композиция для предотвращения и лечения простудных заболеваний

Формула изобретения

1. Применение ладанника (Cistus) для получения композиции для профилактики и/или лечения общих простудных заболеваний, при этом указанное общее простудное заболевание включает первичную инфекцию, вызванную риновирусами, а указанная композиция представляет собой сухой или полутвердый экстракт.

2. Применение по п.1 для лечения насморка.

3. Применение по меньшей мере по одному из пп.1 или 2, где указанное растение выбирают из Cisfus incanus.

4. Применение по меньшей мере по одному из пп.1-3, где применяют надземные части растения.

5. Применение по меньшей мере по одному из пп.1-4, где указанную композицию вводят пероральным или местным способом.

6. Применение по меньшей мере по, одному из пп.1-5, где указанная композиция представляет собой препарат для назального применения или смесь для ингаляции.

7. Применение по меньшей мере походному из пп.1-5, где указанная композиция представляет собой аэрозоль или комнатный спрей.

8. Применение по меньшей мере по одному из пп.1-5, где указанная композиция находится в виде таблетки, таблетки с оболочкой, шипучей таблетки, капсулы, порошка, гранулы или таблетки с покрытием на основе сахара.

9. Применение по меньшей мере по одному из пп.1-5, где указанная композиция находится в виде мази, геля или крема.

10. Применение по меньшей мере по одному из пп.1-5, где указанное общее простудное заболевание включает первичную инфекцию, вызванную риновирусами, и вторичную бактериальную инфекцию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к применению ладанника (Cistus) для получения композиции или препарата, предназначенного для профилактики и/или лечения общих простудных заболеваний (вирусных простудных заболеваний).

Наиболее распространенные общие простудные заболевания включают заболевания дыхательных путей, такие как насморк и воспаление миндалин и глотки, а также кашель и бронхит. Как правило, одно из этих заболеваний влечет за собой остальные, хотя распространение простудного заболевания может и не пойти дальше области носоглотки или бронхов. Общие простудные заболевания такого рода также называют "вирусными простудными заболеваниями". Их не следует путать с гриппом, вызываемым вирусами гриппа, для которого характерно значительно более длительное и серьезное течение заболевания, как правило, сопровождаемое высокой температурой.

Указанные общие простудные заболевания также вызываются вирусами. Поскольку существует, например, более сотни различных видов вирусов, которые могут вызывать насморк, возможность разработки вакцины против насморка представляется маловероятной. Поэтому, как правило, лечение насморка или простуды направлено на облегчение симптомов заболевания. Для этого обычно применяют испытанные домашние средства. Например, при сильно заложенном носе может помочь ингаляция горячим паром. Она позволяет уменьшить отек слизистой оболочки носа и способствует удалению слизи. Может также помочь, например, добавление в горячую воду нескольких капель масла чайного дерева или масла ромашки. Также известно, что обычное промывание носа солевым раствором может уменьшить предрасположенность к насморку.

Помимо домашних средств сужению сосудов опухшей слизистой оболочки носа, приводящему к уменьшению отека слизистой оболочки, могут способствовать медицинские препараты. Однако носовые капли для уменьшения отека слизистой оболочки носа не следует применять более двух или трех дней подряд. При этом существует вероятность того, что после прекращения приема капель отек слизистой оболочки носа увеличится еще больше и разовьется "отек с возобновлением симптомов" (медикаментозный ринит).

В отличие от химических синтетических назальных спреев, растительные лекарственные препараты имеют мало побочных эффектов. Даже при применении в течение более длительного периода времени они не повреждают слизистую оболочку носа и не приводят к медикаментозному риниту. Чем раньше начинают применение растительных лекарственных препаратов, тем более эффективными они являются. Лекарственные препараты растительного происхождения можно применять уже при первых признаках простуды. Они также препятствуют распространению инфекции.

