композиция для улучшения состояния кожи, содержащая в качестве активного ингредиента гормоны роста человека

Формула изобретения

1. Композиция, составленная для поверхностного нанесения на кожу для улучшения состояний кожи, которая содержит гормон роста человека в диапазоне нанесения от 0,001 до 100 нг на см² кожи и косметически приемлемый носитель.

2. Композиция по п.1, где косметически приемлемый носитель включает липосому.

3. Композиция по п.2, где липосома представляет собой нанолипосому и эта нанолипосома имеет размер от 20 до 1000 нм.

4. Композиция по п.1, где эта композиция составлена в виде крема, лосьона, тоника, сыворотки, геля, раствора, высушенного порошка или маски.

5. Композиция по п.1, где состоянием кожи являются угри, морщины, темные пятна, эластичность кожи, рост волос, старение кожи, влажность кожи или пролиферация дермальных стволовых клеток.

6. Композиция по п.1, где композиция является косметической или фармацевтической композицией.

7. Способ улучшения состояний кожи человека, который включает поверхностное нанесение на кожу человека композиции согласно любому из пп.1-6.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к улучшающим состояния кожи композициям для поверхностного нанесения на кожу, которые содержат в качестве активного компонента гормон роста человека, и к способу улучшения состояний кожи человека.

Уровень техники

В данной области в основном известно, что макромолекулы, такие как гормон роста человека (молекулярный вес около 22 кДа), не могут проникать сквозь роговичный слой кожи. Обычно считается, что молекулярный вес веществ, способных эффективно переноситься через эпидермис кожи, не превышает приблизительно 500 Да или не более 2 кДа, даже с помощью усилителей проницаемости кожи. Поэтому нанесение макромолекул таких, как гормон роста человека, на поверхность интактной (неповрежденной) кожи и косметическое или медицинское воздействие макромолекул считались безуспешными.

Делались некоторые попытки доставлять белки в дермальный слой кожи путем местного нанесения липосом со включенными в них белками. Было отмечено, что инкапсулированные внутрь липосом белки проходят в дермис или в волосяные фолликулы. Отмечалось, что для доставки сквозь волосяные фолликулы требуется либо система доставки в форме липосом, либо липидная композиция, содержащая липиды такие, как жирные кислоты. Кроме того, для доставки сквозь волосяные фолликулы в качестве способствующей среды испытывались также водные растворы, содержащие органический растворитель такой, как этанол, или содержащие полимер такой, как полиэтиленгликоль, хотя эффективности доставки были намного ниже. Что касается эффективностей доставки белков сквозь кожу с помощью несущих белки липосом, общий принцип пока не был определен, поскольку случаев доставки липосомных форм белков пока было мало, и даже в этих редких случаях эффективности доставки белков различались в широких пределах в зависимости от эмпирического выбора целевых белков и природы использованных липосом. Заслуживает упоминания то, что хотя идея доставки белков сквозь волосяные фолликулы получает большее одобрение, даже когда белок доставляется в инкапсулированной в липосомы форме, липосомы не могут проходить интактными сквозь воронкообразную часть волосяных фолликул. Скорее всего они могут претерпевать различные морфологические преобразования или фазовые переходы, благодаря, во-первых, характеристикам фосфолипидов, создающих рН снаружи и внутри, и зарядовые валентности липосом, во-вторых, в зависимости от белков, прикрепленных к липосомам или инкапсулированных в липосомы, и, в-третьих, в зависимости от составных ингредиентов окружающих волосяные фолликулы тканей. Поэтому эти три фактора и их сложные взаимоотношения определяют, по-видимому, в целом эффективность доставки содержащих целевые белки липосом в волосяные фолликулы. Однако в настоящий момент здесь работают скорее эмпирические соотношения, а не общий руководящий принцип. В отношении настоящего изобретения особого внимания заслуживает наличие сообщения о том, что рецепторы гормона роста человека располагаются на слоях живых клеток эпидермиса и на всех вспомогательных органах и тканях, составляющих и окружающих волосяные фолликулы.

Гормон роста человека секретируется из передней доли гипофиза и циркулирует в крови, оказывая влияние на все органы тела человека. На стадии роста человека он главным образом участвует в росте скелета, увеличении мышечной массы, разрушении жира, росте внутренних органов, половом созревании и т.п. Кроме того, высказано предположение, что если вводить гормон роста человека взрослым в количествах, соответствующих физиологической концентрации в крови, он проявит различное действие - такое, как усиление сердечной системы циркуляции, улучшение способности к обучению, усиление мышц, уменьшение отложения жира на животе, повышение либидо, снижение атеросклероза и ослабление старческой депрессии. Известно, что воздействие гормона роста человека на его организм - это не действие самого гормона роста человека, оно скорее определяется действием инсулино-подобного фактора роста 1 (IGF-1), экспрессию которого стимулирует фактор роста человека и который продуцируется в основном в печени и секретируется в кровь. Это определяется тем, что время полужизни гормона роста человека в крови составляет около 15 мин, тогда как время полужизни IGF-1 в крови составляет около 20 ч. Поэтому IGF-1 может сохраняться намного дольше, чем гормон роста человека. В реальности секретированный из гипофиза гормон роста человека связывается с имеющимся в крови связывающим гормон роста человека белком, мигрирует вместе с кровотоком и встречается с рецепторами гормона роста человека, имеющимися во всех тканях человека. В этот момент гормон роста человека высвобождается из комплекса со связывающим гормон роста человека белком, связывается с рецептором гормона роста человека, и это связывание дает сигнал для стимуляции синтеза и секреции IGF-1. Затем секретируемый в кровь IGF-1 связывается со связывающим IGF-1 белком, циркулирует в кровотоке и связывается с рецепторами для IGF-1, имеющимися в каждой ткани человеческого тела, что обеспечивает различные физиологические эффекты, вызванные секрецией гормона роста человека. Поэтому если действительно будет продемонстрировано действие на кожу инъекции средства с гормоном роста человека, это будет эффект, вызванный действием IGF-1, и он будет неизбежно зависеть от присутствия или отсутствия рецептора для IGF-1 на поверхности клеток кожи, которые могут вступить в непосредственный контакт с кровью. Даже если считать, что на кожу воздействует непосредственно гормон роста человека, а не IGF-1, его влияние будет неизбежно опосредовано рецепторами для гормона роста человека, имеющимися в тех местах, которые контактируют с кровью. Таким образом, полагают, что оценка любого воздействия на кожу при нанесении гормона роста человека (имеющего такой молекулярный вес, что он не может проходить сквозь кожу) вместе с косметическими средствами на поверхность нормальной кожи, которая не имеет непосредственного контакта с кровью, вообще не имеет смысла. Настоящее изобретение является первым свидетельством того, что с помощью способа нанесения гормона роста человека в форме косметического препарата на поверхность нормальной кожи, которая не находится в непосредственном контакте с кровью, но не с помощью способа передачи действия гормона роста человека через кровь, гормон роста человека может оказать на кожу косметическое и лечебное действие такое, как избавление от угрей, морщин, излечение аллергической кожи, вызванных УФ-облучением повреждений кожи, удаление темных пятен, веснушек, излечение сухой и жирной кожи, уменьшение волосяных фолликул и стимуляция роста волос.

