ферментационный способ получения дифтерийного токсина

Формула изобретения

1. Способ изготовления препарата дифтерийного токсина или его мутанта или фрагмента, включающий способ ферментации, включающий ферментационную стадию выращивания штамма Corynebacterium diphtheriae в среде в ферментаторе при условиях перемешивания, достаточных для поддержания гомогенной культуры, и ограниченной аэрации, так что парциальное давление кислорода (pO₂) в культуре падает до уровня менее 4% на протяжении большей части ферментационной стадии, и выделение дифтерийного токсина или его мутанта или фрагмента из культуры.

2. Способ ферментации по п.1, где рО₂ падает до уровня, близкого к нулю, на протяжении большей части ферментационной стадии.

3. Способ по п.1 или 2, где рО₂ менее 4% поддерживают с момента времени, когда культура Corynebacterium diphtheriae выращена до плотности, достаточной для того, чтобы рО₂ упало до уровня менее 4% вследствие быстрого потребления кислорода, до завершения ферментационной стадии.

4. Способ по п.1, где ферментационную стадию проводят при постоянном значении объемного коэффициента массопередачи кислорода (KLa).

5. Способ по п.1, где ферментационную стадию проводят при постоянной скорости перемешивания и скорости аэрации.

6. Способ по п.1, где ферментационную стадию проводят при условиях варьирующего KLa.

7. Способ по п.1, где ферментационную стадию проводят при KLa 10-50 ч^-1.

8. Способ по п.1, где ферментационную стадию осуществляют в 10-30-литровом ферментаторе и при KLa 10-30 ч^-1.

9. Способ по п.1, где ферментационную стадию осуществляют в 100-250-литровом ферментаторе при KLa 30-60 ч^-1.

10. Способ по п.1, где ферментационную стадию осуществляют в 250-800-литровом ферментаторе при KLa 60-150 ч^-1.

11. Способ по п.8, где ферментационную стадию осуществляют с использованием потока сжатого воздуха 1-5 л/мин и со скоростью перемешивания 200-400 об/мин.

12. Способ по п.9, где ферментационную стадию осуществляют с использованием потока сжатого воздуха 15-25 л/мин и со скоростью перемешивания 150-250 об/мин.

13. Способ по п.1, где среда представляет собой CY, SOC или аналогичную среду, и рН в ферментаторе поддерживают при значении от 7,0 до 7,8 интенсивностью аэрации без необходимости добавления кислоты или основания.

14. Способ по п.1, где штамм Corynebacterium diphtheriae продуцирует дифтерийный токсин или его мутант, в частности CRM 197.

15. Способ по п.1, где штамм Corynebacterium diphtheriae представляет собой АТСС39255.

16. Способ по п.1, где данная культура является достаточно устойчивой к присутствию солей железа в среде, так что перед применением не требуется обработка среды для удаления железа.

17. Способ по п.1, где среда содержит 10-4000 млрд^-1 железа.

18. Способ по п.1, включающий стадию добавления одного или более чем одного дополнительного антигена(ов) к дифтерийному токсину или его фрагменту или мутанту.

19. Способ по п.18, дополнительно включающий стадию конъюгации дифтерийного токсина или его фрагмента или мутанта с одним или более чем одним дополнительным антигеном(ами).

20. Способ изготовления фармацевтической композиции для лечения или предупреждения заболевания, вызванного С.diphtheriae, включающий стадию получения дифтерийного токсина или его мутанта с использованием ферментационного способа по любому из пп.1-19 и смешивания его с фармацевтически приемлемым носителем.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области дифтерийных антигенов, в частности токсинов (включая мутантные формы дифтерийного токсина, такие как CRM197), и к ферментационным способам производства смешанных культур таких антигенов.

Дифтерийный токсин представляет собой белковый экзотоксин, продуцируемый бактерией Corynebacterium diphtheria. Он продуцируется в виде одиночного полипептида, который легко подвергается сплайсингу с образованием двух субъединиц, связанных дисульфидной связью, фрагмента А и фрагмента В, в результате расщепления по остатку 190, 192 или 193 (Moskaug et al., Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989). Фрагмент А представляет собой каталитически активную часть и представляет собой NAD-зависимую ADP-рибозилтрансферазу, специфической мишенью которой является фактор синтеза белка EF-2, посредством этого она инактивирует EF-2 и прекращает синтез белка в клетке.

Иммунитет к бактериальному токсину, такому как дифтерийный токсин, может быть приобретенным естественным путем во время инфекции, либо искусственно путем инъекции детоксифицированной формы токсина (анатоксина) (Germanier, er, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, FI., 1984). Анатоксины традиционно получали путем химической модификации нативных токсинов (Lingood et al., Brit. J. Exp.Path. 44; 177, 1963), делая их нетоксичными при сохранении антигенности, что защищает вакцинированное животное против последующего заражения природным токсином. В качестве альтернативы описали несколько мутантных дифтерийных токсинов с пониженной токсичностью (US 4709017, US 4950740).

CRM197 представляет собой нетоксичную форму дифтерийного токсина, но является иммунологически неотличимым от дифтерийного токсина. CRM197 продуцируется С.diphtheriae, инфицированной нетоксигенным фагом 197tox-, созданным путем нитрозогуанидинового мутагенеза токсигенного каринефага b (carynephage b) (Uchida et al., Nature New Biology (1971) 233; 8-11). Белок CRM197 имеет ту же самую молекулярную массу, что и дифтерийный токсин, но отличается от него одиночной заменой основания в структурном гене. Это приводит к замене аминокислоты глицин на глутамин в положении 52, что делает фрагмент А неспособным связывать NAD и, следовательно, нетоксичным (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983, p.560-564).

Дифтерийный анатоксин и мутантная форма с пониженной токсичностью, CRM197, являются компонентами во многих вакцинах, обеспечивающих иммунитет против Corynebacterium diphtheriae. Известно несколько комбинированных вакцин, которые могут предупреждать заболевания, вызванные Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae и возможно вирусом гепатита В и/или Haemophilus influenzae типа b (смотри, например, WO 93/24148 и WO 97/00697, WO 02/055105).

Дифтерийный токсин и мутантные формы, включая CRM197, также использовали в вакцинах в качестве безопасных и эффективных носителей сахаридов, зависимых от Т-клеток. CRM197 в настоящее время используют в конъюгатной вакцине CRM197 с олигосахаридом Haemophilus influenzae типа b (HibTitre®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.).

Способы получения дифтерийного анатоксина (DT) хорошо известны в данной области техники. Например, DT можно получить путем очистки токсина из культуры Corynebacterium diphtheriae с последующей химической детоксификацией, или можно получить путем очистки рекомбинантного или генетически детоксифицированного аналога данного токсина (например, CRM197 или других мутантов, как описано в US 4709017, US 5843711, US 5601827 и US 5917017). Corynebacterium diphtheriae культивируют при аэробных условиях. Rappuoli et al., (Biotechnology February 1985, p.161-163) полагают, что pO₂ следует регулировать на уровне 25% путем аэрации смесью воздуха и кислорода, которая автоматически регулируется так, чтобы поддерживать желательное pO₂.

Продуцирование значительных количеств дифтерийных токсинов, таких как CRM197, для применения в вакцинах была затруднена из-за малого относительного количества белка. Ранее эту проблему решали путем введения дополнительных копий гена, кодирующего дифтерийный токсин или мутантную форму, в Corynebacterium diphtheriae (US 4925792; US 5614382). Такие способы приводят к увеличению продуцирования примерно в три раза. Способы дополнительного повышения выхода дифтерийного токсина воспроизводимым образом были бы полезными для обеспечения более высоких уровней продуцирования этих ценных антигенов.