Например, для лечения общих простудных заболеваний часто применяют препараты эхинацеи, при этом на рынке существует большое количество различных фитохимических композиций. Однако контролируемые исследования эффективности этих фитотерапевтических средств проводятся не всегда, при этом получаемые результаты являются противоречивыми. При этом недавно проведенное исследование показало, что эхинацея не обладает предполагаемой эффективностью. Указанное исследование включало оценку трех препаратов эхинацеи с различными фитохимическими профилями, при этом указанные препараты были получены путем экстракции корней E.-angustifolia диоксидом углерода, 60% этанолом или 20% этанолом. В исследовании принимали участие 437 добровольцев с риновирусными инфекциями, получавшие исследуемый лекарственный препарат либо в качестве профилактического средства в течение семи дней до инфицирования, либо с целью лечения в период указанного инфекционного воздействия. В исследовании участвовала контрольная группа, которая получала плацебо. В результате исследования не было выявлено существенного различия между указанными тремя экстрактами эхинацеи и плацебо по их воздействию на количество зараженных, степень тяжести симптомов, объем секретируемых назальных выделений, содержание лейкоцитов, концентрацию интерлейкина-8 в воде после промывания носа или значения титра вирусов (Deutsches Arzteblatt 102, Issue 48 from 2 December 2005, page A-3341 / B-2822 / C-2640 and the New England Journal of Medicine, 2005, 353, 341-348).

Еще один лекарственный препарат растительного происхождения представляет собой экстракт корней Petargonium reniforme или sidoides (пеларгонии почковидной), имеющийся в продаже под названием Umckaloabo®. Umckaloabo® традиционно применяют не только для лечения заболеваний дыхательных путей, но также для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта. Как полагают в настоящее время, ингредиентами, определяющими эффективность данного лекарственного препарата, являются некоторые антибактериальные и иммуномодулирующие компоненты, такие как кумарины и танины. Предполагается, что указанный экстракт обладает антибактериальным, противовирусным и секретолитическим действиями, при этом препарат не следует принимать беременным или кормящим женщинам, или пациентами с заболеваниями печени или почек или повышенной склонностью к кровотечениям, поскольку пока не имеется достаточного количества экспериментальных данных в этой области. Кроме того, Umckaloabo® является достаточно дорогостоящим препаратом по сравнению с другими фитофармацевтическими препаратами.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении противовирусной композиции для профилактики и/или лечения общих простудных заболеваний (вирусных простудных заболеваний), при этом указанная композиция при введении не должна вызывать побочных эффектов или вызывать лишь незначительные побочные эффекты, а ее производство должно быть экономически целесообразным.

Указанную задачу решают путем применения ладанника (Cistus) для получения композиции для профилактики и/или лечения общих простудных заболеваний (вирусных простудных заболеваний).

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлены результаты исследования жизнеспособности, полученные путем окрашивания иодидом пропидия клеток А549, которые были обработаны экстрактом ладанника (Cistus).

На фиг.2 представлены результаты исследования жизнеспособности, полученные путем окрашивания иодидом пропидия клеток MDCK, которые были обработаны экстрактом ладанника (Cistus).

На фиг.3 представлены результаты исследования апоптоза клеток А549, которые были обработаны экстрактом ладанника (Cistus).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению под общими простудными заболеваниями понимают воспалительные заболевания дыхательных путей, как правило, носа, глотки, гортани, трахеи и бронхиол. В данном случае термины "общие простудные заболевания" и "вирусные простудные заболевания" применяют в качестве синонимов. Вирусное простудное заболевание отличается от гриппа тем, что последний вызывают только вирусы гриппа.

Вирусную простуду, с другой стороны, как правило, вызывают аденовирусы, коронавирусы и/или риновирусы.

Аденовирусы (Adenoviridae) принадлежат к семейству кубических ДНК-вирусов без оболочки и имеют диаметр от 60 до 90 нм. Их геном состоит из линейных двухспиральных ДНК примерно 36 кб в длину. Различают примерно 50 иммунологически отличных видов аденовирусов, примерно 35 из которых относятся к человеческим патогенным видам, подвиду А-F. Семейство Adenoviridae подразделяют на род мастаденовирусов, которые могут инфицировать млекопитающих, и род авиаденовирусов, которые являются эндемичными для различных видов птиц. Аденовирусы характеризуются необычайной устойчивостью к химическим и физическим воздействиям и выживают при самых неблагоприятных значениях рН среды, что обеспечивает их выживание в течение сравнительно долгого времени вне организма-хозяина.

