применение смеси транс-галакто-олигосахаридов и инулина

Формула изобретения

1. Применение смеси транс-галакто-олигосахаридов со средней степенью полимеризации 2, 3, 4, 5 или 6 и инулина со средней степенью полимеризации 20 или более для производства композиции для лечения или предупреждения вздутия живота, газообразования, абдоминальной боли и/или метеоризма.

2. Применение смеси транс-галакто-олигосахаридов со средней степенью полимеризации 2, 3, 4, 5 или 6 и инулина со средней степенью полимеризации 20 или более для производства композиции для лечения или предупреждения аллергии, экземы или атопических заболеваний.

3.Применение смеси транс-галакто-олигосахаридов со средней степенью полимеризации 2, 3, 4, 5 или 6 и инулина со средней степенью полимеризации 20 или более для производства композиции для ослабления сокращений ободочной кишки, предпочтительно тонических и/или фазовых сокращений.

4. Применение смеси транс-галакто-олигосахаридов со средней степенью полимеризации 2, 3, 4, 5 или 6 и инулина со средней степенью полимеризации 20 или более для производства композиции для лечения или предупреждения синдрома раздраженной толстой кишки или воспалительного заболевания кишечника.

5. Применение смеси транс-галакто-олигосахаридов со средней степенью полимеризации 2, 3, 4, 5 или 6 и инулина со средней степенью полимеризации 20 или более для производства композиции для улучшения барьерной функции кишечника и/или продуцирования слизи толстой кишки.

6. Применение по любому из пп.1-5, при котором повышается кишечное и/или фекальное содержание жирных кислот с короткой цепью, повышается кишечное и/или фекальное содержание ацетата относительно общих жирных кислот с короткой цепью, повышается кишечное содержание лактата, кишечный и/или фекальный pH снижается, суммарное содержание кишечного и/или фекального бутирата, изобутирата, валерата и/или изовалерата относительно общих жирных кислот с короткой цепью снижается и/или уменьшается газообразование в кишечнике, без существенного действия на общее и/или относительное количество кишечных бифидобактерий.

7. Применение по любому из пп.1-5, при котором соотношение транс-галакто-олигосахариды : инулин составляет от 3:97 до 97:3, предпочтительно от 5:95 до 95:5 и еще предпочтительнее от 90:10 до 45:55.

8. Применение по любому из пп.1-5, при котором указанная композиция пригодна для снижения фекального и/или кишечного pH до уровня ниже 6, предпочтительно до pH 5,75 или ниже, при этом указанная композиция пригодна для перорального введения младенцу.

9. Применение по любому из пп.1-5, при котором указанная композиция пригодна для увеличения кишечного и/или фекального лактата до более чем около 10 ммоль/кг фекалий, при этом указанная композиция пригодна для перорального введения младенцу.

10. Применение по любому из пп.1-5, при котором указанная композиция пригодна для увеличения кишечного и/или фекального ацетата до более чем около 85% общих жирных кислот с короткой цепью (SСFА).

11. Применение по любому из пп.1-5, при котором указанная композиция пригодна для уменьшения суммы кишечного и/или фекального бутирата, изобутирата, валерата и изовалерата до менее чем 7% общих жирных кислот с короткой цепью (SCFA).

12. Применение по любому из пп.1-5, для усиления продуцирования жирных кислот с короткой цепью в начале, середине и конце ободочной кишки.

13. Применение по любому из пп.1-5, при котором эта композиция является пищевой композицией или композицией пищевой добавки, предпочтительно детским питанием, более предпочтительно смесью для младенцев до 12 месяцев или детей последующего возраста.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к области здорового питания. Изобретение обеспечивает новые синергетические смеси пребиотических углеводов, особенно смеси галактоолигосахаридов (GOS), например, трансгалактоолигосахаридов (TOS) и полифруктозы (например, инулина), а также содержащие их питательные композиции. Такие питательные композиции оказывают полезный эффект при искусственном вскармливании или частичном искусственном вскармливании младенцев, а также улучшают здоровье принимающих их взрослых, имеющих проблемы с кишечником, такие как воспалительное заболевание кишечника (IBD) или синдром раздраженной толстой кишки (IBS).

Микрофлора толстого кишечника человека (обычно подразделяемого на слепую, ободочную и прямую кишку) играет решающую роль как в питании, так и в здоровье человека. На бактериальный состав влияет потребление пищи, и бактериальный состав может модулироваться потреблением пищи. Углеводы, которые проходят через желудок и тонкую кишку, метаболизируются бактериями, и в качестве основного конечного продукта метаболизма образуются жирные кислоты с короткой цепью (SCFA), такие как ацетат, пропионат, бутират и валерат, которые затем высвобождаются в кровь. Другие конечные продукты бактериальной ферментации включают в себя, например, лактат и сукцинат. Общие количества и составы (относительные количества) этих конечных продуктов, в свою очередь, оказывают очень сильное действие на бактериальный рост, рН, устранение патогенных видов, и т.д. Одним из способов полезного влияния на микробную флору и здоровье человека является введение пребиотиков. «Пребиотики» определяются как «неусваиваемые» ингредиенты пищи, которые благоприятно действуют на хозяина посредством селективной стимуляции роста и/или активности одной бактерии или ограниченного числа бактерий в ободочной кишке и, следовательно, улучшают здоровье хозяев (Gibson and Roberfroid 1995, J. Nutr. 125, 1401-1412). Критериями, которым должно удовлетворять соединение, чтобы оно было классифицировано как пребиотик, являются: 1) оно не должно гидролизоваться или всасываться в верхней части желудочно-кишечного тракта (желудке, тонкой кишке), 2) оно должно быть селективно ферментируемым одной или несколькими потенциально полезными бактериями в ободочной кишке, 3) оно должно изменять микробиотические компоненты ободочной кишки в направлении более полезного для здоровья состава, и 4) оно должно предпочтительно индуцировать эффекты, которые являются полезными для здоровья субъекта. Обычно используемыми пребиотиками являются так называемые неусваиваемые углеводы (или «пищевые неперевариваемые волокна» (растворимая диетическая клетчатка)), которые проходят в непереваренном виде через верхнюю часть желудочно-кишечного тракта в толстую кишку. Они включают в себя, например, фруктоолигосахариды (FOS), олигофруктозу, инулин и транс-галактоолигосахариды (TOS). Следует отметить, что в литературе часто несогласованно используются такие термины, как фруктоолигосахарид, инулин, олигофруктоза и инулоолигосахариды, и один и тот же термин может использоваться для различных соединений или композиций.

Хорошо известными полезными бактериями, которые стимулируются приемом пребиотиков, являются молочно-кислые бактерии, такие как лактобациллы и бифидобактерии, и этому стимулирующему действию приписывались благоприятные эффекты, касающиеся здоровья. Например, были описаны благоприятные действия инулина и фруктанов типа инулина, таких как олигофруктоза, на функцию кишечника (Jenkins et al., 1999, J. Nutrition 129, 1431S-1433S), и предполагается, что это действие обусловлено бифидогенным эффектом, который называют селективным стимулирующим рост действием на общие бифидобактерии, измеряемым либо in vivo подсчетом бифидобактерий фекалий, либо in vitro (см. например, Roberfroid, Am J Clin Nutr 2001, 73(suppl), 406S-409S).

Молоко человека, по-видимому, также имеет бифидогенное действие, так как доминантными бактериями, которые были установлены у вскармливаемых грудью младенцев, являются бифидобактерии. В отличие от этого бактериальная колонизация вскармливаемых молочными смесями младенцев не обнаруживает доминирования бифидобактерий и является более разнообразной в отношении бактериальных видов (Harmson et al. 2000, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30, 61-67). Считается, что олигосахариды, обнаруживаемые в молоке человека, являются ответственными за бифидогенное или пребиотическое действие, и предпринимались попытки модификации детской смеси таким образом, чтобы она была как можно больше сходной с молоком человека. Это было выполнено добавлением пребиотиков к молочной смеси для младенцев (Boehm et al. Acta Paediatr. Suppl. 2003, 441, 64-67 и Moro et al. 2002, J Pediatr Gastroenterol Nutr 34, 291-295). Например, было описано, что обогащение смеси из коровьего молока смесью олигосахаридов, содержащей транс-галактоолигосахариды (TOS) и инулинНР, увеличивает количество бифидобактерий в фекалиях искусственно вскармливаемых младенцев (Boehm et al. 2002, Arch Dis Child 86, F178-F181).

Было также описано, что обогащение молочного питания для младенцев TOS и инулином оказывает бифидогенное действие и уменьшает рН фекалий (Boehm et al. 2003 supra; Moro et al. 2003, Acta Paediatr. Suppl. 441:77-79; Marini et al. 2003, Acta Paediatr. Suppl. 441:80-81; Boehm et al. 2002, Arch. Dis. Child Fetal. Neonata. Ed. 86:F178-F181; Moro et al. 2002, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 34:291-295; Schmelzle et al. 2003, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36:343-51).

После ферментации пребиотиков молочно-кислыми бактериями образуются органические кислоты, и снижается рН. Лактобациллы продуцируют либо лактат, либо лактат или ацетат (жирную кислоту с короткой цепью; SCFA). Лактат может быть в L- или D-форме. С другой стороны, бифидобактерии продуцируют L-лактат и ацетат, но не D-лактат. Бифидобактерии (и другие молочно-кислые бактерии) обычно не приводят к образованию газов, таких как Н₂ и СН₄ . Они также не продуцируют другие SCFA, такие как пропионат, бутират, изобутират, валерат и изовалерат. Присутствие SCFA, таких как изобутират и изовалерат, является показателем ферментации углеводов другими бактериальными видами, такими как Clostridia и Bacteroides или Enterobacteriaceae, или является показателем ферментации белков (в отношении которой бифидобактерии имеют лишь слабую способность). Другие кишечные бактерии также способны продуцировать ацетат или лактат, такие как Propionibacteria, Enterococci и Pediococci.

Ранее сообщалось, что потребление определенных пребиотических углеводов увеличивает (относительные) количества бифидобактерий и/или лактобацилл. Наблюдали одновременно образование SCFA и уменьшение рН. Но также сообщалось образование газов, которое приводит к нежелательным симптомам, таким как метеоризм и абдоминальная боль, при введении пребиотиков, таких как инулин или GOS, в диету. Кроме того, сообщались не только увеличения в ацетате, но и, например, в бутирате, что является нежелательным. Таким образом, был описан диапазон нежелательных действий, происходящих из потребления питания, обогащенного определенными пребиотиками.