Ткань кожи состоит из эпидермиса, дермиса и гиподермиса. Эпидермис определяет свойства кожи и часто подвержен повреждению при прямом воздействии внешних факторов, поэтому залечивание и восстановление эпидермиса очень важны. Эпидермис состоит из слоя эпидермальных клеток. Эпидермальные клетки кожи называются также «кератиноцитами», так как эпидермальные клетки кожи в ходе их дифференцировки синтезируют промежуточный фибриллярный белок кератин, усиливающий эпидермис. Эти клетки в ходе дифференцировки образуют слои, мигрируя в сторону эпидермиса, становятся плоскими по мере того, как постепенно исчезают внутриклеточные органеллы, и превращаются в мертвые клетки. Слой клеток, расположенный в самой глубинной части эпидермиса, прилегает к базальному слою и называется «базальным слоем» (stratum basale), а образующие слой клетки называют «базальными клетками», среди которых присутствуют стволовые клетки эпидермиса. Клетки базального слоя дифференцируют в эпидермис, при этом они последовательно образуют stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum и stratum corneum, причем эти слои разделяются на слой живых клеток в нижнем положении по отношению к stratum granulosum и слой мертвых клеток в верхнем положении. Уплощенные чешуйчато-подобные ткани вне базального слоя называют также «чешуйками» (squames), они плотно заполнены кератином. Расположенные между внешней стороной stratum granulosum и stratum corneum клетки усилены слоем сшитого белка, и их плазматическая мембрана тонкая и плотная. Поскольку клетки эпидермиса пролиферируют из стволовых клеток эпидермиса и дифференцируются в stratum corneum, они усилены изнутри сшитыми кератинами и связаны также кератинами с десмосомами, плотно сцепленными с другими клетками того же слоя, так что они поддерживают всю структуру слоя. Клетки эпидермиса дифференцируют во внешний эпидермис, продуцируют и секретируют липид, формируя на плазматической мембране двухслойную ткань, ороговевшую вследствие наличия белка, что защищает, подобно оболочке («покрывало Сары») поверхность кожи от внешнего окружения. Поскольку человеческий эпидермис обновляется с двухнедельным интервалом, способность формирующих эпидермис стволовых клеток кожи можно считать очень высокой.

Недавно было установлено, что мультипотентные стволовые клетки кожи располагаются в области расширения, которая лежит непосредственно ниже сальных желез волосяных фолликул. Эти стволовые клетки расширения служат основой для образования стволовых клеток эпидермиса, стволовых клеток матрикса волос и стволовых клеток сальных желез. Стволовые клетки расширения располагаются только в области расширения и экспрессируют специальную комбинацию белков, сохраняя свою специфичность стволовых клеток. Стволовые клетки эпидермиса в ходе пролиферации и дифференцировки поддерживают эпидермис. Когда волос выпадает, стволовые клетки матрикса волос пролиферируют и дифференцируют, создавая новый волос. Однако стволовые клетки эпидермиса, стволовые клетки матрикса волос или стволовые клетки сальных желез ограничены в их способности к пролиферации или в способности сохранять специфику стволовых клеток. Поэтому, например, большинство стволовых клеток эпидермиса дифференцируют после 3-6 актов пролиферации. С другой стороны, хотя стволовые клетки расширения пролиферируют медленнее других трех типов стволовых клеток, эти стволовые клетки могут, по-видимому, пролиферировать бесконечно в течение жизни человеческих существ, создавая стволовые клетки эпидермиса, стволовые клетки матрикса волос и стволовые клетки сальных желез, сохраняя в то же время свою специфику стволовых клеток. В ходе разработки настоящего изобретения был впервые установлен тот факт, что экспрессия и действие гормона роста человека происходят в месте локализации стволовых клеток расширения, и этот новый факт чрезвычайно важен, так как означает, что гормон роста человека проявляет действие по улучшению различных состояний кожи.

Детальное описание настоящего изобретения

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования, разрабатывая вещество, способное улучшать состояния кожи, и в результате установили, что поверхностное нанесение гормона роста человека на кожу может существенно улучшить состояния кожи, что формирует в полном объеме настоящее изобретение.

В соответствии с этим цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить композицию для поверхностного нанесения на кожу, улучшающую состояния кожи.

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ улучшения состояния кожи.

Другие цели и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего далее детального описания в сочетании с приложенной формулой изобретения.

В одном из аспектов настоящего изобретения предлагается композиция для улучшения состояний кожи, содержащая в качестве активного ингредиента гормон роста человека, рецептура которой предназначена для поверхностного нанесения на кожу.

В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ улучшения состояний кожи человека, включающий поверхностное нанесение на кожу человека композиции, содержащей в качестве активного ингредиента гормон роста человека.

Авторы настоящего изобретения провели исследования и предприняли усилия для обнаружения нового применения гормона роста человека. В результате они установили, что поверхностное нанесение на кожу гормона роста человека может существенно улучшить состояния кожи. Применяемая в настоящее время терапия с применением гормона роста человека использует способ инъекции и направлена в основном на лечение карликовости и дефицита гормона роста человека. В данной области к настоящему времени не было отмечено, что поверхностное нанесение гормона роста человека на нормальную кожу позволяет ожидать его действия. Это мнение было основано на высоком молекулярном весе гормона роста человека и на предубежденном мнении о пути действия гормона роста человека. Настоящее изобретение в значительной степени преодолевает это общепринятое мнение или знание в данной области и характеризуется тем, что впервые было обнаружено действие поверхностного нанесения на нормальную кожу гормона роста человека. Настоящее изобретение является первым изобретением, рассматривающим нанесение гормона роста человека на кожу двумя путями: через волосяные фолликулы и через эпидермис.