В первую очередь, аденовирусы вызывают заболевания дыхательных путей. Однако, в зависимости от конкретного серотипа, они могут вызывать также ряд других заболеваний, например гастроэнтерит, конъюнктивит, цистит, фарингит или диарею. Симптомы заболевания дыхательных путей, вызванного аденовирусами, варьируются от обычной простуды до бронхита и пневмонии. У пациентов с ослабленной иммунной системой имеется особая предрасположенность к серьезным осложнениям вследствие аденовирусных инфекций, таким как, например, синдром острой дыхательной недостаточности (acute respiratory distress syndrome, ARDS). Кроме того, предполагают, что существует корреляция между вирусным типом Ad-36 и ожирением у человека.

Коронавирусы, принадлежащие к роду Coronaviridae, как правило, вызывают у человека легкие формы заболевания верхних дыхательных путей, редко гастроэнтерит и тяжелый острый респираторный синдром (serious acute respiratory syndrome, SARS), вызываемый связанным с SARS коронавирусом SARS-CoV.

Коронавирусы относятся к семейству оболочечных плеоморфных РНК-вирусов и имеют диаметр от 70 до 160 нм. Они имеют однонитевую +РНК (позитивный геном) длиной от 20 до 30 кб. Вид Coronaviridae подразделяют на три рода: коронавирусы, артеривирусы и торовирусы, из которых только коронавирусы включают человеческие патогенные вирусы. Передача вирусов происходит посредством инфицирования воздушно-капельным путем (аэрогенно), путем инфицирования через загрязнение (фекально-перорально) или путем простого контакта (механически) с инфицированным человеком. При этом у инфицированных субъектов молодого возраста заболевание может протекать в более тяжелой форме, чем у более взрослых. Коронавирусы являются причиной возникновения от 15 до 30% простудных заболеваний у человека, сопровождаемых повышенной температурой тела, насморком, кашлем и болью в горле.

Острое или хроническое раздражение слизистой оболочки носа с симптомами в виде зуда, чиханья, назальных выделений и заложенности носа, обусловленными причинами инфекционного, аллергического или неаллергического характера, называют ринитом, катаральным ринитом, острым ринитом или, в разговорной речи, насморком. Патогенный микроорганизм, как правило, представляет собой микроорганизм вида пикорнавирусов - риновирус. Инфицирование риновирусами осуществляется посредством прямой передачи, например, через загрязненные руки, или воздушно-капельным путем.

В настоящее время известно более 115 серотипов данного вида. Риновирусы имеют однонитевую +РНК (информационную РНК) длиной от 7.2 до 8.5 кб. Они представляют собой лишенные оболочки вирусы с икосаэдрической структурой диаметром от 24 до 30 нм. Белковая оболочка толщиной от 10 до 15 нм (капсид), окружающая РНК, состоит из 60 симметрично расположенных субъединиц, которые называют протомерами. Каждый протомер состоит из четырех капсидных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Считается, что кратное число протомеров является причиной антигенной изменчивости риновирусов.

Как уже упоминалось, общие простудные заболевания вызывают аденовирусы, коронавирусы и/или риновирусы. В зависимости от вида инфицирующего вируса простуда может сопровождаться жалобами на такие симптомы, как насморк, кашель, хрипота, боль в горле, например, вызванная воспалением миндалин и глотки, боль в суставах и головная боль, озноб, повышенная температура тела и упадок сил. Согласно настоящему изобретению к общим простудным заболеваниям также относятся бронхит и очаговая пневмония.

Среди указанных общих простудных заболеваний наиболее часто в зимние месяцы встречается насморк. Насморк обусловлен инфицированием риновирусами или, менее часто, аденовирусами. Предложенную в настоящем изобретении композицию или препарат предпочтительно применяют для профилактики и/или лечения насморка.

Кроме того, общие вирусные инфекции могут сопровождаться бактериальными инфекциями, которые накладываются на уже существующую вирусную инфекцию. Инфекции такого рода называют вторичными бактериальными инфекциями или бактериальными суперинфекциями. Применение композиции согласно изобретению также относится к профилактике и/или лечению указанных вторичных бактериальных инфекций.