В ободочной кишке и фекалиях вскармливаемых грудью младенцев преобладющей SCFA является ацетат. Кроме того, обнаружены высокие концентрации лактата. Эти (относительные) количества являются более высокими, чем количества, наблюдаемые у взрослых (где концентрации лактата обычно являются незначительными) или во вскармливаемых стандартной молочной смесью младенцах. Вследствие этого концентрации пропионата и особенно бутирата являются гораздо более низкими в ободочной кишке и фекалиях вскармливаемых грудью младенцев, чем у взрослых, и даже более низкими, чем у младенцев, вскармливаемых стандартной молочной смесью для младенцев. рН фекалий является наиболее низким во вскармливаемых грудью детях. Как упоминалось выше, желательно обеспечение питательных композиций, в частности композиций молочных смесей, которые при потреблении приводят к кишечной микрофлоре, наиболее близко сходной с кишечной флорой вскармливаемых грудью младенцев.

Были описаны многочисленные действия на здоровье SCFA и лактата и низкого рН ободочной кишки. Было описано, что пониженный рН и присутствие органических кислот оказывают противопатогенное действие и обеспечивают преимущество относительно кислотоустойчивых бактерий, таких как молочно-кислые бактерии (в том числе бифидобактерии). Описаны также действия SCFA на стенку кишечника. SCFA являются источником энергии колоноцитов и посредством этого способствуют целостности кишечного барьера. SCFA участвуют также в действиях на перистальтику, метаболизм желчных кислот, абсорбцию воды и дифференцировку клеток (см., например, ЕР1105002). Известно, что SCFA стимулируют продуцирование слизи и участвуют в абсорбции минеральных соединений и продуцировании слизи.

Подробное описание изобретения

Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что GOS (в частности, TOS) и полифруктоза (в частности инулин), при совместном введении, обеспечивают ряд полезных действий, которые не могут быть объяснены увеличением количества кишечных бифидобактерий и которые, следовательно, не обусловлены бифидогенным действием, описанным для TOS или инулина НР в уровне техники (например, в Boehm et al. 2002, supra). В частности, неожиданно было обнаружено, что после введения смесей GOS и полифруктозы было увеличение общих количеств образованных SCFA, увеличение относительных количеств ацетата и лактата и уменьшение фекального рН младенцев, причем эти действия не коррелировали с увеличенным (относительным) количеством бифидобактерий. Наряду с полезным количеством и профилем SCFA и увеличенным количеством лактата наблюдали уменьшение газообразования. Кроме того, было обнаружено, что сам лактат имел до сих пор неизвестное полезное действие на ободочную кишку, так как было обнаружено, что он увеличивал секрецию простагландина Е1 и простагландина Е2. Это действие сообщалось ранее только для SCFA, в частности для ацетата (Willemsen et al. 2003, Gut 52, 1442-1447). Таким образом, композиции, содержащие лактат, и композиции, содержащие пребиотики, которые стимулируют образование лактата, могут быть использованы для стимуляции продуцирования муцина и поддержания целостности слизистого барьера (мукопротекции). Было также обнаружено, что лактат уменьшает самопроизвольные сокращения и напряжение (ригидность) мышц ободочной кишки, приводя к ослаблению спазма и боли.

Таким образом, эти пребиотические композиции являются новыми в том смысле, что они не увеличивают или не увеличивают существенно количество бифидобактерий, в то время как они действительно приводят к увеличению общих количеств SCFA, полезным изменениям профиля SCFA (увеличениям ацетата, уменьшениям бутирата и пропионата), увеличению молочной кислоты (и получению полезных уменьшающих сокращение и напряжение действий и мукостимулирующего действия), уменьшению фекального рН, уменьшению газообразования и более постепенному образованию SCFA (в том числе образованию в дистальной части ободочной кишки), т.е. к общей оптимальной картине ферментационных продуктов (больше L-лактата, меньше бутирата и т.д.). Все эти изменения делают среду ободочной кишки более сходной со средой ободочной кишки вскармливаемых грудью младенцев. В одном варианте осуществления данного изобретения, здесь обеспечено применение смесей GOS и полифруктозы в эффективных количествах для производства композиций, которые приводят к среде ободочной кишки, по существу сходной со средой ободочной кишки вскармливаемых грудью младенцев.

Эти обнаруженные полезные действия были значительно более выраженными после совместного введения, чем при введении либо только GOS, либо только полифруктозы (например, TOS или инулина), что указывает на то, что GOS и полифруктоза действуют синергетически. В уровне техники не проводили исследований, в которых отдельные действия введения TOS и инулина непосредственно сравнивали с совместным введением этих двух типов соединений, и очевидно, что такие независимые отдельные исследования не могут сравниваться друг с другом и являются непригодными для обнаружения синергетических действий.

Это новое синергетическое взаимодействие GOS и полифруктозы (например, TOS и инулина), и действия in vivo их совместного введения, приводит к новым применениям композиций, содержащих как GOS, так и полифруктозу в подходящих (синергетических) количествах, таким как лечение или предупреждение колитических и/или абдоминальных спазмов, вздутия живота, метеоризма, абдоминальной боли, констипации, IBS, IBD, аллергии, и/или увеличенной мукопротекции кишечника. Кроме того, композиция, содержащая лактат (D-лактат и/или L-лактат, предпочтительно L-лактат), может быть использована для лечения или предупреждения одного или нескольких из этих симптомов или нарушений.

Таким образом, неожиданно, ферментация этих специфических смесей пребиотиков (GOS и полифруктозы) кишечной флорой приводит к усиленному и кинетически полезному образованию SCFA и лактата и улучшенному распределению метаболических конечных продуктов. В результате получают многие полезные действия, такие как действия на продуцирование слизи, противовоспалительные действия, действие на восприятие боли и действия на абдоминальные спазмы/колики (в обоих случаях через релаксацию ободочной кишки и уменьшение самопроизвольных сокращений). Питательные композиции, содержащие эти пребиотические смеси, могут быть также использованы для взрослых, имеющих проблемы кишечника, такие как IBD или IBS, или уменьшенную целостность кишечного барьера вследствие нарушения питания.

Определения

«Полисахариды» обозначают углеводные цепи моносахаридных элементарных звеньев с длиной цепи по меньшей мере 10 элементарных звеньев. В отличие от этого «олигосахариды» имеют длину цепи менее чем 10 элементарных звеньев.

«Степень полимеризации», или DP , обозначает общее количество сахаридных элементарных звеньев в олиго- или полисахаридной цепи. «Средняя DP» обозначает среднюю DP олисахаридов или полисахаридных цепей в композиции, без учета возможных моно- или дисахаридов (которые предпочтительно удаляют, если они присутствуют). Среднюю DP композиции используют для различения между композициями. Кроме того, % сахаридных элементарных звеньев, например, % глюкозных и % фруктозных элементарных звеньев, служит отличительным признаком.

Термины полифруктоза или полифруктан , или фруктополисахарид относятся к полисахаридному углеводу, содержащему цепь -связанных фруктозных элементарных звеньев со степенью полимеризации 10 или более, и он включает в себя, например, инулин (например, инулин НР), леван и/или полифруктан смешанного типа (см. ниже).

«Инулин» или «негидролизованный инулин», или «инулин НР» обозначает глюкоза-терминированные фруктозные цепи с большинством цепей (по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%), имеющих степень полимеризации (DP) 10 или более. Таким образом, инулин может быть описан как GF_n , где G представляет глюкозильное элементарное звено, F представляет фруктозильное элементарное звено, а n равно числу фруктозильных элементарных звеньев, связанных друг с другом, причем n равно 9 или более. Отношение G/F равно приблизительно 0,1 к 0. Однако небольшая часть этих молекул инулина может не иметь терминального глюкозного элементарного звена. Средняя DP равна здесь предпочтительно по меньшей мере 15, более предпочтительно 20 или более, например, 20, 21, 22, 23, 25, 30, 40, 60, 70, 100, 150 или более. В инулине фруктозные элементарные звенья связаны связью (2 1). Подходящий инулин коммерчески доступен, например, в виде Raftiline®HP (Orafti) со средней DP>23.

«Гидролизованный инулин» или «олигофруктоза» обозначает смесь глюкоза- и фруктоза-терминированных фруктозных цепей с DP ниже 10. Таким образом, гидролизованный инулин может быть описан как смесь GF_n-цепей и F_n-цепей (где G представляет глюкозильное элементарное звено, F представляет фруктозильное элементарное звено, а n=1-8). Гидролизованный инулин обозначает продукт (ферментативного или кислотного) гидролиза или продукт частичного гидролиза инулина, происходящий из расщепления (1-2)-фруктозил-фруктозных связей. Термин «гидролизованный инулин» включает в себя также синтетически полученный или рекомбинантно изготовленный инулин, которые имеют одну и ту же структуру.

«Леван» или «левулан», или «левулин», или «левулозан» обозначает полисахарид, состоящий из полифруктозы, в которой фруктозные элементарные звенья связаны связями (2 6). Может присутствовать начальная глюкозная часть молекулы, но это необязательно. Степень полимеризации равна более чем 10.

В «полифруктанах смешанного типа» фруктозные элементарные звенья связаны связями (2 1) и (2 6). Полифруктаны смешанного типа являются разветвленными и имеют DP>10.

«GOS» или «галактоолигосахариды», или «транс-галактоолигосахариды», или TOS обозначают олигосахариды, состоящие из галактозных элементарных звеньев, с DP 10 или менее и средним DP 2, 3, 4, 5 или 6. Глюкозное элементарное звено может присутствовать на редуцирующем конце этой цепи. Предпочтительно, GOS содержит по меньшей мере 2/3 галактозных элементарных звеньев. Наиболее предпочтительными являются транс-галактоолигосахариды (TOS) с гликозидными связями -(1-4). Таким GOS является, например, GOS, который находится в Vivinal®GOS (коммерчески доступном из Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Netherlands), содержащем транс-галактоолигосахариды с гликозидными связями -(1-4) и гликозидными связями -(1-6).

«SCFA» или «жирные кислоты с короткой цепью» обозначают жирные кислоты с длинами углеродной цепи до С6, продуцируемые в качестве конечного продукта бактериальной кишечной ферментации, такие как ацетат (С2), пропионат (С3), бутират и изобутират (С4), валерат и изовалерат (С5) и другие. Выражение «iC4-5 относится к сумме изобутирата, валерата и изовалерата.

«Синергетически эффективное количество» обозначает количество GOS и полифруктозы (например, TOS и инулина), которое, при совместном введении, дает один или несколько специфических физиологических эффектов (описанных здесь в другом месте), посредством чего общий эффект совместного введения является значительно большим, чем сумма эффектов отдельного введения GOS или полифруктозы. Например, если эффект введения одного GOS равен Х, а эффект введения одной полифруктозы равен Y, то эффект совместного введения концентрации GOS плюс концентрации полифруктозы имеет эффект больший, чем Х+ Y, и т.д.

Совместное введение двух или более веществ обозначает введение этих веществ одному индивидууму, либо в одной композиции, либо в отдельных композициях (набора частей; в виде объединенной композиции), которые вводят в одно и то же время (одновременно) или в пределах короткого промежутка времени (раздельное или последовательное применение, например в пределах минут или часов).

Энтеральное относится здесь к доставке непосредственно в желудочно-кишечный тракт субъекта (например, перорально или через трубку, катетер или стому).