Настоящее изобретение впервые показывает, что при способе нанесения гормона роста человека на поверхность нормальной кожи, противоположную участку, находящемуся в контакте с кровью, но не при способе перенесения действия гормона роста человека кровью, гормон роста человека может оказывать косметическое и лечебное действие на кожу - такое, как избавление от угрей, морщин, излечение аллергической кожи, вызванных УФ-облучением повреждений кожи, удаление темных пятен, веснушек, излечение сухой и жирной кожи, уменьшение волосяных фолликул и стимуляция роста волос.

Гормон роста человека (ГРЧ), используемый в настоящем изобретении в качестве активного ингредиента, может быть любым полипептидом, проявляющим активность гормона роста человека. Например, может быть использован любой представитель, выбранный из группы, состоящей из зрелого ГРЧ, Мет-ГРЧ, вариантов ГРЧ, модифицированного ГРЧ, фрагментов ГРЧ и аналогов ГРЧ. Предпочтительны зрелый ГРЧ или Мет-ГРЧ. Зрелый ГРЧ представляет собой гормон роста человека, имеющий аминокислотную последовательность основного гормона роста человека, присутствующего в крови человека; Мет-ГРЧ относится к гормону роста человека, имеющему добавленный к N-концу зрелого ГРЧ метионин; варианты ГРЧ относятся к гормонам роста человека, имеющим аминокислотную последовательность гормонов роста человека, отличающихся от основного гормона роста человека, присутствующего в теле человека; модифицированный ГРЧ относится к гормону роста человека, модифицированному введением добавки - такой, как пептидогликан или гликан, по меньшей мере в один аминокислотный остаток гормона роста человека; фрагменты ГРЧ обозначают гормоны роста человека, полученные делецией части аминокислотных последовательностей методом генетической инженерии или биохимическим методом; а аналог ГРЧ относится к гормону роста человека, полученному преобразованием методом генетической инженерии аминокислотной последовательности гормона роста человека в другую аминокислотную последовательность, имеющую аналогичные свойства. Фраза «имеющий активность гормона роста человека», как она использована здесь, может быть точно определена в соответствии с одним из следующих двух методов. В одном из методов она может быть определена в соответствии с тем, вызывает ли гормон роста человека передачу сигнала при связывании с белком, связывающимся с гормоном роста человека, или с рецептором для гормона роста человека. В другом методе она может быть определена в соответствии с тем, проявляются ли биологические эффекты, вызванные действием гормона роста человека.

В настоящем изобретении гормон роста человека может быть нанесен на кожу в виде водного раствора или вместе с носителем. Одна из неожиданных характеристик настоящего изобретения состоит в том, что, как показано в примере XII и на фиг.10б, даже в том случае, когда непосредственно на кожу наносится водный раствор самого гормона роста человека, до некоторой степени может быть достигнут эффект улучшения состояний кожи. Даже если водный раствор самого гормона роста человека наносится поверхностно на кожу, гормон роста человека достигает расположения стволовых клеток расширения в волосяных фолликулах и может обеспечить эффект улучшения состояний кожи.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению представляет собой фосфолипидную или липосомную композицию, предпочтительно липосомную композицию. Предпочтительно, чтобы гормон роста человека, как активный ингредиент, был инкапсулирован в липосомы и нанесен на кожу. Согласно более предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения настоящая композиция представляет собой нанолипосомную композицию. Термин «нанолипосомы», как он использован здесь, относится к липосомам, имеющим форму обычных липосом и средний диаметр частиц от 20 до 1000 нм. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения средний диаметр частиц нанолипосом составляет 50-500 нм, более предпочтительно 50-350 нм и наиболее предпочтительно 50-250 нм.

Липосому определяют как сферическую фосфолипидную везикулу из коллоидных частиц, ассоциированных друг с другом, причем липосомы, составленные из бифильных молекул, каждая из которых имеет водорастворимую головку (гидрофильную группу) и водонерастворимый хвост (гидрофобную группу), имеют структуру, выстроенную путем их спонтанного соединения за счет взаимодействий между ними. Их классифицируют, в соответствии с их размером и слоистостью, как малые однослойные везикулы (small unilamellar vesicle, SUV), крупные однослойные везикулы (large unilamellar vesicle, LUV) и многослойные везикулы (multi lamellar vesicle, MLV). Липосомы с различной степенью слоистости, как они описаны выше, имеют двухслойную структуру мембраны, подобную структуре клеточной мембраны.

(Нано)липосомы согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены с использованием фосфолипида, полиола, поверхностно-активного вещества, жирной кислоты, соли и/или воды.

Фосфолипид, используемый как компонент в приготовлении данных (нано)липосом, применяется в виде бифильного липида, и его примеры включают природные фосфолипиды (например, лецитин яичного желтка, лецитин соевых бобов и сфингомиелин) и синтетические фосфолипиды (например, дипальмитоилфосфатидилхолин или гидрированный лецитин), причем предпочтителен лецитин. Более предпочтительно, чтобы лецитин был ненасыщенным или насыщенным лецитином природного происхождения, выделенным из соевых бобов или яичного желтка.

Полиолы, которые можно использовать для приготовления данных (нано)липосом, никак специально не ограничены и предпочтительно включают пропиленгликоль, дипропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, глицерин, метилпропан-диол, изопренгликоль, пентиленгликоль, эритритол, ксилитол и сорбитол.

Поверхностно-активное вещество, которое можно использовать для приготовления данных (нано)липосом, может быть любым известным в данной области поверхностно-активным веществом, и его примеры включают анионные поверхностно-активные вещества (например, алкилацил-глутамат, алкилфосфат, алкиллактат, диалкилфосфат и триалкилфосфат), катионные поверхностно-активные вещества, амфотерные поверхностно-активные вещества и неионные поверхностно-активные вещества (например, алкоксилированный алкильный простой эфир, алкоксилированный алкильный сложный эфир, алкилполигликозид, полиглицерильный сложный эфир и сахарный сложный эфир).

Жирные кислоты, которые можно использовать для приготовления данных (нано)липосом, представляют собой высшие жирные кислоты, предпочтительно насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, имеющие С_12-22 алкильную цепь. Их примеры включают лауриловую кислоту, миристоиловую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту и линолевую кислоту.

Соль, используемая для приготовления данных (нано)липосом, может быть любой известной в данной области солью, ее примеры включают фосфатную соль, сульфатную соль, нитратную соль, хлоридную соль, соль гидроксида, натриевую соль, калиевую соль, кальциевую соль, аммонийную соль, соль аминокислоты и аминокислоту.