Согласно настоящему изобретению растение Cistus (ладанник) применяют для получения композиции для профилактики и/или лечения вирусных простудных инфекций. В семействе Cistus известны 20 видов:

С albidus L

С.chinamadensis Banares & Р.Romero

С clusii Dunal

C crispus L.

С.heterophyllus Desf.

С incanus (также называемый С creticus)

С inflatus Pourr. Ex Demoly (также называемый С.hirsutus Lam. или С psilosepalus Sweet).

С ladanifer L.

С.launfolius L.

C libanotis L.

C monspeliensis L.

С munbyi Pomel

С ochreatus Chr. Sm. ex Buch

С osbeckiifolius Webb ex Christ.

С parvifloms Lam.

C. populifolius L.

C. pouzolzii Deute

C. salviifolius L

C sintenisii Litard. (также называемый C. albanicus E.F.Warburg ex Heywood)

C symphytifolius Lam.

Предпочтительно композицию получают из растений вида С.Incanus, который включает два подвида: С incanus ssp. tauricus и С incanus ssp. undulatus. Среди этих двух видов для получения предложенной композиции особенно предпочтительно применять С incanus ssp. tauricus.

Полный состав компонентов растения Cistus до конца не известен. Однако было установлено, что Cistus имеет высокое содержание полифенолов. Среди этих полифенолов в наибольшей степени представлены флавоноиды.

Флавоноиды по существу состоят из двух ароматических колец и одного кислородсодержащего гетероциклического кольца. В зависимости от структурных различий в О-гетероциклическом кольце флавоноиды можно подразделить на следующие шесть групп: флавонолы, флаванолы, флаваноны, флавоны, антоцианины и изофлаваноиды. Некоторые из компонентов, обнаруженных в растениях Cistus, представляют собой флавонолы, такие как кверцетин и мирицетин и их гликозиды, флаван-3-олы (катехины), такие как (+)-галлокатехин и (+)-галлокатехин-3-О-галлат, а также димеры и олигомеры катехинов, проантоцианидины.

Другие компоненты представляют собой -пинен, камфен и терпеноиды, такие как лабда-7,13-диен-15-ол, 8 ,15-лабдандиол, лабдановая кислота, лаурифолиевая кислота, ацетиллаурифолиевая кислота, 8,13-эпокси-15-диметокси-энт-лабдан, 3а-гидрокси-энт-13-эпйманоилоксид (= рибенол), салмантиновая кислота (salmanti acid), салмантидиол (salmanti diol), халимиковая кислота (halimic acid), дигидрохалимиковая кислота (dihydro halimic acid), 2 -гидрокси-дигидрохалимиковая кислота (2 -hydroxy-dihydro halimic acid), цистодиоиковая кислота (cistodioic acid), цистодиол (cistodiol), энт-кауран-16,17-диол, метиловый эфир дигидроабиетиновой кислоты (dihydro-abietic-acid-methylester) кабралеон (cabraleone) и 20,25-эпокси-24-гидроксидаммаран-3-он [R.Hegnauer, Chemotaxonomie tier Pflanzen Vol.VII IS. 1989, 246-247].

Композицию, применяемую согласно настоящему изобретению, получают из надземных частей растений. Предпочтительно применяют надземные побеги растения, которые выросли в этом же году. Можно применять все компоненты надземной части растения, такие как листья, стебли или цветки. Предпочтительно применяют стебли с листьями и цветками. Части растения можно высушить или подвергнуть выжиманию непосредственно после сбора урожая, т.е. в исходном состоянии, или, при необходимости, после измельчения для получения сока путем выжимки. Согласно дополнительному варианту реализаций изобретения части растения в исходном состоянии подвергают экстракции растворителем, например мацерации или перколяции. Альтернативным образом перед экстракцией части растения можно также высушить и/или затем измельчить на мелкие куски подходящим способом, например путем их растирания или резки.

Для получения композиции согласно настоящему изобретению используют высушенные и, при необходимости, измельченные части растения, сок, полученный в результате выжимки растения, или экстракт. Согласно изобретению термин "экстракт" применяют для всех продуктов, полученных посредством экстракции растворителем, например путем мацерации или перколяции.

