способ получения бад "л-пфи" из вторичного молочного сырья и полученная этим способом бад "л-пфи"

Формула изобретения

1. Способ получения биологически активной добавки БАД, включающий очистку молочного сырья от механических примесей, сепарирование, кислотное осаждение казеина, диализ, холодную стерилизацию, лиофильную сушку, отличающийся тем, что полученную сыворотку после кислотного осаждения казеина подщелачивают до рН 6,8 и подвергают ультрафильтрации, пропуская ее через мембраны 100 кДа, после чего выделенную иммуноглобулиновую фракцию подвергают микрофильтрации с применением керамических мембран с селективностью пор 0,2 мкм и давлении 0,05-0,2 мПа и отправляют на промежуточное хранение, а пермеат подвергают повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа, полученный при этом концентрат белков наносят на колонку с сорбентом СМ-агарозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируя градиентом NaCl от 0,35 М до 1 М, две фракции (лактоферриновую и лактопероксидазную) с А₂₈₀>0,1 собирают и проводят диализ против дистиллированной воды, а затем проводят микрофильтрацию полученных фракций через мембраны с селективностью пор 0,2-0,3 мкм, смешивают в соотношении, аналогичном содержанию их в свежевыдоенном коровьем молоке 91:5:4 соответственно.

2. Биологически активная добавка, полученная по п.1, характеризующаяся тем, что она содержит биологически активные белки молока в соотношении, соответствующем содержанию их в свежевыдоенном коровьем молоке.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской, фармацевтической, косметической промышленности, а именно к способам получения биологически активных веществ, которые могут использоваться в качестве биологически активных добавок (БАД).

Известна антибактериальная композиция, разработанная в форме жевательных пастилок, содержащая в качестве активных компонентов лактоферрин и сухое молозиво с добавлением цитрусового пектина [Патент US 6258383 (США)]. / Добавка для диетического питания, состоящая из молозива и лактоферрина/ Маркус Б. Кокрум (США), Ричард Н. (США)]. Композиция применяется для лечения и профилактики инфекционных болезней, стимулирования иммунитета и регенерации тканей.

Известен способ получения БАД на основе иммуноглобулинов и пищевых волокон, который заключается в том, что в пастеризованное молоко вносится закваска, применяемая при производстве сыра, проводится процесс сквашивания молока, во время которого тщательно контролируются изменения значения рН и время заквашивания, для получения необходимого качества сгустка и минимального воздействия на иммуноглобулиновую фракцию сывороточных белков молока. Выделившуюся сыворотку подвергают сепарированию для удаления несвязавшихся частиц жира и казеина, а затем подвергают ультрафильтрации с последующим применением ионнобменной хроматографии. Полученный концентрат иммуноглобулинов подвергают лиофильному высушиванию с последующим сухим смешиванием с пищевыми волокнами, такими как инулин, пектин, гуаровая камедь в соотношении иммуноглобулин - 40%, пищевое волокно - 60%. Состав рекомендуется применять в качестве средства для лечения и профилактики диарейных инфекций, вызываемых криптгоспоридиями, а также с инфекциями желудочно-кишечного тракта, вызываемыми Candida, Giardia lambda, Entamoeba histolytica, Cholerae, Shigella, Salmonella, Helicobacter pylori, Campylobacter, ротовирусами и аденовирусами. Японскими учеными запатентован способ получения из молока препарата лактопероксидазы [Патент JP 2004039704 (Япония). / Способ получения лактопероксидазы/ Ищихаши Нобуо (Япония), Ямаучи Кожи (Япония), Шин Коучироу (Япония), Андо Тетсуя (Япония)]. Способ включает в себя следующие стадии: обезжиренное молочное сырье подвергается ионнобменной хроматографии, промывается водой, чтобы вымыть неабсорбировавшиеся компоненты молока, фракция, содержащая лактопероксидазу, элюируется с колонки 1,6% раствором поваренной соли. Полученную фракцию подвергают ультрафильтрации через мембраны с селективностью пор 20 кДа при давлении 0,3 мПа, с последующим введением в систему дистиллированной воды для опреснения полученного ультрафильтрата, который затем подвергают холодной стерилизации и лиофильной сушке.

