способ нековалентной фиксации олигодезоксирибонуклеотидов на внешней поверхности живых клеток

Формула изобретения

1. Способ нековалентной фиксации олигодезоксирибонуклеотидов, в том числе несущих модифицированные звенья, на внешней поверхности живых клеток, заключающийся во внесении в клеточную суспензию в буфере или в бессывороточной среде растворов ациламиноалкильных олигодезоксирибонуклеотидов М формулы 5 -Z-Olig-Spacer-NHY-3 , где Z - ненуклеотидный модификатор, который, в частности, может отсутствовать, Olig - заданная олигонуклеотидная последовательность, Spacer - спейсерная группа ненуклеотидного строения, Y - остаток жирной кислоты С16-С18.

2. Способ нековалентной фиксации на внешней поверхности живых клеток дуплексов олигонуклеотидов состава M-L, заключающийся в инкубировании после удаления избытка олигомера М клеток, обработанных в соответствии с п.1, в присутствии олигодезоксирибонуклеотида L формулы 5 -Z-Olig -Z -3 , в которой Olig - олигодезоксирибонуклеотид, несущий комплементарный к олигодезоксирибонуклеотиду М или его участку фрагмент длины и состава, достаточных для образования стабильного в физиологических условиях антипараллельного ДНК-дуплекса, где Z и Z - ненуклеотидные модификаторы, которые, в частности, могут отсутствовать.

3. Способ нековалентной фиксации на внешней поверхности живых клеток дуплексов олигодезоксирибонуклеотидов состава M-L по п.2, отличающийся тем, что дуплекс формируют предварительно и далее инкубируют клетки в его присутствии в условиях п.1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области клеточной инженерии и может быть использовано для избирательного маркирования живых клеток. Разработка доступных и направленных методов ДНК-маркирования клеток может сыграть решающую роль в создании новых устройств, основанных на работе иммобилизованных живых клеток или микроорганизмов, включая биосенсоры для скрининга лекарственных средств, в инженерии тканей, а также при создании исследовательских моделей межклеточных ассоциатов с целью изучения биологии клетки.

Уровень технического состояния.

Известен способ ДНК-маркирования за счет ковалентного присоединении производных олигонуклеотидов на внешней поверхности живых клеток [1], заключающийся в предварительном добавлении тетраацетил-N- -азидоацетилманнозамина в культуральную среду клеток млекопитающих, в т.ч. линии человеческих Т-лимфоцитов Jurkat. Через трое суток в полисахаридной оболочке внешней поверхности культивируемых клеток обнаруживалось около 3% (от всех полисахаридов) углеводных остатков - продуктов метаболизма данного углевода - сиаловых кислот, несущих азидную группу. 5 -Аминоалкил-производное 20-мерного олигонуклеотида (А) с помощью модифицированного дифенилфосфина переводили в производное I (Фиг.1), которое образовывало дуплекс с комплементарным ему олигонуклеотидом (А ), содержащим 5 -биотин. Дуплекс (АА -биотин) вносили в культуральную среду указанных модифицированных клеток на 1-2 ч. Дуплекс ковалентно присоединялся к азидным остаткам полисахаридов на поверхности клеток за счет образования структуры II (Фиг.2). Избыток дуплекса отмывали, клетки обрабатывали флуоресцеин-меченным авидином и доказывали связывание дуплекса с клетками методом проточной цитофлуориметрии.

В другом примере авторы [1] зарегистрировали иммобилизацию клеток, связавших олигонуклеотид (А), на твердой фазе с предварительно привитым к ней немеченым комплементарным олигонуклеотидом (А ).

Однако авторы не показали образования дуплекса олигонуклеотида А, предварительно связанного на клетке, с комплементарным ему А . Кроме того, для достижения технического результата авторам необходимо было предварительно получить модифицированный углевод, инкубировать клеточную культуру в его присутствии в течение трех суток, а затем провести в культуральной среде химическую конденсацию, что потребовало бы и наличия дефицитных реагентов, и дополнительных манипуляций с клетками, и временных затрат.

Известно также использование холестериновых производных олигонуклеотидов для манипуляций с живыми клетками [2, 3]. Но данные известные способы предназначены для доставки генетического материала внутрь клеток и не описывают накопления указанных производных на внешней поверхности живых клеток.