Соответственно, в настоящей заявке предложен улучшенный способ ферментации, включающий ферментационную стадию выращивания штамма Corynebacterium diphtheriae в среде в ферментаторе при условиях перемешивания, достаточных для поддержания гомогенной культуры, и ограниченной аэрации, так что парциальное давление кислорода (рO₂) в культуре падает до уровня менее 4% на протяжении большей части ферментационной стадии.

Данная ферментация происходит в аэробных условиях, но при ограниченной аэрации, так что кислород используется, как только он поступает в культуру, на протяжении большей части ферментации, то есть после исходной фазы, на которой плотность С.diphtheriae является относительно низкой и уровни pO₂ могут быть более высокими. Авторы данного изобретения обнаружили, что культура в таких условиях дает более эффективную и/или согласованную экспрессию дифтерийного токсина или мутанта по сравнению со способами ферментации, осуществляемыми при более высоком pO₂. Способ по изобретению является более надежным, чем ферментация при более высоких уровнях кислорода, и обеспечивает сохранение высокого выхода дифтерийного токсина даже в том случае, когда культуральная среда содержит добавленное железо, или когда используют сложные исходные вещества варьирующего качества.

Во втором аспекте данного изобретения предложен способ изготовления препарата дифтерийного токсина или его мутанта, включающий проведение способа ферментации по изобретению и выделение дифтерийного токсина или его мутанта из культуры. Несмотря на то, что здесь описаны дифтерийный токсин и его мутанты, предусматривается, что любой антиген С.diphtheriae можно выделить с использованием способа по изобретению.

Применение такого способа приводит к более высоким выходам дифтерийного токсина или мутанта, например CRM197, по сравнению с условиями, при которых рO₂ поддерживают на уровне 5% или выше, например 20%.

В третьем аспекте данного изобретения предложен дифтерийный токсин или его мутант, выделенный способом по изобретению.

В четвертом аспекте данного изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая дифтерийный токсин или его мутант по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В дополнительном аспекте данного изобретения предложен дифтерийный токсин или его мутант для применения в терапии, в частности для лечения или предупреждения бактериального заболевания, такого как заболевание, вызванное С.diphtheriae.

В еще одном аспекте данного изобретения предложено применение дифтерийного токсина или его мутанта по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения бактериального заболевания, в частности заболевания, вызванного С.diphtheriae.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ предупреждения или лечения бактериальной инфекции, в частности инфекции, вызванной С.diphtheriae, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по изобретению.

Описание графических материалов

Фиг.1 - графики, показывающие профиль насыщения кислородом и его использование в определении KLa ферментации. Панель А показывает динамику насыщения кислородом после перевода с азота на кислород. Панель Б показывает график ln(100-рO₂) против времени, который дает возможность оценить KLa путем определения градиента линии.

Фиг.2 - обзор схемы ферментационного способа для С.diphtheriae.

Фиг.3 - график, показывающий типичную кинетику роста культуры С.diphtheriae. Линия с круглыми маркерами показывает оптическую плотность (ОП) при 650 нм через различные периоды времени культивирования. Линия с ромбовидными маркерами показывает рН культуры.

Фиг.4 - электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) супернатантов культуры. Полоса 1 - маркеры молекулярной массы, полоса 2 - 1 мкг стандарта CRM197, полоса 3 - 0,5 мкг стандарта CRM197, полоса 4 - 0,25 мкг стандарта CRM197, полосы 5 - 11 - супернатанты от ферментаций С.diphtheriae. Гель А показывает супернатанты от CDT082 в полосе 5, CDT198 в полосах 6-8 (линия 6 - супернатант удаляли в момент 22,5 часа, линия 7 - в момент 24 часа и линия 8 - в момент 28 часов), CDT199 в полосах 9, 10 и 11 (полоса 9 - супернатант удаляли в момент 22 часа 45 минут, линия 10 - в момент 24 часа 45 минут и линия 11 - после последовательных микрофильтрации и фильтрации). Гель Б показывает супернатанты от CDT082 в линии 5, от CDT205 в линиях 6-9 (линия 7 - после 21 часа 43 минут ферментации, линия 8 - после 23 часов ферментации, линия 9 - после 24 часов ферментации) и от CDT206 в линиях 10-13 (линия 10 - после 22 часов 10 мин ферментации, линия 11 - после 23 часов 49 минут ферментации, линия 12 - после 24 часов 30 мин ферментации, линия 13 - после микрофильтрации и фильтрации).

Фиг.5 - График, показывающий KLa 150-литрового ферментатора при разных скоростях перемешивания в условиях аэрации 23 литра в минуту.

Подробное описание изобретения

Авторы данного изобретения подразумевают, что термины «содержащий», «содержат» и «содержит» в каждом случае можно заменить, соответственно, терминами «состоящий из», «состоят из» и «состоит из».

Один аспект данного изобретения представляет собой способ ферментации, включающий ферментационную стадию выращивания штамма Corynebacterium diphtheriae в среде в ферментаторе при условиях перемешивания, достаточных для поддержания гомогенной культуры (например, достаточных для достижения времени смешивания менее 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 секунды), и ограниченной аэрации, так что pO₂ в культуре падает до уровня менее 5%, 4%, 3%, 1% или 0,5% на протяжении большей части ферментационной стадии. В предпочтительном воплощении рO₂ падает до уровня, близкого к нулю, предпочтительно на протяжении большей части ферментационной стадии.

Например, рO₂ в культуре падает до уровня менее 5%, 4%, 3%, 1% или 0,5% с момента времени, когда Corynebacterium diphtheriae выращена до плотности, достаточной для потребления большей части кислорода, как только кислород поступает в культуру (латентный период, например, от по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов после начала ферментации), до момента ферментации, когда концентрация рO₂ вновь возрастает, близко к концу ферментационной стадии (например, через 16, 18, 20, 22 или 24 часа после латентного периода).

Ферментация обычно заканчивается, и культуру собирают, когда рO₂ возрастает до уровней, превышающих условия ограниченной аэрации. Следует отметить, что при разных условиях инокуляции, например, когда ферментатор инокулируют значительно большим количеством культуры С.diphtheriae, условия ограниченной аэрации начинаются вскоре после начала ферментации (например, через 1, 5, 10, 20, 30, 40 или 60 минут после начала ферментации).

100%-ное рO₂ представляет собой количество кислорода, присутствующее, когда среда (в отсутствие культуры) насыщена кислородом после барботирования сжатым воздухом через данную среду при 34,5°С и давлении 0,5 бар (50 кПа). Для 150-литрового ферментатора скорость аэрации и скорость перемешивания следует устанавливать на 23 литр/мин и 240 об/мин, тогда как для 20-литрового ферментатора скорость аэрации и скорость перемешивания следует устанавливать на 3 литр/мин и 300 об/мин, рO₂ можно определить как количество кислорода, присутствующего в полностью аэрированной ферментационной среде перед инокуляцией.

Гомогенная культура представляет собой культуру, в которой бактерии равномерно диспергированы во всем ферментаторе, так что по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% бактерий присутствует в верхних 10% культуральной среды.

Ферментационную стадию определяют как стадию, на которой Corynebacterium diphtheriae культивируют в ферментаторе. Ферментационная стадия начинается с момента введения в ферментатор предкультуры и заканчивается, когда при условиях ограниченной аэрации, описанных здесь, рO ₂ в итоге возрастает до уровня, превышающего 10%. Ферментационная стадия обычно продолжается в течение более 12, 14, 16, 18, 20 или 24 часов, например от 16 до 40 часов или, например, от 22 до 28 часов.

Смешивание проводят путем перемешивания культуры в ферментаторе, но его можно осуществлять любым другим подходящим способом, например путем встряхивания, при помощи вибросмесителя и/или путем барботирования газа. Перемешивание является достаточным для получения времени смешивания культуры менее 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 секунды.