К недостаткам двух вышеперечисленных аналогов можно отнести наличие одного антибактериального компонента в составе препаратов.

Известен запатентованный в США способ производства жидкой формы биологически активной композиции общеукрепляющего действия, а также направленный на ликвидацию существующего дефицита железа. Композиция содержит насыщенный железом лактоферрин и бикарбонат натрия [Патент US 5098722 (США). / Способ производства напитка, обогащенного железом/ Танака (Япония), Маки Ши (Япония), Тожима (Япония), Теичи (Япония), Шун-Ищи (Япония), Татсуми (Япония), Кийощи (Япония)].

Известен состав, содержащий выделенный из молока коров и других млекопитающих трехвалентный хром - хлорид, ацетат, сульфат, пиколинат, никотинат, GTF Cг (фактор толерантности к глюкозе), хром из дрожжей, минеральные и соли хрома и их комбинации [Патент US 20070010426 (США). / Состав для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний / Мао Франк Чиахунг (Тайвань), Чен Вен-Йинг (Тайвань), Чианг Йи Чунг (Тайвань), Чианг Лиу Ченг (Тайвань)]. Состав, применимый в качестве средства при лечении гипертонии, гиперлипидемии, ожирения, а также сердечно-сосудистых заболеваний, например, инфаркта миокарда. Состав обладает синергическим действием при соотношении лактоферрина и соединений Сг{3+}1:200-1:10. В составы, используемые перорально, в виде твердых пищевых биодобавок и в напитках также вводят витамины и минеральных соли.

Известен способ получения биологически активного продукта из молозива [Патент CN 1112394 (Китай) /Способ приготовления биологически активного продукта из молозива коров / Жаокуоун Денг (CN); Юниян Лю (CN); Лю Шенгву (CN)]. Способ включает следующие последовательные операции: удаление жира и казеина центрифугированием, добавление пепсина или соляной кислоты, удаление сгустка центрифугированием, осаждение иммуноглобулина насыщенным сульфатом аммония или гиперфильтрацией, сбор и отделение иммуноглобулина и лизоцима. Полученный продукт обладает значительным действием для профилактики и лечения диареи, а также хронических бронхитов у новорожденных. Недостатком данного способа является то, что при добавлении пепсина или соляной кислоты часть биологически значимых компонентов молозива теряют свою активность.

Существует способ получения биологически активной добавки на основе ангиогенина, панкреатической РНКазы, лизоцима и полипептидов, полученной методом катионно-обменной хроматографии на СМ-целлюлозе [Патент № 2183935 (РФ). Способ получения биологически активной добавки «МИЛКАНГ» и полученная этим способом БАД «МИЖАНГ» / Рогов И.А., Титов Е.И., Шалыгина A.M., Тихомирова Н.А., Комолова Г.С., Рогов С.И.]. Способ заключается в том, что сначала белки молочного происхождения отделяют от жировой фракции, затем проводят сорбцию и хроматографическое разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., диализ против физиологического раствора, стабилизируют ее путем проведения микрофильтрации через полупроницаемую мембрану с селективностью более 50 кДа, после чего полученную БАД, включающую ангиогенин, панкреатическую РНКазу, лизоцим и полипептиды, направляют на фасовку. К недостаткам данного способа можно отнести получение БАД в жидкой форме, что значительно снижает уровень сохранности компонентов, входящих в состав БАД в процессе хранения.