Предпочтительно композиция представляет собой экстракт растения Cistus (ладанника).

Как правило, проводят экстракцию подходящим растворителем. Подходящие растворители представляют собой воду, спирты, такие как метанол, этанол или изопропиловый спирт, или хлорсодержащие растворители, такие как дихлорметан, а также ацетон, ацетилацетон, этилацетат, аммиак или ледяную уксусную кислоту, а также жидкий диоксид углерода. Можно также применять смеси указанных растворителей. Предпочтительно применяют воду или смесь воды с метанолом или этанолом.

Экстракцию обычно проводят при температуре от 25°С до температуры кипения применяемого растворителя там, где это возможно. Предпочтительно экстракцию проводят при температуре от 3 до 100°С.

Кроме того, для проведения экстракции можно применять жиры, такие как свиной жир, воски, например пчелиный воск, или масла, такие как оливковое масло и миндальное масло. Предпочтительно применяют миндальное масло.

Для того чтобы достичь наибольшего возможного выхода, растительный материал можно экстрагировать несколько раз. В этом случае возможно применение различных растворителей на разных стадиях экстракции либо же за экстракцией растворителем может следовать экстракция жиром, воском или маслом, или наоборот.

С помощью экстракции получают жидкий, полутвердый или твердый неочищенный продукт, который можно применять в таком виде для получения композиции для профилактики и/или лечения общих простудных заболеваний.

Процедуру мацерации, как правило, осуществляют в течение от пяти до девяти дней, предпочтительно в течение семи дней, при комнатной температуре с использованием смеси воды и этанола, полностью заливая части растения смесью растворителей и оставляя их настаиваться в течение указанного периода времени.

Согласно изобретению перколяцию частей растения обычно осуществляют путем обработки частей растений водой при температуре от 95 до 100°С в течение от четырех до пяти часов, пропуская воду через части растения.

Неочищенный продукт, полученный путем экстракции растворителем, например посредством мацерации или перколяции, перед применением можно также концентрировать и/или высушивать и/или подвергать дальнейшей обработке. Дальнейшая обработка может, например, включать стадии очистки, известные специалистам в данной области техники, такие как центрифугирование, фильтрование и декантирование, с целью удаления суспендированного материала из экстракта.

Экстракт, полученный таким образом, далее может быть подвергнут обработке с получением сухого экстракта. Чтобы получить сухой экстракт, можно удалить растворитель из жидкого неочищенного экстракта, концентрированного экстракта или очищенного экстракта путем, например, сушки распылением, сублимационной сушки или вакуумной сушки.

Композицию из растения Cistus можно применять для профилактики и/или лечения распространенных простудных заболевании в любой из форм, описанных выше.

Предпочтительно применять композицию для профилактики и/или лечения общих простудных заболеваний, вызываемых риновирусами, аденовирусами или коронавирусами.

Таким образом, композицию согласно настоящему изобретению можно вводить в качестве лекарственного препарата.

Помимо терапевтического применения предложенная композиция также подходит для не-терапевтической профилактики и/или лечения общих простудных заболеваний.

Композицию можно применять в любых формах, известных специалистам в данной области техники, как для медицинских, так и для немедицинских целей, например, в виде таблеток, таблеток с оболочкой, шипучих таблеток, капсул, порошков, гранул или таблеток с покрытием на основе сахаров, мазей, кремов, гелей, растворов или спреев.

При применении в галеновой и других лекарственных формах композиция может содержать традиционно используемые галеновые добавки, такие как связующее для таблеток, наполнители, консерванты, вещества, дезинтегрирующие агенты, вещества, регулирующие текучесть, смягчающие вещества, увлажняющие вещества, диспергирующие вещества, эмульгаторы, растворители, вещества, замедляющие высвобождение, антиоксиданты, регуляторы плотности, вещества, улучшающие проникающую способность и/или газы-препелленты.

К композиции, применяемой согласно настоящему изобретению, можно добавить дополнительные вещества, такие как витамины и минералы.