Известно также использование пальмитинового производного тиофосфорамидатного олигонуклеотида GRN163, структура которого не раскрывается авторами, для манипуляций с живыми клетками [4]. Но данный известный способ предназначен для улучшения противоопухолевых свойств указанного олигонуклеотида и не описывают накопления указанного пальмитинового производного, GRN163L, на внешней поверхности живых клеток.

Раскрытие изобретения и технический результат.

Техническим результатом настоящего изобретения является устранение указанных для прототипа [1] недостатков, а именно упрощение работы и сокращение времени манипуляций с клетками, а также отказ от труднодоступных реагентов за счет использования ациламиноалкильных производных олигонуклеотидов.

Технический результат достигается тем, что для фиксации олигонуклеотидов на внешней поверхности живых клеток разработан простой в техническом отношении способ получения ациламиноалкильных производных олигонуклеотидов, в том числе несущих флуоресцентную метку, предусматривающий предварительный синтез в стандартных условиях аминоалкильных производных олигонуклеотидов с последующей их обработкой N-оксисукцинимидными производными жирных кислот, приводящей к целевым ациламиноалкильным производным (Фиг.3). Указанные ациламиноалкильные производные олигонуклеотидов самопроизвольно фиксируются на внешней поверхности живых клеток при их совместном инкубировании в фосфатно-солевом буфере (PBS) или в бессывороточной среде за несколько минут, сохраняют способность к гибридизации с комплементарными им олигонуклеотидами и не изменяют выживаемости клеток при культивировании в стандартных условиях. Нагрузка зафиксированных олигонуклеотидов на поверхность клетки в данном случае зависит не от количества на ней остатков модифицированных углеводов, а от концентрации указанных ациламиноалкильных производных в инкубационной среде.

Описание чертежей.

Фиг.1. Конъюгат 5 -аминоалкил-производного олигонуклеотида (А) с модифицированным дифенилфосфином [1].

Фиг.2. Структура связи дуплекса АА -биотин с остатком сиаловой кислоты на поверхности клетки [1].

Фиг.3. Схема получения ациламиноалкильных производных олигонуклеотидов, где:

Олигонуклеотид	X	Z	Y
T18N	18	-	-
T25N	25	-	-
FT18N	18	(6-FAM)	-
FT18N	18	(6-FAM)	-
FT25N	25	(6-FAM)	-
T18NPal	18	-	Pal
T18NSte	18	-	Ste
T25NPal	25	-	Pal
T25NSte	25	-	Ste
FT18NPal	18	(6-FAM)	Pal
FT18N Pal	18	(6-FAM)	Pal
FT18NSte	18	(6-FAM)	Ste
FT25NPal	25	(6-FAM)	Pal
FT25NSte	25	(6-FAM)	Ste

Фиг.4. ВЭЖХ-анализ реакции олигонуклеотида FT18N с N-оксисукцинимидным эфиром пальмитиновой кислоты. Условия ВЭЖХ указаны в Примере 2.1.

Фиг.5. Примеры MALDI TOF масс-спектров полученных олигонуклеотидов.

Фиг.6. Флуоресцентная микроскопия клеток Jurkat, меченных олигонуклеотидами FT18NSte и FT18N.

Клетки инкубировали с 0,2 мкМ растворами FT18NSte (панели А, С) или FT18N (панели В, D) 15 мин при 37°С в PBS (зеленое окрашивание). Дополнительно клетки окрашивали 0,5 мкМ CTFR 10 мин при комнатной температуре (панели С, D, красное окрашивание). На панелях Е, F показаны флуоресцентные профили отдельных клеток, окрашенных действием CTFR и либо FT18NSte, либо FT18N; профили построены по фиолетовым линиям для клеток, показанных на панелях С, D. Клетки дополнительно окрашивали действием PI (5 мкМ) и либо FT18NSte (панель G), либо FT18N (панель Н). Темные объекты на панели Н - неокрашенные клетки на флуоресцентном фоне. Мертвые клетки окрашивались и FT18NSte, и FT18N сходным образом, с разбросом флуоресценции в цитозоле и ядре (панель Н).

Фиг.7. Определение эффективности фиксации меченых олигонуклеотидов на клетках Jurkat методом проточной цитометрии.

Условия инкубации такие же, как на Фиг.6А, В. Гистограммы распределения популяций клеток после обработки их FT18NSte (из первой серии) и FT18N (из второй серии) представлены в логарифмической шкале. График на панели С получен пересчетом указанных кривых.

Фиг.8. Флуоресцентная микрофотография макрофагов линии J774, обработанных олигонуклеотидом FT18NSte.