Термин содержащий должен интерпретироваться как указывающий присутствие указанных частей, стадий или компонентов, но он не исключает присутствия одной (одного) или нескольких дополнительных частей, стадий или компонентов.

Младенец относится здесь к детям в возрасте 0-36 месяцев, предпочтительно 0-18 месяцев или более предпочтительно 0-12 месяцев.

Термин вскармливаемые грудью младенцы относится к младенцам, вскармливаемым исключительно грудным молоком человека. Не вскармливаемые грудью или частично вскармливаемые грудью младенцы являются младенцами, вскармливаемые не исключительно грудным молоком человека. Этот термин включает в себя младенцев, вскармливаемых по меньшей мере одной бутылочкой (около 80 мл) молочной смеси в день.

Процент или среднее обычно обозначает массовые проценты средних величин, если нет другого указания или не является ясным, что имеется в виду другая основа расчета.

В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает ряд новых применений композиций, содержащих как GOS, так и полифруктозу в подходящих (синергетически эффективных) количествах.

Применения и способы по изобретению

В различных описанных здесь применениях субъектом является предпочтительно субъект-человек, более предпочтительно младенец, например, новорожденный младенец с возрастом до 12 месяцев. В частности, имеют в виду искусственно вскармливаемых или частично искусственно вскармливаемых младенцев. Альтернативно, субъектом может быть ребенок, подросток или взрослый. В частности, с использованием композиций по изобретению могут предупреждаться и/или лечиться проблемы кишечника, такие как, но не только, воспалительное заболевание кишечника (IBD), синдром раздраженной толстой кишки (IBS), метеоризм, абдоминальные спазмы, колики, абдоминальное вздутие, абдоминальная боль и т.д., которые могут приводить к усталости, депрессии или плохому расположению духа. Может быть также усилено продуцирование слизи, и могут предупреждаться или лечиться аллергии, происходящие из субоптимального функционирования кишечника. Может быть также улучшена барьерная функция кишечника у пациентов с барьерной функцией, нарушенной вследствие нарушения питания, хирургии, химиотерапии и т.д.

Композиции, содержащие как GOS, так и полифруктозу, такие как композиции, содержащие TOS и инулин, могут быть в одном варианте осуществления использованы для индукции продуцирования SCFA в толстой кишке субъекта и для существенного увеличения общего (кишечного и/или фекального) количества SCFA, продуцированного после введения, и/или для существенной модификации относительных количеств продуцируемых (кишечных и/или фекальных) SCFA, в частности, для увеличения относительного (кишечного и/или фекального) количества ацетата из общего количества SCFA и/или для существенного увеличения количества (абсолютного или относительного) продуцируемого кишечного лактата, и/или для существенного уменьшения или предотвращения образования кишечных газов, и/или для распространения продуцирования SCFA в дистальную часть ободочной кишки, и/или для существенного снижения pH в толстой кишке и фекального pH. Может быть также уменьшена сумма кишечного и/или фекального бутирата, изобутирата, валерата и/или изовалерата относительно общих SCFA. Эти эффекты достигаются после введения, без проявления существенного влияния на общее и/или относительное количество кишечных бифидобактерий. Здесь обеспечены композиции для лечения или профилактики любых заболеваний, или нарушений, или дискомфортов, ассоциированных с одним или несколькими из этих кишечных эффектов или вызываемых одним или несколькими из этих кишечных эффектов.

Данное изобретение обеспечивает применение галактоолигосахаридов и полифруктозы для производства композиции для лечения или предупреждения вздутия живота, газообразования, абдоминальной боли и/или метеоризма. В следующем варианте осуществления данное изобретение обеспечивает применение галактоолигосахаридов и полифруктозы для производства композиции для лечения или предупреждения аллергии, экземы или атопических заболеваний. В следующем варианте осуществления данное изобретение обеспечивает применение галактоолигосахаридов и полифруктозы для производства композиции для лечения и/или предупреждения колик и/или для релаксации сокращений ободочной кишки, предпочтительно тонического и/или фазового сокращения. В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает применение галактоолигосахаридов и полифруктозы для производства композиции для лечения или предупреждения синдрома раздраженной толстой кишки или воспалительного заболевания кишечника. Еще в одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает применение галактоолигосахаридов и полифруктозы для производства композиции для улучшения барьерной функции кишечника и/или продуцирования слизи в толстой кишке.

Если нет другого указания, существенное увеличение (например, SCFA, ацетата или лактата) обозначает здесь увеличение по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20% или более, в сравнении с количеством, продуцируемым при отдельном введении либо GOS, либо полифруктозы (например, инулина). Подобным образом, если нет другого указания, существенное уменьшение (например, газообразования) обозначает уменьшение по меньшей мере 5%, предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 20%, 25%, 50% или более (например, 70%, 80%, 90%, 100%) в сравнении с количеством, продуцируемым при введении одной полифруктозы (например, инулина).

Увеличение общего количества SCFA, продуцируемых в качестве продукта ферментации композиций GOS и полифруктозы, может быть измерено в виде значимого уменьшения pH фекальных проб субъектов, отражающего уменьшение pH in vivo в толстой кишке. У младенцев было обнаружено, что фекальный pH уменьшался до около 5,8 или менее, например, до pH 5,6, 5,5 или 5,4, или 5,2 после совместного введения TOS и полифруктозы (например, инулина), в то время как pH вскармливаемых стандартными смесями младенцев был около или выше pH 6, например, около pH 5,9, 6,8 или даже 7,0. Таким образом, существенным уменьшением называют уменьшение pH по меньшей мере на 15% или на 0,9 единиц в сравнении с pH младенцев, вскармливаемых стандартной смесью.

Другим полезным эффектом совместного введения GOS и полифруктозы в подходящих количествах является то, что состав SCFA является существенно другим, чем состав при введении либо GOS, либо полифруктозы. В частности, относительное количество бутирата является существенно уменьшенным, тогда как относительное количество ацетата является существенно увеличенным. Таким образом, эти композиции могут быть использованы для изменения не только общих количеств SCFA, но также относительных соотношений SCFA. У младенцев, получающих одновременно TOS и полифруктозу (например, инулин), относительные содержания SCFA больше похожи на содержания, обнаруживаемые у вскармливаемых грудью младенцев, с отношениями ацетат : пропионат : бутират обычно около 80-85%:1-15%:1-5%, в то время как у младенцев, вскармливаемых стандартной молочной смесью, отношения обычно были около 69-74%:16-19%:5,6% (как показано в примерах). Таким образом, композиции по изобретению увеличивали, в частности, относительные количества ацетата и уменьшали относительные количества пропионата и бутирата. Совместное введение GOS и полифруктозы приводит к соотношениям ацетат : пропионат : бутират, сходным с соотношениями у вскармливаемых грудью младенцев гораздо более близко, чем соотношения у вскармливаемых смесями младенцев (которые продуцируют высокие содержания бутирата и пропионата и относительно низкие содержания ацетата). Действие на относительные соотношения SCFA могут быть измерены способами, известными в данной области, такими как газовая хроматография фекальных проб, в различных временных точках после введения, с использованием либо исследований in vivo, либо систем ферментации in vitro, например, как описано в примерах. Существенно модифицированный состав SCFA или существенно увеличенное количество ацетата относится к количеству ацетата (% общих SCFA), являющемуся по меньшей мере приблизительно на 4%, 5%, 10%, 15% или более, более высоким, чем в том случае, когда не вводят GOS или полифруктозу или когда GOS или полифруктозу вводят отдельно. Предпочтительно, относительные количества пропионата и/или бутирата являются более низкими, чем в том случае, когда не вводят GOS или полифруктозу или когда GOS или полифруктозу вводят отдельно. В одном варианте осуществления, композиция по изобретению пригодна для увеличения кишечного и/или фекального ацетата до более чем около 85%, например, 86%, 87%, 88%, 90% или более, общего количества SCFA.

Еще одним полезным эффектом, наблюдаемым при совместном введении GOS и полифруктозы, является существенное уменьшение разветвленных SCFA в сравнении с долей разветвленных SCFA, обнаруживаемой при введении только GOS или только полифруктозы. Существенным уменьшением разветвленных SCFA называют в данном контексте уменьшение по меньшей мере 70% в сравнении с концентрацией, обнаруживаемой у младенцев, не вскармливаемых пребиотиками, или приводящее к фекальной доле менее, чем 1,5% общего количества SCFA. Доля разветвленных SCFA относительно общего количества SCFA может быть измерена делением суммы разветвленных SCFA, т.е. изобутирата, плюс изовалерата, плюс валерата, на сумму общих SCFA, т.е. ацетата, плюс пропионата, плюс бутирата, плюс изобутирата, плюс изовалерата, плюс валерата, и т.д.

Уменьшение доли разветвленных SCFA является полезным для здоровья субъекта, так как разветвленные SCFA являются вредными. Это свидетельствует о меньшей деградации белков, которая является нежелательной, так как ферментация белков приводит к увеличению pH и к образованию повреждающих агентов, таких как Н₂S.

Существенным уменьшением бутирата называют уменьшение по меньшей мере на 50% в сравнении с концентрацией, обнаруживаемой у младенцев, не вскармливаемых пребиотиками, или приводящее к фекальной доле менее чем 4% общего количества SCFA. В одном варианте осуществления композиция по изобретению пригодна для уменьшения суммы кишечного (и/или фекального) бутирата, изобутирата, валерата и изовалерата, которое ниже 7% общего количества SCFA, например, 6,5%, 6%, 5%, 4; или менее общего количества SCFA.

В другом варианте осуществления композиции GOS и полифруктозы пригодны для увеличения продолжительности ферментации в ободочной кишке. В частности, бактериальная ферментация будет все еще активной в наиболее дистальных частях ободочной кишки после совместного введения, как показано продукцией SCFA в дистальной части ободочной кишки. SCFA не продуцируется или продуцируется лишь в очень небольшом количестве в дистальной части ободочной кишки после введения композиций, содержащих только GOS или только полифруктозу. Кроме того, наблюдается быстрая ферментация в начале ободочной кишки после совместного введения, которая является особенно важной для противопатогенных эффектов и также наблюдается у вскармливаемых грудью младенцев. В целом, это свидетельствует о том, что эти композиции являются пригодными для установления и/или поддержания относительно однородной картины ферментации во всей ободочной кишке субъекта и распространения ферментации и продуцирования SCFA в дистальный конец ободочной кишки. Таким образом, SCFA и, наиболее вероятно, также другие продукты ферментации, в частности лактат, продуцируются по всей ободочной кишке, в начале, в середине и в конце ободочной кишки.