Используемая для приготовления данных (нано)липосом вода - это обычно деионизованная дистиллированная вода.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения данные (нано)липосомы приготовлены только из фосфолипида, соли и воды, как детально описано далее в примерах.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения данные нанолипосомы, содержащие гормон роста человека (ГРЧ), готовят путем процесса, включающего следующие этапы: (а) растворение фосфолипида, способного образовать липосомы (предпочтительно лецитин яичного желтка или лецитин соевых бобов), в буферном водном растворе соли, содержащем гормон роста человека; и (б) пропускание содержащего гормон роста человека и фосфолипид водного раствора через гомогенизатор высокого давления при постепенном повышении с увеличением числа пропусканий содержания фосфолипида и давления в гомогенизаторе высокого давления; таким путем получают нанолипосомы, содержащие гормон роста человека.

Водный раствор, содержащий гормон роста человека, предпочтительно представляет собой буферный раствор, имеющий рН в диапазоне от 6 до 8, более предпочтительно около 7. Это, например, буферный раствор фосфата натрия. Если используют буферный раствор фосфата натрия, его концентрация предпочтительно составляет 5-100 мМ, более предпочтительно - 5-60 мМ, еще предпочтительнее - 10-30 мМ и наиболее предпочтительно - около 20 мМ.

Наиболее выдающейся особенностью данного процесса является то, что смесь фосфолипида и содержащего ГРЧ водного раствора пропускают через гомогенизатор высокого давления несколько раз, причем по мере увеличения числа пассажей количество фосфолипида и давление в гомогенизаторе повышают ступенчато. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения давление в гомогенизаторе повышают ступенчатым образом от 0 до 1000 бар, предпочтительно от 0 до 800 бар. Давление может повышаться ступеньками по 50 бар или по 100 бар, предпочтительно по 100 бар. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения количество фосфолипида ступенчато повышают от 5 до 40% (вес к объему), более предпочтительно - от 5 до 30% (вес к объему).

В ходе процесса пропускания через гомогенизатор высокого давления, включающего эти ступенчатые повышения содержания фосфолипида и давления, получают содержащие ГРЧ нанолипосомы, предпочтительно жидкие содержащие ГРЧ нанолипосомы.

Композиция согласно настоящему изобретению полезна для улучшения различных состояний кожи. Предпочтительно данная композиция эффективна для улучшения состояний кожи, в том числе для избавления от угрей, морщин, темных пятен, повышения эластичности кожи, усиления роста волос, предотвращения старения кожи, усиления способности кожи к удержанию влаги или стимуляции пролиферации стволовых клеток кожи. Более предпочтительно улучшаемые настоящим изобретением состояния кожи включают угри, морщины или рост волос.

Данная композиция может быть предоставлена как косметическая или фармакологическая композиция.

Косметическая композиция согласно настоящему изобретению для улучшения состояний кожи может быть составлена в более широком разнообразии форм, включая, например, раствор, суспензию, эмульсию, пасту, мазь, гель, крем, лосьон, порошок, мыло, содержащий поверхностно-активное вещество очиститель, масло, порошковая основа, эмульсионная основа, восковая основа и распыляемый раствор.

Содержащийся в данной косметической композиции косметически приемлемый носитель может меняться в зависимости от типа рецептуры. Например, рецептура мази, паст, кремов или гелей может содержать животные или растительные жиры, воски, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, двуокись кремния, тальк, окись цинка или смеси этих веществ. Рецептура порошка или распыляемого раствора может включать лактозу, тальк, двуокись кремния, гидроокись алюминия, силикат кальция, порошок полиамида и смеси этих веществ. Распыляемый раствор может дополнительно содержать обычные распылители, например хлорфтор-углеводороды, пропан/бутан или диметиловый эфир.

Рецептура раствора и эмульсии может включать растворитель, солюбилизатор и эмульгатор, например воду, этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензил-бензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутилгликоль, масла, в частности масло семян хлопка, масло земляного ореха, масло проростков маиса, оливковое масло, касторовое масло и масло семян кунжута, глицериновые эфиры жирных кислот, полиэтиленгликоль, сорбитановые эфиры жирных кислот или смеси этих веществ. Рецептура суспензии может включать жидкие разбавители, например воду, этанол или пропиленгликоль, суспендирующие агенты, например этоксилированные изостеариновые спирты, полиоксиэтиленовые эфиры сорбитола и полиоксиэтиленовые эфиры сорбитана, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар, трагакант или смеси этих веществ.

Рецептура мыла может включать соли щелочных металлов и жирных кислот, соли полуэфиров жирных кислот, белковые гидролизаты жирных кислот, изотионаты, ланолин, жирный спирт, растительное масло, глицерин, сахара или смеси этих веществ.

Кроме того, косметические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать вспомогательные вещества, а также носитель. Неограничивающие примеры вспомогательных веществ включают консерванты, антиоксиданты, стабилизаторы, солюбилизаторы, витамины, красители, улучшающие запах агенты или смеси этих веществ.

Если данная композиция составлена так, чтобы предоставить фармацевтическую композицию, она может включать фармацевтически приемлемый носитель, в том числе углеводы (например, лактозу, амилозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, крахмал, целлюлозу), камедь акации, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, солевые растворы, спирты, гуммиарабик, сироп, растительные масла (например, кукурузное масло, масло семян хлопка, масло арахиса, оливковое масло, масло кокосовых орехов), полиэтиленгликоли, метилцеллюлозу, метилоксибензоат, пропилоксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, без ограничения этим перечислением. Фармацевтическая композиция согласно данному изобретению может дополнительно содержать увлажняющий агент, подслащивающий агент, эмульгатор, буфер, суспендирующий агент, консерванты, вкусовые добавки, ароматизаторы, смазку, стабилизатор или смеси этих веществ. Подробные сведения о подходящих фармацевтически приемлемых носителях и рецептурах приведены в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995), включенном сюда ссылкой.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена для поверхностного нанесения на кожу.

Точная дозировка фармакологических композиций согласно настоящему изобретению будет меняться в зависимости от конкретной рецептуры, способа нанесения, возраста, веса тела и пола пациента, диеты, времени введения, состояния пациента, комбинирования лекарств, чувствительности к воздействию и остроты заболевания. Понятно, что врач с обычным опытом легко определит и пропишет точную дозировку этих фармацевтических композиций. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения подходящая дозировочная единица подлежит введению один раз в день и составляет 0,001-100 нг/см² (на единицу площади поверхности кожи), наиболее предпочтительно 0,1-2 нг/см².

Согласно известной специалистам в данной области обычной технике фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены с включением фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя, как описано выше, и в итоге предоставляют различные формы, в том числе форму единичной дозировки. Наиболее предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция представляла собой раствор, содержащий нанолипосомы.

