способ диагностики стеатоза печени по биохимическим маркерам

Формула изобретения

1. Способ in vitro диагностики стеатоза печени у пациента, включающий стадии:

a) исследование 5 биохимических маркеров путем измерения их содержания в сыворотке или плазме крови указанного пациента, где указанными маркерами являются

АроА1 (аполипопротеин А1),

альфа.2-макроглобулин,

АЛТ (аланин-аминотрансфераза),

ГГТ (гамма-глутамин транспептидаза), и

триглицериды;

b) исследование одного клинического маркера, выбранного из группы, состоящей из индекса массы тела (Масса/Рост² ), объема талии, и соотношения (объем талии/объем бедер);

c) объединение указанных показателей через логистическую (логарифмическую) функцию, включающую указанные маркеры для получения конечного результата, где указанная логистическая функция получена с помощью следующего способа:

i) классификация когорты пациентов в различных группах в соответствии со степенью их заболевания;

ii) выявление факторов, которые значительно различаются между этими группами путем одномерного анализа;

iii) анализ логистической регрессии для определения независимого дифференциального значения маркеров для диагностики стеатоза печени;

iv) составление логистической функции этих выявленных независимых факторов и

d) анализ указанного конечного результата указанной логистической функции для определения наличия стеатоза печени у указанного пациента.

2. Способ по п.1, в котором указанная логистическая функция, кроме того, учитывает возраст и пол пациента.

3. Способ по п.2, в котором указанная логистическая функция, кроме того, учитывает, по меньшей мере, один биохимический маркер, выбираемый из группы, состоящей из общего билирубина, галтоглобина, ACT (аспартат-аминотрансферазы), глюкозы, и (холестерина или ЛВП-холестерина).

4. Способ по п.3, в котором указанная логистическая функция учитывает общий билирубин, гаптоглобин, глюкозу и холестерин.

5. Способ по п.4, в котором указанной логистической функцией является

f=a1-а2. [Возраст(лет)] + а3. [АроА1(г/л)] - а4. [Индекс Массы Тела (Масса/Рост² )] + а5.log [.альфа.2-макроглобулин (г/л)] - a6.log [ALT (аланин-аминотрансфераза)(МЕ/л)] - a7.log [общий билирубин (мкмоль/л)] - а8. [холестерин (ммоль/л)] - a9.log [ГТТ (гамма-глутамин транспептидаза) (МЕ/л)] - а10. [глюкоза (ммоль/л)] - а11.log [Гаптоглобин (г/л)] - а12. [триглицериды (ммоль/л)] + а13. [Пол (женщины = 0, мужчины = 1)], с

а1, входящим в интервал [6,68805-х%; 6,68805+х%],

а2, входящим в интервал [1,55337Е-02-х%; 1,55337Е-02+х%],

а3, входящим в интервал [1,161531-х%; 1,1б1531+х%],

а4, входящим в интервал [0,11889-х%; 0,11889+х%],

а5, входящим в интервал [1,74791-х%; 1,74791+х%],

а6, входящим в интервал [0,96453-х%; 0,96453+х%],

а7, входящим в интервал [0,11958-х%; 0,11958+х%],

а8, входящим в интервал [0,68125-х%; 0,68125+х%],

а9, входящим в интервал [1,17922-х%; 1,17922+х%],

а10, входящим в интервал [1,46963-х%; 1,46963+х%],

a11, входящим в интервал [0,34512-х%; 0,34512+х%],

а12, входящим в интервал [1,1792б-х%; 1,17926+х%], и

а13, входящим в интервал [0,35052-х%; 0,35052+х%].

6. Способ по п.5, в котором указанная логистическая функция является

f=6,68805-1,55337Е-02. [Возраст (лет)] + 1,161531. [ApoA1 (г/л)] - 0,11889. [Индекс Массы Тела (Масса/Рост²)] + 1,74791.log [.альфа.2-макроглобулин (г/л)] - 0,96453.log [АЛТ (аланин-аминотрансфераза) (МЕ/л)] - 0,11958.log [общий билирубин (мкмоль/л)] - 0,68125.log [холестерин(ммоль/л)] - 1,17922.log [ГГТ (гамма-глутамин транспептидаза) (МЕ/л)] - 1,46963.log [глюкоза (ммоль/л)] - 0,34512.log [Гаптоглобин (г/л)] - 1,17926.log [триглицериды (ммоль/л)] + 0,35052. [Пол (женщины = 0, мужчины = 1)].

7. Способ по п.5 или 6, в котором стеатоз 2-4 стадии (умеренная-тяжелая) диагностируют, если конечный результат превышает 0,5 и отсутствие стеатоза или слабый стеатоз 1 стадии, если конечный результат находится ниже 0,5.

8. Способ по п.1, в котором указанный пациент страдает от заболевания, включая стеатоз.

9. Способ по п.8, в котором указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из гепатита В и С, алкоголизма, гемохроматоза, метаболического заболевания, диабетов, ожирения, аутоиммунного заболевания печени, билиарного первичного цирроза печени, дефицита альфа.1-антитрипсина, заболевания Вильсона.

10. Способ по п.1, в котором указанный пациент уже подвергался диагностическому тестированию на фиброз печени и/или наличие некровоспалительных повреждений.

11. Способ по п.10, в котором указанным диагностическим тестом являлся Фибротест/Акти-Тест.

12. Набор для диагностики стеатоза печени у пациента, включающий

a) реагенты для измерения сывороточных значений содержания 5 биохимических маркеров, где указанными маркерами являются

АроА1 (аполипопротеин А1),

альфа.2-макроглобулин,

АЛТ (аланин-аминотрансфераза),

ГТТ (гамма-глутамин транспептидаза), и

триглицериды;

b) необязательно, по меньшей мере, один реагент для измерения сывороточных значений содержания общего билирубина, гаптоглобина, ACT (аспартат-аминотрансферазы), глюкозы, или (холестерина или ЛВП-холестерина);

c) логистическая функция, которая используется для объединения указанных значений с одним клиническим маркером, выбранным из группы, состоящей из Индекса Массы Тела (Масса/Рост²), объема талии, и соотношения (объем талии/объем бедер) для определения конечного значения и

d) ROC кривую для анализа указанного конечного значения.

13. Набор по п.12, дополнительно содержащий таблицы, которые позволяют определить предиктивные значения, в зависимости от предполагаемой распространенности стеатоза печени в популяции пациентов.

14. Набор по п.12, дополнительно содержащий инструкции для количественного определения различных стадий стеатоза печени (отсутствие = 0%, легкая = 1-5%, умеренная = 6-32%, выраженная = 33-66%, и тяжелая = 67-100%) и других промежуточных стадий.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому способу диагностики для определения степени стеатоза печени у пациентов, в частности у пациентов, которые страдают от заболевания, включая стеатоз печени, или кто уже имеет положительные результаты диагностического теста на фиброз печени и/или наличие некровоспалительных повреждений печени, при использовании сывороточного содержания легко обнаруживаемых биологических маркеров. Изобретение также касается диагностических наборов для осуществления способа.