В следующем варианте осуществления совместное введение GOS и полифруктозы в синергетических количествах может быть использовано для существенного увеличения продуцирования лактата, как может быть опять определено анализом фекальных проб тест-субъектов и контрольных субъектов, которые получали композиции, содержащие либо только GOS, либо только полифруктозу, или эквивалентные базовые композиции (композиции-основы) без пребиотиков. Существенным увеличением лактата называют по меньшей мере 5%, 10%, 20% или даже 50% или большее увеличение лактата, продуцируемого в субъектах, которым вводят совместно композиции, содержащие GOS и полифруктозу, в сравнении с субъектами, которым не вводят GOS или полифруктозу. Например, младенцы, вскармливаемые на стандартной молочной смеси, дополненной 6 г/л смесей TOS/инулин (90%:10%), продуцировали при 16 неделях около 16% лактата (в виде % общих кислот), тогда как вскармливаемые стандартной смесью младенцы продуцировали около 0,6%, а вскармливаемые грудью младенцы продуцировали около 35% лактата. Хотя и не достигалось количество лактата, продуцируемого вскармливаемыми грудью младенцами, обогащение стандартной молочной смеси смесями TOS и инулина приводило к существенному увеличению продуцирования лактата. Как показано в Примерах, было обнаружено, что лактат имел неожиданные полезные эффекты. Подобно ацетату, он увеличивал продуцирование простагландина Е1 и простагландина Е2 и приводил к усиленной экспрессии эпителиального муцина. Кишечная слизистая оболочка играет важную роль в здоровье человека, так как она служит в качестве барьера инфекционным патогенам, аллергенам и канцерогенам. Таким образом, композиции, которые положительно влияют на развитие и/или целостность этой слизистой оболочки, могут быть использованы для содействия построению здоровой слизистой оболочки у новорожденных младенцев и для содействия установлению здоровой слизистой оболочки у искусственно вскармливаемых младенцев и у субъектов, страдающих от симптомов или заболеваний, происходящих из неправильно функционирующей кишечной слизистой оболочки или ассоциированных с неправильно функционирующей кишечной слизистой оболочкой. Например, кишечные проблемы, такие как воспалительное заболевание кишечника (IBD, например, колит или болезнь Крона) или синдром раздраженной толстой кишки (IBS), могут лечиться или предупреждаться, или присоединение патогена и/или вхождение через слизистую оболочку может быть уменьшено, или другие иммунологические проблемы, такие как развитие астмы, могут предупреждаться или уменьшаться. Может также предупреждаться или лечиться потеря целостности кишечного барьера в результате нарушения питания, хирургии, химиотерапии и т.д.

Кроме того, самопроизвольные сокращения и абдоминальное напряжение существенно уменьшались зависимым от дозы образом после введения D- или L-лактата. Таким образом, композиции по изобретению могут быть использованы для повышения содержания лактата в кишечнике и посредством этого лечения или предупреждения таких симптомов, как абдоминальная боль, колика, абдоминальные сокращения, абдоминальное напряжение и т.п.

Поскольку было обнаружено, что сам лактат демонстрировал неожиданные эффекты, задачей данного изобретения является также обеспечение композиций, содержащих лактат в подходящих количествах, которые могут быть использованы для лечения или предупреждения вышеописанных симптомов и нарушений. В одном варианте осуществления композиции содержат только лактат в подходящих количествах, тогда как в другом варианте осуществления композиции, содержащие GOS и полифруктозу, описанные здесь, дополнительно содержат лактат для дополнительного повышения содержания лактата в кишечнике. Одна такая композиция по изобретению содержит TOS и инулин в синергетически эффективных количествах и дополнительно содержит лактат в подходящих количествах. В одном варианте осуществления обеспечены композиции, которые пригодны для увеличения кишечного и/или фекального лактата до более чем около 10 ммоль/кг фекалий.

Понятно, что при ссылке на анализ фекальных проб речь идет об опосредованном измерении действительного эффекта in vivo. Подобным образом, могут проводиться анализы in vitro, посредством которых бактериальные популяции выращивают in vitro и подходящие количества композиций добавляют в культуры. В частности, может быть использована система ферментации in vitro, описанная в Примерах.

Таким образом, совместное введение композиций, содержащих GOS и полифруктозу, может использоваться для достижения одного или нескольких следующих физиологических эффектов:

- существенного увеличения общего содержания SCFA

- существенного снижения pH

- существенной модификации композиции SCFA

- существенного уменьшения разветвленных SCFA

- существенного уменьшения газообразования на моль продуцированных SCFA

- более продолжительная и более однородная ферментация, в том числе ферментация даже в наиболее дистальных частях ободочной кишки, и/или

- высокое начальное образование SCFA и/или образование молочной кислоты в наиболее проксимальной части ободочной кишки,

- усиление продуцирования SCFA в начале, середине и конце ободочной кишки,

- существенное увеличение содержания молочной кислоты (абсолютное и/или относительное) и/или

- увеличение относительного содержания L-лактата в виде доли общей образованной молочной кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 этих эффектов или все эти эффекты существенно модифицируются при использовании композиций, содержащих как GOS, так и полифруктозу, в сравнении с введением композиций, содержащих только GOS или полифруктозу или не содержащих ни GOS, ни полифруктозу. В частности, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 эффектов или все эти эффекты являются существенно большими после совместного введения (синергетически эффективного количества) GOS и полифруктозы, чем сумма этих эффектов введения GOS и полифруктозы по отдельности.

Таким образом, синергетические композиции по изобретению являются особенно подходящими для создания и/или поддержания здоровой микрофлоры в толстой кишке младенца после введения синергетически эффективного количества. В предпочтительном варианте осуществления младенца вскармливают только базовой композицией (композицией-основой), такой как молочная смесь, дополненная синергетически эффективным количеством GOS и полифруктозы, в первые недели после рождения. Таким образом, предпочтительной композицией является диетическая композиция для младенцев. В другом варианте осуществления младенца только частично вскармливают композицией по изобретению. В одном варианте осуществления эту композицию используют для лечения или предупреждения симптомов, выбранных из одного или нескольких из: газообразования, метеоризма, колита, вздутия живота, абдоминальных спазмов, абдоминальной боли, IBS, IBD, аллергии, и/или в качестве мукопротектора. Таким образом, GOS и полифруктоза могут быть использованы для производства композиции или комбинированной композиции для одновременного, раздельного или последовательного применения в лечении метеоризма, избыточного газообразования, колита, вздутия живота, абдоминальных спазмов, абдоминальной боли, IBS, IBD, аллергии, пониженной барьерной функции кишечника и/или в качестве мукопротектора. Субъектом в этом случае может быть любой субъект в диапазоне от младенца, ребенка, подростка до взрослого. Ясно, что композиции-основы, к которым добавляют GOS и полифруктозу в синергетически эффективных количествах, будут зависеть от возраста субъекта, способа введения и от основных симптомов, которые должны лечиться или предупреждаться. Например, для младенцев композицией-основой является предпочтительно смесь для новорожденных или для более старших детей в жидкой или порошкообразной форме, тогда как для взрослых может быть более подходящей композиция пищевой добавки (жидкая, полужидкая или твердая) или композиция для кормления через трубку.

В предпочтительном варианте осуществления GOS и полифруктозу вводят совместно в синергетически эффективном количестве, подходящем для существенного увеличения общего количества образованных кишечных SCFA и/или для существенного улучшения кишечного состава SCFA (в частности, для существенного увеличения процента ацетата относительно общего количества SCFA) и/или для существенного увеличения продуцирования лактата, и/или для понижения кишечного pH и/или для существенного уменьшения кишечного газообразования.

Обеспечено применение композиций, содержащих синергетически эфффективное количество GOS и полифруктозы, для лечения и/или предупреждения колитических и/или абдоминальных спазмов, вздутия живота и/или метеоризма, абдоминальной боли, IBS, IBD и/или аллергии. Обеспечено также применение таких композиций для увеличения мукопротекции и улучшения кишечного барьера. Понятно, что необязательно имеется в виду одна композиция, но имеется в виду также, что GOS и полифруктоза могут присутствовать в отдельных композициях, что обеспечивает синергетически эффективное количество при их совместном введении.

Посредством этих изменений уровней, профиля SCFA и кишечного pH эти композиции способны вызывать один или несколько из следующих ниже полезных эффектов:

а) В месте образования SCFA уменьшается кишечная проницаемость. Это является важным для предотвращения заболевания и поддержания здоровья, в частности для предотвращения развития аллергий. Обнаружение, что совместное введение GOS и полифруктозы вызывает более однородную ферментацию и распространяет ферментацию в дистальную часть ободочной кишки, является важным в этом отношении, так как проницаемость кишечника, в том числе дистальных частей ободочной кишки, может быть равномерно уменьшена, и посредством этого кишечник может быть равномерно поддерживаемым в здоровом состоянии.

b) Сократительная способность или перистальтика кишечника усиливается, что уменьшает или предупреждает констипацию (запор), обычную проблему, наблюдаемую у вскармливаемых смесями младенцев.

с) Уменьшение количества самопроизвольных сокращений и мышечного напряжения ободочной кишки приводит к меньшим спазмам и меньшей абдоминальной боли.

d) Абсорбция ионов кальция увеличивается, что является важным для минерализации костей и развития костей субъекта, особенно, если этим субъектом является ребенок.

е) Вторичные симптомы ухудшенного здоровья, такие как усталость, депрессия и колебания настроения, могут уменьшаться.

f) Образование слизи кишечной слизистой оболочки существенно усиливается, что обеспечивает защиту против прикрепления и колонизации патогенов. В частности, было обнаружено, что уровни лактата положительно коррелируют с продуцированием слизи. Таким образом, композиции по изобретению могут быть использованы для стимуляции продуцирования слизи.

g) Метаболизм желчи может быть модифицирован до уровней и/или картин, наблюдаемых у вскармливаемых грудью младенцев.

h) Рост кишечных патогенных микроорганизмов ингибируется во всей ободочной кишке.

Таким образом, композиция, содержащая синергетически эффективное количество GOS и полифруктозы, может быть использована либо для поддержания, либо для установления (например, в новорожденном, преждевременно рожденном или рожденным в срок новорожденном или в не вскармливаемом грудью или частично вскармливаемом грудью младенце или других субъектах, таких как взрослые) одного или нескольких из описанных выше физиологических эффектов и поддержания или улучшения здоровья субъекта обеспечением или установлением здоровой среды толстой кишки и оптимальной активности толстой кишки.

В частности, встречаемость, продолжительность и/или тяжесть заболеваний, нарушений или симптомов, таких как колитические и/или абдоминальные спазмы, вздутие живота и/или метеоризм, абдоминальная боль, IBS, IBD и/или аллергия, инфекция кишечных патогенов (например, бактерий, вирусов, грибов), диарея, экзема, индуцированная аллергией астма и другие атопические заболевания и/или констипация, могут быть уменьшены, устранены или предотвращены введением композиции по изобретению. Композиции по изобретению могут быть также использованы для релаксации сокращений ободочной кишки, предпочтительно фазовых и/или тонических сокращений.