Данная композиция действует на стволовые клетки эпидермиса, что увеличивает число волосяных фолликул и тем самым стимулирует рост волос, вызывает пролиферацию кератиноцитов эпидермального слоя, значительно подавляя старение кожи, залечивает повреждения кожи и морщины, вызванные УФ-облучением, преобразует соединительную ткань дермального слоя, повышая упругость кожи и разглаживая морщины, и проявляет способность к лечению угрей и удалению темных пятен. Все это вместе показывает, что композиция согласно настоящему изобретению может значительно улучшать состояния кожи. Кроме того, настоящее изобретение в высокой степени безопасно для организма человека и при осуществлении в форме нанолипосом имеет высокую стабильность.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - электронно-микроскопическая фотография препарата крема из липосом, содержащих гормон роста человека (ГРЧ) (рецептура А), полученной в примере 1.

Фиг.2 - гель-проникающая хроматограмма содержащих ГРЧ липосом (липо-ГРЧ) в рецептуре Б, полученной в примере 1.

Фиг.3 - показывает результаты электрофореза в полиакриламидном геле с SDS ГРЧ, инкапсулированного в виде липо-ГРЧ в рецептуре Б, полученной в примере 1.

Фиг.4 - высокоэффективная обратно-фазная жидкостная хроматограмма ГРЧ, инкапсулированного в виде липо-ГРЧ в рецептуре Б, полученной в примере 1.

Фиг.5 - высокоэффективная обратно-фазная жидкостная хроматограмма фосфолипида в составе липо-ГРЧ в рецептуре Б, полученной в примере 1.

Фиг.6 - графическая диаграмма, показывающая результаты испытаний на безопасность липо-ГРЧ в рецептуре Б, полученной в примере 1.

Фиг.7 - графическая диаграмма, показывающая результаты испытаний на безопасность содержащих ГРЧ липосом в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.8 показывает результаты теста на снижающее количество морщин действие данных липосом с инкапсулированным ГРЧ у мышей «nude» с индуцированными УФ морщинами.

Фиг.9 показывает результаты анализа активности гормона роста человека, инкапсулированного в содержащие ГРЧ липосомы согласно настоящему изобретению.

Фиг.10а - фотография, показывающая локализацию гормона роста человека в результате введения данных нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ в кожу крыс Sprague Dawley через волосяные фолликулы.

Фиг.10б - фотография, показывающая действие данных нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ на дермальный слой и волосяные фолликулы кожи крыс Sprague Dawley.

Фиг.11а - фотография, показывающая действие данных нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ на эпидермис и дермальный слой кожи мышей ICR.

Фиг.11б - фотография, показывающая, что данные нанолипосомы с инкапсулированным ГРЧ индуцируют преобразование соединительной ткани дермального слоя мышей ICR.

Фиг.12 - фотография, показывающая действие данных нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ на искусственную кожу человека.

Фиг.13 показывает результаты анализа распределения частиц по размерам у нанолипосом с инкапсулированным ГРЧ согласно настоящему изобретению.

Фиг.14 - графическая диаграмма, показывающая эффект снижения количества морщин, оказываемый данными нанолипосомами с инкапсулированным ГРЧ.

Следующие далее конкретные примеры предназначены для иллюстрации изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие область охвата изобретения, определенную прилагаемой формулой изобретения.

Примеры

Пример I. Приготовление различных рецептур, содержащих гормон роста человека (липо-ГРЧ)

Рецептура А (препарат крема): содержащая гормон роста человека рецептура крема

В рецептуре А использовали следующие фосфолипиды: lipoid S100 (Lipoid GmbH, Germany) или lipoid S75 (Lipoid GmbH, Germany).

Теплообменник гомогенизатора высокого давления (максимальный выход 5 л/ч, наивысшее давление 1200 бар, модель HS-1002; производство фирмы Hwasung Machinery Co., Ltd., South Korea) помещали в ледяную воду так, что температура выхода гомогенизатора не превышала 30°С, затем внутренность гомогенизатора промывали для готовности дистиллированной водой. После этого к 100 мл раствора гормона роста человека (LG Life Sciences, Ltd), растворенного в буферном растворе (20 мМ NaH₂PO ₄, рН 6,5-7,5, 1 мМ EDTA) при концентрации 1 мг/мл, добавляли фосфолипид в количестве 5% (вес к объему) и в достаточной степени увлажняли и перемешивали. Перемешанный раствор пропускали три раза или больше через гомогенизатор при комнатной температуре и низком давлении (0 бар). К пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 6% (вес к объему) и достаточно увлажняли и перемешивали. Перемешанный раствор пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 100 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 100 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 7% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 200 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 200 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 8% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 300 бар. К пропущенному через гомогенизатор при давлении 300 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 9% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 400 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 400 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 10% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 500 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 500 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 11% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 600 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор при давлении 600 бар раствору добавляли фосфолипид в количестве 12% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 800 бар. Таким путем получали рецептуру крема с липосомами, содержащими гормон роста человека (липо-ГРЧ).

На фиг.1 представлена электронно-микроскопическая фотография приготовленной в этом примере рецептуры крема с липосомами, содержащими гормон роста человека. Приготовленную в этом примере рецептуру с липосомами покрывали золотом и обследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (HITACHI S 2500). В результате наблюдения сочтено установленным, что сходящий на нет край и прилегающий фон представляют собой гель, а небольшие сферические зерна являются липосомами наноразмера (0,02-0,3 мкм).

Рецептура Б (препарат липосом): содержащая гормон роста человека (ГРЧ) липосомная рецептура

В приготовлении рецептуры Б использовали следующие фосфолипиды: лецитин соевых бобов (ShinDongBang Corp., South Korea), Metarin P (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG), Nutripur S (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG) или Emultop (Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG).