Уровень техники

Жировая инфильтрация печени, также называемая стеатоз печени, определяется как избыточное накопление жира в гепатоцитах (Bravo AA, et al. N. Engl. J. Med. 2001:344; 495-500; Angulo P.N. Engl. J. Med. 2002 Apr 18; 346(16):1221-31). Заболевание - жировая инфильтрация печени - проявляется накоплением триглицеридов в гепатоцитах, некрозом гепатоцитов, воспалением (Day СР. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2002; 16:663-78; Browning JD, Horton JD. J. Clin. Invest. 2004; 114:147-52), облитерацией малых печеночных вен и зачастую фиброзом с прогрессированием его иной раз в цирроз, печеночно-клеточный рак и летальный исход в результате развития печеночной недостаточности (El-Serag HB, et al. Gastroenterology 2004; 126:460-468, Dam-Larsen S, et al. Gut 2004; 53:750-5).

Во всем мире распространенность стеатоза печени довольно высока, что связано с различными факторами, такими как алкоголь, диабеты, избыточная масса тела, гиперлипидемия, резистентность к инсулину, гепатит С генотип 3, абеталипопротеинемия и некоторые лекарственные средства (Bellentani S, et al. Ann. Intern. Med. 2000; 132:112-7; Levitsky J, Mailliard ME. Semin. Liver Dis. 2004; 24:233-47).

Неалкогольная жировая болезнь печени (НЖБП) является адаптационной реакцией печени на резистентность к инсулину, что может приводить к развитию неалкогольного стеатогепатита (НСГ), который сам может индуцировать фиброгенную реакцию, что может приводить к развитию цирроза (Day СР. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2002; 16:663-78).

У пациентов с заболеванием печени алкогольной этиологии (Sorensen TI, et al. Lancet. 1984; 2:241-4), с хроническим гепатитом С (Fabris P, et al. J. Hepatol. 2004; 41:644-51), и возможно с гепатитом В (Phillips MJ, et al. Am. J. Pathol. 1992; 140: 1295-308), существование стеатоза печени также ассоциировано с развитием фиброза, с или без сочетанных некровоспалительных повреждений (алкогольный или вирусный гепатит).

Не существует нормативных рекомендаций для диагностики стеатоза печени. Обычная рекомендация состоит в измерении содержания ГГТ (гамма-глутамин транспептидазы) и АЛТ (аланинаминотрансферазы) и выполнении биопсии печени для определения степени и стадии распространения (Bellentani S, et al. Ann. Intern. Med. 2000; 132:112-7; Levitsky J, Mailliard ME. Semin. Liver Dis. 2004; 24:233-47; Bravo AA, et al. N. Engl. J. Med. 2001:344; 495-500). Поскольку биопсия печени все еще является инвазивной и дорогостоящей процедурой с потенциальной ошибкой выборочного исследования, то может являться выгодным наличие быстрого и нетрудного в осуществлении теста, который будет давать приемлемое предсказание значения степени стеатоза печени у пациента.

Для диагностики фиброза утвержден неинвазивный Фибротест (ФТ) (Biopredictive, Paris France, патент US 6631330) в качестве заместительного маркера для хронического гепатита С (Poynard Т, et al. Comp Hepatol. 2004; 3:8) и В (Myers RP, et al. J Hepatol. 2003; 39:222-30) и, в последнее время, для алкогольного заболевания печени (Callewaert N, et al. Nature Med 2004; 10; 1-6; Naveau S, et al. Clin Gastroenterol Hepatol в печати).

Однако до сих пор исследования не продемонстрировали, что один или группа биомаркеров могут использоваться как альтернатива биопсии печени для диагностики стеатоза печени в наиболее распространенных случаях: алкогольный, вирусный гепатит и НЖБП.

В связи с чем, существует потребность в разработке способа диагностики, который бы обеспечивал приемлемое предиктивное значение степени стеатоза печени у пациента и который являлся бы достаточно достоверным для снижения потребности в проведении биопсии печени. Этот способ будет чрезвычайно выгодным для пациента, который страдает от заболевания, включая стеатоз печени, или который уже имеет положительный результат диагностического теста на фиброз печени или некровоспалительные повреждения, для адаптации лечения к его точно определенному заболеванию.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики, по которому перспективно определяется предсказующее значение совокупности сывороточных биохимических маркеров для диагностики стеатоза печени, в частности в печени пациента, который страдает от заболевания, включая стеатоз печени, или который уже имеет положительный результат диагностического теста на фиброз печени или некровоспалительные повреждения. С увеличением высокоположительных предиктивных значений (достоверный прогноз стеатоза печени) или отрицательных предиктивных значений ряд показаний для проведения биопсии могут быть снижены. Это может являться полезным для пациентов и общества с целью снижения стоимости и опасности проведения биопсий печени.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Графический алгоритм пациентов, проанализированных и включенных в тренировочные и проверочные группы.

Фиг.2. Связь между СтеатоТестом, ГГТ (МЕ/л) и АЛТ (МЕ/л) и стадией стеатоза печени.

Боксовые диаграммы, демонстрирующие соотношение в тренировочной группе (фиг.2А); в проверочной группе 1, HCV-инфицированные пациенты перед лечением (фиг.2В); в проверочной группе 2, вылеченные HCV пациенты (фиг.2С); в проверочной группе 3, алкогольное заболевание печени (фиг.2D); и в контролях, здоровые добровольцы, «голодные» (перед сдачей крови натощак) и «неголодные» доноры и доноры, сдающие кровь на сытый желудок (фиг.2Е).

Горизонтальная линия внутри каждого бокса представляет собой медиану, и ширина каждого бокса медианная величина ±1,57 интерквартильного размаха/ n для определения 95% уровня значимости между группами медиан. Ошибка в перекрытии затемненных боксов означает статистическую значимость (Р<0,05). Горизонтальные линии вверху и внизу каждого бокса охватывают интерквартильный размах (от 25-го до 75-го процентилей), и вертикальные линии от концов бокса охватывают смежные значения (верхний: 75-й процентиль плюс 1,5-кратный интерквартильный размах, нижний 25-й процентиль минус 1,5-кратный интерквартильный размах). В проверочной группе 3 почти все пациенты имели стеатоз и группы S0 и S1 объединялись.

Фиг.3. Связь между СтеатоТестом, ГГТ (МЕ/л) и АЛТ (МЕ/л) и стадией стеатоза печени в интегрированной базе данных, объединяющей контроли, тренировочную группу и проверочные группы.

Ошибка в перекрытии затемненных боксов означает статистическую значимость между медианами (Р<0,05). Наблюдаются значительные различия между всеми стадиями по критерию множественного сравнения Тьюки-Крамера для всех попарных различий между средними (Р<0,05).

Для ГГТ и АЛТ не наблюдалось различий между "Отсутствием стеатоза" и "<5%" и между "5-33%" и "33-100%". Для АЛТ также не наблюдалось существенных различий между "Отсутствием стеатоза" и "5-33%", "<5%" и "5-33%".