Композиции по изобретению

Композиции, подходящие для описанных выше применений, содержат как полифруктозу, так и GOS в синергетически эффективных количествах. Эти композиции содержат GOS/полифруктозу в соотношениях, в диапазоне от 3/97 до 97/3, предпочтительно 5/95-95/5, более предпочтительно 90/10-45/55. Все отдельные соотношения между этими конечными точками включены здесь, например, 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 55/45, 60/40, 70/30, 80/20, 85/15, 90/10, и т.д.

Необходимые дозы и отношение GOS/полифруктоза для достижения (оптимального) синергетического эффекта могут варьироваться в зависимости от типа композиции и способа и частоты введения. Однако несколько примеров даны ниже. Специалист с квалификацией в данной области сможет легко определить, какие дозы каждого компонента требуются для получения наилучшего физиологического эффекта, и какое отношение GOS/полифруктоза является наиболее подходящим. Например, если основной целью является увеличение общего уровня SCFA после перорального введения композиции, содержащей GOS и полифруктозу, лицо с квалификацией в данной области будет готовить различные композиции (композиции GOS плюс полифруктоза, только GOS, только полифруктоза) и сравнивать их эффективность в индукции высоких уровней SCFA с использованием тестов in vivo или in vitro, известных в данной области. Понятно, что использование терминов «суточная доза» или «доза на один день» не предполагает, что эта доза должна быть введена субъекту только один раз.

Синергетически эффективная смесь для младенцев может, например, состоять из композиции-основы (например, стандартной детской смеси), содержащей около 4 г/л, 5 г/л или более смеси GOS и полифруктозы, посредством чего отношение GOS к полифруктозе может варьироваться, как описано здесь в другом месте (например, 90% GOS:10% полифруктоза).

Полифруктозой может быть, например, леван и/или инулин. Полифруктоза, например, леван или инулин, для применения в этих композициях может быть либо экстрагирована из природных источников (растений или бактерий), либо получена синтезом de novo или технологиями рекомбинантных ДНК, как известно в данной области. Способы экстракции, разделения по размерам и очистки инулина были описаны, например, в De Leenheer (1996), US6569488 и US5968365. Способы рекомбинантного получения были описаны, например, в US6559356. Синтез включает в себя обычно использование молекул и ферментов с активностью фруктозилтрансферазы. Инулин, пригодный для использования в этих композициях, является также уже коммерчески доступным, например, Raftiline®HP, Orafti.

Инулины растений обычно имеют гораздо более низкую степень полимеризации, чем бактериальные инулины (до 150, в сравнении с 100000 в бактериях). Растительные источники включают в себя двудольные виды, такие как Compositae. Примерами видов, которые продуцируют относительно большие количества инулина, в основном в их корнях, луковицах или клубнях, являются цикорий, спаржа, далия (георгин), артишок иерусалимский (земляная груша, топинамбур), чеснок и другие (см. Kaur and Gupta, J. Biosci. 2002, 27, 703-714). Поскольку инулин предпочтительно не должен содержать олигофруктозу, следует избегать гидролиза, или присутствующие олигофруктоза и/или моно- или дисахариды должны быть удалены перед использованием.

Особенно предпочтительной является полифруктоза со степенью полимеризации (PD) по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 70, 100, 120, 130, 150, 200, 300, 500 или более. Полифруктозы, такие как леваны, могут быть гидролизованы во избежание проблем вязкости, ассоциированных со слишком длинными цепями, пока сохраняется PD 10 или более.

Леваны могут быть также получены из природных источников, таких как растения (например, однодольные), дрожжи, грибы, бактерии, или получены химически или с использованием технологии рекомбинантных ДНК.

GOS может быть получен из природных источников, таких как растения (например, цикорий, соя) или бактерии, или может быть получен синтетически или технологией рекомбинантных ДНК, как известно в данной области. GOS может быть -галактоолигосахаридом или -галактоолигосахаридом или смесью обоих. В частности, галактозные остатки связаны гликозидными связями (1-4) и (1-6) (транс-GOS или TOS). GOS, подходящий для использования в этих композициях, является также уже коммерчески доступным, например, Vivinal®GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, The Netherlands. GOS может быть также получен из лактозы, обработкой лактозы ферментативно -галактозидазой или гидролизом из полиглюкана. В предпочтительном варианте осуществления используют TOS. В одном варианте осуществления предпочтительной полифруктозой является инулин НР, так что комбинация TOS и инулина НР является здесь также предпочтительным вариантом осуществления.

Другими обеспеченными композициями являются композиции, содержащие лактат в подходящих количествах, в частности, для описанных выше применений. Подходящие количества лактата могут варьироваться и могут находиться, например, в диапазоне 1-30 граммов в день.

Композиции по изобретению могут быть либо пищевыми композициями, композициями пищевых добавок или фармацевтическими композициями. Наряду с полифруктозой и GOS (и/или лактатом), они могут содержать дополнительные ингредиенты. Для пищевых композиций или композиций пищевых добавок они должны быть композициями пищевой категории и быть физиологически приемлемыми. Термин пищевая относится к жидкой, твердой или полутвердой диетическим композициям, в частности, полным пищевым композициям (заменителям пищи), которые не требуют дополнительного потребления питательных веществ, или композициям пищевых добавок. Композиции пищевых добавок не заменяют полностью потребление питательных веществ посредством других средств. Пищевые композиции и композиции пищевых добавок являются в предпочтительном варианте осуществления пищевым продуктом или пищевыми добавками для младенцев, пищевым продуктом или пищевыми добавками для преждевременно родившихся детей, пищевым продуктом для младенцев, пищевым продуктом для начинающих ходить детей и т.д., которые предпочтительно вводят энтерально, предпочтительно перорально несколько раз в сутки. Пищевые композиции или композиции пищевых добавок особенно пригодны для не вскармливаемых грудью или частично вскармливаемых грудью младенцев. Эти композиции могут с пользой вводиться младенцам в период их адаптации к твердой пище или при переводе младенцев от вскармливания грудью к искусственному вскармливанию. Эта композиция может также быть частью обогатительной добавки молока человека.

В одном варианте осуществления эта композиция является смесью для младенцев (до 12 месяцев) или для детей последующего возраста, как, например, известно в данной области, в частности, как описано в European Commission directive 91/321/EEC и ее исправлениях, но она может быть модифицирована таким образом, что она содержит эффективное количество полифруктозы и GOS. Эта смесь для младенцев и детей после года может быть смесью на основе молока (коровьего молока, козьего молока и т.д.), молочной смесью для младенцев (IMF) или соевой смесью для не переносящих лактозу младенцев или может содержать аминокислоты в качестве источника азота для младенцев, имеющих проблемы, связанные с аллергией или абсорбцией. Таким образом, коммерчески доступные смеси для младенцев и детей после года содержат основу из белка молока или белка сои, жир, витамины, усваиваемые углеводы и минеральные соединения в рекомендуемых суточных количествах и могут быть порошками, жидкими концентратами или готовыми для кормления композициями.

Введение модифицированной смеси для младенцев и детей после года приводит к созданию среды в толстой кишке, которая похожа на среду в толстой кишке вскармливаемых грудью младенцев, как может быть определено анализами фекального pH, бактериального состава, продуцирования и профилей SCFA, газообразования и т.д. Когда эта композиция является напитком, предпочтительно объем (содержащий суточную эффективную дозу), потребляемый или вводимый в расчете на сутки, находится в диапазоне приблизительно 100-1500 мл, более предпочтительно приблизительно 450-1000 мл в сутки. Когда эта смесь является твердой, предпочтительно количество (содержащее суточную эффективную дозу), потребляемое или вводимое в расчете на сутки, находится в диапазоне приблизительно 15-220 г/сутки, предпочтительно приблизительно 70-150 г/сутки порошка смеси.

Суточная эффективная доза GOS и полифруктозы находится в диапазоне приблизительно 1-30 г/сутки, предпочтительно приблизительно 2-10 г/сутки для младенцев и предпочтительно приблизительно 5-20 г/сутки для взрослых.

Пищевые композиции или композиции пищевых добавок по изобретению могут дополнительно содержать другие активные ингредиенты, такие как витамины (А, В1, В2, В3, В5, В12, С, D, E, K, и т.д.), пробиотики (например, бифидобактерии, лактобациллы и т.д.), другие пребиотики, волокна (балластные вещества), лактоферрин, иммуноглобулины, нуклеотиды и т.п. Питательные вещества, такие как белки, липиды и другие углеводы (например, перевариваемые углеводы, неперевариваемые углеводы, растворимые или нерастворимые углеводы), могут присутствовать в различных количествах. Типичными нерастворимыми неусваиваемыми углеводами, присутствующими в детском питании, являются полисахариды сои, устойчивый крахмал, целлюлоза и гемицеллюлоза. Типичными растворимыми и перевариваемыми углеводами для применения в детском питании являются, например, мальтодекстрин, лактоза, мальтоза, глюкоза, фруктоза, сахароза и другие моно- или дисахариды или их смеси. Эта композиция может также содержать другие неактивные ингредиенты и носители, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, сахарин-натрий, тальк, карбонат магния и т.п. Эта композиция может также содержать воду, электролиты, незаменимые и заменимые аминокислоты, микроэлементы, минеральные соединения, клетчатку, подслащивающие вещества, вкусовые вещества, красители, эмульгаторы и стабилизаторы (такие как лецитин сои, лимонная кислота, сложные эфиры моно- и диглицеридов), консерванты, связывающие вещества, ароматизирующие вещества и т.п.

Липидами, подходящими для этих композиций, в частности, для питания или пищевых добавок младенцев, являются жиры молока, растительные липиды, такие как рапсовое масло, саффлоровое масло, подсолнечное масло, оливковое масло, жиры морских млекопитающих и т.д. или их фракции или смеси, содержащие подходящие жирные кислоты (полиненасыщенные и/или насыщенные).

Белки, подходящие для этих композиций, в частности, для питания или пищевых добавок для младенцев, включают в себя казеин, молочную сыворотку, сгущенное сепарированное молоко, сою, говядину, коллаген, кукурузу и другие белки растений или гидролизованные белки, свободные аминокислоты и т.д. Предпочтительно, белки, содержащиеся в питании или пищевых добавках для младенцев, интенсивно гидролизуют и/или частично гидролизуют для уменьшения риска аллергий. Пищевые композиции для младенцев по изобретению предпочтительно содержат все витамины и минеральные соединения, незаменимые в суточной или недельной диете, в существенных для питания количествах, таких как минимальные рекомендуемые суточные количества.

Эта пищевая композиция или композиция пищевой добавки может быть также приготовлена в одном варианте осуществления на основе пищевого продукта (т.е. может исходить из него или содержать его). Например, она может быть основана на молочном продукте или содержать молочный продукт, такой как ферментированный молочный продукт, в том числе, но не только, молоко, йогурт, напиток на основе йогурта или пахта. Такие композиции могут быть приготовлены известным per se способом, добавлением эффективного количества полифруктозы и GOS или TOS к подходящему пищевому продукту или пищевой основе. Другими подходящими пищевыми основами могут быть растительные основы, мясные основы и т.п.