Теплообменник гомогенизатора высокого давления (максимальный выход 5 л/ч, наивысшее давление 1200 бар, модель HS-1002; производство фирмы Hwasung Machinery Co., Ltd., South Korea) помещали в ледяную воду так, что температура выхода гомогенизатора не превышала 30°С, внутренность гомогенизатора промывали для готовности дистиллированной водой. После этого к 100 мл раствора гормона роста человека (LG Life Sciences, Ltd) в буферном растворе (20 мМ NaH₂PO₄, рН 6,5-7,5, 1 мМ EDTA) с концентрацией 1 мг/мл добавляли фосфолипид в количестве 10% (вес к объему) и в достаточной степени увлажняли и перемешивали. Перемешанный раствор пропускали три раза или больше через гомогенизатор при комнатной температуре и низком давлении (0 бар). Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 14% (вес к объему), достаточно увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 100 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 18% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 200 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 20% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 300 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 22% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 400 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 24% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 500 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 26% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 600 бар. Затем к пропущенному через гомогенизатор раствору добавляли фосфолипид в количестве 28% (вес к объему), в достаточной степени увлажняли и перемешивали, и пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 700 бар. Затем пропущенный через гомогенизатор при давлении 700 бар раствор пропускали три раза или больше через гомогенизатор при давлении 800 бар и удаляли из гомогенизатора. Удаленный раствор подвергали высокоскоростному центрифугированию при 15000 g в течении 30 мин и отделяли надосадочную жидкость. Теперь гормон роста человека, который остался неинкапсулированным в липосомы, удаляли с помощью гель-проникающей хроматографии (GE Healthcare, USA), получая таким образом липосомы в жидкой фазе (см. фиг.2).

Рецептура Б, полученная с использованием раствора в дистиллированной воде и буферного раствора (20 мМ NaH₂PO₄, 1 мМ EDTA, рН 6,0-7,5), не отличалась по физическим свойствам и стабильности липосом. Однако в результате хранения полученной рецептуры при концентрации лецитина более 10% (вес к объему) в течение длительного времени при 15-30°С происходило разделение фаз на слой липида (нижний слой) и водный раствор (верхний слой). Но при концентрации лецитина менее 10% (вес к объему) рецептура имела прекрасную стабильность без разделения фаз.

Пример II. Разделение методом FPLC и анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с SDS

Для анализа содержащих гормон роста человека липосом рецептуры Б, полученной в примере I, установку FPLC (Acta explorer, Amersham Bioscience) снабжали колонкой superdex 200 HR/30, при комнатной температуре колонку уравновешивали двукратным по отношению к объему колонки объемом буферного раствора (20 мМ NaH₂ PO₄, 1 мМ EDTA, 150 мМ NaCl). Затем фракционировали содержащие гормон роста человека липосомы, фракции собирали и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с SDS. Как показано на фиг.3, зону гормона роста человека можно было наблюдать в положении, соответствующем приблизительно 22 кДа.

Пример III. Количественное определение гормона роста человека в липосомах

Установку ВЭЖХ (HPLC, Shimadzu) снабжали колонкой С₁₈ Delta pack (Waters, USA)

и проводили обратно-фазную ВЭЖХ в градиенте концентрации (раствор В 60-10%: 0-25 мин, раствор В 60%: 25,01-30 мин) при скорости протока 1 мл/мин, используя в качестве раствора А 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) в ацетонитриле, а в качестве раствора В 0,1% ТФУ в H₂O. Стандартный образец (international standard human growth hormone NIBSC code 98/574) количественно определяли с флуоресцентным детектором (возбуждение при 295 нм, диапазон длин волн 270-300 нм, эмиссия при 350 нм, диапазон длин волн 300-400 нм) при температуре термостата 55°С и времени протока 30 мин. Затем обрабатывали образец, разрушая раствор содержащих гормон роста человека липосом в ультразвуковом дезинтеграторе и добавляя к нему такой же объем буферного раствора (50 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ EDTA, 8 М мочевина, 2% твин-20), после чего отбирали смесь пипеткой и анализировали методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектором (см. фиг.4).

Результаты количественного определения показывают, что полученные в примере I липо-ГРЧ рецептуры Б содержат приблизительно 3,69 мкг/мл гормона роста человека.

Пример IV. Анализ содержания фосфолипида

Установку ВЭЖХ (HPLC, Shimadzu) снабжали колонкой Spherisorb S5 NH₂ (Waters), ВЭЖХ проводили с изократическим градиентом при скорости протока 1 мл/мин, используя смешанный раствор 60% ацетонитрила, 30% метанола и 5% Н₂O. Фосфолипид полностью растворяли в смеси метанол:хлороформ (90%:10%) и определяли количественно с использованием УФ-детектора (длина волны 215 нм) при температуре термостата 35°С и времени протока 20 мин. Таким же самым образом раствор липосом, содержащих гормон роста человека, полностью растворяли в смеси метанол:хлороформ (90%:10%) и определяли количественно методом ВЭЖХ (см. фиг.5).

Результаты количественного определения показывают, что полученные в примере I липо-ГРЧ рецептуры Б содержат приблизительно 3,26 мг/мл фосфолипида.

Пример V. Испытание стабильности

Стабильность содержащих гормон роста человека липосом рецептуры Б, полученной в примере I, анализировали следующим образом. Данные липо-ГРЧ, содержащие 0,1% метил-парабен, помещали в сосуды коричневого стекла, выдерживали сосуды при температурах 4°С и 15-30°С и с интервалами в 1 неделю определяли количественно содержание ГРЧ методом ВЭЖХ. Как можно видеть на фиг.6, данные липо-ГРЧ после хранения в течение 10 месяцев сохраняли 87,5% от исходного содержания ГРЧ при 4°С и 75% при комнатной температуре. Это позволяет заключить, что данные липо-ГРЧ имеют прекрасную стабильность.

Пример VI. Испытание безопасности

Чтобы оценить безопасность данных содержащих гормон роста человека липосом (рецептура Б, полученная в примере I), исследовали цитотоксичность для линии клеток НаСаТ кератиноцитов человека (DKFZ, Germany) и клеток фибробластов HEF эмбриона человека (любезно предоставлены профессором Lee Jaeyong, Department of Biochemistry, School of Medicine, Hallym University).

Клетки НаСаТ и HEF суспендировали в 10% FBS/DMEM (среда FD) при концентрациях соответственно 1×10 ⁵ клеток/мл и 5×10⁴ клеток/мл. По 1 мл каждой суспензии вносили в планшет с 24 ячейками и инкубировали в термостате с 5% CO₂ при 37°С в течение суток. После этого аккуратно удаляли покрывающую слой клеток среду, в ячейки планшета вносили необходимое количество среды 10% FD с различными концентрациями проб и инкубировали в течение суток в термостате с 5% CO₂ при 37°С. Использовали следующие пробы: буферный раствор (содержал 20 мМ фосфат Na, рН 7,0, 1 мМ EDTA и 0,1% метил-парабен) липосомы, гормон роста человека и липо-ГРЧ рецептуры Б, полученной в примере I. После проведения реакции измеряли выживаемость клеток с помощью красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ: Sigma, USA) (Shearman и др. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Т. 91, № 4. С.1470-1474; Shearman и др. // J. Neurochem. 1995. Т. 65, № 1. С.218-227 и Kaneko и др. // J. Neurochem. 1995. Т. 65, № 6. С.2585-2593). Поглощение продуктов реакции с МТТ при 570 нм измеряли с помощью сканера ELISA (Molecular Devices, USA). Выживаемость клеток для каждой из проб выражали величиной отношения измеренного поглощения к принятому за 100% поглощению в ячейке, не содержавшей проб (фиг.7).