Время смешивания культуры можно измерить в стеклянном ферментаторе. Оно представляет собой время, затраченное после введения окрашенного водного раствора на то, чтобы этот окрашенный водный раствор был равномерно диспергирован во всей культуральной среде.

Ферментатор представляет собой любую установку для промышленного получения бактериальных культур. Однако этот термин не включает культуральные колбы, которые обычно используют для выращивания бактерий в меньшем масштабе.

Большую часть ферментационной стадии определяют как время, превышающее 50%, 60%, 70%, 80% или 90% общей продолжительности ферментационной стадии. Ферментацию обычно проводят при условиях ограниченной аэрации в течение 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 28 часов.

Термин «ограниченная аэрация» описывает условия аэрации, которые позволяют С.diphtheriae использовать аэробное дыхание и все же лимитируют количество доступного кислорода, так что после увеличения плотности культуры (например, после по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 часов ферментации) кислород потребляется очень быстро после поступления в культуру, так что рO₂ составляет менее 5, 4, 3, 2, 1 или 0,5%. Следует отметить, что путем увеличения количества культуры, используемой для инокуляции ферментатора, условия ограниченной аэрации могли бы достигаться очень быстро после инокуляции (например, через 1, 5, 10, 20 или 30 минут после начала ферментации).

Такие условия ограниченной аэрации приводят к устойчивой экспрессии токсина, такого как дифтерийный токсин или его мутанты.

Падение рО₂ до приближения к нулю достигается скоростью аэрации и перемешивания, которые являются такими, что кислород, введенный в культуру, используется культурой для дыхания вскоре после его введения в данную культуру, так что несмотря на аэрацию культуры рO₂ считывается датчиком кислорода как равный нулю или близкий к нулю.

На протяжении ферментационной стадии значение рO₂ будет отсчитываться с более высокого уровня для заданных установок перемешивания и скорости аэрации. Это происходит из-за того, что в начале ферментационной стадии плотность бактерий в культуре является низкой и увеличивается на протяжении ферментационной стадии. Обычно требуется период времени (например, вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 часов), перед тем как pO₂ упадет до уровня менее 5%. Начиная с этого момента pO₂ остается на уровне менее 5, 4, 3, 2, 1 или 0,5%, предпочтительно на уровне, близком к нулю, до момента, близкого к концу ферментационной стадии, например, до сбора культуры из ферментатора.

Возможно, ферментационную стадию проводят при постоянном значении объемного коэффициента массопередачи кислорода (KLa) на протяжении всей ферментационной стадии. Альтернативно, ферментационную стадию проводят при одном или более чем одном KLa, так что ограниченная аэрация достигается при значениях KLa, сохраняющихся на протяжении большей части (например, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%) ферментационной стадии.

KLa представляет собой меру скорости, с которой кислород поступает в культуру. Чем выше KLa, тем больше скорость, с которой кислород вводят в культуру. Несколько факторов, включая объем и состав среды, перемешивание, аэрацию, давление, температуру, положение и характеристики подвижных частей ферментатора, будут влиять на KLa конкретной ферментационной стадии.

Обычно кислород вводят в ферментационную культуру путем барботирования сжатого воздуха через культуру. Когда в воздухе, вводимом в культуру, присутствуют разные концентрации кислорода, скорость потока следует адаптировать с учетом этого. Например, когда в культуру вводят источник 100%-ного кислорода, тогда скорость потока должна быть, соответственно, ниже. Когда в культуру вводят газ, содержащий меньше кислорода, чем воздух, тогда можно использовать более высокую скорость потока.

KLa можно измерить, используя способ, описанный в Примере 1. Данный способ включает установку в ферментаторе условий объема среды, температуры, давления, перемешивания и аэрации, при которых следует измерить KLa, откачивание газа путем замещения воздуха газообразным азотом, закачивание газа путем восстановления аэрации воздуха и измерение скорости, с которой рO₂ возвращается до его стационарного уровня.

ln(100-pO₂)=-KLa.T+C

При построении графика ln(100-pO₂) от времени, градиент (или угловой коэффициент) линии представляет собой KLa.

На значение KLa ферментационной стадии влияет ряд факторов, включающих степень перемешивания культуры и скорость аэрации культуры. Постоянный KLa можно поддерживать, например, при снижении перемешивания культуры и увеличении скорости аэрации или наоборот. Однако в одном воплощении как перемешивание культуры, так и скорость аэрации на протяжении ферментационной стадии являются постоянными.

Ферментационную стадию проводят, например, при KLa 10-200 ч^-1, 10-150 ч^-1, 10-100 ч^-1 , 10-80 ч^-1, 10-50 ч^-1, 10-40 ч^-1 , 10-30 ч^-1, 20-150 ч^-1, 20-100 ч^-1 , 20-50 ч^-1, 20-60 ч^-1, 20-80 ч^-1 , 20-30 ч^-1, 20-40 ч^-1, 30-60 ч^-1 , 60-80 ч^-1, 60-150 ч^-1 или 60-200 ч ^-1.

Значение KLa способа ферментации по изобретению может отличаться в зависимости от размера ферментационной культуры. Для культур 10-30 литров можно использовать KLa 10-30 ч^-1, 15-30, 20-30 или 22-28 ч^-1. Для культур 30-250 литров можно использовать KLa 30-60 или 40-50 ч^-1 . Для культур 250-800 литров можно использовать KLa 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30-80 или 60-150 ч^-1. Для культур 800-3000 литров можно использовать KLa 30-50, 40-50, 40-60, 30-60, 30-80, 60-150 или 60-200 ч^-1.

Для размера ферментационной культуры 10-30 литров KLa 10-30 ч^-1 , например, достигается при использовании потока воздуха или скорости аэрации 1-5 литр/мин и скорости перемешивания 200-400 об/мин, например, скорости аэрации 2-4 литр/мин и скорости перемешивания 250-350 об/мин.

Для ферментационной культуры 30-250 литров KLa 30-60 ч^-1 достигается, например, при использовании скорости потока воздуха 15-25 литр/мин и скорости перемешивания 150-250 об/мин, например, при использовании скорости потока воздуха 20-25 литр/мин и скорости перемешивания 200-250 об/мин, например, при использовании скорости потока воздуха 15-20 литр/мин и скорости перемешивания 200-250 об/мин.

рН культуры С.diphtheriae в среде CY во время ферментационной стадии зависит от условий аэрации и перемешивания данной культуры (Nikolajewski et al., J. Biological Standardization, 1982, 10; 109-114). В начале ферментационной стадии рН среды CY составляет 7,4. В случае пониженной аэрации или KLa, рН падает до значения около 5. В случае повышенной аэрации рН возрастает вплоть до значения около 8,5. В одном воплощении данного изобретения С.diphtheriae культивируют в среде CY или в среде SOC (Sambrook J et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), либо в аналогичной среде. рН от 7,0 до 7,8 может поддерживаться в ферментаторе интенсивностью аэрации, возможно без необходимости добавления кислоты или основания.

Способ по изобретению можно использовать с любым штаммом Corynebacterium diphtheriae. Такие штаммы могут продуцировать дифтерийный токсин дикого типа, слитые белки, включающие дифтерийный токсин или его фрагмент (например, белки, описанные в US 5863891), или мутантные формы, или фрагменты дифтерийного токсина, предпочтительно те, которые имеют пониженную токсичность. Примерами таких мутантных токсинов являются CRM176, CRM197, CRM228, CRM45 (Uchida et al., J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 и CRM107, и другие мутации, описанные Nicholls and Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc. 1992; делеция или мутация Glu-148 на Asp, Gln или Ser и/или Ala-158 на Gly и другие мутации, раскрытые в US 4709017 или US 4950740; мутация по меньшей мере одного или более чем одного остатка Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534, и другие мутации, раскрытые в US 5917017 или в US 6455673; или фрагмент, раскрытый в US 5843711. В одном воплощении штамм С.diphtheriae продуцирует CRM197.