Описание предпочтительных воплощений

Настоящее изобретение, таким образом, заключается в способе диагностики стеатоза печени у пациента или в сывороточных и плазменных образцах, взятых у пациента, при этом способ включает следующие стадии:

a) исследование 5 биохимических маркеров путем измерения их содержания в сыворотке или плазме крови указанного пациента, где указанными маркерами являются:

- ApoAl (аполипопротеин Al),

- альфа.2-макроглобулин,

- АЛТ (аланин-аминотрансфераза),

- ГГТ (гамма-глутамин транспептидаза), и

- триглицериды;

b) исследование одного клинического маркера, выбранного из группы, состоящей из индекса массы тела (Масса/Рост²), объема талии, и соотношения (объем талии/ объем бедер);

c) объединение указанных показателей посредством логистической (логарифмической) функции, включая указанные маркеры для получения конечного результата, где указанная логистическая функция получена с помощью следующего способа:

i) классификация когорты пациентов в различных группах в соответствии со степенью их заболевания;

ii) выявление факторов, которые значительно различаются между этими группами путем одномерного анализа;

iii) анализ логистической регрессии для определения независимого дифференциального значения маркеров для диагностики стеатоза печени;

iv) составление логистической функции этих выявленных независимых факторов; и

d) анализ указанного конечного значения указанной логистической функции для определения наличия стеатоза печени у указанного пациента.

Стеатоз печени может ассоциироваться с различными факторами, такими как алкоголь, диабеты, избыточная масса тела, гиперлипидемия, резистентность к инсулину, гепатит С генотип 3, абеталипопротеинемия и некоторые лекарственные средства. В частности, настоящее изобретение направлено на диагностику стеатоза как алкогольной, так и неалкогольной этиологии.

С помощью определения наилучшего индекса ("Шкала стеатоза") для дифференциации использовали логистическую регрессионную функцию, связывающую различные факторы.

Логистическая функция получается путем объединения относительного веса каждого параметра, как отдельно определяется в логистической регрессии, с отрицательным знаком, если маркеры обратно коррелируют со стадией стеатоза печени. Логарифмы используются для маркеров, чьи значения составляют очень широкие интервалы.

Качество логистической функции проверяется с помощью Рабочей Характеристической (ROC) кривой, получаемой в зависимости от порога, желаемого для диагностики. Способ получения ROC кривой описывается в примерах. В настоящем изобретении классификация пациентов указывается в соответствии с различными стадиями стеатоза печени (отсутствует = 0%, легкая = 1-5%, умеренная = 6-32% и (выраженная и тяжелая) = 33-100%, где каждое процентное содержание относится к процентному содержанию гепатоцитов, вовлеченных в стеатоз), но это может изменяться, если осуществлялась диагностика пациента только с выраженной или тяжелой степенью. Это будет приводить к другой ROC кривой.

Кроме того, диагностика наличия или отсутствия стеатоза печени у пациента может уточняться с помощью данных, касающихся предполагаемой распространенности стеатоза печени в популяции.

Также логистическая функция может содержать другие клинические и биохимические маркеры. В предпочтительном воплощении, логистическая функция также содержит показатели возраста и пола пациента. В другом воплощении логистическая функция может также содержать другие биохимические маркеры, такие как общий билирубин, гаптоглобин, ACT (аспартат-аминотрансфераза), глюкоза и (холестерин или ЛВП-холестерин). Предпочтительно логистическая функция будет содержать, по меньшей мере, 1 или 2, более предпочтительно от 3 до 5 из этих биохимических маркеров. Наиболее предпочтительно логистическая функция может также содержать общий билирубин, гаптоглобин, глюкозу и холестерин.

Биохимические маркеры, которые представлены в стадии а) способа настоящего изобретения, являются "простыми" биохимическими маркерами, что означает, что они без труда определяются способами, уже известными из уровня техники (хроматография, электрофорез, ELISA анализ ).

Различные коэффициенты, используемые для значений, полученных для различных маркеров в логистической функции, могут быть рассчитаны посредством статистического анализа, как описывается в примерах.

В частности, пригодной логистической функцией, которая может использоваться для осуществления способа изобретения, является следующая:

f=a1-а2. [Возраст (лет)] + а3. [ApoAl (г/л)] - а4 [Индекс Массы Тела (Масса/Рост ²)] + а5.log [.альфа.2-макроглобулин (г/л)] - a6.log [ALT (аланин-аминотрансфераза)(МЕ/л)] - a7.log [общий билирубин (мкмоль/л)] - а8. [холестерин (ммоль/л)] - a9.log [ГГТ (гамма-глутамин транспептидаза)(МЕ/л)] - а10. [глюкоза (ммоль/л)] - а11.log [Гаптоглобин (г/л)] - а12. [триглицериды (ммоль/л)] + а13. [Пол (женщины = 0, мужчины = 1)], с

а1, входящим в интервал [6,68805-х%; 6,68805+х%],

а2, входящим в интервал [1,55337Е-02-х%; 1,55337Е-02+х%],

а3, входящим в интервал [1,161531-х%; 1,161531+х%],

а4, входящим в интервал [0,11889-х%; 0,11889+х%],

а5, входящим в интервал [1,74791-х%; 1,74791+х%],

а6, входящим в интервал [0,96453-х%; 0,96453+х%],

а7, входящим в интервал [0,11958-х%; 0,11958+х%],

а8, входящим в интервал [0,68125-х%; 0,68125+х%],

а9, входящим в интервал [1,17922-х%; 1,17922+х%],

а10, входящим в интервал [1,46963-х%; 1,46963+х%],

all, входящим в интервал [0,34512-х%; 0,34512+х%],

а12, входящим в интервал [1,17926-х%; 1,17926+х%], и

а13, входящим в интервал [0,35052-х%; 0,35052+х%].

"Интервал [а-х%; а+х%]" означает интервал [(100-х)/100.а; (100+х)/100.а]. Предпочтительно, х - это, главным образом, 90, 80 или 70, более предпочтительно, по большей части, 60, 50, или 40, даже более предпочтительно, по большей части, 30, 20, 10 или 5. Все a_i коэффициенты представляют собой ряд 5 десятичных знаков. Например, для х, равного 90, а13 входит в интервал [0,03505; 0,66598].

Более того, численные определения для коэффициентов в различных функциях могут варьировать в зависимости от количества и характеристик исследуемых пациентов. В связи с чем, значения коэффициентов различных маркеров должны пониматься в том смысле, что допускаются некоторые их незначительные различия, без ограничения объема изобретения.

Конкретной применимой функцией, где х равно нулю, является:

f=6,68805-1,55337Е-02. [Возраст (лет)] + 1,161531. [АроА1(г/л)] - 0,11889. [Индекс Массы Тела (Масса/Рост²)] + 1,74791.log [.альфа.2-макроглобулин (г/л)] - 0,96453.log [АЛТ (аланин-аминотрансфераза) (МЕ/л)] - 0,11958.log [общий билирубин(мкмоль/л)] - 0,68125.log [холестерин (ммоль/л)] - 1,17922.log [ГГТ (гамма-глутамин транспептидаза) (МЕ/л)] - 1,46963.log [глюкоза (ммоль/л)] - 0,34512.log [Гаптоглобин (г/л)] - 1,17926.log [триглицериды (ммоль/л)] + 0,35052. [Пол (женщины = 0, мужчины = 1)].

В зависимости от конечного значения, полученного при анализе значений биохимических показателей с помощью логистической функции, становится возможным сделать вывод о наличии или отсутствии стеатоза печени у пациента. Также является возможным сделать заключение о стадии стеатоза печени путем принятия указанной стадии за порог в схеме ROC кривой.