Композицию можно, например, также добавлять к корму для животных или продуктам питания, таким как напитки. При применении в виде экстракта композицию можно также настаивать и употреблять в виде чая. Однако также возможно для приготовления чая непосредственно запивать горячей водой части растения, например листья растения Cistus. Кроме того, композиция может входить в состав пищевых добавок, прием которых в зимние месяцы может способствовать усилению защитной функции организма и, как следствие, предотвращению, например, появления насморка.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения композицию согласно настоящему изобретению можно применять в виде раствора, в частности раствора для полоскания, для профилактики и/или течения общих простудных заболеваний, в частности воспалительных заболеваний полости рта и глотки.

Композицию можно также применять в виде смеси с компонентами других растений, в этом случае указанные компоненты предпочтительно находятся в форме растительных экстрактов. Предпочтительно применяют компоненты растений или растительные экстракты со сходным действием или обеспечивающие синергетический эффект.

Концентрация композиции в подходящей для применения форме варьирует в зависимости от конкретного применения. Как правило, количество композиции находится в диапазоне от 0.5 до 1.000 мг на дозу для твердых форм. Предпочтительно количество композиции находится в пределах от 1 до 500 мг на дозу. В случае применения в жидком виде концентрация композиции может составлять от 1 мкг/мл до 100 мг/мл, предпочтительно от 25 мкг/мл до 50 мг/мл. В случае полутвердых форм содержание композиции составляет от 1 до 90% по весу, предпочтительно от 5 до 75% по весу.

Предпочтительно, композицию вводят в форме таблетки. В этом случае указанная композиция предпочтительно находится в форме экстракта. Наиболее предпочтительно композиция находится в форме сухого экстракта.

Еще более предпочтительно введение композиции в виде эмульсий, мазей, гелей или кремов для топического применения. В этом случае предпочтительно применение композиции в виде экстракта, содержащего активные вещества, извлеченные из растений с помощью экстракции жиром, воском или маслом. Еще более предпочтительно этот экстракт дополнительно перерабатывают в сухой экстракт, который затем смешивают с жиром, воском или маслом или растворяют в них.

Кроме того, предпочтительно композиция находится в форме аэрозоля или комнатного спрея. С этой целью предпочтительно применять жидкий или твердый экстракт Cistus. Помимо экстракта аэрозоль или спрей также может содержать фармацевтически безвредные вещества, носитель и вспомогательные вещества. Аэрозоль или спрей можно применять для дезинфицирования предметов или помещений, с которыми вирусы простуды вступают в контакт или потенциально могли вступить в контакт, в частности, в транспортных средствах всех видов, в которых перевозят людей, животных или продукты питания. Например, согласно настоящему изобретению в самолете перед полетом можно распылить аэрозоль или спрей с целью предотвращения распространения вирусов простуды и, таким образом, минимизации риска инфицирования людей. Аэрозоль или спрей можно также распылить в присутствии людей, например, в комнатах ожидания, поскольку он не оказывает никакого токсического действия на людей.

Кроме того, композицию можно также вводить в виде назального препарата или раствора для ингаляции. Назальные препараты можно применять в виде спрея для носа или геля для носа. Для введения можно применять различные аппликаторы и дисперсионные системы.

Применение ладанника (Cistus) согласно настоящему изобретению не ограничивается людьми, поскольку также возможно его применение на животных, особенно млекопитающих, таких как домашние животные или домашний скот.

Для иллюстрации настоящего изобретения далее приведены следующие примеры.

Экстракт ладанника (Cistus) исследовали на предмет его токсичности в отношении клеток и клеточной жизнеспособности, а также его антивирусной активности по отношению к риновирусам. Для этого экстракт растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (стерильном) при нагревании (1 ч/100°С) (исходный раствор 1 мг/мл). Дозировка при исследованиях in vitro составляла 100 мкг/мл системы.

Человеческие риновирусы 14 типа выступали в качестве вирусного изолята. Клетки HeLa (линия человеческих клеток карциномы шейки матки) выступали в качестве клеток-хозяев.

Для определения характеристик экстракта применяли следующие методики исследования.

Исследования под микроскопом

При исследованиях под микроскопом эпителиальные клетки легких А549 и эпителиальные клетки собачьих почек MDCK (Madin-Darby Canine Kidney cells) обрабатывали различными концентрациями экстракта (2, 10, 25, 50 мкг/мл) в течение различного времени (9, 24, 32, 48 ч) и затем исследовали под световым микроскопом. Для контроля результатов эксперимент повторяли дважды.