В одном воплощении в способах по изобретению используют следующие штаммы С.diphtheriae: АТСС39255, АТСС39526, АТСС11049, АТСС11050, АТСС11051, АТСС11951, АТСС11952, АТСС13812, АТСС14779, АТСС19409, АТСС27010, АТСС27011, АТСС27012, АТСС296, АТСС43145, АТСС51280 или АТСС51696.

Среда для использования в данном изобретении может содержать один или более чем один из следующих компонентов: 5-20 г/л, 10-16 г/л или 10 г/л казаминовых кислот или гидролизата казеина, 5-20 г/л, 7-15 г/л или 9-12 г/л соевого пептона и/или 10-40 г/л, 14-32 г/л или 18-22 г/л дрожжевого экстракта.

Известно, что содержание железа в ростовой среде может влиять на рост С.diphtheriae и влиять на продуцирование токсина (смотри WO 00/50449). Железо является необходимым для роста бактерий, однако, было показано, что железо в больших концентрациях ингибирует продуцирование токсина. На протяжении процесса по изобретению содержание железа в среде имеет нижнюю границу 10, 50, 75, 100, 120 или 150 млрд^-1 и верхнюю границу 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 или 5000 млрд^-1. Например, концентрации железа в среде составляют: 50-1000 млрд^-1, 100-1000 млрд ^-1, 200-1000 млрд^-1, 400-1000 млрд^-1 , 500-1500 млрд^-1, 700-1300 млрд^-1, 50-2000 млрд^-1, 100-2000 млрд^-1, 200-2000 млрд ^-1, 400-2000 млрд^-1, 700-2000 млрд^-1 , 50-3000 млрд^-1, 100-3000 млрд^-1, 200-3000 млрд^-1, 400-3000 млрд^-1, 700-3000 млрд ^-1, 1000-3000 млрд^-1, 1500-3000 млрд^-1 , 1700-3000 млрд^-1, 50-4000 млрд^-1, 100-4000 млрд^-1, 200-4000 млрд^-1, 400-4000 млрд ^-1, 700-4000 млрд^-1, 1000-4000 млрд^-1 , 1500-4000 млрд^-1, 1700-4000 млрд^-1 или 2000-4000 млрд^-1. Железо может находиться в форме Fe²⁺ и/или Fe³⁺.

В одном воплощении способ по изобретению является достаточно устойчивым к присутствию в среде солей железа, так что перед применением не требуется обработка среды для удаления железа.

Ферментационная стадия проходит при температуре, подходящей для культуры С.diphtheriae, например при 25-45°С, 25-40°С, 30-38°С или 34-35°С.

Ферментационная стадия подвержена образованию большого количества пены. Для контролирования образования пены в ферментатор возможно добавляют пеногаситель. Возможно, в ферментаторе используют датчик пены или механический противовспениватель, например, наряду с пеногасителем.

Второй аспект данного изобретения представляет собой способ изготовления препарата антигена, например дифтерийного токсина или его мутанта или фрагмента, включающий стадии осуществления способа ферментации по изобретению, как описано выше, и выделения антигена, например дифтерийного токсина или его мутанта или фрагмента из культуры.

Третий аспект данного изобретения представляет собой дифтерийный токсин или его мутант или фрагмент (например, CRM197), выделенный способом по изобретению.

Токсичность дифтерийного токсина возможно понижена посредством химической обработки, включающей обработку перекрестносшивающими реагентами для образования анатоксина. Ссылки на токсин включают анатоксины.

Дополнительный аспект данного изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую дифтерийный токсин или его мутант (например, CRM197) или фрагмент по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтическая композиция по изобретению возможно дополнительно содержит дополнительные антигены в комбинированной вакцине. В одном воплощении антиген(ы), подлежащие объединению с дифтерийным токсином, его мутантом или фрагментом, как описано выше, включают один или более чем один столбнячный анатоксин, цельноклеточный коклюшный антиген (Pw), бесклеточный коклюшный антиген (Ра) (как описано ниже), поверхностный антиген вируса гепатита В, вируса гепатита А, полисахариды или олигосахариды Haemophilus influenzae b, нейссериальные (например, N. meningitidis) полисахариды или олигосахариды, белки N. meningitidis серотипа В, возможно в виде части везикулы наружной мембраны, полисахариды или олигосахариды пневмококков, белки пневмококков или любые из антигенов, перечисленных ниже. Бактериальные полисахариды могут быть конъюгированы с белком-носителем. Дифтерийный токсин или анатоксин или мутанты дифтерийного токсина, такие как CRM197 или его фрагменты, например, полученные с использованием способа по изобретению, можно использовать в качестве белков-носителей. Однако также можно использовать другие белки-носители, такие как столбнячный анатоксин, фрагмент С столбнячного анатоксина, пневмолизин, Белок D (US 6342224). Данная фармацевтическая композиция возможно содержит множество полисахаридов или олигосахаридов, конъюгированных с разными белками-носителями.

Дифтерийный токсин или его мутант, например CRM197, или его фрагмент, полученный с использованием способа по изобретению, можно приготовить в виде препарата с капсульными полисахаридами или олигосахаридами, происходящими из одного или более чем одного из Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, стрептококков группы А, стрептококков группы В, Staphylococcus aureus или Staphylococcus epidermidis. Например, фармацевтическая или иммуногенная композиция может содержать капсульные полисахариды, происходящие из одной или более чем одной серогруппы А, С, W-135 и Y Neisseria meningitidis. Например, серогруппы А и С; А и W, А и Y; С и W, С и Y, W и Y; А, С и W; А, С и Y; A, W и Y; С, W и Y или А, С, W и Y могут быть приготовлены в виде препарата с CRM197. В другом примере данная иммуногенная композиция содержит капсульные полисахариды, происходящие из Streptococcus pneumoniae. Пневмококковые капсульные полисахаридные антигены предпочтительно выбраны из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F (наиболее предпочтительно из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и 23F). Еще один пример содержит полирибозилрибитолфосфат (PRP) капсульных полисахаридов (или олигосахаридов) Haemophilus influenzae типа b. Дополнительный пример содержит капсульные полисахариды Типа 5, Типа 8, 336, поли-N-ацетилглюкозамин (PNAG или его деацетилированная форма dPNAG) Staphylococcus aureus. Дополнительный пример содержит капсульные полисахариды Типа I, Типа II, Типа III или PIA Staphylococcus epidermidis. Дополнительный пример содержит капсульные полисахариды Типа Ia, Типа Ic, Типа II или Типа III стрептококков группы В. Дополнительный пример содержит капсульные полисахариды стрептококков группы А, возможно дополнительно содержащие по меньшей мере один белок М и, более предпочтительно, множество типов белка М.

Бактериальные полисахариды для применения в данном изобретении могут быть полноразмерными, представляя собой очищенные нативные полисахариды. Альтернативно, данные полисахариды могут иметь размер в 2-20 раз, например в 2-5 раз, 5-10 раз, 10-15 раз или 15-20 раз меньше для более легкого обращения с ними. Олигосахариды обычно содержат от 2 до 20 повторяющихся единиц.

Такие капсульные полисахариды могут быть неконъюгированными или конъюгированными с белком-носителем, таким как столбнячный анатоксин, фрагмент С столбнячного анатоксина, дифтерийный анатоксин или CRM197 (оба, например, получены способом по изобретению), пневмолизин или белок D (US 6342224). Столбнячный токсин, дифтерийный токсин и пневмолизин детоксифицируют или генетической мутацией и/или химической обработкой.