Эта пищевая композиция или композиция пищевой добавки по изобретению может быть использована в качестве лечения и/или профилактически. Следует сказать, что они могут либо вводиться после того как желудочно-кишечные проблемы или заболевания были диагностированы в субъекте, либо, альтернативно, перед появлением симптомов (например, пациентам с высоким риском вероятного развития желудочно-кишечных проблем). Например, если наблюдаются симптомы, ассоциированные с заболеванием или субоптимальным функционированием толстой кишки, такие как констипация, метеоризм, аллергии, колики, абдоминальная боль, абдоминальные спазмы, IBD, IBS, введение этой композиции будет способствовать восстановлению здоровой среды толстой кишки или предотвращать развитие таких симптомов.

В одном варианте осуществления эти композиции вводят профилактически для поддержания развития здоровой микрофлоры и/или здоровой среды толстой кишки. «Здоровой средой толстой кишки» называют нормальную кишечную физиологию и активность, в частности, нормальную абсорбцию питательного вещества, воды, устойчивость слизистой оболочки к прикреплению и инфекции патогенов, и т.д., как может быть определено анализом фекалий и по образованию газов, в частности, здоровой средой называют оптимальную физиологию и активность. Любое субоптимальное функционирование толстой кишки приводит к описанным выше симптомам и может быть определено анализом фекалий и по образованию газов. Кишечные заболевания или нарушения, происходящие из субоптимального функционирования, включены в данное изобретение.

Фармацевтические композиции для лечения или профилактики кишечных нарушений или симптомов субоптимального кишечного функционирования, таких как IBD, колит, IBS и/или увеличенная барьерная целостность, могут содержать дополнительные биологически активные ингредиенты, такие как лекарственные средства, биологически активные белки или пептиды, пробиотики и другие. Варианты осуществления, описанные для пищевых композиций и композиций пищевых добавок, применимы также к фармацевтическим композициям.

Композиции по изобретению могут быть в любой дозированной форме, такой как жидкая, твердая, полутвердая формы, таблетки, напитки, порошки и т.д., в зависимости от способа введения. Введение субъекту является предпочтительно пероральным, хотя для некоторых применений могут быть подходящими ректальное введение или введение через трубку (с трубкой, непосредственно введенной в желудок, двенадцатиперстную кишку или тонкую кишку, или толстую кишку).

Дополнительным вариантом осуществления данного изобретения является обеспечение способа приготовления композиции по изобретению добавлением синергетически эффективного количества GOS (или TOS) и полифруктозы в подходящую основу композиции, как описано выше.

Следующие неограничивающие Примеры описывают синергетическое действие GOS и полифруктозы. Если нет другого указания, практика данного изобретения будет использовать стандартные общепринятые способы молекулярной биологии, фармакологии, иммунологии, вирологии, микробиологии или биохимии. Такие способы описаны в Sambrook amd Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, в Volumes 1 и 2 Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA и Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17 ^th ed. (1985), Microbiology: A Laboratory Manual (6 ^th Edition) by James Cappuccino, Laboratoty Methods в Food Microbiology (3^rd edition) by W. Harrigan (Author) Academic Press, все из которых включены здесь в качестве ссылки.

Подписи к чертежам

Фигура 1

Образование ацетата, пропионата и бутирата после 48 часов ферментации in vitro TOS, инулина, смеси TOS/инулин 9/1 и смеси олигофруктозы и инулина 1/1 свежими фекалиями, полученными от младенцев.

Фигура 2

Относительные количества ацетата, пропионата и бутирата после 48 часов ферментации in vitro TOS, инулина, смеси TOS/инулин 9/1 и смеси олигофруктозы и инулина 1/1 свежими фекалиями, полученными от младенцев. Сумма образованных ацетата плюс пропионата плюс бутирата была взята за 100% для каждого из тестированных волокон (балластных веществ).

Фигура 3

Газообразование после 48 часов ферментации in vitro TOS, инулина, смеси TOS/инулин 9/1 и смеси олигофруктозы и инулина 1/1 свежими фекалиями, полученными от младенцев. Количество образованного газа (мл) относили к количеству общих образованных SCFA (в ммоль на г волокна).

Фигура 4

Действия смесей SCFA (ацетат/пропионат/бутират в соотношении 90/5/5 на молярной основе) и L-лактата.

Фигура 4А: Действие 0, 0,1, 0,5, 1 и 4 мМ смеси SCFA или L-лактата на экспрессию muc-2 в сокультуре CCD18/T84 (n=6). Стержни ошибок показывают SEM. Увеличение при 1 мМ и 4 мМ смеси SCFA и 0,5, 1 и 4 мМ L-лактата является статистически значимым.

Фигура 4В: Действие 0, 50, 100, 250 и 500 мкМ смеси SCFA или L-лактата на спонтанную реакцию PGE1 и PGE2 в клетках CCD18 (n=7). Стержни ошибок показывают SEM. Увеличение простагландина Е1 (PGE1) при 100, 250 и 500 мкМ SCFA и 100 мкМ L-лактата является статистически значимым. Увеличение простагландина Е2 (PGE2) при 100, 250 и 500 мкМ SCFA и 100 мкМ L-лактата является статистически значимым (Р<0,05).

Фигура 5

Действия ацетата натрия и L-лактата натрия на самопроизвольное сокращение в дистальной и проксимальной части ободочной кишки. Слепой опыт (установка на напряжение 1 г) равен 0%. Напряжение после добавления 40 мМ KCl было установлено на 100%.

Примеры

Пример 1

Исследования ферментации in vitro показывают синергетические действия на распределение ферментации

1.1 Материалы и способы

Микроорганизмы

Микроорганизмы получали из свежих фекалий от искусственно вскармливаемых младенцев. Материал свежих фекалий от младенцев в возрасте 1-4 месяца объединяли и помещали в консервирующую среду в пределах 2 часов.

Композиции/субстрат

В качестве субстрата использовали либо смесь пребиотиков (TOS; TOS (из VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, The Netherlands)) и инулина (RaftilinHP из Orafti, Belgium) в соотношении 9/1 (масса/масса); инулин; смесь олигофруктозы и инулина в соотношении 1:1 (масса/масса), либо ничего (слепой опыт).

Среды

Среда McBain & MacFarlane: Забуференная пептонная вода 3,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,5 г/л, муцин (щеточная каемка) 0,8 г/л, триптон 3,0 г/л, L-цистеин-HCl 0,4 г/л, соли желчных кислот 0,05 г/л, К ₂НРО₄·3Н₂О 2,6 г/л, NaHCO ₃ 0,2 г/л, NaCl 4,5 г/л, MgSO₄·7Н₂ О 0,5 г/л, CaCl₂ 0,228 г/л, FeSO₄·7Н ₂О 0,005 г/л. Склянки Скотта на 500 мл заполняли этой средой и стерилизовали в течение 15 минут при 121°С.

Забуференная среда: К₂НРО₄·3Н ₂О 2,6 г/л, NaHCO₃ 0,2 г/л, NaCl 4,5 г/л, MgSO ₄·7Н₂О 0,5 г/л, CaCl₂ 0,228 г/л, FeSO₄·7Н₂О 0,005 г/л. pH доводили до 6,3±0,1 К₂НРО₄ или NaHCO₃ . Склянки Скотта на 500 мл заполняли этой средой и стерилизовали в течение 15 минут при 121°С.

Консервирующая среда: Забуференный пептон 20,0 г/л, L-цистеин-HCl 0,5 г/л, тиогликолат натрия 0,5 г/л, таблетка резазурина 1 на литр. pH доводили до 6,7±0,1 1 М NaOH или HCl. Эту среду кипятили в микроволновой печи. Склянки на 30 мл заполняли 25 мл среды и стерилизовали в течение 15 минут при 121°С.

Свежие фекалии смешивали с консервирующей средой. Свежие фекалии могут сохраняться в этой форме в течение нескольких часов при 4°С.

Фекальная суспензия: Консервированный раствор фекалий центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант удаляли и фекалии смешивали со средой McBain & MacFarlane в массовом отношении 1:5.

Ферментация

3,0 мл фекальной суспензии объединяли с 85 мг глюкозы или пребиотика или использовали без добавления (слепой опыт) в склянке и тщательно перемешивали. Брали пробу t=0 (0,5 мл). 2,5 мл полученной суспензии вносили в диализную трубку в склянке на 60 мл, заполненной 60 мл забуференной среды. Склянку хорошо закрывали и инкубировали при 37°С. Брали пробы из диализной трубки (0,2 мл) или из буфера для диализа (1,0 мл) шприцом для подкожных инъекций спустя 3, 24 и 48 часов и немедленно помещали на лед для остановки ферментации.

Определение жирных кислот с короткой цепью и лактата

См. Пример 2. Величины корректировали в отношении слепого опыта.

Определение газа

При t=3 и t=48 давление газа в верхнем пространстве склянки на 60 мл измеряли газовым манометром (Druckmessumformer, Econtronic, Germany) прокалыванием с использованием шприца для подкожных инъекций на 6 мл резиновой крышки и набиранием газа из головного пространства этим шприцом, пока давление газа не становилось равным 0. Объем в этом шприце был объемом образованного газа. Величины корректировали в отношении слепого опыта.

1.2. Результаты

Ферментацию in vitro проводили с использованием следующих проб:

1) 85 мг TOS (из VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, The Netherlands)

2) 85 мг инулина (RaftilinHP из Orafti, Belgium)

3) 85 мг смеси TOS/инулин с соотношением TOS/инулин 9/1 (масса/масса) и

4) 85 мг OF (raftiloseP95, из Orafti, Belgium)/инулин (raftilinHP) в соотношении OS/инулин 1/1 (масса/масса).

Общее количество образованных SCFA

Результаты показаны на фигуре 1. Фигура 1 показывает, что смесь TOS/инулин приводила к существенно более высокому количеству SCFA на г волокна, чем отдельные компоненты, но были также более высокому, чем смесь олигофруктозы (OF) и инулина. Испытывали также 85 мг смеси TOS/инулин в соотношении 1/1 (данные не показаны), которые также обеспечивали синергетическое действие.

Образование L- и D-лактата

L- и D-лактат удалось определить только при t=3. Таблица 1 показывает метаболические конечные продукты, образованные в этой временной точке.

Таблица 1 Метаболические конечные продукты (ммоль/г волокна), образованные после 3 часов ферментации in vitro
	Ацетат	Пропионат	Бутират	L-лактат	D-лактат
TOS	0,23	0	0	0,14	0,03
Инулин	0	0	0	0,00	0,00
TOS/инулин	0,40	0	0	0,17	0,04
OF/инулин	0,30	0	0	0,04	0,02

Опять наблюдали синергетическое более высокое образование лактата для смеси TOS/инулин в сравнении в отдельными компонентами TOS и инулином. В сравнении со смесью OF и инулина процент лактата (в расчете на общие кислоты) и отношение L-/D-лактата является более высоким в смеси TOS/инулин.