В некоторых воплощениях изобретение касается способа, описанного ранее, в котором конечное значение логистической функции используется в дальнейшем для диагностики стадии стеатоза печени. Различные стадии стеатоза печени определяются в соответствии с гистологическими признаками биопсии печени. Более точное определение стадий стеатоза печени обеспечивается в примере 1.

Способ изобретения может, кроме того, содержать стадию прогнозирования развития заболевания, исходя из стадии стеатоза печени, выведенной из конечного значения логистической функции. В частности, шкала стеатоза при усечении 0,30 имеет довольно большое изменение диапазонов чувствительности от 85% до 100% в разных группах (табл.4) и шкала стеатоза при усечении 0,70 имеет довольно большое изменение диапазонов чувствительности от 83% до 100%. Более того, как уже продемонстрировано для Фибротеста (Poynard 2004 Clin Chem 2004), многие расхождения между Стеато-системой и биопсией наблюдались вследствие ошибочной биопсии (маленький размер образца). Ожидается, что способ изобретения будет снижать потребность в проведении биопсии печени более чем на 80%. Впервые клинический врач может иметь оценку основных гистологических признаков, приводящих к циррозу, или объяснения отклонений печеночных тестов: Шкала стеатоза для определения стеатоза, Шкала фиброза (Фибротест, Biopredictive, Paris, France) для определения фиброза. Шкала активности (АктиТест, Biopredictive, Paris, France) для некротико-воспалительных признаков хронического гепатита С и В. Проведение биопсии должно требоваться только во вторую очередь в случае необъяснимых компонентов, как описывается для Шкалы фиброза (Фибротест), т.е. острого воспаления, синдрома Гилберта или гемолиза (Poynard Clin Chem 2004).

В соответствии с изобретением стадия стеатоза печени, выведенная из конечного значения логистической функции, также может быть достаточно значимой для клинического врача при выборе приемлемого лечения пациента в соответствии со стадией заболевания.

Также указанная стадия стеатоза печени может использоваться клиницистом для решения вопроса о проведении биопсии печени у пациента.

В зависимости от распространенности стеатоза печени в популяции пациентов, которые консультируются, данные, полученные при осуществлении способа изобретения, могут использоваться для определения потребности в проведении биопсии печени у пациента. Ожидается, что способ изобретения будет снижать потребность в проведении биопсии печени приблизительно на 80%.

Способ изобретения предназначается для применения у пациентов, которые страдают любым заболеванием, включая стеатоз печени, на фоне которого может развиться цирроз. Под "заболеванием, включая стеатоз печени" понимается любое заболевание, которое может приводить к развитию стеатоза печени. В частности, способ изобретения приемлемо осуществляется для выявления стеатоза печени у пациентов, страдающих от заболевания, включенного в группу, состоящую из гепатита В и С, алкоголизма, гемохроматоза, метаболического заболевания, диабетов, ожирения, аутоиммунного гепатита, билиарного первичного цирроза печени, дефицита альфа.1 - антитрипсина, заболевания Вильсона.

Способ изобретения, в частности, предназначается для применения для пациента, который уже подвергнут диагностическому исследованию на фиброз печени и/или наличие некровоспалительных повреждений печени.

Более предпочтительно способ изобретения предназначается для применения для пациента, который уже подвергнут диагностическому исследованию Фибротест/Акти-Тест, как описывается в патенте US 6631330, который здесь включается посредством ссылки.

Изобретение также обеспечивает набор для диагностики стеатоза печени у пациента, содержащий инструкции, позволяющие определить наличие или отсутствие стеатоза печени у указанного пациента, после определения содержания биохимических маркеров.

Инструкции могут содержать логистическую функцию, которая должна использоваться после определения содержания биохимических маркеров. Инструкция может иметь вид печатного носителя, также как и носителя, пригодного для компьютера, как, например, программное обеспечение. Инструкции также могут содержать ROC кривую, зависящую от порогового значения, которое определяется для проведения анализа конечных данных, полученных из логистической функции. Также они могут содержать различные таблицы, которые позволяют получить предиктивные значения, в зависимости от предполагаемой распространенности стеатоза печени в популяции пациентов.

Диагностический набор настоящего изобретения также может содержать элементы, позволяющие определить содержание интересующих биологических маркеров.

Указанный диагностический набор может также содержать инструкции для количественного анализа различных стадий стеатоза печени (отсутствует = 0%, легкая = 1-5%, умеренная = 6-32%, выраженная = 33-66% и тяжелая = 67-100%), и других промежуточных стадий.

Способ изобретения может без труда автоматизироваться, определение содержания маркеров становится осуществляемым автоматически, данные посылаются в компьютер и обрабатываются, при этом рассчитывается значение логистической функции и анализируется с помощью ROC кривой, и, в конечном итоге, определяется распространенность стеатоза печени в популяции пациентов. В связи с чем, данные, полученные клиническим врачом, являются более легко объясняемыми и будут позволять усовершенствовать процесс при решении вопроса о проведении биопсии или назначении адекватного лечения.

Следующие примеры предназначаются для описания аспекта изобретения и представляют методики для воспроизведения способа изобретения, но не должны ограничивать изобретение.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Пациенты и методы

1.1. Пациенты

Следующие пациенты с пригодной к применению сывороткой, соответствующими результатами биопсии печени и продолжительностью времени между взятием сыворотки и проведением биопсии менее 3 месяцев были включены (фиг.1). Невнесенные критерии включают непригодную сыворотку и непригодные результаты биопсии и пациентов, у которых биопсия и сыворотка были собраны с интервалом более чем 3 месяца. Анализ осуществлялся в отношении первой группы (тренировочная группа) и проверялся на 3 различных группах (проверочные группы).

Пациенты тренировочных групп ретроспективно включались для этого конкретного анализа, но исследовались в предыдущих проспективных проверочных исследованиях при использовании Фибротеста в период между сентябрем 2000 и августом 2004 (Poynard T, et al. Comp. Hepatol. 2004; 3:8; Myers RP, et al. J Hepatol. 2003; 39:222-30; Ratziu V, et al. Hepatology 2003; 38:510A). Все являлись стационарными пациентами, госпитализированными в Отделение гепато-гастроэнтерологии (Groupe Hospitalier Pitie-Salpetriere) no поводу НЖБП, гепатита С, В и алкогольного заболевания печени.

Пациенты проверочной группы 1 (пациенты с гепатитом С) ретроспективно анализировались для изучения стеатоза печени у пациентов с хроническим гепатитом С (Poynard Т, et al. Hepatology. 2003; 38:75-85). Для этого включались ранее не лечившиеся пациенты проспективного многоцентрового рандомизированного исследования пегелированного интерферона-альфа (PEG-IFN) и рибавирина. Использовались биомаркеры и результаты биопсии при исходном уровне.

Пациентами проверочной группы 2 (бывшие пациенты с гепатитом С с не выявляемым HCV) являлись пациенты аналогичного рандомизированного исследования, как и в проверочной группе 1 (Poynard Т, et al. Hepatology. 2003; 38:75-85), которые являлись "излеченными" со стойкой вирусологической реакцией, что означает, что РНК HCV не обнаруживалась спустя 24 недели после окончания лечения. Биомаркеры и результаты биопсии, выполненные спустя 24 недели после окончания лечения, применялись. Данная группа рассматривается как проверочная группа по НЖБП, поскольку возможный вирусный стеатоз излечен посредством соответствующего лечения (Poynard Т, et al. Hepatology, 2003; 38:75-85).