Полисахаридный или олигосахаридный конъюгат можно получить любой известной методикой сочетания. Например, полисахарид можно получить сочетанием через тиоэфирную связь. Этот способ конъюгации основан на активации полисахарида тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) с образованием цианатного эфира. Активированный полисахарид, таким образом, можно получить сочетанием непосредственно или через спейсерную группу с аминогруппой на белке-носителе. Возможно, цианатный эфир получают сочетанием с гександиамином, и аминопроизводное полисахарида конъюгируют с белком-носителем, используя химию гетеролигирования, включая образование тиоэфирной связи. Такие конъюгаты описаны в опубликованной РСТ заявке WO 93/15760 Uniformed Services University.

Данные конъюгаты также можно получить способами прямого восстановительного аминирования, как описано в US 4365170 (Jennings) и US 4673574 (Anderson). Другие способы описаны в ЕР-0161188, ЕР-208375 и ЕР-0477508.

Дополнительный способ включает сочетание активированных бромцианом полисахаридов, дериватизированных гидразидом адипиновой кислоты (ADH), с белком-носителем путем карбодиимидной конденсации (Chu С. et al., Infect. Immunity, (1983) 245; 256).

В конкретных примерах дифтерийный токсин или его фрагмент или мутант (например, CRM197) конъюгируют с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дополнительными антигенами фармацевтической композиции. В одном воплощении его конъюгируют с полисахаридным(и) компонентом(ами), например, с бактериальными полисахаридами, включающими полисахариды, перечисленные выше.

Фармацевтическая или иммуногенная композиция по изобретению кроме того может содержать дополнительные белковые компоненты. Ее возможно изготавливают в виде препарата с антигенами, обеспечивающими защиту против одной или более чем одной инфекции, вызванной столбнячными бактериями и Bordetella pertussis. Коклюшный компонент может представлять собой убитый цельноклеточный В. pertussis (Pw) или бесклеточный коклюшный компонент (Ра), который содержит по меньшей мере один антиген (предпочтительно два или все три) из РТ, FHA и 69 кДа пертактина. Некоторые другие бесклеточные коклюшные препараты также содержат агглютиногены, такие как Fim2 и Fim3, и эти вакцины также рассматриваются для применения в данном изобретении. Обычно антигеном, обеспечивающим защиту против столбняка, является столбнячный анатоксин, который представляет собой либо химически инактивированные токсины (например, после обработки формальдегидом), либо инактивированные введением одной или более чем одной точечной мутации(ий).

Фармацевтическая или иммуногенная композиция по изобретению возможно содержит белковые антигены пневмококков, например те белки пневмококков, которые экспонированы на наружной поверхности пневмококка (которые могут распознаваться иммунной системой хозяина на протяжении по меньшей мере части жизненного цикла пневмококка), или представляют собой белки, которые секретируются или высвобождаются пневмококком. Например, данный белок может представлять собой токсин, адгезин, двухкомпонентный переносчик сигнала или липопротеин Streptococcus pneumoniae, или их фрагменты. Примеры таких белков включают: пневмолизин (предпочтительно детоксифицированный химической обработкой или мутацией) [Mitchell et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jul; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA и его варианты с трансмембранной делецией (US 5804193 - Briles et al.); PspC и его варианты с трансмембранной делецией (WO 97/09994 - Briles et al.); PsaA и его варианты с трансмембранной делецией (Веrrу & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesion essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); белки пневмококков, связывающие холин, и их варианты с трансмембранной делецией; СbрА и его варианты с трансмембранной делецией (WO 97/41151; WO 99/51266); глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); М-подобный белок (ЕР 0837130) и адгезин 18627 (ЕР 0834568), но не ограничены ими. Дополнительные белковые антигены пневмококков для включения в иммуногенную композицию представляют собой антигены, раскрытые в WO 98/18931, WO 98/18930 и PCT/US 99/30390.

Примеры нейссериальных белков, предназначенных для включения в иммуногенную композицию по изобретению, включают TbpA (WO 93/06861; ЕР 586266; WO 92/03467; US 5912336), ТbрВ (WO 93/06861; ЕР 586266), Hsf (WO 99/31132), NspA (WO 96/29412), Нар (РСТ/ЕР 99/02766), PorA, PorB, OMP85 (также известный как D15) (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP 99/03603), PldA (РСТ/ЕР 99/06718), FrpB (WO 96/31618, смотри SEQ ID NO:38), FrpA или FrpC либо консервативную часть, общую для обоих, из по меньшей мере 30, 50, 100, 500, 750 аминокислот (WO 92/01460), LbpA и/или LbpB (PCT/EP 98/05117; Schryvers et al. Med. Microbiol. 1999 32: 1117), FhaB (WO 98/02547 SEQ ID NO:38), HasR (PCT/EP 99/05989), lipo02 (PCT/EP 99/08315), MltA (WO 99/57280) и ctrA (PCT/EP 00/00135). Нейссериальные белки возможно добавляют в виде очищенных белков или в виде части препарата наружной мембраны.

Фармацевтическая или иммуногенная композиция по изобретению возможно содержит один или более чем один антиген, который может защищать хозяина против нетипируемого Haemophilus influenzae, RSV и/или один или более чем один антиген, который может защищать хозяина против вируса гриппа.

Примеры белковых антигенов нетипируемого Н.influenzae включают белок фимбрин (US 5766608) и слитые белки, содержащие пептиды, происходящие из него (например, слияние LB1) (US 5843464 - Ohio State Reserch Foundation), OMP26, P6, белок D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Нар и D15.

Примеры антигенов вируса гриппа включают целый живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или в клетках MDCK, или в клетках Vero, или целые виросомы гриппа (как описано R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920), или их очищенные или рекомбинантные белки, такие как белки НА, NP, NA или М, или их комбинации.

Примеры антигенов RSV (респираторно-синцитиальный вирус) включают гликопротеин F, гликопротеин G, белок HN, белок М или его производные.

Следует принимать во внимание, что антигенные композиции по данному изобретению могут содержать один или более чем один капсульный полисахарид из одного вида бактерий. Антигенные композиции также могут содержать капсульные полисахариды, происходящие из одного или более чем одного вида бактерий.

Дополнительный аспект данного изобретения включает иммуногенные композиции или вакцины, содержащие дифтерийный токсин, его фрагмент или мутант (например, CRM197), полученные способами по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.

Иммуногенная композиция или вакцина возможно содержит количество адъюванта, достаточное для усиления иммунного ответа на иммуноген. Подходящие адъюванты включают соли алюминия, смеси сквалена (SAF-1), мурамилпептид, производные сапонина, препараты клеточных стенок микобактерий, монофосфориллипид А, производные миколовой кислоты, поверхностно-активные вещества на основе неионных блоксополимеров, Quil А, субъединицу В холерного токсина, полфосфазен и производные и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs), такие как комплексы, описанные Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875, но не ограничены ими. Для ветеринарного применения и для получения антител у животных можно использовать митогенные компоненты адъюванта Фрейнда.

Как и во всех иммуногенных композициях или вакцинах, иммунологически эффективные количества иммуногенов определяют эмпирически. Факторы, которые следует рассматривать, включают иммуногенность, будет или нет иммуноген образовывать комплексы либо ковалентно связываться с адъювантом или белком-носителем или с другим носителем, путь введения и число иммунизирующих дозировок, подлежащих введению. Такие факторы известны в области вакцин, и проведение таких определений без излишнего экспериментирования безусловно находится в пределах квалификации иммунологов.

