способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы оmpт

Классы МПК:C12P21/06 гидролизом пептидной связи, например белковых гидролизатов
C12N9/52 получаемые из бактерий
C07K19/00 Гибридные пептиды
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):АСУБИО ФАРМА КО., ЛТД. (JP)
Приоритеты:
подача заявки:
2004-09-29
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биомедицинской промышленности. Предложен способ получения целевого пептида путем расщепления полипептида или слитого белка вариантом протеазы OmpT с заменой аминокислоты в положении 97 аминокислотой, выбранной из группы, включающей аланин, лейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, глутаминовую кислоту и гистидин, по сайту, структура которого характеризуется общей формулой Pnспособ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 Р2-Р1-Р1'-Р2'способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 Pn', где P1 - аргинин или лизин, Р2 и Р2' - аминокислота, не являющаяся глутаминовой или аспарагиновой кислотой, а Р1' - аланин, валин, изолейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, тирозин или аспарагин. Применение изобретения может обеспечить эффективное и специфическое выделение терапевтических пептидов с любым типом N-концевой последовательности. 2 н. и 20 з.п.ф-лы, 3 табл., 20 ил.

способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582

Формула изобретения

1. Способ расщепления полипептида, характеризующийся тем, что расщепление осуществляют по сайту, имеющему структуру, определяемую общей формулой Pnспособ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 Р2-Р1-Р1'-Р2'способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 Pn', где P1 - аргинин или лизин, Р2 и Р2' - аминокислота, не являющаяся глутаминовой или аспарагиновой кислотой, а Р1' - аланин, валин, изолейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, тирозин или аспарагин, путем обработки указанного полипептида вариантом протеазы OmpT, в котором аминокилота в положении 97 заменена аминокислотой, выбранной из группы, включающей аланин, лейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, глутаминовую кислоту и гистидин.

2. Способ расщепления полипептида по п.1, в котором одна основная аминокислота или две или три последовательные основные аминокислоты расположены в любом сайте аминокислотной последовательности от положения Р10 до положения Р3 или от положения Р3' до положения Р5'.

3. Способ получения целевого пептида, характеризующийся тем, что трансформируют клетки-хозяева экспрессионной плазмидой, имеющей ген, кодирующий слитый белок, включающий целевой пептид, слитый с защитным пептидом через желаемый сайт расщепления, по которому может осуществляться расщепление вариантом протеазы OmpT по 97-й аминокслоте, как определено в пункте 1, экспрессируют названный ген в указанных клетках и получают целевой пептид из слитого белка путем расщепления названной протеазой в указанном сайте расщепления.

4. Способ получения целевого пептида по п.3, в котором С-конец защитного пептида является аргинином или лизином, а N-конец целевого пептида является аминокислотой иной, чем аргинин или лизин.

5. Способ получения целевого пептида по п.4, где одна основная аминокислота или две или три последовательные основные аминокислоты располагаются в любом сайте аминокислотной последовательности от положения Р10 до положения Р3 или от положения Р3' до положения Р5' желаемого сайта расщепления слитого белка.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором в случае наличия в полипептиде или слитом белке сайта, по которому нежелательно проводить расщепление вариантом протеазы OmpT по 97-й аминокислоте, расщепление в указанном сайте ингибируют, располагая кислую аминокислоту в положении Р3 указанного сайта.

7. Способ по любому из пп.2 и 5, который включает расположение двух или трех последовательных основных аминокислот между положениями Р10 и Р3 желаемого сайта расщепления в полипептиде или слитом белке.

8. Способ по п.7, который включает расположение трех последовательных основных аминокислот между положениями Р5 и Р3 желаемого сайта расщепления в полипептиде или слитом белке.

9. Способ по любому из пп.2 и 5, в котором основными аминокислотами являются аргинин и/или лизин.

10. Способ по п.9, где основной аминокислотой является аргинин.

11. Способ по п.6, где кислой аминокислотой является аспарагиновая кислота.

12. Способ по любому из пп.2 и 5, где аминокислотная последовательность от положения Р5 до положения Р1 желаемого сайта расщепления в полипептиде или слитом белке является Arg-Arg-Arg-Ala-Arg.

13. Способ по любому из пп.2 и 5, где аминокислотная последовательность от положения Р7 до положения Р1 желаемого сайта расщепления в полипептиде или слитом белке является Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg.

14. Способ по любому из пп.1-5, где 97-й аминокислотой от N-конца протеазы OmpT являются лейцин, метионин или гистидин.

15. Способ по любому из пп.1-5, где положение Р1' желаемого сайта расщепления полипептида или слитого белка или N-конец целевого пептида представлены серином или аланином, и 97-я аминокислота применяемого варианта протеазы OmpT по 97-й аминокислоте является лейцином.

16. Способ по любому из пп.1-5, где положение Р1' желаемого сайта расщепления полипептида или слитого белка или N-конец целевого пептида представлены фенилаланином, аланином, серином, цистеином или тирозином, и 97-я аминокислота применяемого варианта протеазы OmpT по 97-й аминокислоте является метионином.