Относительные количества SCFA

Фигура 2 показывает распределение продуктов ферментации после 48 часов. Смесь TOS/инулин показывает существенно более высокий процент ацетата, чем отдельные компоненты, который является также более высоким, чем для смеси олигофруктозы (OF) и инулина. Фекалии вскармливаемых грудью младенцев показывают высокий процент ацетата, так что смесь TOS/инулин приводит к распределению продуктов ферментации, которое наиболее сходно с распределением вскармливаемых грудью младенцев.

Газообразование

Результаты показаны на фигуре 3. Что касается газообразования, TOS и смесь TOS/инулин образуют самое низкое количество газа на ммоль образованных SCFA. Инулин и смесь OF/инулин обнаруживают гораздо более высокое количество образованного газа. В расчете на ммоль SCFA это количество газа является самым низким в смеси TOS/инулин.

Кинетика образования SCFA

Таблица 2 показывает кинетику образования SCFA. Комбинация TOS/инулин все еще показывает высокое образование SCFA между 24 и 48 часами, что свидетельствует о том, что в дистальной части ободочной кишки все еще образуются SCFA и оказывают благоприятное действие на проницаемость ободочной кишки, образование слизи и противопатогенные эффекты. В первые 3 часа также образуется наивысшее количество SCFA, как и в случае с олигосахаридами молока человека (данные не показаны). Быстрая ферментация в начале ободочной кишки является важной вследствие противопатогенных эффектов.

Таблица 2 Кинетика образования SCFA (ммоль), SCFA (с поправкой на слепой опыт)
	Временной интервал (часы)
Пребиотики	0-3 ч	3-24 ч	24-48 ч
TOS	0,23	3,85	0,13
TOS/инулин НР	0,40	4,49	0,24
Инулин НР	0,00	3,05	0,05
OF/инулин НР	0,11	4,26	0,00
OF=олигофруктоза

Пример 2

Клиническое исследование со смесью TOS/инулин: Относительное увеличение ацетата и относительное уменьшение бутирата не коррелирует с увеличением бифидобактерий. TOS и инулин имеют синергетическое действие.

2.1 Материалы и способы

63 беременных женщин, которые решили вскармливать грудью, и 57 беременных женщин, которые решили не вскармливать грудью, были внесены в исследование во время их последнего триместра беременности. Младенцы с нормальной массой при рождении, без врожденной патологии, врожденного заболевания или желудочно-кишечного заболевания были внесены в списки в пределах 3 дней после родов. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Медицинского Центра, St. Radboud, Nijmegen, The Netherlands. Письменное информированное согласие было получено от родителей перед внесением в списки в данном исследовании.

Младенцев матерей, которые решили не вскармливать грудью, случайным и двойным слепым образом распределяли в одну из групп питания (OSF, SF). Группа со стандартным питанием (SF; n=19) получала обычную, недополненную смесь для новорожденных (Nutrition I, Nutricia, The Netherlands). Основные данные по составу этой стандартной смеси при стандартном разведении 131 г/л представлены в таблице 3. Группа с содержащей пребиотик смесью (OSF; n=19) получала ту же самую смесь для новорожденных, дополненную смесью 6 г/л транс-галактоолигосахаридов (TOS; Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, The Netherlands) и инулина (PF; RaftilinHP, Orafti active food ingredient, Tienen, Belgium). Эта смесь содержала 90% TOS и 10% инулина (полифруктозы). Смеси исследования скармливали ad libitum во время периода исследования. Консультант по лактации поощрял и поддерживал матерей, которые решили вскармливать новорожденных грудью, во время хода исследования. При завершении кормления грудью их младенцы получали одну из двух смесей. Соблюдение режима и схемы оценивали подсчетом неиспользованных баночек со смесью во время каждого визита и сравнением количества потребленной смеси с регистрируемым потреблением питания.

Таблица 3 Состав стандартной смеси на литр
Энергия	ккал	670
Белок	г	14
Отношение казеин/ сыворотка (молочная)		40/60
Жир	г	35
Общие углеводы	г	75
Лактоза	г	75
Минеральные соединения
Кальций	мг	540
Фосфор	мг	270
Магний	мг	50
Натрий	мг	190
Калий	мг	680
Хлорид	мг	430
Железо	мг	5
Цинк	мг	5

Опросники

Демографические, клинические и антропометрические данные матерей собирали перед родами. Информацию о родах получали у матерей в день 5 после родов. Информацию о потреблении питания, переносимости смеси, характеристиках стула, здоровье и антропометрических данных получали из опросников в послеродовой день 5, 10, 28 и один раз каждые 4 недели после этого до конца этого исследования.

Фекальные пробы

Родителей просили брать фекальные пробы у их младенцев в послеродовые дни 5, 10, 28 и один раз каждые 4 недели после этого. Пробы брались из пеленки, как можно быстрее после дефекации, собирались в контейнеры для фекалий (Greiner Labortechnik, the Netherlands) и хранились немедленно при -20^оС родителем и транспортировались в портативном морозильнике в лабораторию исследователями.

Приготовление фекальных проб

Для определения SCFA 1 грамм этих проб оттаивали в ледяной воде, разводили 10× в MilliQ, и гомогенизировали в течение 10 минут с использованием Stomacher (IUL Instruments, Barcelona, Spain). 350 мкл гомогенизированных фекалий смешивали с 200 мкл 5% (об./об.) муравьиной кислоты, 100 мкл 1,25 г/л 2-этилмасляной кислоты (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands) и 350 мкл MilliQ. Эти пробы центрифугировали в течение 5 минут при 14000 об/мин для удаления больших частиц и супернатант хранили при -20^оС. Для анализа FISH (гибридизации in situ с флуоресценцией) и измерений молочной кислоты пробы оттаивали в ледяной воде, разбавляли 10х (масса/объем) в забуференном фосфатом солевом растворе, рН 7,4 (ЗФР) и гомогенизировали в течение 10 минут с использованием stomacher. Гомогенизированные фекалии хранили при -20^оС.

Гибридизация in situ с флуоресценцией

Анализ FISH выполняли, как описано (Langendijk et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:3069-3075) с некоторыми небольшими модификациями. Фиксированные параформальдегидом пробы наносили на покрытые желатином стеклянные предметные стекла (покрытые PTEE 8-луночные [1 см²/лунка] предметные стекла, CBN labsuppliers, Drachten, The Netherlands) и сушили на воздухе. Высушенные пробы дегидратировали в 95% этаноле в течение 10 минут. Буфер для гибридизации (20 мМ Трис-HCl, 0,9 М NaCl, 0,1% ДСН [рН 7,1]) с 10 нг/л Cy3-меченого Bifidobacterium-специфического зонда Bif 164 mod (5'-CAT CCG GYA TTA CCA CCC) предварительно нагревали и добавляли к высушенным пробам. Bif 164 mod является модифицированной версией зонда S-G-Bif-a-0164-a-A-18 ((Langendijk et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:3069-3075). Эти предметные стекла инкубировали в течение ночи в темной увлажненной камере при 50^оС. После гибридизации эти предметные стекла промывали в течение 30 минут в 50 мл предварительно нагретого промывочного буфера (20 мМ Трис-HCl, 0,9 С NaCl [рН 7,2] и быстро промывали в MilliQ. Для окрашивания всех бактерий эти пробы инкубировали с 0,25 нг/л 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в ЗФР в течение 5 минут при комнатной температуре. После окрашивания DAPI предметные стекла промывали кратковременно в MilliQ, сушили, монтировали препараты с Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, U.S.A.) и накрывали покровным стеклом. Эти предметные стекла анализировали автоматически с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Olympus AX70 с программным обеспечением для автоматического анализа изображения (Analysis 3.2, Soft Imaging Systems GmbH, Munster, Germany). Процент бифидобактерий на пробу определяли анализом 25 случайно выбранных положений. В каждом положении процент бифидобактерий определяли счетом всех клеток с набором фильтров DAPI (SP 100, Chroma Technology Corp., Brattleboro, U.S.A.) и счетом всех бифидобактерий с использованием набора фильтров Cy3 (41007, Chroma Technology, Brattleboro, U.S.A.).

Анализ жирных кислот с короткой цепью

Жирные кислоты с короткой цепью (SCFA), уксусную, пропионовую, н-масляную, изомасляную и н-валериановую кислоты количественно определяли с использованием газового хроматографа (GC) Varian 3800 (Varian Inc., Walnut Creek, U.S.A.), оборудованного детектором пламенной ионизации. 0,5 мкл пробы инжектировали при 80^оС в эту колонку (Stabilwax, 15х0,53 мм, толщина пленки 1,00 мкм, Restek Co., U.S.A.) с использованием гелия в качестве газа-носителя (3,0 фунтов на квадратный дюйм). После инжекции пробы печь нагревали при скорости 20°С/мин и, наконец, поддерживали при температуре 220°С в течение 1,5 минут. Температура инжектора и детектора была 200°С. В качестве внутреннего стандарта использовали 2-этилмасляную кислоту.

Анализ лактата

Гомогенизированные фекалии оттаивали на льду и центрифугировали в течение 5 минут при 14000 об/мин. 100 мкл супернатанта нагревали в течение 10 минут при 100°С для инактивации всех ферментов. Лактат определяли ферментативно с использованием набора для детектирования L-молочной кислоты с D-и L-лактатдегидрогеназой (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). Лактат определяли только в тех фекальных пробах, которые были достаточно большими.

Анализ рН

После хранения при -20^оС пробы оттаивали и рН измеряли непосредственно в фекалиях при комнатной температуре с использованием рН-метра Handylab (Scott Glas, Mainz, Germany), оборудованного рН-электродом Inlab 423 (Mettler-Toledo, Columbo, U.S.A.).

Анализ результатов

Перед исследованием квалифицированные расчеты показали, что для детектирования различия в проценте бифидобактерий между группой со смесью по изобретению и группой со стандартной смесью, 30% с SD 25%, т.е. 13 младенцев на группу, должны быть исключены из исследования. Вследствие ожидаемого исключения 30% в группах со смесями, в это исследование были включены большие количества младенцев, чем рассчитанные количества. Для статистического анализа этих результатов использовали статистический пакет SPSS (версия 11/0). Все величины проверяли на нормальность визуальным обследованием графиков нормальной вероятности. Различия в проценте бифидобактерий, рН, относительных количествах SCFA и лактата между этими группами испытывали на значимость с использованием дисперсионного анализа. В случае значимого различия (р<0,05) группы сравнивали с использованием post hoc критерия Бонферрони. Поскольку невозможно двойное слепое соотнесение грудного и искусственного вскармливания и гарантирование адекватной рандомизации, статистический анализ не выполняли для сравнения вскармливания грудью с какой-либо из групп кормления смесями. Данные из вскармливаемой грудью группы приводятся только в том случае, когда младенец получал только грудное молоко в данной временной точке.