Активный агент в фармацевтической композиции или вакцине по изобретению может присутствовать в разных концентрациях. Обычно минимальная концентрация вещества представляет собой количество, необходимое для достижения его целевого применения, тогда как максимальная концентрация представляет собой максимальное количество, которое будет оставаться в растворе или будет гомогенно суспендированным в исходной смеси. Например, минимальное количество терапевтического агента предпочтительно представляет собой количество, которое будет давать одну терапевтически эффективную дозировку. Для биологически активных веществ минимальная концентрация представляет собой количество, необходимое для биологической активности при растворении, и максимум концентрации находится в точке, в которой не может поддерживаться гомогенная суспензия. В случае однодозовых единиц данное количество представляет собой количество для однократного терапевтического применения. Обычно ожидают, что каждая доза будет содержать 1-100 мкг белкового антигена, предпочтительно 5-50 мкг и наиболее предпочтительно 5-25 мкг. Предпочтительные дозы бактериальных полисахаридов представляют собой 10-20 мкг, 10-5 мкг, 5-2,5 мкг или 2,5-1 мкг. Предпочтительное количество вещества варьирует от вещества к веществу, но его может легко определить квалифицированный специалист в данной области.

Вакцинные препараты по настоящему изобретению можно использовать для защиты или для лечения млекопитающего (например, пациента, являющегося человеком), подверженного инфекции, посредством введения указанной вакцины через системный путь или через слизистые оболочки. Эти введения могут включать инъекцию через внутримышечный, внутрибрюшинный, интрадермальный или подкожный пути; или введение через слизистую оболочку в полость рта/пищеварительный тракт, дыхательные пути, мочеполовые пути. Несмотря на то, что вакцину по изобретению можно вводить в виде однократной дозы, ее компоненты также могут быть введены совместно в одно и то же время или в разное время (например, если в вакцине присутствуют полисахариды, они могут быть введены раздельно в одно и то же время или через 1-2 недели после введения комбинации бактериального белка для оптимальной координации иммунных ответов по отношению друг к другу). Помимо одного пути введения можно использовать два разных пути введения. Например, вирусные антигены можно вводить ID (интрадермально), тогда как бактериальные белки можно вводить IM (внутримышечно) или IN (интраназально). Если присутствуют полисахариды, их можно вводить IM (или ID), и бактериальные белки можно вводить IN (или ID). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить IM для доз первичной иммунизации и IN для доз повторной иммунизации.

Получение вакцины в общем описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомы описана Fullerton, патент США 4235877.

Другой аспект данного изобретения представляет собой способ изготовления фармацевтической композиции, включающий стадию получения дифтерийного токсина или его фрагмента или мутанта (например, CRM197) с использованием способа ферментации по изобретению и объединение его с фармацевтически приемлемым носителем и возможно добавление любых дополнительных антигенов, упомянутых выше.

Такой способ может дополнительно включать стадию конъюгирования дифтерийного токсина или его фрагмента или мутанта (например, CRM197) с одним или более чем одним дополнительным компонентом фармацевтической композиции, предпочтительно с бактериальными полисахаридами или олигосахаридами, как описано выше.

Дополнительный аспект данного изобретения представляет собой применение дифтерийного токсина или его фрагмента или мутанта (например, CRM197) по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения бактериального заболевания, в частности заболевания, вызванного С.diphtheriae.

Другой аспект данного изобретения представляет собой способ предупреждения или лечения бактериальной инфекции, в частности инфекции, вызванной С.diphtheriae, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, иммуногенной композиции или вакцины по изобретению.

Все ссылки или заявки на патент, процитированные в данной заявке, включены в нее посредством ссылки.

Данное изобретение проиллюстрировано сопровождающими примерами. Примеры, приведенные ниже, осуществляют с использованием стандартных методик, которые хорошо известны и являются обычными для специалистов в данной области техники, за исключением тех случаев, когда это описано в подробностях иначе. Данные примеры являются иллюстративными, но не ограничивают изобретение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Измерение KLa

Для измерения KLa ферментационной стадии ферментатор заполняли желательным объемом воды, применяли заданные параметры ферментации (например, температура, давление, перемешивание и аэрация) и оставляли систему до достижения стационарного состояния. Датчик pO₂ калибровали при 100%.

Аэрацию быстро переводили на газообразный азот, поддерживая ту же самую скорость потока. Значение pO₂ отслеживали до тех пор, пока оно не падало до уровня менее 5%. Когда достигалась эта точка, аэрацию быстро переводили на воздух, поддерживая ту же самую скорость потока. Уровень pO₂ отслеживали и записывали в несколько моментов времени в виде процента от исходного стационарного 100%-ного уровня.

KLa рассчитывали путем построения графика log(100-рO₂) против времени. Угловой коэффициент линейной части графика соответствует - KLa. Обычно рассматривают только данные от 20%-ного до 80%-ного рO₂.

Результаты

Показатели рO₂ в различные моменты времени показаны в таблице 1.

Таблица 1
Время (секунды)	Время (часы)	pO 2 (%)	ln(100-pO 2)
200	0,056	20	4,382026635
210	0,058	21,9	4,357990057
220	0,061	23	4,343805422
230	0,064	25	4,317488114
240	0,067	27	4,290459441
250	0,069	29	4,262679877
260	0,072	32	4,219507705

Данные результаты наносили на график, как показано на фиг.1, и KLa определяли из углового коэффициента линии, показанной на фиг.1,Б.

Пример 2: Ферментация штамма АТСС 39255 С.diphtheriae в масштабе 150 литров

Бактерия, используемая при получении CRM197 (дающий перекрестную реакцию материал), представляет собой мутантный штамм Corynebacterium diphtheriae, полученный обработкой нитрозогуанидином согласно способу А. Pappenheimer (Nature New Biol. 233:8-11, 1971). Он экспрессирует детоксифицированный дифтерийный токсин (аа 52: мутация, представляющая собой замену глицина на глутаминовую кислоту). Он получен из Американской коллекции тканевых культур (АТСС) и имеет номер 39255. Общее описание способа ферментации показано на фиг.2.

Рабочий посевной материал, содержащий 1,1×10¹⁰ КОЕ/мл (колониеобразующих единиц/мл), извлекали из морозильной камеры (-70°С) и размораживали при комнатной температуре. Сразу после размораживания сосуд встряхивали в вибросмесителе, и 250 мкл посевного материала отбирали 1-мл шприцем с иглой.

Этот объем инъецировали в 100 мл стерильного физиологического раствора (0,9%). Колбу встряхивали. Два мл суспензии отбирали 2-мл шприцем с иглой и использовали для инокуляции 3-литровой колбы Эрленмейера, содержащей 500 мл среды, описанной в US 4925792. Данную колбу инкубировали при 34,5°С±0,5°С при скорости перемешивания 250 об/мин, пока оптическая плотность (650 нм) не достигла 4,0-6,0 (после 16-19 ч инкубации).

150-литровый ферментатор стерилизовали и 100 л культуральной среды асептически переносили в ферментатор. Бутыль для кислоты наполняли 500 мл Н₃ РO₄ 25% (об./об.); рН данной среды исходно составлял около 7,4, и его не регулировали.

Ферментатор готовили за сутки до инокуляции и поддерживали его в состоянии готовности при температуре 34,5°С, давлении 0,5 бар (50 кПа), потоке воздуха 23 N L/мин в свободном пространстве над средой и при скорости перемешивания 50 об/мин в течение 16-20 ч до инокуляции.

Перед инокуляцией в ферментаторе устанавливали следующие условия культивирования: температуру 34,5°С, давление 0,5 бар (50 кПа), поток воздуха 23 N L/мин, впрыскиваемого в среду, и скорость перемешивания 240 об/мин. Перемешивание со скоростью 240 об/мин дает окружную скорость 1,76 м/с и теоретическое время смешивания 3,9 секунды. Уровень растворенного кислорода не регулировали, а только отслеживали, система контроля пенообразования была включена; рН давали достигать 7,8 и затем поддерживали на этом уровне добавлением Н₃ РО₄. Перед инокуляцией датчик рО₂ устанавливали на 100%.

Скорость перемешивания устанавливали на 240 об/мин, что соответствует периферической скорости 1,76 м/с. Скорость перемешивания 240 об/мин сочеталась со скоростью аэрации 23 л/мин, что приводило к KLa (20-80%, вода 30°С, давление 0,5 бар (50 кПа)), определенному при 42 ч^-1 (фиг.5).