Как видно из фиг.7, данные нанолипосомы, содержащие ГРЧ, не влияли на выживаемость клеток НаСаТ и HEF, что указывает на высокую степень безопасности рецептуры для организма.

Пример VII. Анализ пролиферации клеток Nb₂ при действии нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ

В ячейки планшета с 96 ячейками, содержащие 50 мкл линии клеток Nb₂ лимфомы крыс линии «noble» (NIBSC ЕСАСС #97041101) при концентрации 1×10⁵ клеток/мл, добавляли S-ГРЧ (стандартный гормон роста человека, NIBSC code 98/574), образец, содержащий 1000-кратное разбавление предобработанного раствора (полученного разрушением ультразвуком раствора липосом, не содержащих гормона роста человека, добавлением к нему равного объему образца объема раствора (содержащего 50 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ EDTA, 8 М мочевину, 2% твин-20) и затем пипетированием раствора), или образец, содержащий 1000-кратное разбавление липо-ГРЧ (N-ГРЧ; полученная в примере I рецептура Б), подвергнутых процессу предобработки образца (включающего разрушение ультразвуком раствора липосом, содержащих гормон роста человека, добавлением к нему равного объему образца объема раствора (содержащего 50 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ EDTA, 8 М мочевину, 2% твин-20) и пипетированием раствора). Все образцы инкубировали в термостате с 5% CO₂ при 37°С в течение 5 дней, количество пролиферирующих клеток измеряли с помощью МТТ. Среднее поглощение в группе проб, содержащих ГРЧ, рассчитывали как отношение поглощения к принятому за 100% поглощению в контрольной группе проб, не содержащих ГРЧ.

Как показано на фиг.9, инкапсулированный гормон роста человека в препарате липо-ГРЧ сохраняет свою исходную активность.

Пример VIII. Анализ распределения частиц по размерам

Распределение частиц по размерам для липо-ГРЧ в рецептуре Б после гель-проникающей хроматографии в приведенном выше примере анализировали с помощью анализатора размера частиц (Mastersizer 2000/Malvern Instruments Ltd.) при показателе преломления 1,52 (см. фиг.13). Как показывает распределение на фиг.13, у данных липо-ГРЧ максимальный размер частиц составлял 0,193 мкм, это показывает, что липо-ГРЧ рецептуры Б имеют нанометровый размер.

Пример IX. Анализ эффекта уменьшения числа морщин

Мышей «nude» в возрасте 4 недель (полученных от Korea Research Institute of Chemical Technology) испытывали с применением липо-ГРЧ (N-ГРЧ). В камере для животных поддерживали температуру 22±2°С, влажность 55-60% и световой цикл: 12 ч света и 12 ч темноты. Животных подвергали акклиматизации в течение приблизительно 2 недель и обеспечивали им свободный доступ к твердой пище (Central Lab. Animal Inc., Seoul, Korea) и воде, стерилизованной облучением. Чтобы индуцировать образование морщин на спине этих мышей, «nude» мышей облучали трижды в неделю в течение 8 недель УФ-В с дозой 20 мДж. Затем на облученные УФ-В спины наносили в течение 8 недель с помощью косметической щеточки растворы каждого из образцов и контрольный раствор. После этого эффект снижения числа морщин оценивали по методу Donald (Hyun-Seok Kim и др. // Mech. Ageing Dev., 2005. Т. 8, № 16, в печати).

Результаты испытаний представлены на фиг.8 и 14. На фиг.8 контрольную группу (n=3) не обрабатывали ничем, контрольную группу UVB (n=3) обрабатывали облучением 20 мДж УФ-, чтобы только индуцировать морщины, группу «липосомы» (n=3) обрабатывали 20 мДж УФ-В для индукции морщин и липосомами, а группу «липо-ГРЧ» (n=3) обрабатывали 20 мДж УФ-В для индукции морщин и данными липо-ГРЧ. Как показано на фиг.8 и 14, данные липо-ГРЧ эффективно удаляют индуцированные УФ морщины, этот эффект отчетливо проявляется, начиная с 2 недель после поверхностного нанесения данных липо-ГРЧ.

Пример X. Анализ эффекта лечения угрей

Анализ лечебного действия данных, содержащих гормон роста человека липосом на угри, проводили следующим образом.

Шестьдесят женщин в возрасте 15-40 лет разделяли случайным образом на 3 группы. Каждая из групп применяла рецептуру Б с содержащими ГРЧ липосомами из примера I (рецептура 1), сравниваемый раствор, содержащий только липосомы (рецептура 2), и сравниваемый раствор буфера (рецептура 3). Растворы применялись сразу после умывания лица дважды в день (утром и вечером) в течение 3 недель. Кроме этого не было специальных ограничений в использовании обычной косметики. Затем степень излечения угрей оценивалась на основании мнений пользователей по следующим критериям. Полученные результаты представлены ниже в таблице 1. Критерии оценки были следующими: +++ (очень хорошее улучшение состояния); ++ (заметное улучшение); + (слабое улучшение); ± (нет улучшения, но отсутствует ухудшение); и - (ухудшение).

Таблица 1
Период	Рецептура 1	Рецептура 2	Рецептура 3
1-я неделя	+	±	±
2-я неделя	++	+	±
3-я неделя	+++	+	±

Как видно из таблицы 1, данная рецептура оказывает очень хорошее действие по излечению угрей, которое начинает явственно быть видным через 2 недели после нанесения рецептуры. Кроме того, данная композиция не вызывает заметного раздражения кожи, например покраснения или чесотки.

Пример XI. Анализ эффекта удаления темных пятен

Эффект удаления темных пятен данными липосомами, содержащими гормон роста человека, тестировали следующим способом.