Клетки инкубировали с 0,2 мкМ раствором FT18NSte, как описано в подписи к Фиг.6.

Фиг.9. Гистограммы распределения клеток по флуоресценции FA25 в составе дуплекса с T18NSte. Условия инкубации - в Примере 3.4.

Кривая	Клетки	Средняя интенсивность сигнала FAM-флуоресценции клеток, au
1	Необработанные	20
2	Обработанные FA25 после предварительной инкубации cT18NSte	88
3	Обработанные дуплексом FA25-T18NSte	111

Фиг.10. Гибридизация разных количеств олигонуклеотида T18NSte, фиксированного на клетках Jurkat, с комплементарным олигонуклеотидом FA25.

А - гистограммы распределения клеток по флуоресценции FA25, добавленного после предварительной инкубации клеток с T18NSte с концентрациями 0,0, 0,4 и 1,6 мкМ. В - зависимость флуоресценции клеток от концентрации T18NSte. С-Е - микрофотографии флуоресценции FA25 для клеток, преинкубированных с 1,6 мкМ T18NSte (С) и без преинкубации (D, E). Фотографии С, D выполнены при одинаковых настройках, Е - при более высокой чувствительности детектора, что позволило выявить неокрашенные клетки (темные пятна) на слабофлуоресцентном фоне FA25, присутствующего в буфере.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1 описывает химический синтез N-оксисукцинимидных производных пальмитиновой и стеариновой кислот.

Пример 2 описывает химический синтез олигонуклеотидов, содержащих флуоресцентную метку (производное флуоресцеина, 6-FAM) и/или аминоалкильные и ациламиноалкильные звенья.

Примеры 3-5 описывают манипуляции с живыми клетками, их взаимодействие с ациламиноалкильными производными олигонуклеотидов и выявляют наличие или отсутствие фиксации олигонуклеотидов на клетках, дислокацию связанных олигонуклеотидов, их цитотоксичность, влияние их концентрации на степень нагрузки на клетку и способность фиксированных на клетке олигомеров образовывать дуплексы только с комплементарными олигонуклеотидами.

Флуоресцентная микроскопия показала, что FAM-меченые олигонуклеотиды FT18NPal, FT18NTal, FT18NSte, FT25NPal и FT25NSte, содержащие жирнокислотные остатки, с примерно одинаковой эффективностью фиксируются на клетках Jurkat (Фиг.6А). Эффективность удерживания жирнокислотных производных олигонуклеотидов не зависела от длины спейсера -CH ₂-CH(CH₂OH)-(CH₂)_N-. Олигонуклеотиды без жирнокислотных остатков - FT18N, FT25N и FA25 - фиксируются на незначительном количестве клеток (Фиг.6В), причем, как было подтверждено экспериментами с окрашиванием клеток пропидий йодидом, это - мертвые клетки с проницаемой мембраной. Одновременное окрашивание клеток маркером CellTrace Far Red DDAO-SE (CTFR), ковалентно метящим клеточные белки, показало, что флуоресцирующие объекты - не агрегаты, которые могут быть образованы дифильными молекулами олигонуклеотидов, а именно клетки, и что эти молекулы располагаются в клеточной мембране (Фиг.6С, D). Последний факт подтверждается и распределением FAM-флуоресценции меченых олигонуклеотидов и CTFR по профилям живой и мертвой клеток (Фиг.6Е и 6F соответственно).

Совместная обработка клеток Jurkat FAM-меченными олигонуклеотидами и пропидий йодидом (PI), который может окрашивать только клетки с поврежденной мембраной, показала, что лишенные жирнокислотного остатка олигонуклеотиды окрашивают лишь мертвые клетки, причем как снаружи, так и диффузно локализуясь внутри всей клетки, судя по совмещению зеленой (FAM) и красной (PI) флуоресценции (Фиг.6G и Н). Аналогичные опыты показали, что после добавления жирнокислотных производных олигонуклеотидов к клеткам доля мертвых клеток не увеличивалась, то есть указанные производные не проявляли цитотоксических свойств.

Проточная цитометрия показала, что интенсивность флуоресценции FAM-метки на клетках линейно зависела от концентрации жирнокислотных производных меченых олигонуклеотидов и почти не зависела от концентрации таковых, лишенных жирнокислотных остатков (контроль), в интервале 0,05-0,2 мкМ (Фиг.7, панель С). Отметим, что уровень флуоресценции для первых (Фиг.7, панель А) был, по крайней мере, в 300 раз выше в сравнении с контролем (Фиг.7, панель В).