Ферментатор инокулировали через порт для инокуляции, используя 400 мл посевной культуры, описанной выше.

Ферментацию продолжали до тех пор, пока не были соблюдены оба из следующих условий: прошло 20 часов ферментации, и уровень растворенного кислорода увеличился до 10%. Общая продолжительность ферментации обычно составляла от 22 до 28 ч.

В конце ферментации устанавливаемое значение температуры изменяли на 20°С, выключали регуляцию рН, поток воздуха переводили в свободное пространство над средой для того, чтобы ограничить пенообразование, систему контроля пенообразования выключали, другие параметры не изменяли.

Систему микрофильтрации подсоединяли к ферментатору, и микрофильтрацию начинали, когда температура суспензии достигала 21°С. Микрофильтрацию осуществляли в две фазы: концентрирование и диафильтрация. На протяжении фазы концентрирования параметры были следующими: давление внутри - 0,6 бар (60 кПа), давление снаружи - ~0,1 бар (10 кПа), скорость фильтрата поддерживали на постоянном уровне 2 л/мин с использованием откалиброванного перистальтического насоса (давление фильтрата составляло примерно 0,3 бар (30 кПа). Данную суспензию концентрировали, пока не происходило одно из следующих событий: либо давление на входном отверстии достигало 0,9 бар (90 кПа), либо получали 75 литров фильтрата.

Во время фазы диафильтрации использовали следующие параметры: внутреннее давление поддерживали на уровне, который достигался в конце стадии концентрирования (максимум 0,9 бар (90 кПа)); воду добавляли со скоростью 2 литра/мин; общее количество добавленной воды составляло 3 объема ультраконцентрата.

Ультраконцентрат фильтровали на 0,22 мкм мембране и хранили при +4°С. Стабильность CRM197 в такой суспензии тестировали после вплоть до 4 суток хранения либо при +4°С, либо при комнатной температуре (+20°С<КТ<23°С). Никакого разложения и никаких различий не наблюдали, исходя из количественной оценки методом ELISA или SDS-PAGE. Тест для подтверждения отсутствия роста проводили на агаре ВАВ, инкубируемом при 36°С.

Результаты

Две ферментации в масштабе 150 л осуществили, используя протокол ферментации, описанный выше (CDT 199 и CDT 206). Условия для предкультуры и культуры показаны в таблицах 2 и 3, и выходы CRM197 показаны в таблице 4. Фиг.3 показывает график типичной кинетики роста предкультуры. Когда ОП (650 нм) составляла от 4,0 до 6,0, культура очевидно находилась в экспоненциальной фазе роста, и рН лишь слегка изменялся.

Таблица 2
Условия для предкультур
№ культуры	Длительность цикла предкультуры (ч:мин)	ОП650 предкультуры	Конечное значение рН
CDT199	16:44	5,88	7,30
CDT206	17:53	4,03	7,25

Таблица 3
Условия для культур
№ культуры	Продолжительность ферментации (ч:мин)	Использованная 25%-ная Н3РO4 (г)	Конечное значение ОП650	Общее требуемое количество пеногасителя (г)	Оценка КОЕ (бакт./мл)
CDT199	24:45	2	17,2	102	4,9 Е9
CDT206	24:31	2	13,9	119	нет данных

Таблица 4
Оценка CRM197
№ культуры	Денситометрия на SDS-PAGE (мг/л)	ELISA (мг/л)
CDT199	89/106	138
CDT206	92/83	116

Во время ферментации наблюдали различные фазы.

Первая фаза характеризовалась снижением уровня растворенного кислорода до достижения 0% (продолжительность около 6-7 ч). На протяжении этой фазы рН остается стабильным или слегка снижается (примерно на 0,1 единицу рН).

На протяжении второй фазы рН возрастает и достигает плато при примерно рН 7,8. На этом уровне начинали регуляцию рН, однако часто при этих условиях ферментации кислоту вообще не нужно добавлять. На протяжении этого плато рН наблюдалось увеличение уровня растворенного кислорода свыше 0% с последующим падением до 0%.

Третья фаза характеризовалась снижением рН до примерно 7,4.

Наконец, от 22 до 24 ч ферментации наблюдали увеличение рO₂. Это является сигналом для сбора.

Газы, откачиваемые из ферментатора, анализировали на масс-спектрометре. Наблюдали типичный профиль продукции СO₂.

Две представленные ферментации продолжали после получения сигнала на сбор для оценки кинетики продукции CRM197. Авторы данного изобретения наблюдали, что уровень CRM197 не увеличивается после получения сигнала на сбор, но имело место увеличение ценообразования. Для того чтобы ограничить потребление пеногасителя, предпочтительно прекращать ферментацию в момент сигнала на сбор. Однако CRM197, по-видимому, не подвергается влиянию избыточного пенообразования, и не происходит его разложения.

Микрофильтрация

Показаны данные для микрофильтрации CDT206.

74,3 л фильтрата собирали, когда давление на входном отверстии достигало 0,9 бар (90 кПа). Давление на выходном отверстии на всей стадии концентрирования составляло от 0,15 до 0,10 бар (от 15 до 10 кПа). Давление фильтрата на всей стадии концентрирования составляло 0,3-0,4 бар (30-40 кПа), и стадия концентрирования длилась 36 минут.

Для фазы диафильтрации постепенно добавляли 75 л воды (2 л/мин), тогда как фильтрат экстрагировали при той же самой скорости потока. Давление на входном отверстии составляло 0,9 бар (90 кПа) в начале и падало до 0,7 бар (70 кПа) в конце диафильтрации. Давление на выходном отверстии было стабильным на уровне 0,1 бар (10 кПа). Продолжительность стадии диафильтрации составляла 39 мин.

Количественная оценка CRM197

Уровень экспрессии CRM197 в условиях малой аэрации обычно был в 2-4 раза выше, чем уровень экспрессии, который достигался в условиях более сильной аэрации, когда рO ₂ поддерживался на уровне 5% или выше на протяжении всей ферментации.

Окрашенный SDS-PAGE супернатантов культуры

На гелях SDS-PAGE (фиг.4) разделяли супернатанты культуры при восстанавливающих условиях, так что было можно определить любые полосы разложения (после разрезания могут быть определены две субъединицы соответственно в 35 и 23 кДа). Их затем окрашивали кумасси синим.

Результаты

Гели образцов от двух ферментаций, окрашенные кумасси, показаны на фиг.4,А (CDT 199) и 4 В (CDT 206). CRM197 проявлялся при ожидаемой молекулярной массе (теоретическая молекулярная масса: 58,4 кДа). CRM197 не разлагался, так как в пробах, взятых после сигнала окончания ферментации (фиг.4,А, полосы 9 и 10), не наблюдалось изменения электрофоретической картины на геле. На количество CRM197 не влияла микрофильтрация и конечная фильтрация на 0,22 мкм, так как полосы 9 и 11 фиг.4,А показывают эквивалентные количества CRM197.

Температура может иметь отрицательное влияние на стабильность CRM (фиг.4,Б, полоса 12). Этот образец отбирали, когда пробоотборный клапан был теплым, и количество CRM197, присутствующее в этом образце снижается.

Пример 3: Ферментация штамма АТСС 39255 С.diphtheriae в 20-литровом масштабе

Для ферментации С.diphtheriae использовали способ, аналогичный способу, описанному в примере 2, за исключением того, что использовали 20-литровый ферментатор. Культуру перемешивали при скорости 300 об/мин, и поток воздуха был установлен на 3 литра/минуту. На протяжении ферментации не требовалось добавления кислоты или основания, так как на протяжении всей ферментации рН сохранялся около нейтрального значения.