Пациенты проверочной группы 3 (пациенты с заболеванием печени алкогольной этиологии) ретроспективно включались для данного конкретного анализа, но проспективно включались в период между 1998 и 2000 в когорту пациентов, больных алкоголизмом, для которых один первичный результат был определен с помощью биохимических маркеров. Отдельные детали этой когорты недавно были опубликованы в проверочном исследовании Фибротеста (Naveau S, et al. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2005 в печати). Все пациенты являлись стационарными пациентами, госпитализированными в Отделение гепато-гастроэнтерологии (Hopital Antoine Beclere) по поводу осложнений алкогольного заболевания печени. Характеристики пациентов различных групп перечисляются в табл.1.

Таблица 1
Характеристики пациентов, включенных в исследование
Параметры	Тренировочная группа	Проверочная группа 1 HCV	Проверочная группа 2 HCV вылеченные	Проверочная группа 3 Заболевание печени алкогольной этиологии
Количество пациентов	310	171	201	62
Возраст на момент биопсии (лет)	48,9 (12,4)	44,1 (7,2)	43,6 (8,0)	46,6 (9,8)
Мужчины	201 (65%)	111 (65%)	122 (61%)	47/62 (76%)
Женщины	109 (35%)	60 (35%)	79 (39%)	15 (24%)
ИМТ(кг/м2)	25,4 (5,1)	27,7 (5,0)	26,5 (4,8)	24,2 (4,1)
Качество биопсии
Длина	17,0 (6,2)	16,6 (15,5)	17,0 (8,2)	13,5 (6,8)
Длина >=15 мм	205 (67%)	82 (48%)	96 (48%)	15 (24%)
Количество фрагментов	2,5 (2,3)	-	-	1,9 (1,6)
Один фрагмент	128/278 (46%)	-	-	37 (60%)
Длительность биопсия-сыворотка, среднее (диапазон дней)	1 (0-30)	40 (0-90)	11 (0-45)	7 (0-14)
Фактор риска со стороны печени
HCV	211 (68%)	171 (100%)	0 (0%)	0 (0%)
HBV	18 (6%)	0 (0%)	0 (0%)	0 (0%)
НЖБП	69 (22%)	0 (0%)	0 (0%)	0 (0%)
АЛД	12 (4%)	0 (0%)	0 (0%)	0 (0%)
Суточная доза алкоголя >=50 г/день	34/236 (14%)	0 (0%)	0 (0%)	62 (100%)
Вылеченная HCV инфекция	0 (0%)	0 (0%)	201 (100%)	0(0%)
Метаболический фактор
ИМТ >=27,0	92 (30%)	88 (51%)	77 (38%)	14 (23%)
Глюкоза >=6,0 ммоль/л	63 (20%)	30 (18%)	27 (13%)	20 (32%)
Триглицериды >=1,7 ммоль/л	67 (22%)	36 (21%)	54 (27%)	20 (32%)
Холестерин >=6,0 ммоль/л	61 (20%)	12 (7%)	26 (13%)	23 (37%)
Метаболический фактор: число на пациента
Нет	132 (43%)	60 (35%)	96 (48%)	17 (27%)
Один	101 (33%)	64 (37%)	72 (36%)	20 (32%)
Два	52 (17%)	39 (23%)	31 (15%)	19 (31%)
Три	22 (7%)	8 (5%)	0 (0%)	5 (8%)
Четыре	3 (1%)	0 (0%)	2 (1%)	1 (2%)
Степень стеатоза печени
Отсутствует (0%)	130 (42%)	58 (34%)	116 (58%)	2 (3%)
Легкая (Шкала 1-5%)	40 (13%)	68 (40%)	63 (31%)	2 (3%)
Умеренная (Шкала 6-33%)	69 (22%)	35 (20%)	17 (8%)	42 (68%)
Выраженная (Шкала 34-66%)	36 (12%)	7 (4%)	4 (3%)	12 (19%)
Тяжелая (Шкала 67-100%)	35 (11%)	3 (2%)	1 (0,5%)	4 (7%)
Степень стеатоза печени по результатам биопсии
F0 Нет	62 (20%)	0 (0%)	16 (8%)	8 (13%)
F1 Фиброз без септ	127 (41%)	102 (60%)	1,36 (68%)	23 (37%)
F2 Единичные септы	52 (17%)	39 (23%)	33 (16%)	11 (18%)
F3 Множественные септы	36 (11%)	19 (11%)	9 (4%)	7 (11%)
F4 Цирроз	33 (11%)	11 (6%)	7 (3%)	13 (21%)
Маркеры (диапазоны нормы)
ACT МЕ/л (17-27 женщин; 20-32 мужчин)	83 (159)	82 (57)	23 (9)	89 (83)
АЛТ МЕ/л(11-26 женщин; 16-35 мужчин)	109 (114)	118 (94)	19 (10)	72 (88)
Общий билирубин моль/л (1-21)	14,8 (26,2)	11,1 (4,8)	8,8 (4,6)	21,5 (19,6)
ГТТ мкг/л (7-32 женщин; 11-49 мужчин)	112 (183)	84 (96)	21 (18)	323 (443)
2 макроглобулин г/л (женщин 1.6-4.0;	2,4 (1,0)	3,1 (1,2)	2,0 (0,8)	1,8 (0,5)
мужчин 1.4-3.3) ApoAl г/л(1.2-1.7)	1,4(03)	1,3(0,3)	1,2(0,3)	1,5(0,5)
Гаптоглобин г/л (0·35-2·00)*	0,95 (0,57)	0,78 (0,45)	0,86 (0,43)	1,39 (0,63)
Глюкоза (ммоль/л)	5,5 (3,2)	5,4 (1,2)	5,3 (1,0)	5,8 (1,6)
Холестерин (ммоль/л)	4,9 (1,3)	4,5 (1,0)	5,0 (1,0)	5,4 (1,9)
Триглицериды (ммоль/л)	1,5 (1,4)	1,4 (0,8)	1,6 (1,0)	1,9 (3,1)
Фибротест	0,42 (0,28)	0,47 (0,26)	0,29 (0,20)	0,43 (0,28)
Жировой тест	0,49 (0,25)	0,53 (0,22)	0,36 (0,22)	0,58 (0,25)
Данные представляют средние (SD) или относительные значения. ACT = аспартат-аминотрансфераза. АЛТ = аланин-аминотрансфераза. ГГТ = гамма-глутамин транспептидаза. ApoAl = аполипопротеин a1.

Также была проанализирована контрольная группа. В нее входили практически здоровые добровольцы, обследуемые натощак и на сытый желудок, которые ранее включались в проведение Фибротеста (Munteanu M, et al. Comp. Hepatol. 2004; 3,3), и дополнительно доноры, у которых кровь отбиралась не натощак.