Установлено, что олигонуклеотидный дуплекс, в состав которого входит ациламиноалкильное производное олигодезоксирибонуклеотида, эффективно фиксируется на поверхности живых клеток (Фиг.9).

Установлено, что после фиксации на клетках жирнокислотных производных олигонуклеотидов они остаются доступными для образования дуплексов. Например, из Фиг.10А следует, что вся клеточная популяция, предварительно инкубированная с T18NSte, приобрела сильный флуоресцентный сигнал после обработки ее FAM-олигонуклеотидом FA25, комплементарным к T18NSte. При этом интенсивность сигнала в гораздо большей степени зависела от концентрации предварительно связанного T18NSte, чем от концентрации FA25 (Фиг.10В). Флуоресцентная микроскопия подтвердила, что только предварительно обработанные T18NSte клетки флуоресцируют после добавления FA25 (Фиг.10С-Е). Сходные результаты для олигонуклеотидов T18NPal и T25NSte не приведены. При инкубировании тех же клеток с некомплементарными к T18NSte олигомерами, например с FT18, увеличения флуоресценции не наблюдалось.

Таким образом, в проведенных экспериментах ДНК дуплекс на поверхности клеток фиксировался двумя способами: 1) инкубацией клеток с заранее гибридизованными комплементарными олигонуклеотидами М и L, один из которых (М) снабжен якорной жирнокислотной группой, а второй (L) - флуоресцентной меткой; 2) инкубацией клеток, предварительно обработанных олигомером М в той же концентрации, что и в первом варианте, в присутствии олигонуклеотида L. В первом случае, судя по интенсивности сигнала FAM-флуоресценции клеток, содержание дуплекса на клетках было несколько выше (см. Фиг.9 и Фиг.10).

FAM-меченые олигонуклеотиды, содержащие жирнокислотные остатки, одинаково хорошо фиксировались на внешней мембране различных клеток как растущих в суспензионной культуре, так и прикрепленных к поверхности. На Фиг.8 приведена флуоресцентная микрофотография макрофагов линии J774, инкубированных с FT18NSte. В этом случае были подтверждены закономерности, найденные для клеток линии Jurkat по следующим показателям: цитотоксичность, распределение меченых производными олигонуклеотидов по профилям живых и мертвых клеток, зависимость нагрузки олигонуклеотидов на клетку от их концентрации. Поэтому подробные данные для макрофагов линии J774 не приводятся. Очевидно, есть все основания утверждать, что данный метод фиксации олигонуклеотидов можно успешно применять для широкого круга клеток.

Таким образом, мы установили, что ациламиноалкильные производные олигодезоксирибонуклеотидов при внесении в клеточную культуру, помещенную в фосфатно-солевой буфер или в бессывороточную среду, способны нековалентно фиксироваться на внешней поверхности живых клеток, не изменяя жизнеспособности последних в стандартных условиях культивирования, а также способны в связанном состоянии гибридизоваться комплементарными фрагментами ДНК.

Примеры реализации изобретения

Пример 1. N-оксисукцинимидные производные жирных кислот.

Смесь 1 ммоль пальмитиновой или стеариновой кислоты, 2 ммоль N-оксисукцинимида и 1 ммоль N,N-диметиламинопиридина высушивали упариванием с сухим пиридином, растворяли в 3 мл смеси диоксан-пиридин (3:1), затем при перемешивании вносили раствор 2 ммоль М,М-дициклогексилкарбодиимида в 1 мл диоксана. Через 5 ч к реакционной массе добавили 200 мкл воды, перемешивали 45 мин, осадок отфильтровывали. Маточник высушивали в вакууме досуха, остаток растворяли в 10 мл эфира. Раствор промывали 3×5 мл 5% NaHCO₃, 3×5 мл воды, сушили Na ₂SO₄, органическую фазу упаривали. Продукты перекристаллизовывали из гексана и сушили в вакууме. Выходы составили 87-92% на исходные кислоты. R_f 0,35, Kieselgel 60 (Merck, Германия), хлороформ-эфир 10:1.

Пример 2. Синтез используемых олигонуклеотидов.

Пример 2.1. Автоматический синтез.