Данная культура росла до конечной ОП (650 нм) 18,3. Обнаружили, что выход CRM197 составляет 103 мг/литр при оценке денситометрией на окрашенном геле.

Пример 4: Ферментация штамма АТСС 39255 С.diphtheriae в разных масштабах

Ферментационный способ выращивания С.diphtheriae при условиях постоянного KLa можно адаптировать для применения в ферментаторах других размеров и разных конструкций. Хороших выходов продуцирования CRM197 достигали, соблюдая условия размера ферментатора, потока воздуха и скорости перемешивания, указанные в таблице 5. Три ферментации в 150-литровом масштабе проводили в ферментаторах различной конструкции.

Таблица 5
Масштаб (л)	Поток воздуха (л/мин)	Скорость перемешивания (об/мин)	KLa (ч-1)
20	3	300	22-28
150	23	240	~42
150	23	185	~50
150	17	200	~40

Как показано в таблице 5, важным было значение KLa, а не конкретный выбор условий потока воздуха и скорости перемешивания. Таким образом, более слабый поток воздуха мог быть компенсирован более высокой скоростью перемешивания, что приводило к аналогичному KLa, и все же достигались хорошие выходы CRM197. Скорость перемешивания должна быть достаточной для получения гомогенной суспензии, и аэрацию ограничивают для поддержания низкого рO₂. N.B. Различные ферментаторы использовали для 20-литровых ферментаций. Разные геометрические формы различных ферментаторов приводили к интервалу значений KLa, показанному в таблице 5.

Однако условия с разными KLa были оптимальными для разных масштабов ферментации. Следовательно, для ферментации в 20-литровом ферментаторе более низкий KLa 22-28 ч^-1 был оптимальным.

Условиями с оптимальным KLa являются условия, которые обеспечивают ограниченную аэрацию, так что рO₂ в культуре падает до низких уровней. Специалист в данной области должен быть способен легко определить такие условия для конкретного размера и геометрической формы ферментатора.

Пример 5: Влияние концентрации железа на выход ферментаций при различных рO₂

Ряд ферментаций штамма АТСС 39255 С.diphtheriae проводили в 20-литровом масштабе, следуя способу, изложенному в Примере 3, так что на протяжении большей части ферментации pO₂ был низким или находился на установленном постоянном уровне 5% pO₂ . Количество присутствующего Fe³⁺ варьировало от отсутствия добавления Fе³⁺ до добавления 250 млрд^-1 Fe³⁺, добавления 500 млрд^-1 Fe³⁺ и добавления 500 млрд^-1 Fe²⁺. Выход CRM197 в конце ферментации измеряли денситометрией на SDS-PAGE геле. Этот способ дает результаты приблизительно на 20% ниже, чем результаты, которых достигали ELISA.

Результаты

Таблица 6
Условия ферментации	Выход CRM197 (мг/литр)
среда с 5%-ным pO2 без добавления Fe3+	38
среда с 5%-ным рО2 с добавлением 250 млрд-1 Fe3+	14
среда с 5%-ным рO2 с добавлением 500 млрд-1 Fe 3+	18
среда с 5%-ным рO2 с добавлением 500 млрд-1 Fe2+	13
Низкое рO2, постоянный KLa, среда без добавления Fe3+	100
Низкое рO2, постоянный KLa, среда с добавлением 250 млрд-1 Fe 3+	88
Низкое рO 2, постоянный KLa, среда с добавлением 500 млрд-1 Fe3+	97

Как показано в таблице 6, когда С.diphtheriae ферментируется при 5%-ном рO ₂, добавление железа приводит к снижению выхода. Однако, когда уровень рO₂ снижен, и ферментация проводится при условиях низкого рO₂ при постоянном KLa, как описано в примере 3, достигаются более высокие выходы, и на выход не влияет добавление Fe³⁺.

Пример 6: Влияние концентрации железа на выход DT или CRM197 при условиях малой аэрации

Интервал концентрации железа, который не влияет на экспрессию CRM197, определяли в микропланшетах. Микропланшеты имитируют условия ограниченной аэрации, в которых осуществляют способ ферментации по изобретению.

Культивирование в микропланшетах проводили в той же самой среде, которую использовали при ферментациях, описанных выше (в среде, аналогичной среде CY). Fe³⁺ добавляли из исходного раствора FeCl₃·6Н₂О с концентрацией иона Fe³⁺ 1 г/л.

Лунки микротитрационных планшетов заполняли средой и инокулировали в концентрации 8 Е5 бактерий/мл.

Микротитрационные планшеты инкубировали при 34,5°C с перемешиванием 250 об/мин в течение 46 ч в случае, как Corynebacterium diphtheriae, экспрессирующей CRM197, так и Corynebacterium diphtheriae, экспрессирующей дифтерийный токсин.

Данные образцы фильтровали через 0,22 мкм фильтр.

Экспрессию измеряли способом денситометрии на SDS-PAGE (XT Criterion 4-12% bis tris от BioRad) с окрашиванием кумасси синим (синий краситель Gelcode от Pierce). Эталоном, используемым для количественной оценки, был мутант CRM дифтерийного токсина от List Biological Laboratories INC. введенный в гель в разных концентрациях.

Результаты

Таблица 7 показывает экспрессию CRM197 при разных концентрациях железа для С.diphtheriae, выращенной при условиях ограниченной аэрации в микротитрационных лунках. Экспрессия CRM197 была слабо чувствительной к репрессии Fe³⁺, и на нее значительно не влияло добавление 1 млн^-1 или 2 млн^-1 Fe³⁺. Только при 3 млн^-1 действительно происходило значительное снижение экспрессии CRM197. Даже при этом уровне Fe³⁺, экспрессия CRM197 все же составляла 79% от уровня экспрессии, который достигался без добавления Fe ³⁺.

Таблица 7
Corynebacterium diphtheriae, экспоессирующая CRM197
Добавленный Fe 3+ (млн-1)	Оптическая плотность 46 ч	рН	CRM (%)
0	18,1	7,66	100
200 млрд-1	17,9	7,72	96
300 млрд-1	16,9	7,77	97
400 млрд-1	16,9	7,8	106
500 млрд-1	17,2	7,83	109
600 млрд-1	17,7	7,81	112
700 млрд-1	17,2	7,77	109
800 млрд-1	17,2	7,77	103
900 млрд-1	16,5	7,79	101
1 млн -1	16,9	7,75	96
2 млн -1	17	7,79	88
3 млн -1	16,9	7,83	79

Выходы CRM197 выражены как процент от выхода, который достигается без добавления дополнительного Fe³⁺.

Результаты экспрессии DT для С.diphtheriae, выращенной при указанных условиях в микротитрационных лунках, показаны в таблице 8. Продукция DT при условиях ограниченной аэрации также была слабо чувствительной к репрессии Fe³⁺. Экспрессия DT возрастала с увеличением концентрации Fe³⁺ с максимумом продукции DT, который достигался при 700 млрд^-1. Экспрессия DT начинала падать только тогда, когда концентрация Fe³⁺ увеличивалась до 3 млн^-1.

Таблица 8
Corynebacterium diphtheriae, экспрессирующая дифтерийный токсин
Добавленный Fe3+ (млн-1)	Оптическая плотность 46 ч	рН	DT (%)
0	4,16	8,66	100
200 млрд-1	4,72	8,42	106
300 млрд-1	4,6	8,47	107
400 млрд-1	4,9	8,51	125
500 млрд-1	4,22	8,59	155
600 млрд-1	4,48	8,51	148
700 млрд-1	4,04	8,63	167
800 млрд-1	4,28	8,52	164
900 млрд-1	4,58	8,62	168
1 млн -1	4,48	8,64	166
2 млн -1	4,7	8,68	176
3 млн -1	4,2	8,68	141

Выходы DT выражены как процент от выхода, который достигается без добавления дополнительного Fe³⁺.