способ снижения уровня пероксидного окисления липидов печени русского осетра добавлением (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метилендифосфоновой кислоты

Формула изобретения

Способ снижения уровня пероксидного окисления липидов печени русского осетра добавлением (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метилендифосфоновой кислоты, включающий спектрофотометрическое определение окрашенного комплекса конечного продукта пероксидного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) с тиобарбитуровой кислотой, отличающийся тем, что в гомогенат печени добавляют в концентрации 1·10 ^-4 М (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метилендифосфоновую кислоту, обладающую множественным механизмом антиоксидантного действия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии, в частности к новым биологически активным соединениям, а именно к (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метилендифосфоновой кислоте, являющейся фосфорсодержащим производным 2,6-ди-трет-бутилфенола, обладающей антиоксидантными свойствами на различных этапах пероксидного окисления липидов (ПОЛ) гомогената печени русского осетра.

Данное соединение представляет собой фосфорсодержащий пространственно-затрудненный фенол, содержащий группы с множественным механизмом ингибирования - один фрагмент обрывает цепи, акцептируя пероксильные радикалы липидов, RO₂ , второй снижает скорость автоинициирования, разрушая гидропероксиды липидов, ROOH и связывает в комплекс металлы, разрушающие гидропероксиды с образованием свободных радикалов (металл-индуцированное ПОЛ) [Эммануэль Н.М., Бучаченко А.Л. Химическая физика старения и стабилизации полимеров. М.: Наука. 1982. 356 с.]. Высокая антиоксидантная эффективность (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метилендифосфоновой кислоты связана с наличием в ее структуре двух реакционных центров - фенольной группы и атомов фосфора с заместителями, которые различаются электронным и стерическим эффектами [Кашкай A.M., Касаикина О.Т. Полифункциональные антиоксиданты. Реакционная способность. Механизм ингибирования. М.: Изд-во "Викинг", 2001, 138 с., Кирпичников П.А., Победимский Д.Г., Мукменева Н.А. В сб.: Химия и применение фосфорорганических соединений. М.: Наука. 1974. С.215.]. Таким образом, гибридные молекулы фосфорсодержащих фенолов способны тормозить развитие ПОЛ на стадиях инициирования и развития цепи, что обеспечивает комплексное ингибирование ПОЛ.

Известно, что для фармакологической коррекции окислительного стресса широко используют природные или синтетические антиоксиданты (АО) различной химической природы [Oxidants and Antioxidants. Ultrastructure and Molecular Biology Protocols. Ed.D.Armstrong. Methods in Molecular Biology Series. 2002. Vol.196. HUMANA PRESS], которые во многих случаях либо недостаточно эффективны, либо обладают негативными побочными эффектами. Известны широко применяемые антиокислительные агенты -пространственно-затрудненные 2,6-ди-трет-бутилфенолы, которые в определенных условиях проявляют прооксидантные свойства.

Прототипом изобретения является ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) [Rice-Evans C.A., Diplock A.T. // Free Radical Biol. Med. - 1993. - Vol.15. - P.77-96], [Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. // Эксперим. клин. фармакол. - 2003. - Т.66, № 4. - С.66-70, с.68]. Однако недостатками данного соединения является то, что при применении его в высоких дозах увеличивается образование активных метаболитов кислорода. Кроме того, продукты окислительной деструкции этого соединения подавляют ферментную антиоксидантную систему.

Техническая задача - снижение уровня пероксидного окисления липидов путем применения не обладающих негативными побочными эффектами полифункциональных ингибиторов окислительных процессов, молекулы которых содержат несколько реакционных центров, ингибирующих окислительные процессы по разным механизмам и обладающих внутримолекулярным синергизмом.

Технический результат - повышение эффективности подавления уровня ПОЛ печени на различных этапах окислительного процесса внесением добавок антиоксиданта в минимальных концентрациях. Он достигается тем, что в предлагаемом способе, включающем спектрофотометрическое определение скорости ПОЛ в гомогенатах ткани печени русского осетра по накоплению малонового диальдегида (МДА), дающего окрашенный комплекс с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), имеющий максимум поглощения при 532 нм, в качестве антиоксиданта в концентрации 1·10 ^-4 M используют (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)метилендифосфоновую кислоту, молекула которой содержит в своем составе функциональные группы различной химической природы, способные проявлять суммарный синергический эффект, что снижает риск проявления побочных эффектов, при этом скорость накопления МДА в гомогенате печени снижается в среднем на 70% на различных этапах пероксидного окисления липидов.