Твердофазным амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК АСМ 800 ("Биоссет", Россия) были получены олигонуклеотиды составов (см. подпись к Фиг.3) 5 -Т_х-CH₂-CH(CH₂OH)-(CH ₂)₄-NH₂-3 (где х=18 и 25 для олигонуклеотидов T18N и T25N соответственно), 5 -(6-FAM)-T₁₈ (названный FT18), 5 -(6-FAM)-T_x-CH₂-CH(CH₂ OH)-(CH₂)_M-NH₂-3 (названные FT18N и FT25N для М=4 и х=18 и 25 соответственно и FT18N для М=1 и Х=18), а также 5 -(6-РАМ)-А₂₅-3 (FA25).

В синтезе использовали стандартные коммерческие нуклеозид-амидофосфиты и нуклеозид-полимеры, а также 5 -fluorescein phosphoramidite (6-FAM); для синтеза 3 -аминоалкил-олигомеров вместо нуклеозид-полимера использовали 3 -Amino-Modifier С7 CPG для М=4, и 3 -Amino-Modifier С3 CPG для М=1 (все реагенты - Glen Research, США). Удаление синтезированного олигомера с носителя и деблокирование осуществляли аммонолизом (28% аммиак, 5 часов, 50°С). 5 -O-Диметокситритильные (DMTr-) производные олигонуклеотидов T18N и T25N выделяли ВЭЖХ (Agilent Chemstation) в градиенте ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония. Колонка Teknokroma (Испания), 1×25 см, 45°С, 1,5 мл/мин. Удаление DMTr-группы проводили 80% водной раствором уксусной кислоты (20 мин). Не имеющие DMTr-группы олигонуклеотиды очищали обращеннофазовой ВЭЖХ.

Пример 2.2. Синтез жирнокислотных производных олигонуклеотидов.

(См. подпись к Фиг.3). 5-7 мкмоль 3 -аминоалкил-олигонуклеотидов T18N, T25N, FT18N, FT18N или FT25N и 100 мкм N-оксисукцинимидного производного жирной кислоты, согласно Примеру 1, растворяли в 40-60 мкл DMSO, встряхивали и оставляли в темноте (17 час, 60°С), затем добавляли 500 мкл воды и 1 мл эфира, встряхивали, эфирный слой отбрасывали. Конъюгаты, названные T18NPal, T18NSte, T25NPal, T25NSte, FT18NPal, FT18N Pal, FTlSNSte, FT25NPal и FT25NSte, выделяли из водной фазы обращеннофазовой ВЭЖХ (Фиг.4) в условиях Примера 2.1. Выходы составили 55-66% на исходные 3 -аминоалкил-олигонуклеотиды. Все полученные олигонуклеотиды, в том числе и жирнокислотные производные, охарактеризованы УФ-спектрофотометрией, аналитической ВЭЖХ и MALDI TOF масс-спектрометрией (Фиг.5).

Пример 3. Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности жирных клеток.

Пример 3.1. Условия культивирования клеток.

Клетки человеческой Т-лимфобластической лимфомы линии Jurkat выращивали в среде RPMI 1640 (Панэко, Россия), содержащей 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки ("ФБС", Панэко, Россия), 2 мМ глютамин (Панэко, Россия), 25 мМ Hepes и гентомицин (50 мкг/мл). Мышиные макрофагоподобные клетки линии J774 выращивали в среде DMEM (Панэко, Россия), содержащей 10% PBS и 4 мМ глютамин. Все клетки выращивали в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Мертвые клетки получали выдерживанием в 50% спирте в течение 30 мин.

Пример 3.2. Тест на выживание клеток.

Выживаемость клеток определяли проточной цитометрией и флуоресцентной микроскопией с помощью пропидий йодида (PI) (Sigma, США). Клетки промывали PBS (Хеликон, Россия) или бессывороточной средой RPMI 1640 и выдерживали в тех же растворах с PI при его итоговой концентрации 5 мкМ, 5 мин при комнатной температуре.

Пример 3.3. Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности клеток Jurkat и макрофагов J774.

Клетки Jurkat центрифугировали (1000g, 5 мин), промывали и ресуспендировали в бессывороточной среде RPMI. Сток-растворы олигонуклеотидов FT18NPal, FT18N Pal или FT18NSte (10 мкМ в 50% этаноле) добавляли к бессывороточной среде RPMI до концентрации 0,2 мкМ и содержания этанола 5%. Клетки (10⁶ клеток/20 мкл) выдерживали в полученных растворах 15 мин при 37°С и затем отмывали бессывороточной средой RPMI. Аналогичные опыты проводили, используя PBS вместо RPMI.