1.2. Сывороточные маркеры

10 следующих биохимических маркеров определялись для разных групп: ApoAl, АЛТ (аланин-аминотрансфераза), ACT (аспартат-аминотрансфераза), альфа.2-макроглобулин, ГТТ (гамма-глутамин транспептидаза), общий билирубин, гаптоглобин, холестерин, глюкоза и триглицериды.

Эти 10 биохимических маркеров включали 6 компонентов Фибротест-АктиТеста, скорректированные по возрасту и полу (запатентованный алгоритм искусственного интеллекта USPTO 6631330) плюс маркеры ACT, холестерин, глюкоза и триглицериды и ИМТ.

Фибротест (Biopredictive, Paris, France; FibroSURE LabCorp, Burlington, NC, USA) определялся как опубликовано ранее (Poynard Т, et al. Comp Hepatol. 2004; 3:8; Myers RP, et al. J Hepatol. 2003; 39:222-30; Callewaert N, et al. Nature Med 2004; 10; 1-6; Naveau S, et al. Clin Gastroenterol Hepatol в печати; Imbert-Bismut F, et al. Clin Chem Lab Med 2004; 42:323-33; Munteanu M, et al. Comp Hepatol 2004; 3:3).

Применялись опубликованные рекомендованные преаналитические и аналитические процедуры (Poynard Т, et al. Comp Hepatol. 2004; 3:8; Myers RP, et al. J Hepatol. 2003; 39:222-30; Callewaert N, et al. Nature Med 2004; 10; 1-6; Naveau S, et al. Clin Gastroenterol Hepatol в печати; Imbert-Bismut F, et al. Clin Chem Lab Med 2004; 42:323-33; Munteanu M, et al. Comp Hepatol 2004; 3:3).

В тренировочной и контрольных группах содержание ГТТ, АЛТ, сывороточной глюкозы, триглицеридов, холестерина и общего билирубина определялось с помощью анализатора Hitachi 917 или анализаторов Modular DP (оба от Roche Diagnostics Mannheim, Germany) при использовании реагентов производителя. Альфа2-макроглобулин, аполипопротеин Al и гаптоглобин измерялись при использовании автоматического нефелометра BNII (Dade Behring; Marburg, Germany).

В проверочных группах 1 и 2 содержание ГГТ, АЛТ, сывороточной глюкозы, триглицеридов, холестерина и общего билирубина измерялось с помощью Hitachi 747 или 911 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) при использовании реагентов производителя. Аполипопротеин А1, альфа2-макроглобулин и гаптоглобин определялись в образцах сыворотки при использовании автоматического нефелометра BNII (Dade Behring; Marburg, Germany).

В проверочной группе 3 АЛТ, ГГТ, сывороточная глюкоза, триглицериды, холестерин, общий билирубин и гаптоглобин измерялись с помощью автоанализатора (Olympus AU 640 Automate) при использовании реагентов производителя (Olympus, Rungis France); альфа2-макроглобулин и аполипопротеин А1 определялись при использовании автоматического нефелометра (BNII, Dade Behring; Marburg, Germany).

Все коэффициенты отклонений в значениях составляли ниже 10%.

1.3. Гистологическая оценка

Гистологическая оценка осуществлялась на основании результатов биопсий печени. Применялись общие правила для различных групп; один патологоанатом на группу, неосведомленный о состоянии пациентов, анализировал гистологические признаки. Образцы биопсии печени обрабатывались при использовании стандартных способов.

Стадия стеатоза печени оценивалась по 0-4 бальной системе: 0 = отсутствие стеатоза, 1-5% = легкий, 6-32% = умеренный, 33-66% = выраженный, 67-100% = тяжелый, все процентные значения относились к процентному содержанию гепатоцитов, вовлеченных в стеатоз (Poynard Т, et al. Hepatology, 2003; 38:75-85). Основным гистологическим критерием являлось наличие стеатоза в стадии 2-4 (между 6-100%).

Пример 2

Статистический анализ

Для статистического анализа использовались точный критерий Фишера, критерий хи-квадрат, t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни и дисперсионный анализ при использовании критерия Биферрони для оценки достоверности различий между каждой парой групп и критерия множественного сравнения Тьюки-Крамера для пересчета множественных сравнений и множественной логистической регрессии для многофакторного анализа (Hintze JL. NCSS 2003 User Guide. Number Cruncher Statistical Systems 2003 software NCSS, Kaysville, Utah). Анализ осуществлялся на первой группе (тренировочная группа) и проверялся на 3 различных группах (проверочные группы 1, 2 и 3), в когортах пациентов, как показано в табл.1.

В соответствии с оценочной системой стеатоза печени пациенты разделялись на несколько групп.

Первичным результатом являлась идентификация пациентов со стеатозом печени в стадии 2, 3 или 4 (умеренная, выраженная или тяжелая).

При вторичном анализе пациенты классифицировались по 4-бальной оценочной системе.

Первая стадия состояла из идентификации факторов, которые различаются значительно между этими группами, путем одномерного анализа при использовании критерия хи-квадрат, t-критерия Стьюдента или критерия Манна-Уитни.

Вторая стадия состояла из анализа логистической регрессии для определения независимого дискриминационного значения маркеров для диагностики фиброза.

Третья стадия состояла в составлении индекса, связывающего эти идентификационные независимые факторы. С помощью определения наилучшего индекса ("Шкала стеатоза") для дискриминации использовали логистическую регрессионную функцию, связывающую независимые факторы. Во всех следующих примерах, Шкала стеатоза в дальнейшем относится к "Системе СтеатоТест". Система СтеатоТест охватывает диапазон от нуля до 1,00, с высшими оценками, указывающими на большую вероятность значительных повреждений.

Диагностические значения маркеров были получены при использовании чувствительностей, специфичностей, положительных (ППЗ) и отрицательных предиктивных значений (ОПЗ) и площадей под ROC кривыми (Hintze JL. NCSS 2003 User Guide. Number Cruncher Statistical Systems 2003 software NCSS, Kaysville, Utah).

Соответствующие общие диагностические значения были сравнены с помощью площади под ROC кривыми. ROC кривая строится путем построения графика чувствительности против (1-специфичности), после классификации пациентов, в соответствии со значением, полученным для логистической функции, для различных пороговых величин (от 0 до 1). Обычно признается, что площадь ROC кривой, под которую попадает значение, превосходящее 0,7, является хорошей прогнозной кривой для диагностики. ROC кривая должна признаваться как кривая, позволяющая прогнозировать качество диагностического способа.

Площади под ROC кривыми рассчитывались эмпирическим непараметрическим способом. Анализ чувствительности также осуществлялся для определения достоверности маркеров для первичных результатов, в соответствии с размером биоптата. Для всех анализов использовались двусторонние статистические тесты; Р-значение 0,05 или менее рассматривалось как значимое. Программное обеспечение Number Cruncher Statistical Systems 2003 (NCSS, Kaysville, Utah) использовалось для всех анализов (Hintze JL. NCSS 2003 User Guide. Number Cruncher Statistical Systems 2003 software NCSS, Kaysville, Utah).

Эти статистические анализы осуществлялись раздельно для различных групп, как ранее указывалось.

Пример 3

Определение логистической функции

"Система СтеатоТест" определяется как функция логистической регрессии, соединяющая независимые факторы, которые отражают наилучший индекс значений дискриминации между наличием или отсутствием стеатоза печени.

