. После промывания планшетов добавили энзимоспецифичный хромогенный субстрат и после конечного этапа инкубации оптическую плотность каждой лунки измеряют при длине волны, подходящей для используемого субстрата. В зависимости от уровня реактивности бычьей сыворотки с белком NS3, покрывающим планшет, связывание меченого mAb может ингибироваться. Отсутствие связывания mAb указывает на присутствие в сыворотке крупного рогатого скота антител, которые распознают специфический для дикого типа эпитоп, указывающий на природную (дикого типа) инфекцию. Напротив, сыворотка крупного рогатого скота, иммунизированного маркированной вакциной, имеющей специфическую(ие) мутацию(и) эпитопа, не будет содержать антитела, которые будут связываться с белком NS3, покрывающим планшет. Следовательно, mAb будет связываться с белком и приведет к последующему развитию окрашивания.

Многочисленные варианты возникнут у специалистов в данной области техники в свете приведенного выше описания. Например, другие цитопатические штаммы BVDV могут быть мутированы в геликазном домене NS3 способом, аналогичным проиллюстрированному здесь, при помощи штамма NADL. Хотя в типичных мутациях здесь используют аланин, другие неконсервативные аминокислотные замены или другие мутации, приводящие к сохранению репликации, но к потере распознавания антителами, генерируемыми на NS3 дикого типа, входят в объем изобретения. Представленное приведено только в качестве примера.