Макрофаги J774 высевали на плашки (5×10 ⁴ клеток в каждую из 24 ячеек, конфлуентность монослоя -15%) с покровными стеклами (5×5 мм) и культивировали в течение ночи. Инкубацию клеток с меченым олигонуклеотидом FT18NSte проводили так же, как описано выше.

После всех манипуляций клетки выдерживали с 0,5 мкМ раствором реагента CellTrace Far Red DDAO-SE (CTFR) (Molecular Probes, США) в PBS, 10 мин при комнатной температуре, промывали и исследовали флуоресцентной микроскопией или методом проточной цитометрии.

Пример 3.4. Фиксация олигонуклеотидных дуплексов на клеточной поверхности.

Смешивали равные объемы 0,8 мкМ растворов олигонуклеотидов T18NSte и FA25, выдерживали 5 мин при 37°С и 40 мин при 4°С, получая 0,4 мкМ раствор дуплекса FA25-T18NSte. В условиях предыдущего примера 0,5×10⁶ клеток/20 мкл промывали, ресуспендировали и инкубировали в PBS с указанным выше раствором дуплекса 5 мин при 37°С и 40 мин при 4°С. Либо таким же образом подготовленные клетки инкубировали в тех же условиях в 0,4 мкМ растворе T18NSte, обработанные клетки отфуговывали, ресуспендировали в PBS и инкубировали в тех же условиях в 0,4 мкМ растворе FA25. Процессы фиксации или образования дуплексов изучали проточной цитофлуориметрией (Фиг.8).

Пример 3.5. Гибридизация олигонуклеотидов на клеточной поверхности.

В условиях предыдущего примера 0,5×10⁶ клеток/20 мкл промывали, ресуспендировали и выдерживали в PBS с 0,4-1,6 мкМ растворами T18NSte 5 мин при 37°С. Обработанные клетки отфуговывали, ресуспендировали в PBS и инкубировали в 0,2 мкМ растворе FA25 5 мин при 37°С. Затем пробирки с клетками выдерживали 20 мин при 6°С. Аналогичную процедуру проводили с теми же клетками без предварительной обработки раствором T18NSte. Процесс гибридизации изучали флуоресцентной микроскопией и проточной цитофлуориметрией (Фиг.9).

Пример 4. Конфокальная флуоресцентная микроскопия.

Флуоресцентные микрофотографии клеток получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа ECLIPSE Е-800 (Nikon, Япония), снабженного конфокальным С1-модулем, аргоновым и гелиево-неоновым лазерами. Зеленую флуоресценцию FAM-меченых олигонуклеотидов регистрировали при длине волны возбуждения 488 нм и фильтре эмиссии 535/50 нм. Красную флуоресценцию PI регистрировали при длине волны возбуждения 488 нм и барьерном фильтре эмиссии 610 нм. Красную флуоресценцию CTFR обнаруживали при длине волны возбуждения 594 нм и барьерном фильтре эмиссии 610 нм. Данные о красной и зеленой флуоресценции записывали одновременно и хранили в виде 8-битовых изображений с помощью программы EZ-C1 2.30 (Nikon, Япония). Изображения анализировали с помощью программы ImageJ (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA, www.rsb.info.nih.gov/ij/).

Пример 5. Проточная цитометрия.

Клетки анализировали на цитофлуориметре Coulter Epix XL (Beckman Coulter, США), снабженном аргоновым лазером (488 нм). Зеленую флуоресценцию FAM-меченых олигонуклеотидов и красную флуоресценцию PI регистрировали с помощью фильтров эмиссии 505/545 и 650/725 нм соответственно.

Литература

1. Chandra R.A., Douglas E.S., Mathies R.A., Bertozzi C.R., Francis M.B. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006. V.45. P.896.

2. Зарытова И.Ф., Иванова E.M., Часовских M.H. // Биоорг. хим. 1990. Т.16. С.610.

3. Krieg A.M., Tonkinson J., Matson S., Zhao Q., Saxon M., Zhang L.M., Bhanja U., Yakubov L., Stein C.A.W Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. P.1048.

4. Djojosubroto M.W., Chin A.C., Go N., Schaetzlein S., Manns M.P., Gryaznov S., Harley C.B., Rudolph K.L. // Hepatology, 2005, V.42. N.5. P.1127.