Шестьдесят женщин в возрасте 40-60 лет разделяли случайным образом на 3 группы. Каждая из групп применяла рецептуру Б с содержащими ГРЧ липосомами из примера I (рецептура 1), сравниваемый раствор, содержащий только липосомы (рецептура 2), и сравниваемый раствор буфера (рецептура 3). Растворы применялись сразу после умывания лица дважды в день (утром и вечером) в течение 8 недель. Кроме этого не было специальных ограничений в использовании обычной косметики. Степень удаления темных пятен оценивалась на основании мнений пользователей по следующим критериям. Полученные результаты представлены ниже в таблице 2. Критерии оценки были следующими: +++ (очень хорошее улучшение состояния); ++ (заметное улучшение); + (слабое улучшение); ± (нет улучшения, но отсутствует ухудшение); и - (ухудшение).

Как можно видеть в таблице 2, данная рецептура оказывает достоверное очень хорошее действие по удалению темных пятен, которое начинает быть отчетливо видным приблизительно через 3-5 недель после нанесения рецептуры. Кроме того, данная композиция не вызывает заметного раздражения кожи, например покраснения или чесотки.

Таблица 2
Период	Рецептура 1	Рецептура 2	Рецептура 3
1-я неделя	±	±	±
2-я неделя	±	±	±
3-я неделя	+	±	±
4-я неделя	+	±	±
5-я неделя	++	+	±
6-я неделя	++	+	±
7-я неделя	++	+	±
8-я неделя	++	+	±

Пример XII. Анализ локализации нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ и ее действия на кожу

Брюшную область крысы Sprague Dawley делили на 6 зон (окружностями с радиусом каждой 1 см) и обрабатывали следующими пробами: буферный раствор с 0,1% метил-парабеном, 0,1% липосомы, 0,001 ед. ГРЧ, 0,0001 ед. ГРЧ, 0,001 ед. липо-ГРЧ и 0,0001 ед. липо-ГРЧ.

Животное обрабатывали дважды по 50 мкл каждой из проб с интервалом 24 ч, всего 7 раз. Через 24 ч после последней обработки ткань у животного удаляли. Удаленную ткань разрезали на слои толщиной 40 мкм и обрабатывали в качестве первичных антител поликлональными кроличьими антителами к гормону роста человека (DAKO, USA), а затем конъюгированными с биотином вторичными антителами к кроличьим антителам (VECTASTAIN ABC kit (RABBIT IgG), VECTOR, USA) при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем нарезанную на слои ткань обрабатывали реагентом VECTASTAIN ABC reagent (VECTOR, USA) при комнатной температуре в течение 30 мин и подвергали реакции окрашивания с субстратом DAB (диаминобензидин, Diaminobenzidine, Sigma, USA). Слои ткани обезвоживали поочередно 78% этанолом, 85% этанолом и 95% этанолом, затем обрабатывали ксилолом в течение 5 мин. Ткань фиксировали на предметных стеклах и определяли локализацию содержащегося в липо-ГРЧ гормона роста человека.

Как показано на фиг.10а, инкапсулированный в данных липо-ГРЧ гормон роста человека или гормон роста крысы, исходно имеющийся у крысы, обнаруживаются в областях, которые считаются стволовыми клетками расширения в волосяных фолликулах.

Кроме того, как показано на фиг.10б, дермальный слой кожи крысы, на которую нанесены данные липо-ГРЧ (содержащие 0,0001 ед. ГРЧ) расширился, а число волосяных фолликул в дермальном слое увеличилось. Более того, на фиг.12 можно видеть, что даже если на кожу был нанесен водный раствор ГРЧ, ГРЧ достиг расположения стволовых клеток расширения в волосяных фолликулах, и это крайне неожиданно, учитывая технический уровень и общее состояние в данной области. Это приводит к улучшению состояний кожи, даже если на кожу наносят не только ГРЧ, инкапсулированный в липосомы, но даже и водный раствор самого ГРЧ.

Пример XIII. Анализ действия нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ на кожу мышей

Действие данной нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ (полученной в примере I) на кожу мышей ICR анализировали путем окрашивания гематоксилином и эозином. Для этой цели после удаления волос со спины мышей ICR спинную область, разделенную на участки относительно позвоночника, обрабатывали контролем и препаратами данных липо-ГРЧ с интервалами 4 ч в течение 2 недель. Группы мышей обрабатывали следующим образом: группа 1 (n=3) - без обработки; группа 2 (n=3) - обработка липосомами (0,1 ед. данных липо-ГРЧ); группа 3 (n=3) - обработка липосомами (0,01 ед. данных липо-ГРЧ); группа 4 (n=3) - обработка липосомами (0,001 ед. данных липо-ГРЧ). После 2 недель обработки у мышей выделяли ткани. Выделенные ткани заливали парафином, нарезали на слои толщиной 4 мкм и слои помещали на предметные стекла. Затем из слоев удаляли парафин и обрабатывали их раствором гематоксилена при комнатной температуре в течение 10 мин и раствором эозина при комнатной температуре в течение 1 мин. Наконец слои обезвоживали последовательно 78% этанолом, 85% этанолом, 95% этанолом и 100% этанолом и после этого обрабатывали ксилолом в течение 5 мин. Ткани иммобилизовали, после чего окрашенные ткани анализировали под микроскопом.

Как показано на фиг.11а, пролиферация клеток в эпидермальном слое кожи, обработанной данной нанолипосомной рецептурой липо-ГРЧ, значительно усилилась, и произошло преобразование соединительных тканей в дермальном слое с повышением компактности соединительных тканей. Фиг.11б - фотография с увеличением 400×, ясно показывающая, что происходит преобразование соединительных тканей в дермальном слое.

Пример XIV. Анализ действия нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ на искусственную кожу

Для анализа действия данной нанолипосомной рецептуры липо-ГРЧ на искусственную кожу использовали Neoderm-ED (Tego Science, South Korea). Neoderm-ED - это модель кожи человека для тестов in vitro, которая состоит из эпидермального и дермального матрикса. Испытуемые группы были следующими: группа 1 - без обработки; группа 2 - обработка только буферным раствором; группы 3 и 4 - обработка липосомами; группы 5 и 6 - обработка соответственно 0,001 ед. и 0,01 ед. данными липо-ГРЧ. Заливку парафином и окрашивание гематоксилином и эозином выполняли так же, как и в предыдущем примере. После всех процедур окрашенные ткани наблюдали под микроскопом.

Как показано на фиг.12, активно происходила пролиферация клеток в слое кератиноцитов Neoderm-ED , обработанной данной нанолипосомной рецептурой липо-ГРЧ.

После описания конкретных примеров настоящего изобретения должно быть понятно, что такие примеры являются лишь предпочтительными вариантами осуществления изобретения и не должны считаться ограничивающими область охвата настоящего изобретения. Таким образом, действительная область охвата настоящего изобретения может быть определена прилагаемыми пунктами формулы и их эквивалентами.