способ получения раствора, используемого в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эритроцитарных и латексных диагностикумов

Формула изобретения

Способ получения раствора, используемого одновременно в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эритроцитарных и латексных диагностикумов, заключающийся в том, что раствор получают из 5 мл белка куриного яйца с 10 мл 5%-ного натрия фосфорнокислого трехзамещенного 12-водного (Na₃PO₄×12H ₂O), кипятят на водяной бане в течение 10 мин, разводят 1:1000 и добавляют 0,001% азида натрия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и может быть использовано при получении раствора, используемого в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эритроцитарных и латексных диагностикумов.

Для эритроцитарных и латексных диагностикумов необходимы среды высушивания, предотвращающие повреждающее действие замораживания и лиофилизации, а также разводящая жидкость при постановке реакции. В качестве разводящей жидкости при постановке реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) используют нормальную кроличью сыворотку (НКС), нормальную лошадиную сыворотку (НЛС), твин-80 и т.д. В качестве разводящей жидкости при постановке реакции агглютинации латекса применяют водную эмульсию белка куриного яйца с твин-80 и т.д. В качестве сред высушивания используют желатин, сахарозу, поливинилпирролидон, обеспечивающие мелкопористую, достаточно плотную структуру.

Известен способ получения среды высушивания, приготовленной следующим образом: в 100 мл 0,15 М фосфатно-боратного буфера с рН 7,2 растворяют 3,0 г пептона и кипятят на малом огне в течение 30 мин, в охлажденный раствор добавляют 1,0 г сахарозы, фильтруют через бумажный фильтр, добавляют 5,0 мл НКС. Препараты замораживают, лиофилизируют, запаивают. Лиофилизированные диагностикумы суспендируют в дистиллированной воде в объеме, указанном на этикетке, и через 3 ч разводят в 3 раза 1% раствором НКС (Ф.С.Носков. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций, под ред. Перадзе Т.В. и Халонена П., М.: Медицина, 1985, - с.106-107).

Недостатками способа является многостадийность приготовления среды высушивания, расход реактивов и НКС, возможность быстрого пророста растворенного после лиофилизации препарата (в силу того, что среда белково-углеводная без консерванта) и применение дополнительно разводящей жидкости при постановке серологических реакций, что усложняет и увеличивает по времени приготовление диагностикума и постановку реакции.

Наиболее близкими к предлагаемому способу можно считать следующие известные способы. Способ получения диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового холерного путем сенсибилизации иммуноглобулинами. В качестве конъюгирующего агента использовали глютаровый альдегид. Лиофилизацию проводили в среде высушивания, состоящей из 7,5% сахарозы и 1,5% поливинилпирролидона (Бабицин С.Н., Сидорович И.В. и др. Изготовление и практическое использование эритроцитарного иммуноглобулинового холерного энтеротоксического моноклонального диагностикума // Тезисы конференции «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии». Махачкала, 29-30 мая, 1990 г. - ч.II. - с.60).

Недостатками прототипа является то, что после растворения лиофилизированного препарата срок его годности незначительный, в силу того, что углеводная среда высушивания не предохраняет препарат от микробного пророста и при постановке реакции необходимо дополнительное применение разводящей жидкости (твин-80, НКС и т.д.).

Также известен способ постановки реакции непрямой латексной агглютинации (РНЛА), где в качестве разводящей жидкости используют водную эмульсию белка куриного яйца (Патент РФ № 2198407. Опубликован 10.02.03. Бюл.4).

Недостатком прототипа является то, что при постановке реакции необходимо использовать дополнительно импортный реактив - твин-80, применяемый только в качестве разводящей жидкости и который не может быть использован в качестве среды высушивания. Данная разводящая жидкость предназначена только для одной реакции - РНЛА.

Целью изобретения является получение универсального раствора, используемого в качестве как разводящей жидкости для постановки реакций - РНГА, РНЛА, так и среды высушивания при производстве эритроцитарных и латексных диагностикумов.

Технический результат изобретения, заключается в получении раствора, используемого в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эритроцитарных и латексных диагностикумов, который готовят следующим образом: к 5 мл белка куриного яйца добавляют 10 мл 5% натрия фосфорнокислого трехзамещенного 12 водного (Nа₃РO₄×12Н ₂O) и кипятят на водяной бане 10 мин. В результате процесса солюбилизации получается термодинамически устойчивый изотропный раствор вещества. Перед замораживанием и лиофилизацией диагностикумы центрифугируют и осадок ресуспендируют в равном объеме белкового раствора в разведении 1:1000 с 0,001% азида натрия. При этом упрощается и ускоряется постановка реакции с сокращением материальных и трудовых затрат, при увеличении срока годности препарата с сохранением его специфической активности и высокой чувствительности.