2.2 Результаты

В целом, 120 младенцев на группу были включены в исследование. 57 младенцев начинали получать кормление смесью сразу же после рождения и были поровну разделены между группами, вскармливаемыми смесями. Из 63 младенцев, которые получали грудное молоко сразу же после рождения, 24 переводили на вскармливание смесью перед возрастом 16 недель и 5 младенцев были выведены из исследования. Характеристики субъектов исследования показаны в таблице 4. В группах со смесями, 9 младенцев были выведены из исследования в пределах первых 16 недель после рождения (4 в группе SF, 5 в группе OSF). Причины выведения включали в себя: колики, подозрение на аллергию на коровье молоко, констипация (запор) и практические проблемы.

Таблица 4 Характеристики объектов исследования
		Стандартная смесь, SF N=19	Пребиотическая смесь, OSF N=19	Грудное молоко, BF N=63
Пол	Мужской	5	12	33
Женский	14	7	30
Место рождения	Дома	7	8	40
больница	12	11	23
Способ родов	Вагинальный	14	16	59
	Кесарево сечение	5	3	4
Масса при рождении		3600±501	3318±602	3651±601

Фекальные бифидобактерии

Процент бифидобактерий в фекалиях в возрасте 5 дней, 10 дней, 4, 8, 12 и 16 недель этих групп вскармливания показан в таблице 5 и величинах в таблице 5. Группа OSF имеет тенденцию к наличию более высокого % бифидобактерий, чем группа SF, на основании общего количества бактерий при всех возрастах, но эти различия не были статистически значимыми. Неожиданно, процент бифидобактерий у вскармливаемых грудью младенцев был также относительно низким и соответствовал группам, вскармливаемым смесями.

Предварительные данные также показывают увеличение лактобацилл в группах BF и OSF, но количества лактобацилл в фекальной флоре являются по меньшей мере на один порядок величин более низкими, чем количества бифидобактерий, и общая картина изменяется очень мало.

рН-результаты

Величины рН, измеренные в фекалиях вскармливаемых смесями младенцев, показаны в таблице 6. Самый низкий рН был обнаружен у младенцев, вскармливаемых грудным молоком. Фекальные рН фекалий младенцев, вскармливаемых смесью OSF, были более низкими, чем в группе SF (p<0,045 при всех возрастах, за исключением дня 5).

Результаты SCFA

Общее количество SCFA в этих фекалиях показано в таблице 5 ниже.

Проценты различных SCFA от общих SCFA показаны в таблице 6. Статистически значимые различия не были обнаружены в общей концентрации SCFA между группами, вскармливаемыми смесями. Количество SCFA также сравнимо с количествами других групп вскармливания. Однако, уже после 10 дней, можно видеть различия в профилях SCFA между младенцами, вскармливаемыми OSF или грудным молоком, относительно профилей SCFA младенцев, вскармливаемых стандартной смесью. Младенцы, вскармливаемые смесью, содержащей GOS и полифруктозу, и младенцы, вскармливаемые грудным молоком, имеют более высокие проценты ацетата и более низкие проценты пропионата, бутирата, iC4-6-SCFA, в сравнении с младенцами, вскармливаемыми стандартной смесью.

Результаты, относящиеся к лактату

Концентрации лактата (ммоль/кг фекалий) всех групп показаны в таблице 5. Уже с 5-дневного возраста, группа со смесью OS (не знач.) и группы с грудным молоком имели более высокие количества лактата в сравнении с группой со стандартной смесью. Относительное количество лактата (в виде процента суммы SCFA и лактата) является наивысшим у младенцев, вскармливаемых грудным молоком, и самым низким у младенцев, вскармливаемых стандартной смесью. Младенцы, вскармливаемые смесью, содержащей TOS/инулин, имеют промежуточное относительное количество лактата. Процент лактата у вскармливаемых OSF младенцев при 16 неделях (относительно общих кислот) значимо отличается от процента младенцев с SF.

Таблица 5 Концентрация лактата и общих SCFA (ммоль/кг фекалий) и бифидобактерий (*1,1013/кг фекалий) и pH между рождением и 16-недельным возрастом. Среднее ±SEM. За исключением pH, не были обнаружены статистически значимые различия
		Лактат	SCFA	pH	Бифидобактерия
5 дней	SF	13,5±7,7	54,7±12,6	5,93±0,15	0,58±0,49
	OSJ	10,7±4,3	56,5±7,7	5,49±0,15	1,20±2,24
	BF	13,3±2,8	48,7±4,4	5,27±0,07	0,47±0,39
10 дней	SF	4,6±3,0	62,0±7,9	6,88±0,15	0,96±0,83
	OSF	9,7±3,6	62,3±7,2	5,95±0,20	1,10±0,99
	BF	15,1±3,2	54,7±4,9	5,35±0,07	0,48±0,61
4 недели	SF	2,6±1,4	68,3±10,3	6,77±0,21	0,97±0,96
	OSF	9,9±3,4	83,1±8,8	5,88±0,18*	1,20±0,55
	BF	22,8±4,4	59,8±4,8	5,45±0,12	0,56±0,64
8 недель	SF	7,6±6,8	76,5±13,2	6,80±0,20	0,89±0,56
	OSF	24,4±5,3	76,0±8,4	5,68±0,18*	1,00±0,52
	BF	30,9±5,3	62,8±5,4	5,27±0,15	0,58±0,59
12 недель	SF	14,1±9,4	73,9±11,9	6,88±0,20	0,91±0,80
	OSF	18,4±7,0	76,1±12,1	5,60±0,18*	1,30±0,99
	BF	42,1±7,1	60,4±4,9	5,29±0,17	1,40+1,38
16 недель	SF	1,7±1,2	68,6±14,0	7,09±0,15	1,00±0,80
	OSF	18,5±5,7	67,7±11,7	5,60±0,20*	1,30±0,76
	BF	45,1±9,0	59,2±6,9	5,68±0,24	0,89±0,78

Р<0,05 в сравнении с SF; SF=вскармливаемые стандартной смесью, OSF=SF, дополненная GOS+инулином; BF=вскармливаемые грудью.

Вышеописанные результаты демонстрируют, что в фекалиях младенцев, вскармливаемых комбинацией GOS и полифруктозы, рН является пониженным, что образуется больше лактата и что образуется распределение кислот (ацетата и лактата), которое более сходно с распределением у вскармливаемых грудью младенцев, и что этот эффект не может быть приписан количественному увеличению бифидобактерий.

Пример 3 - Благоприятные действия лактата и смеси SCFA на экспрессию Muc-2, PGE1 и PGE2

3.1 Материал и способы

Действие лактата и смеси SCFA анализировали, как описано в Willemsen, LEM, Koetsier MA, van Deventer SJH, van Tol EAF (2003), Gut 52:1442-1447, со следующими модификациями: испытывали лактат и смесь ацетат/пропионат/бутират 90/5/5. Для экспериментов по продуцированию слизи использовали сокультуру клеток CCD18 и Т84, в то время как для экспериментов по продуцированию PGE1 и PGE2 использовали монокультуру клеток CCD18.

3.2 Результаты

SCFA, в смеси 90/5/5 (ацетат/пропионат/бутират), и L-лактат индуцируют зависимым от дозы образом экспрессию MUC-2 в сокультуре клеток CCD18 и Т84, как можно видеть на фигуре 4А. В клетках CCD18 увеличивается также концентрация простагландина Е1 (PGE1) и простагландина Е2 (PGE2), как можно видеть на фигуре 4В. При более высоких концентрациях добавленных органических кислот эти увеличения достигают статистической значимости.

Пример 4: Действие лактата на сокращение ободочной кишки

4.1 Материал и способы

Самцов крыс Wistar (CKP/Harlan, Wageningen/Horst, Netherlands) содержали в условиях контролируемой температуры и контролируемого светового цикла и обеспечивали свободным доступом к кормовым гранулам и воде. Животных анестезировали смесью N₂O, О₂ и изофлурана, брюшную полость открывали и сразу же извлекали ободочную кишку. Эту ткань помещали в буфер Кребса-Гензелайта рН 7,4 (состав в мМ: 118,0 NaCl, 4,75 KCl, 1,18 MgSO₄, 2,5 CaCl₂, 10 глюкозы, 1,17 К₂НРО₄ и 24,9 NaHCO₃).

Ободочную кишку разрезали на дистальную и проксимальную части и промывали буфером Кребса-Гензелайта при осторожном выдавливании фекального содержимого. Для как можно большего приближения к условиям in vivo 1 см полностью интактных сегментов присоединяли продольно к изометрическому динамометрическому преобразователю (F30 type 372, HSE, Germany) в банях на 20 мл с водяной рубашкой (37^оС) для органов (Schuler, HSE, Germany), содержащих буфер Кребса-Гензелайта, наполняемый непрерывно газом (95% О ₂-5% СО₂). Эти сегменты постепенно растягивали до напряжения покоя 1 г и давали уравновешиваться в течение 45 минут с перемежающимися промываниями. Напряжения этих сегментов в покое и в ответ на различные стимулы усиливали модулем-усилителем преобразователя (HSE, Germany) и регистрировали многоперьевым самописцем (Rikadenki, HSE, Germany).

Эти сегменты инкубировали с 40 мМ CaCl₂ в течение 5 минут и измеряли сократительные реакции. CaCl₂ вымывали тремя последовательными промываниями с интервалами 5 минут. Затем эти сегменты инкубировали с увеличивающимися концентрациями до 100 мМ ацетата или L-лактата натрия. Растворы кислот были свежеприготовленными в дистиллированной воде. К ацетату добавляли NaOH для получения нейтрального рН. В конце инкубации с жирной кислотой добавляли 40 мМ KCl для определения, влияла ли эта жирная кислота на сократительную реакцию на KCl. Перед новой инкубацией, этим сегментам давали уравновешиваться в течение 45 минут в свежем буфере Кребса-Гензелайта с перемежающимися промываниями.

Экспериментальный протокол использовал два проксимальных и два дистальных отрезка ободочной кишки. Для анализа результатов (n=3), уровень сокращения, индуцируемого этими стимулами, определяли как напряжение в г после 5 минут инкубации. Результаты, полученные из идентичных сегментов (проксимальных или дистальных), использовали для расчета средней величины, и каждый сегмент служил в качестве его собственной контрольной пробы.

4.2 Результаты

Как можно видеть из фигуры 5, ацетат натрия и особенно L-лактат натрия уменьшают напряжение тонических сокращений. Эффекты релаксации являются более высокими в дистальной части ободочной кишки, чем в проксимальной части ободочной кишки.

Ряд спонтанных сокращений, фазовые сокращения также уменьшаются в проксимальной части ободочной кишки после добавления ацетата натрия и L-лактата натрия, тогда как в дистальной части ободочной кишки не наблюдали этих эффектов.

Однако в проксимальной части ободочной кишки тонические сокращения в ответ на KCl являются сравнимыми в присутствии или в отсутствие 25 мМ ацетата натрия или L-лактата натрия. При более высоких концентрациях наблюдается существенная релаксация даже после добавления KCl.