В табл.2 даны характеристики пациентов в соответствии с наличием стеатоза печени по каждому из 10 биохимических маркеров, шкале Фибротеста и системе СтеатоТест, так же как их независимая связь с фиброзом (Р значение).

В тренировочной группе, наиболее значимыми компонентами, ассоциированными с наличием 2-4 стадии стеатоза по одномерному анализу, были ИМТ, возраст, АЛТ, ACT, ГГТ, глюкоза и триглицериды.

В анализе логистической регрессии наиболее значимыми компонентами являлись ИМТ (OR=0,89 Р=0,0002), ГГТ (OR=0,31 Р=0,002), аполипопротеин Al (OR=3,20 P=0,01), альфа2-макроглобулин (OR=5,74 Р=0,02), АЛТ (OR=0,38 P=0,03) и триглицериды (OR=0,31 Р-0,04).

В проверочной группе аналогичные различия обнаруживались, наиболее значимые для ИМТ, ГГТ, АЛТ и триглицеридов (табл.2).

Наилучшая логистическая функция (система СтеатоТеста), соединяющая 9 маркеров и возраст, пол и ИМТ, определялась на тренировочной группе и является следующей:

f=6,68805-1,55337Е-02. [Возраст (лет)] + 1,161531. [ApoAl (г/л)] - 0,11889. [Индекс Массы Тела (Масса/Рост²)] + 1,74791.log [.альфа.2-макроглобулин (г/л)] - 0,96453.log [AЛT (аланин-аминотрансфераза)(МЕ/л)] - 0.11958.log [общий билирубин(мкмоль/л)] - 0,68125.log [холестерин (ммоль/л)] - 1,17922.log [ГГТ (гамма-глутамин транспептидаза)(МЕ/л)] - 1,46963.log [глюкоза (ммоль/л)] - 0,34512.log [Гаптоглобин (г/л)] - 1,17926.log [триглицериды (ммоль/л)] + 0,35052. [Пол (женщины = 0, мужчины = 1)].

Эта функция была получена на тренировочной группе путем совокупности относительного веса каждого параметра, как индивидуально определяется в логистической регрессии, с отрицательным знаком, если маркеры обратно коррелируют со стадией стеатоза печени. Логарифмы используются для маркеров, чьи значения составляют довольно широкий диапазон.

Значение системы СтеатоТест, соединяющей 9 маркеров (альфа2-макроглобулин, АЛТ, аро А1, гаптоглобин, ГГТ и общий билирубин), урегулированной по возрасту, полу и ИМТ, имеет высокую корреляцию с наличием или отсутствием стеатоза печени, на тренировочном образце, так же как и на проверочных образцах (табл.2).

Одним из существенных открытий настоящей работы является крайне значимое усовершенствование диагностического значения стеатоза, когда объединяются маркеры, по сравнению с классическим рутинным тестом, ранее рекомендованным, таким как определение ГГТ и АЛТ. Простые маркеры резистентности к инсулину, такие как ИМТ, глюкоза, триглицериды повышают диагностическое значение определения АЛТ и ГТТ. Ранее для различных случаев стеатоза печени этого не было продемонстрировано. Кроме того, впервые продемонстрировано, что диагностическое значение АЛТ было намного больше, чем значение ГГТ для диагностики стеатоза. Также интересно, что значение ГГТ не увеличивалось в зависимости от тяжести стеатоза по сравнению со значением АЛТ.

Пример 4

Анализ данных

4.1 Эффективность системы СтеатоТест для диагностики стеатоза печени.

Диагностические значения (площади под ROC кривыми) системы СтеатоТест для различных групп пациентов отображены в табл.3. Чувствительность, специфичность и положительные и отрицательные предиктивные значения системы СтеатоТеста с усечением 0,30, 0,50, и 0,70 отображены в табл.4.

Таблица 4
Диагностическое значение шкалы стеатоз для прогноза стеатоза печени более чем 5%
Усечение	Чувствительность	Специфичность	Положительное Предиктивное значение	Отрицательное Предиктивное значение
Тренировочная группа N=310			Распространенность=45%
СтеатоТест 0,30	0,91 (127/140)	0,45 (77/170)	0,58 (127/220)	0,86 (77/90)
0,50	0,69 (97/140)	0,74 (126/170)	0,69 (97/141)	0,75 (126/169)
0,70	0,45 (63/140)	0,89 (152/170)	0,78 (63/81)	0,66 (152/229)
ГГТ 50 МЕ/л	0,66 (92/140)	0,55 (94/170)	0,55 (92/168)	0,66 (94/142)
АЛТ 50 МЕ/л	0,77 (108/140)	0,35 (60/170)	0,50(108/218)	0,65 (60/92)
Проверочная группа 1 N=171			Распространенность = 26%
СтеатоТест 0,30	0,98 (44/45)	0,24 (30/126)	0,31 (44/140)	0,97 (30/31)
0,50	0,89 (40/45)	0,58 (73/126)	0,43 (40/93)	0,94 (73/78)
0,70	0,44 (20/45)	0,83 (105/126)	0,49 (20/41)	0,81 (105/130)
ГГТ50 МЕ/л	0,62 (28/45)	0,61 (72/126)	0,34 (28/82)	0,81 (72/89)
АЛТ 50 МЕ/л	1,00 (45/45)	0,06 (8/126)	0,28(45/163)	1,00(8/8)
Проверочная группа 2 N=201			Распространенность=11%
СтеатоТест 0,30	1,00 (22/22)	0,56 (100/179)	0,22 (22/101)	1,00 (100/100)
0,50	0,68 (15/22)	0,79 (142/179)	0,29 (15/52)	0,95 (142/149)
0,70	0,32 (7/22)	0,92 (165/179)	0,33 (7/21)	0,92(165/180)
ГГТ 50 МЕ/л	0,09 (2/22)	0,97 (174/179)	0,29 (2/7)	0,90 (174/194)
АЛТ 50 МЕ/л	0,05 (1/22)	0,98 (176/179)	0,25 (1/3)	0,89(176/197)
Проверочная группа 3 N=62			Распространенность=94%
СтеатоТест 0,30	0,85 (49/58)	0,00 (0/4)	0,93 (49/53)	0,00 (0/9)
0,50	0,62 (36/58)	1,00 (4/4)	1,00 (36/36)	0,15 (4/26)
0,70	0,40 (23/58)	1,00 (4/4)	1,00(23/23)	0,10(4/39)
ГГТ 50МЕ/л	0,90 (52/58)	0,00 (0/4)	0,93 (52/56)	0,00 (0/6)
АЛТ 50 МЕ/л	0,53 (31/58)	0,75 (3/4)	0,97(31/32)	0,10(3/30)

Все результаты показывают, что система СтеатоТест может достигать довольно высоких диагностических значений (площадь под ROC кривой, см. табл.3) и высокой специфичности, чувствительности и положительных или отрицательных предиктивных значений для диагностики стеатоза печени (см. табл.4).