Исследование жизнеспособности

В ходе исследования жизнеспособности эпителиальные клетки легких А549 и эпителиальные клетки собачьих почек MDCK обрабатывали различными концентрациями экстракта (2, 10, 25, 50 мкг/мл) в течение различного времени (24, 48, 56, 72 ч) и затем окрашивали иодидом пропидия для установления соотношения мертвых и живых клеток с помощью проточно-цитометрических способов. Эксперименты проводили по четыре раза.

Исследование активации апоптической каспазы

Для исследования активации апоптической каспазы клетки А549 в течение 48 часов обрабатывали 25 и 50 мкг/мл экстракта. Затем клетки лизировали, клеточные белки отделяли посредством гель-электрофореза и исследовали методом вестерн-блоттинга с применением антитела antiPARP (Poly(ADP-Ribose) полимераза, субстрат каспазы) с целью апоптического расщепления указанного белка каспазами. Индикатор апоптоза стауроспорин выступал в качестве стимула для положительного контроля. Проводили две параллельные серии экспериментов.

Примеры

Получение экстракта из Cistus incanus ssp. Tauricus

Для экстракции применяли вновь выросшие наземные побеги (листья, цветы и стебли). Растительный материал высушивали при комнатной температуре на открытом воздухе в тени до остаточной влажности максимум 10%. Затем части растений разрезали на куски размером 8 мм.

Разрезанные части растения подвергали перколяции при температуре от 95 до 100°С с использованием десятикратного количества очищенной воды Ph.Eur. в течение от 4 до 5 часов. Полученный раствор концентрировали до 18-19% от первоначального объема, применяя плиточный испаритель при температуре пара от 75 до 80°С. Содержание сухого вещества составляло примерно 45%.

Применяя испаритель с мешалкой, содержание сухого вещества повышали до 50-51% путем нагревания экстракта в течение четырех часов при 110-114°С и пониженном давлении (0.6 бар). Затем экстракт кипятили при 100.3°С в течение 1 часа и получали примерно 53% сухого вещества.

Наконец, осуществляли вакуумную сушку с помощью ленточной сушилки при 16 мбар и понижающемся градиенте температур (140, 120, 90, 20°С). Содержание сухого вещества составляло от 92 до 93%. После этого экстракт подвергали размолу и получали из него описанный ранее исходный раствор.

Исследования под микроскопом

На полученных под микроскопом снимках, полученных в серии экспериментов с использованием клеток MDCK и А549, не видно значительного изменения количества клеток и морфологии клеток по сравнению с необработанными контрольными пробами при любых применяемых концентрациях экстракта и промежутках времени.

Исследование жизнеспособности

Результаты исследования жизнеспособности приведены на фиг.1 и 2, на которых показано среднее значение общего количества живых клеток для каждой из проб по результатам четырех проведенных определений. В течение всего времени наблюдения, составлявшего 72 часа, не было выявлено отрицательного влияния экстракта на выживаемость клеток MDCK или A549.

Исследование активации апоптической каспазы

Результаты исследования активации апоптической каспазы представлены на фиг.3, на которой показаны результаты вестерн-блоттинг анализа, направленного на установление активности каспазы. Хотя стауроспорин в качестве контрольного стимула (Stauro) обеспечивал эффективное расщепление поли(ADP-рибозо)полимеразы каспазой (PARP расщепляемый канал), указанная активность не наблюдалась в необработанных (ложных) или обработанных экстрактом, клетках (25 мкг/мл, 50 мкг/мл). Контрольный блот относительно белка ERK2 выступал в качестве контроля для однородной белковой нагрузки. В результате был сделан вывод о том, что лечение растительным экстрактом при применяемых концентрациях и в течение наблюдаемого периода времени не привело к активации каспазы и апоптической индукции.