В заявляемом способе разработан универсальный раствор. Его преимущества при использовании в качестве среды высушивания: белковый раствор в разведении 1:1000 (предохраняет эритроциты и латекс (полиакролеин) от разрушения во время замораживания, придает препаратам необходимые свойства - вид таблетки, хорошую растворимость и позволяет после растворения диагностикумов постановку РНГА и РНЛА проводить на 0,9% растворе натрия хлорида, исключив использование разводящей жидкости) и азид натрия (позволяет использовать диагностикумы длительное время после растворения без микробного пророста, являясь активным антисептиком и полностью предотвращает как спонтанную агглютинацию, так и снижение чувствительности). При использовании данной среды образуется мелкопористая, хорошо растворимая таблетка. Специфическая активность, определяемая при постановке РНГА, РНЛА сохраняется и через 2 года (срок наблюдения).

Использование разработанного раствора защищает эритроцитарные и латексные диагностикумы при замораживании и лиофилизации, позволяет транспортировать препараты в любых температурных режимах, продлевает их срок годности без потери специфической активности и позволяет проводить реакцию, после растворения содержимого ампул с диагностикумами в 0,9% растворе натрия хлорида, без введения разводящей жидкости.

При четко отработанных параметрах получены эритроцитарные иммуноглобулиновые диагностикумы с чувствительностью в РНГА 1,56×10 ⁵ м.к./мл, что в 2 раза превышает чувствительность диагностикумов при использовании в качестве разводящей жидкости твин-80, обеспечивает отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными штаммами, что полностью удовлетворяет нормативной документации по эритроцитарным диагностикумам.

Отработаны параметры получения латексных (полиакролеиновых) иммуноглобулиновых диагностикумов с активностью в РНЛА 7,8×10⁴ м.к./мл, что в 2 раза превышает чувствительность известных диагностикумов при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами и полностью удовлетворяет нормативной документации по латексным диагностикумам.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Получали 50 мл 5% диагностикума эритроцитарного имму-ноглобулинового туляремийного с активностью в РНГА - 1,56×10⁵ м.к./мл, центрифугировали и осадок растворяли в среде высушивания, состоящей из 50 мл белкового раствора в разведении 1:1000 с 0,5 мг азида натрия, замораживали и лиофилизировали. После чего препарат помещали в условия разных температурных режимов (24°С, 37°С, минус 4°С) и контролировали каждые 3 месяца в течение 2 лет (срок наблюдения). Лиофилизированный диагностикум растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия и ставили РНГА. Препарат сохранял свою первоначальную активность и специфичность. Отрицательного влияния различных температур не выявлено.

Пример 2. Выполняли аналогично примеру 1, за исключением того, что получали диагностикум эритроцитарный иммуноглобулиновый против вируса гриппа птиц (асцитическая жидкость предоставлена ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, г.Москва). Препарат выявлял антиген вируса гриппа птиц в концентрации 50 нг/мл.

Пример 3. Выполняли аналогично примеру 1, за исключением того, что получали диагностикум лептоспирозный иммуноглобулиновый эритроцитарный. Препарат выявлял клетки лептоспирозного микроба в концентрации 1,56×10⁵ м.к./мл.

Пример 4. Получали 20 мл 0,2% диагностикума туляремийного иммуноглобулинового латексного с активностью в РНЛА - 7,8×10⁴ м.к./мл, центрифугировали и осадок растворяли в среде высушивания, состоящей из 20 мл белкового раствора в разведении 1:1000 с 0,2 мг азида натрия, замораживали и лиофилизировали. После чего препарат помещали в условия разных температурных режимов (24°С, 37°С, минус 4°С) и контролировали каждые 3 месяца в течение 2 лет (срок наблюдения). Лиофилизированный диагностикум растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия и ставили РНЛА. Препарат сохранял свою первоначальную активность и специфичность. Отрицательного влияния различных температур не выявлено.

Пример 5. Выполняли аналогично примеру 4, за исключением того, что получали диагностикум против вируса гриппа птиц латексный иммуноглобулиновый (асцитическая жидкость предоставлена ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, г.Москва). Препарат выявлял в РНЛА антиген вируса гриппа птиц в концентрации 50 нг/мл.

Пример 6. Выполняли аналогично примеру 4, за исключением того, что получали диагностикум лептоспирозный латексный иммуноглобулиновый. Препарат выявлял клетки лептоспирозного микроба в концентрации 7,8×10 ⁴ м.к./мл.

Таким образом, один раствор можно с успехом использовать в качестве разводящей жидкости в двух реакциях - РНГА и РНЛА и среды высушивания при производстве диагностикумов, ускоряя и упрощая процесс получения и постановки реакций с сокращением материальных и трудовых затрат, при увеличении срока годности препаратов с сохранением их специфической активности.