Японскими учеными запатентован в России способ получения продукта, содержащего «активные молочно-белковые компоненты», и продукт, полученный этим способом (варианты) [Патент № 21-6785 (Россия). Способ получения продукта, содержащего активные молочно-белковые компоненты, и продукт, полученный этим способом (варианты). / Йосиказу Юки (JP), Кумико Теразава (JP), Томойо Накагава (JP), Казуо Кате (JP)]. Целью разработанного способа является получение для недоношенных детей продуктов, получаемых из грудного или коровьего молока и содержащих активные молочные белковые компоненты, а именно иммуноглобулины, лактоферрин и лизоцим. Эти продукты также могут быть использованы в качестве добавки к грудному молоку и как фармацевтические продукты, например, при терапии неподдающегося поноса. Авторы патента термин «активные белковые компоненты» используют для обозначения любого белка, который в минимальных количествах проявляет физиологические и фармакологические свойства. Продукты получают по способу, состоящему из стадий добавления к молочной плазме или сыворотке сахарного спирта, или дисахарида, или стабилизатора, состоящего из дисахарида и аминокислоты (глицин), и проведения термообработки полученной смеси при рН 6-8, при примерно 60°С в течение около 10 ч; продукты, содержащие активные компоненты молочного белка, представляют собой осадок, образовавшийся при добавлении сульфата аммония в концентрации 30-60% (мас./объем) к термообработанной смеси. Термообработанную смесь охлаждают, а осажденную фракцию собирают центрифугированием и растворяют в изотоническом солевом растворе, подвергают адекватному диализу и стерилизации с помощью мембранной фильтрации.

Недостатками данного способа является содержание биологически активных компонентов в нестандартизованном соотношении, а также использование длительной (10 ч) термообработки, в результате которой происходит не только уничтожение вирусов, но и частичная или полная потеря нативности биологически активных белков молока. Известен способ получения БАД из низкомолекулярных белков молока, содержащей в концентрированном виде защитный комплекс молока, включающий катионные белковые вещества (лактопероксидазу, лактоферрин, лизоцим, ангиогенин, панкреатическую рибонуклеазу), обладающие парафармацевтическими свойствами [Патент № RU 2318406 С1 (Россия). Способ получения БАД из низкомолекулярных катионных белков молока и полученная этим способом БАД. / Рогов И.A. (RU), Титов Е.И. (RU), Семенов Г.В. (RU), Тихомирова Н.А. (RU), Комолова Г.C. (RU), Ионова Г.Г. (RU), Лепихина O.E. (RU)]. Способ включает выделение белковой фракции молока путем центрифугирования молочного сырья, далее проводят их сорбцию и хроматографическое разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., подвергают диализу, сорбцию и хроматографическое разделение проводят на СМ-целлюлозе, а диализ полученной белковой фракции проводят против дистиллированной воды, фосфатного буфера, при этом осуществляют ее микробиологическую очистку путем проведения микрофильтрации через полупроницаемую мембрану, после чего полученную БАД, включающую лактопероксидазу, лактоферрин, молочный лизоцим, ангиогенин, панкреатическую РНКазу направляют на расфасовку. После расфасовки в стерильную тару, для обеспечения длительных сроков хранения, композицию подвергают замораживанию до температуры минус 20-25°С и последующей сублимационной сушке при температуре сублимации минус 20±4°С, температуре досушки 37±2°С.

Данный способ является прототипом.

Недостатками данного способа является выделение биологически активных катионных белков молока в виде единой фракции и отсутствие технологических этапов, направленных на получение очищенных форм биологически активных белков. Что крайне важно, учитывая, что компонентный состав молока-сырья зависит от многих факторов и нестабилен в течение года, а соответственно, полученная таким способом БАД не может характеризоваться постоянным компонентным составом и заданным уровнем биологических свойств.

Стоит также отметить, что предложенный способ не предусматривает получение иммуноглобулинов, которые также содержатся в молочном сырье и играют важную роль в регуляции иммунных процессов в организме.

Таким образом, в результате патентного и литературного поиска установлено, что получение биологически активных веществ из молока является актуальной задачей, а использование белков иммуноглобулина, лактоферрина, лактопероксидазы в виде биологически активного препарата находит широкое распространение в медицине и фармакологии.

Задача настоящего изобретения направлена на разработку способа получения БАД из молочного сырья, в том числе не используемого рационально, а именно вторичного сырья молочной промышленности и получение этим способом БАД, содержащей в концентрированном виде защитный комплекс молока, включающий биологически активные белки молока (иммуноглобулины, лактоферрин, лактопероксидазу), обладающие широким спектром парафармацевтического действия.