Исследования морфологии, жизнеспособности и активации каспазы в клетках, обработанных экстрактом Cistus, показали, что концентрации экстракта вплоть до 50 мкг/мл не оказывали сколько-нибудь значимого токсичного воздействия на применяемые в этих экспериментах клетки-хозяева SA549 и MDCK и не вызывали увеличения некротической или апоптической гибели клеток. Кроме того, не было установлено значительного уменьшения количества клеток; таким образом, воздействие экстракта также не ограничивало рост клеток.

Исследования антивирусной активности

Культура риновирусов

Четыре колбы Т175 с 80% конфлюэнтными клетками HeLa инокулировали человеческим риновирусом типа 14 (HRV) и инкубировали при 33°С в течение одной недели. Для осуществления указанной процедуры смешивали 50 мкл HRV14 (вирусный титр 10⁸ /мл TCID (культуральная инфекцирнная доза)) в 16 мл инфицирующей среды (DMEM (Dulbecco's; Modified Eagle Medium), 2% FCS (сыворотка эмбриона теленка, 10-20 мМ MgCl₂) и добавляли по 4 мл в каждую из колб Т175. Затем в каждую из колб Т175 помещали 10 мл инфицирующей среды, таким образом, что в каждой Т175 содержалось 14 мл инфицирующей среды. Как только 70% адгезивных клеток растворялось, выделяли вирус.

Очистка риновирусов

Надосадочную жидкость, содержащую вирус, сначала центрифугировали в течение 30 минут со скоростью 3000 об/мин с целью удаления дебриса. В ультрацентрифуге надосадочную жидкость, содержащую вирус, центрифугировали при 35000 об/мин (тип ротора SW41 Ti в полиалломерных пробирках Beckman) при 4°С в течение трех часов на сахарозных подушках (1.5 мл 65% раствора сахарозы в воде, 300 мкл 10×PBS (фосфатно-солевой буферный раствор, 1.2 мл воды) и образовавшийся осадок вносили в 100 мкл инфицирующей среды. Дополнительное концентрирование вируса проводили на 100 кДа фильтре (Centricon YM100) при 3300 об/мин в течение одного часа при 4°С. Полученный ретентат содержал концентрат очищенного вируса; фильтрат отбрасывали.

Исследование антивирусной активности

(анализ культуральной инфекционной дозы (TCID))

Накануне проведения исследования клетки 5×104 HeLa высеивали в среде DMEM на 96-луночный планшет, таким образом, что на следующий день образовывалось примерно 70% конфлюэнтных клеток. Ha следующий день среду DMEM удаляли и заменяли 90 мкл инфицирующей среды (DMEM, 2% FCS, 10-20 мМ MgCl₂). Инфицирование осуществляли при самой высокой концентрации в 100 мкг/мл с помощью 10 мкл вируссодержащего раствора в первом 96-луночном ряду. После того, как указанные 100 мкл перемешивали, отбирая раствор пипеткой и выливая обратно, во второй ряд указанного 96-луночного планшета помещали по 10 мкл каждого раствора. Процедуру повторяли для других рядов (серии с разбавления 1:10). Анализ двух или трех партий проводили одновременно и применяли для оценки.

Планшет, обработанный таким способом, инкубировали в инкубаторе в течение пяти дней при 33°С. На пятый день планшет промывали по меньшей мере дважды PBS и проводили окрашивание с использованием 100 мкл/лунку кристаллического фиолетового (0.07% в чистом этаноле) в течение пяти часов. Затем планшет промывали водой, стучали по нему несколько раз (примерно 10 раз) и высушивали. Голубой цвет указывает на живые клетки. Мертвые клетки вымывались из лунок, оставляя белый фон.

Для исследования воздействия экстракта Cistus на инфективность HRV14 либо 100 мкг/мл экстракта Cistus добавляли к инфицирующей среде, либо проводили предварительную обработку вирусов 100 мкг/мл экстракта Cistus в течение одного часа.

В результате можно было видеть, что экстракт Cistus способен предотвращать инфицирование и, следовательно, разрушение клеточного слоя как в инфицирующей среде, так и после проведения предварительной инкубации вируса во всех проведенных сериях экспериментов. При применяемой концентрации экстракт Cistus не оказывал поддающегося обнаружению негативного воздействия на какие бы то ни было клетки. Это подтверждает ингибирующее действие экстрактов Cistus на инфективность риновирусов.