Диагностическое значение (площадь под ROC кривой) системы СтеатоТеста являлось в высокой степени воспроизводимо между тренировочной группой и проверочными 1, 2 и 3 (табл.3). Чувствительность также была достаточно воспроизводимой между тренировочной группой и проверочными 1, 2 и 3 (табл.4). В дополнение чувствительности и специфичности системы СтеатоТеста, наблюдаемые в различных изучаемых популяциях, вероятно, будут повышены в более общих популяциях из-за исключительной специфичности, наблюдаемой у добровольцев и доноров крови (фиг.2Е), и из-за того, что настоящие исследования включали ограниченное количество пациентов с некоторыми метаболическими факторами риска, такими как патологическое ожирение.

Для некоторых пациентов диагнозы наличия стеатоза печени по результатам биопсии и по системе СтеатоТест не согласовывались. Причина несоответствия между наличием >5% стеатоза печени, прогнозируемого по биохимическим маркерам и биопсии, объяснялось в соответствии с соответствующими факторами риска ошибки, как было указано ранее (Poynard Т, et al. Clin. Chem. 2004; 50:1344-55). Существенные несоответствия определялись как несоответствие в прогнозе >5% стеатоза печени (стадии 2-4) и 30% или более разницы в >5% стеатоз печени процентного содержания, как прогнозируется системой СтеатоТест или как наблюдается в биоптатах. Факторами риска ошибки СтеатоТеста являлись гемолиз, заболевание Гилберта, острое воспаление и внепеченочный холестаз. Факторами риска ошибки биопсии являлись размер биоптата (менее чем 25 мм) и фрагментация (более чем один фрагмент). Ошибка, присущая биопсии (ложноотрицательная), подозревалась, если биоптат был меньше 15 мм и фрагментирован в сочетании, по меньшей мере, с одним метаболическим фактором риска.

В тренировочной группе наблюдалось 56 случаев (18%) существенного несоответствия между процентным отношением стеатоза, как определялось по ST и что наблюдалось в биоптатах. Ошибка, присущая ST (ложноположительный ST), подозревалась в одном случае, когда имелся острый лекарственный гепатит, ассоциированный с хроническим гепатитом В. Ошибка, присущая биопсии (ложноотрицательная биопсия), допускалась в 16 случаях с плохим качеством биоптатов (средняя длина 13 мм, 2 фрагмента) и, по меньшей мере, с одним метаболическим фактором риска.

Для проверочных групп существенное несоответствие наблюдалось в 17 случаев (16%) в группе 1, 20 случаев (10%) в группе 2 и 13 случаев (21%) в группе 3. Существенное несоответствие наблюдалось более часто у пациентов с обширным фиброзом (стадия F3 или F4): 38 случаев из 135 (28%) против 91 случаев из 609 (15% Р=0,001).

По сравнению с инвазивной и дорогостоящей биопсийной диагностикой очень важно отметить, что способ изобретения не приводит к большому числу неправильных лечений пациентов или к исключению потребности лечения для пациентов. Данные, представленные в данной заявке, повышают достоверность способа диагностики по настоящему изобретению.

4.2 Сравнение СтеатоТеста с другими неинвазивными диагностическими тестами (Фибротест, ГГТ 50 МЕ/л и АЛТ 50 МЕ/л).

Результаты, полученные в системе СтеатоТест (при использовании 9 биохимических параметров, скорректированных по возрасту, полу и ИМТ), сравнивались с таковыми, полученными при использовании единичных маркеров, таких как ГГТ и АЛТ, которые обычно рассматриваются как значимые маркеры для определения наличия или отсутствия стеатоза печени. Аналогичное стандартное значение усечения использовалось для ГГТ и АЛТ: 50 МЕ/л. Ниже указанного усечения диагностика стеатоза печени рассматривается как отрицательный результат, выше рассматривается как положительный результат.

Характеристики пациентов по наличию стеатоза печени для отдельных биохимических маркеров, системы Фибротест и СтеатоТест показаны в табл.2.

По сравнению с Фибротестом система СтеатоТест обеспечивает намного лучшую дифференциацию между наличием и отсутствием стеатоза печени во всех проанализированных группах, в частности для тренировочной группы и проверочной группы 2 (табл.2).

Диагностические значения (площади под ROC кривыми) системы СтеатоТест, ГГТ 50 МЕ/л и АЛТ 50 МЕ/л для определения главной конечной точки (а именно стадии 2-4 стеатоза печени) представлены в табл.3. Система СтеатоТест имеет более высокие площади под ROC кривыми, чем ГГТ 50 МЕ/л во всех анализируемых группах, чем АЛТ 50 МЕ/л в тренировочной группе и проверочной группе 1 (табл.3).

Чувствительность, специфичность и положительные и отрицательные предиктивные значения системы СтеатоТест с усечением 0,30, 0,50 или 0,70 и ГГТ 50 МЕ/л и АЛТ 50 МЕ/л описываются в табл.4. Для диагностики стадии 2-4 стеатоза система СтеатоТест с усечением 0,50 достигала хорошей чувствительности (0,69, 0,89, 0,68 и 0,62) и хорошей специфичности (0,74, 0,58, 0,79, 1,00), по тренировочной и проверочным группам соответственно. Более того, такая система СтеатоТест с усечением 0,50 проявляла более высокие положительные и отрицательные значения, чем ГГТ 50 МЕ/л и АЛТ 50 МЕ/л во всех анализируемых группах, исключая отрицательное предиктивное значение АЛТ 50 МЕ/л в проверочной группе 1.

В дополнение относительно дифференциации между различными стадиями стеатоза печени наилучшие результаты достигаются путем проведения СтеатоТеста по сравнению с ГГТ 50 МЕ/л и АЛТ 50 МЕ/л во всех анализируемых группах (фиг.2).

Дифференциация между различными стадиями стеатоза печени также анализировалась на интегрированной базе данных, состоящей из всех включенных субъектов тренировочной группы, трех проверочных групп и контрольной группы (884 субъекта).

Наблюдалась значительная общая корреляция между системой СтеатоТест и стадиями стеатоза от контролей до "33-100%" (стадии 3-4, см. фиг.3). Для системы СтеатоТест наблюдалось значительное различие между всеми стадиями по критерию множественного сравнения Тьюки-Крамера для всех попарных различий между средними (Р<0,05). В отличие от этого, для ГТТ и АЛТ, не наблюдалось существенных различий между "Отсутствием стеатоза" (стадия 0) и "<5%" (стадия 1). Для АЛТ даже не наблюдалось значительных различий между "Отсутствием стеатоза" (стадия 0) и "6-32%" (стадия 2), "<5%" (стадия 1) и "6-32%" (стадия 2), и "6-32%" (стадия 2) и "33-66%" (стадия 3).

В заключение настоящее изобретение представляет совокупность, по меньшей мере, 5, предпочтительно 9, биохимических маркеров, скорректированных по возрасту, полу и ИМТ, для применения в определении наличия или отсутствия стеатоза печени. Маркеры, используемые в данном изобретении, никогда ранее не сочетались таким образом, в частности в зависимости от возраста, пола и ИМТ пациентов, что предоставляет хорошее предиктивное значение, как проиллюстрировано по площади под ROC кривой.

Способ диагностики по изобретению может быть автоматизирован при автоматизированном измерении значений маркеров и может выгодно применяться для пациентов со стеатозом печени, включая заболевание, для снижения показаний к проведению биопсии печени.