17. Способ по любому из пп.1-5, где положение Р1' желаемого сайта расщепления полипептида или слитого белка или N-конец целевого пептида представлены аланином, валином, изолейцином, метионином, серином, треонином, цистеином или аспарагином, и 97-я аминокислота применяемого варианта протеазы OmpT по 97-й аминокислоте является гистидином.

18. Способ по п.3, где целевой пептид является пептидом, состоящим из 22-45 аминокислотных остатков.

19. Способ по п.18, где целевой пептид является адренокортикотропным гормоном (1-24), мотилином или предшественником кальцитонина.

20. Способ по п.3, где клетки-хозяева являются клетками Е.coli.

21. Способ по п.3, который включает применение в качестве расщепляющей протеазы бактериальных клеток, экспрессирующих ген, кодирующий вариант протеазы OmpT по 97-й аминокислоте, где 97-й аминокислотой от N-конца протеазы OmpT является аланин, лейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, глутаминовая кислота или гистидин.

22. Способ по п.20, отличающийся тем, что вариант протеазы OmpT является продуктом экспрессии соответствующего гена, включенного в состав второй экспрессионной плазмиды, а выделение целевого пептида достигается путем растворения образующихся в клетке телец включения.

Описание изобретения к патенту

Текст описания приведен в факсимильном виде. способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582 способ расщепления полипептидов с использованием варианта протеазы   оmpт, патент № 2395582

Класс C12P21/06 гидролизом пептидной связи, например белковых гидролизатов

способ выделения низкомолекулярных пептидов -  патент 2510398 (27.03.2014)
способ детекции белков в амилоидном состоянии и набор для детекции белков в амилоидном состоянии -  патент 2509155 (10.03.2014)
способ выделения рекомбинантных белков -  патент 2499052 (20.11.2013)
способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты) -  патент 2458989 (20.08.2012)
дрожжевой экстракт, содержащий двунатриевую соль инозината и двунатриевую соль гуанилата, и способ его получения -  патент 2456347 (20.07.2012)
гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека -  патент 2453604 (20.06.2012)
способы получения симвастатина -  патент 2447152 (10.04.2012)
гибридный белок, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2b человека из этого гибридного белка -  патент 2441072 (27.01.2012)
способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека -  патент 2432401 (27.10.2011)
способ получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и ферментативный гидролизат молочного гриба -  патент 2421513 (20.06.2011)

Класс C12N9/52 получаемые из бактерий

способ получения положительно заряженных белковых фракций с ингибирующей в отношении трипсина активностью в растущей популяции escherichia coli -  патент 2487940 (20.07.2013)
фермент для продукции длинноцепочечной перкислоты -  патент 2487939 (20.07.2013)
протеаза streptomyces -  патент 2486244 (27.06.2013)
способ получения фракции из клеток escherichia coli, обладающей ингибирующей протеазы активностью -  патент 2437934 (27.12.2011)
способ получения igal-протеазы из культуры neisseria meningitidis серогруппы а и иммуногенный препарат на ее основе -  патент 2407792 (27.12.2010)
фермент карбоксипептидаза кпsв, штамм streptomyces bikiniensis - продуцент карбоксипептидазы кпsв, фрагмент днк sb27-995, кодирующий синтез зрелой формы этого фермента, и способ микробиологического синтеза карбоксипептидазы кпsв -  патент 2388825 (10.05.2010)
новая мутантная карбамоилфосфатсинтетаза и способ продукции соединений - производных карбамоилфосфата -  патент 2264459 (20.11.2005)
лекарственный препарат для оптимизации вязкости слизи и стимулирования функции кишечника -  патент 2198673 (20.02.2003)
способ получения коллагеназы -  патент 2180002 (27.02.2002)
нецитотоксическое вещество, способ регуляции выделения нейромедиатора или нейромодулятора из первичных сенсорных афферентных клеток и способ регуляции выделения нейромедиатора и нейромодулятора из первичных ноцицептивных афферентных клеток -  патент 2165976 (27.04.2001)

Класс C07K19/00 Гибридные пептиды

модифицированный фактор виллебранда с удлиненным полупериодом существования in vivo, его применения и способы получения -  патент 2528855 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами -  патент 2524129 (27.07.2014)
искусственный ген mel-tci-a0201, кодирующий полиэпитопный белок-иммуноген mel-tci-a0201, рекомбинантная плазмидная днк pmel-tci-a0201, обеспечивающая экспрессию искусственного гена mel-tci-a0201 и искусственный белок-иммуноген mel-tci-a0201, содержащий множественные ctl- и th-эпитопы антигенов меланомы -  патент 2522830 (20.07.2014)
антитело двойной направленности в новой форме и его применение -  патент 2520824 (27.06.2014)
мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных кислот -  патент 2517608 (27.05.2014)
гибридный белок на основе рекомбинантного эритропоэтина человека, обладающий пролонгированным действием (варианты), и способ его получения -  патент 2515914 (20.05.2014)
гибридный белок, обладающий пролонгированным действием, на основе рекомбинантного интерферона альфа-2 человека (варианты), способ его получения и штамм saccharomyces cerevisiae для осуществления этого способа (варианты) -  патент 2515913 (20.05.2014)
рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса borrelia burgdorferi sensu lato, и способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза -  патент 2514230 (27.04.2014)
Наверх