Поставленная задача решается в разработанном способе получения биологически активной добавки БАД, включающем очистку молочного сырья от механических примесей, сепарирование, кислотное осаждение казеина, диализ, холодную стерилизацию, лиофильную сушку, согласно изобретению полученную сыворотку после кислотного осаждения казеина подщелачивают до рН 6,8 и подвергают ультрафильтрации, пропуская ее через мембраны 100 кДа, после чего выделенную иммуноглобулиновую фракцию подвергают микрофильтрации с применением керамических мембран с селективностью пор 0,2 мкм и давлении 0,05-0,2 мПа и отправляют на промежуточное хранение, а пермеат подвергают повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа, полученный при этом концентрат белков наносят на колонку с сорбентом СМ-агарозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют градиентом NaCl от 0,35 М до 1 М, разделяя полученный концентрат на две белковые фракции (одна из которых содержит лактопероксидазу, другая лактоферрин), обе полученные фракции с А₂₈₀>0,1 собирают и проводят диализ против дистиллированной воды, а затем проводят микрофильтрацию полученных фракций через мембраны с селективностью пор 0,2-0,3 мкм, после чего три полученные монофракции (иммуноглобулиновую, лактоферриновую и лактопероксидазную) смешивают в соотношении, аналогичном содержанию их в свежевыдоенном коровьем молоке.

Технический результат, полученный согласно данному способу производства, заключается в том, что БАД «Л-ПФИ» обладает постоянным компонентным составом и содержит в нативном виде такие полифункциональные компоненты молока, как иммуноглобулины, лактоферрин и лактопероксидазу, которые обладают иммуномодуляторным, антиоксидантным, антистрессовым, антимикробным и общеукрепляющим действием.

Разработан достаточно простой и современный способ получения БАД на основе сывороточных белков молока, обладающих биологической активностью. Впервые получена фракция катионных белков молочного происхождения, обогащенная лактопероксидазой, лактоферрином и иммуноглобулинами. Благодаря получению фракции белков в нативном состоянии данную композицию целесообразно использовать в качестве основы БАД к пищевым продуктам или в технологиях производства медицинских, фармацевтических и косметических препаратов.

Для получения фракции белковых веществ молока применена ступенчатая ультрафильтрация и ионообменная хроматография на СМ-агарозе. Для стерилизации, микробиологической очистки, БАД использована микрофильтрация через полупроницаемые мембраны. Для обеспечения длительных сроков хранения полученной БАД применяют сублимационную сушку. В качестве источника белковых веществ молока, обладающих антимикробным, антиоксидантным, иммуномодуляторными свойствами, использовано сырое молоко, а также вторичное молочное сырье молочной промышленности (обезжиренное молоко). Молоко, в частности вторичные молочные ресурсы, является перспективным источником получения биологически активных веществ [Н.А.Тихомирова, Г.С.Комолова, И.И.Ионова. Биологически активные белки молока: Учеб. пособие. - М: МГУПБ, 2004. - 80 с.], которые могут быть использованы в качестве активной основы БАД для получения продуктов специального назначения и препаратов лечебно-профилактической направленности широкого спектра действия. В частности, представляют интерес практически не используемые в традиционных технологиях катионные белки, обладающие многофункциональными свойствами: лактопероксидаза (78 кДа, обладает антимикробной активностью), лактоферрин (78-80 кДа, полифункциональный белок: бактерицидная и бактериостатическая активность, стимулирует клеточный рост, белок острой фазы, ингибирует иммунные и воспалительные реакции, участвует в процессах внутреннего пищеварения (иммуномодулятор), иммуноглобулин (антимикробная и иммуномодуляторная активность).

Разработанный способ позволяет получать БАД, содержащую в концентрированном, но при этом нативном виде вышеперечисленные биологически активные белки молока. Благодаря сохранности их нативных свойств БАД обладает антимикробным, антиоксидантным, иммуномодуляторным, ангиогенным свойствами, что позволяет использовать ее как непосредственно, так и в виде добавки к молочным и другим продуктам питания, которые могут быть рекомендованы в качестве диетического, функционального, лечебно-профилактического питания.

Белковый состав БАД проверяют электрофоретически в ПААГ, а нативность белков - по ферментативной активности (лактопероксидаза, лактоферрин), иммуноглобулины - методом ИФА (иммуноферментного анализа).