Способ снижения скорости ПОЛ печени добавлением (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил)метилендифосфоновой кислоты отличается от приведенного выше прототипа тем, что используют добавку нового антиоксиданта комбинированного действия. При этом скорость накопления МДА в гомогенате печени снижалась в среднем на 70%. При увеличении концентрации антиоксиданта эффективность его действия сохраняется, инверсии антиоксидантного действия в прооксидантное не наблюдается.

Способ осуществляли следующим образом.

Пример 1

Навеску 0,5 г печени гомогенизировали в 19,5 мл охлажденного до 0-4°С раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед. Полученный гомогенат сливали в емкость.

Брали 3 сухие пробирки. В первую пробирку (холостая проба без добавки антиоксиданта) наливали 2,0 мл гомогената и по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Во вторую пробирку (рабочая проба с добавкой антиоксиданта) наливали 2,0 мл гомогената и по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а также добавляли раствор (3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-фенил)метилендифосфоновой кислоты в хлороформе (в отдельном эксперименте было подтверждено отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ в гомогенате печени). Начальная концентрация соединения в реакционной среде составляла 1·10^-4 М. В третьей пробирке готовили контрольную пробу (без гомогената). Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты.

Первую и вторую пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при 37°С, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин вместе с контрольной пробиркой и затем охлаждали все пробирки в ледяной воде до комнатной температуры. После того как пробы охладились, в первую и вторую пробирки добавляли 1,0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин.

Отбирали верхнюю фазу и измеряли экстинкцию пробы против контрольного раствора на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 1,0 см.

Расчет проводили по формуле:

Х=(Е*3*3,2)/(0,156*2),

где Х - содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3,2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых для спектрофотометрии, мл; 0,156 - экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 им.

Пример 2

Скорость ПОЛ определяли по методу, описанному в примере 1, по накоплению в печени карбонильных продуктов, определяемых с помощью тиобарбитуровой кислоты на различных этапах ПОЛ (3 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч).

Отличие заключается в том, что исследуемый антиоксидант вносили не в пробирку, непосредственно перед выполнением исследования, а в гомогенат печени. Растворы гомогената печени с антиоксидантом и без добавок хранили в холодном темном месте в течение 3 суток. Конечная концентрация исследуемого соединения составляла 1·10 ^-4 М. Изменение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенате печени осетра в присутствии (3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-фенил)метилендифосфоновой кислоты оценивали в течение 3 суток путем отбора 2 мл гомогената из соответствующей емкости через 3 , 24, 48 и 72 ч и последующим выполнением всех необходимых операций согласно способу, описанному в примере 1.

Для оценки проявления соответствующих свойств антиоксидантом была рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) [7] по формуле:

ЭАД=[(С₀ -С₁)/С_о]*100%,

где С ₀ - концентрация малонового диальдегида (МДА) в гомогенате печени (контроль), C₁ - концентрация МДА в гомогенате печени, содержащей исследуемое соединение.

В случае положительного значения показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; в случае отрицательного значения показателя ЭАД - прооксидантное действие. Для сравнения проведены подобные эксперименты с ионолом также в концентрации 1·10^-4 М. Данные опытов представлены в таблице.

Антиоксиданты	ЭАД,%
3 ч	24 ч	48 ч	72 ч
(4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил)-метилендифосфоновая кислота	73,3	75	76,8	61,7
ионол	35,4	42,4	38,9	22,9

Данный способ снижения скорости ПОЛ печени при добавлении(4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил)метилендифосфоновой кислоты в концентрации 1·10^-4 М показал высокую эффективность действия антиоксиданта на всех исследованных этапах пероксидного окисления липидов печени русского осетра.

Источники информации

1. Oxidants and Antioxidants. Ultrastructure and Molecular Biology Protocols. Ed.D.Armstrong. Methods in Molecular Biology Series. 2002. Vol.196. HUMANA PRESS.

2. Rice-Evans C.A., Diplock A.T. // Free Radical Biol. Med. - 1993. - Vol.15. - P.77-96.

3. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. // Эксперим. клин. фармакол. - 2003. - Т.66, № 4. - С.66-70.

4. Эммануэль Н.М., Бучаченко А.Л. Химическая физика старения и стабилизации полимеров. М.: Наука. 1982. 356 с.

5. Кашкай А.М., Касаикина О.Т. Полифункциональные антиоксиданты. Реакционная способность. Механизм ингибирования. М.: Изд-во "Викинг", 2001, 138 с.

6. Кирпичников П.А., Победимский Д.Г., Мукменева Н.А. В сб.: Химия и применение фосфорорганических соединений. М.: Наука. 1974. С.125.

7. Зайцев В.Г. Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиоксидантного действия лекарственных препаратов. Автореф. Дис. канд. биол. наук. Волгоград - 2001 г., с.23.