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения БАД берут очищенное от механических примесей и загрязнений молочное сырье с нативными биологически активными белковыми веществами, сепарируют, далее обезжиренную белковую фракцию подвергают кислотной коагуляции с получением казеина и сыворотки. Полученную сыворотку после кислотного осаждения казеина подщелачивают до рН 6,8 и подвергают ультрафильтрации, пропуская ее через мембраны 100 кДа, получая иммуноглобулиновую фракцию, которую подвергают микрофильтрации с применением керамических мембран с селективностью пор 0,2 мкм и давлении 0,05-0,2 мПа и отправляют на промежуточное хранение, а пермиат подвергают повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа, полученный при этом концентрат белков наносят на колонку с сорбентом СМ-агарозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируя градиентом NaCl от 0,35 до 1 М, две фракции (лактоферриновую и лактопероксидазную) с А₂₈₀>0,1 собирают и проводят диализ против дистиллированной воды. Для обеспечения микробиологической чистоты проводят микрофильтрацию полученных фракций через мембраны с селективностью пор 0,2-0,3 мкм.

После чего три полученные монофракции (иммуноглобулиновую, лактопероксидазную и лактоферринновую) смешивают в заданном соотношении, равном соотношению этих белков в свежевыдоенном коровьем молоке 91:5:4 соответственно.

Стерильную композицию расфасовывают в пенициллиновые флаконы и подвергают замораживанию до температуры минус 20-25°С с последующей лиофильной сушкой при температуре минус 20±4°С и последующей температуре досушки плюс 37±2°С.

Ферментный состав полученной БАД «Л-ПФИ» представлен в таблице 1.

Таблица 1 Ферментный состав БАД «Л-ПФИ» из биологически активных белков молока
№	Фермент	Выход из	Составление композиции
п/п		1 л молока
		мг	мг	мг/мг белка*
1	Иммуноглобулин	414,3±38,4	531.3±38.3	0,91
1	Лактоферрин	14,4±1,4	21.4±1.8	0,35
2	Лактопероксидаза	13,4±1,2	29.6±3.2	0,49
6	Общий белок	444,1±41,0	585,9±43,3	1
* - в расчете на 1 мг общего белка полученной белковой композиции.

Пример.

Цельное молоко в количестве 5 л очищают от механических примесей, сепарируют, далее в обезжиренную фракцию вносят слабый раствор соляной кислоты и осаждают казеин. Полученную сыворотку подщелачивают до рН 6,8 и подвергают ультрафильтрации, последовательно пропуская ее через мембраны 100 кДа, после чего выделенную иммуноглобулиновую фракцию подвергают микрофильтрации с применением керамических мембран с селективностью пор 0,2 мкм и давлении 0,05-0,2 мПа и отправляют на промежуточное хранение, а пермиат подвергают повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа, полученный при этом концентрат белков наносят на колонку с сорбентом СМ-агарозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируя градиентом NaCl от 0,35 до 1 М, две полученные фракции (лактоферриновую и лактопероксидазную) с А₂₈₀>0,1 собирают и проводят диализ против дистиллированной воды. Для обеспечения микробиологической чистоты проводят микрофильтрацию полученных фракций через мембраны с селективностью пор 0,2-0,3 мкм. После чего полученные монофракции (иммуноглобулиновую, лактопероксидазную и лактоферринновую) смешивают в соотношении, аналогичном содержанию их в свежевыдоенном коровьем молоке (91:5:4 соответственно), и получают БАД «Л-ПФИ». Готовую БАД «Л-ПФИ» в жидкой форме фасуют в пенициллиновые флаконы и подвергают замораживанию до температуры минус 20-25°С с последующей лиофильой сушкой при температуре минус 20±4°С и последующей температуре досушки плюс 37±2°С, в результате получают сухую форму БАД «Л-ПФИ».

Таким образом, в сравнении с прототипом в состав БАД входят биологически активные белки в нативном состоянии, обладающие кроме ранозаживляющего и общеукрепляющего эффектов также антимикробным, антиоксидантным и иммуномодуляторным свойствами за счет дополнительного содержания иммуноглобулинов, что позволяет использовать полученную БАД в качестве основы препаратов парафармацевтического действия.