дигидрохлорид 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-a]бензимидазола, проявляющий иммунотропную и антиагрегационную активность

Формула изобретения

1. Дигидрохлорид 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола формулы

2. Соединение по п.1, обладающее иммунотропными и антиагрегационными свойствами.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической химии и фармакологии, и может быть использовано для создания новых иммунотропных и антиагрегационных средств.

Прототипом и препаратом сравнения иммунотропной активности является левамизол (гидрохлорид 6-фенил-2,3,5,6-тетрагидроимидазо[1,2-b]тиазола, декарис, Гедеон Рихтер А.О., Венгрия), который длительное время используется в клинике как иммуномодулирующее средство, стимулирующее клеточные факторы иммунитета (Renoux G. // Drugs. The general immunopharmacology of levamizole. Drugs. 1980. V.20 - P.89-99). Препаратом сравнения антиагрегационной активности является пентоксифиллин (3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1H-пурин-2,6-дион, Aventis, Германия), используемый в клинике как корректор реологических нарушений (Hikiami Н., Goto Н., Sekiya N. [et al.] // Phytomedicine. - 2003. - Vol.10, № 6-7. - P.459-466.).

Задача изобретения - расширение арсенала биологически активных веществ, обладающих иммунотропными и антиагрегационными свойствами.

Технический результат - получение вещества, обладающего иммунотропной и антиагрегационной активностью.

Сущность изобретения: дигидрохлорид 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-a]бензимидазола формулы:

,

проявляющий иммунотропные и антиагрегационные свойства.

Заявляемое соединение - дигидрохлорид 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола (I), получено следующим образцом.

Реакцией 3-хлорметилтиазоло[3,2-а]бензимидазола (Дианов В.М., Сибиряк С.А., Садыков Р.Ф. и др. // Хим.-фарм. журн., - 1991. - № 1. - С.40-42.) с циклогексиламином в кипящем этаноле в течение 2 часов образуется 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазол. Хлористоводородную соль получают обработкой основания хлористым водородом в этилацетате до pH раствора 1-2.

Пример 1. Синтез дигидрохлорида 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола(I).

Раствор 4,4 г (20 ммоль) 3-хлорметилтиазоло[3,2-а]бензимидазола и 8,0 г (80 ммоль) циклогексиламина в 60 мл этилового спирта нагревают на водяной бане 2 часа. Часть растворителя удаляют под вакуумом. Охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат. Получают 5,0 г (87,7%) 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола. Хлористоводородную соль 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола получают растворением основания I в этилацетате и пропусканием через раствор газообразного хлористого водорода до pH раствора 1-2. Перекристаллизовывают из этанола. Т. пл. 247-250°C.

Найдено, %: C 53,8; H 6,0; N 11,8; S 9,9; Cl 19,8. C₁₆H₁₉N₃S·2РCl. Вычислено: C 53,6; H 5,9; N 11,7; S 8,9; Cl 19,7.

Спектр-ЯМР ¹Н (ТФУК, ГМДС), , м.д.: 1,17 (сл. м, 10H, CH₂-циклогекс), 3,47-3,02 (м, 1Н, N-CH), 4,95-4,50 (д, 2H, CH2-NH), 7,55 сл. м. (5Н, аром.).

ИК спектр: 1480, 1540, 1604, 2950 см^-1 (C=C, C=N, CH).

Пример 2. Острая токсичность заявляемого соединения.

Острая токсичность соединения I изучена на белых мышах массой 14-16 г по методу Литчфилда и Уилкоксона (Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - 2-е изд. - Рига, 1963) и на крысах массой 140-160 г по методу Ван дер Вердена (Van der Waerden В.L. // Arch. exp. Path. Pharmacol. - 1990. - Bd.195. - S.389). Результаты испытаний приведены в таблице 1.

Таким образом, заявляемое соединение в зависимости от пути введения в 2-4 раза ниже токсичности левамизола.

Пример 3. Изучение имунотропной активности дигидрохлорида 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-а]бензимидазола (соединение I).

В качестве модели аутоиммунного процесса использованы адьювантный артрит и экспериментальный аллергический энцефаломиелит у крыс. Адьювантный артрит воспроизводили путем внутрикожной инъекции полного адьюванта Фрейнда (ПАФ) в основание хвоста в объеме 0,1 мл при дозе микробактерий 5 мг в 1 мл. Отек конечностей измеряли на электронно-механическом онкометре. Оценку тяжести артрита проводили в период манифестации (+14 день после индукции) внутрибрюшинно 1 раз в три дня в дозе 20 ЛД₅₀ с +1 по +14 день (всего 5 введений). Левамизол вводили по аналогичной схеме в эквивалентной дозе (табл.2).

При использовании соединения I и левамизола в дозе 1/9 ЛД₅₀ ежедневно внутрибрюшинно с +14 по +22 день эффекта не наблюдалось. Описанный характер действия характерен для иммунотропных препаратов и исключает подавление артрита за счет прямого антифлогистического эффекта.

Экспериментальный аллергический энцефаломиелит воспроизводили путем подкожного введения крысам 0,1 мл энцефалитогенной эмульсии, содержащей 200 мг изологичного спинного мозга и 2 мг в 1 мл БЦЖ в неполном адьюванте Фрейнда. Оценку тяжести неврологических симптомов проводили на +14 день. Соединение I и левамизол вводили внутрибрюшинно в дозе 1/20 ЛД₅₀ 1 раз в три дня с +1 по +14 день (табл.4).

Таким образом, в проведенных экспериментах левамизол, при введении в дозе 2,5 мг/кг (1/20 ЛД₅₀ ) 1 раз в три дня, вызывал лишь тенденцию к снижению тяжести артрита, в то время как соединение I при использовании по аналогичной схеме в эквивалентной дозе вызывало существенное подавление заболевания, превосходя левамизол по активности в 1,6-1,8 раз. Соединение I в условиях использованной модели не обладало антифлогистической активностью, так как при введении соединения с +14 по +22 день болезни эффекта не наблюдалось.

На модели экспериментального аллергического энцефалита у крыс соединение I при внутрибрюшном введении в дозе 1/20 ЛД₅₀ 1 раз в 3 дня с +1 по +14 день полностью подавляло развитие болезни, в то время как левамизол эффекта не оказывал.

Для оценки влияния соединения I и левамизола на неспецифическую иммунологическую реактивность был использован интегральный тест-модель летальной инфекции, вызванной введением микробного агента. Инфекцию вызывали внутрибрюшинным введением 1,25 ЛД₅₀ суточной культуры синегнойной палочки, что составило 60-70 млн микробных тел на одно животное.

Соединение I и левамизол вводили в эквивалентных дозах (1/20 ЛД₅₀), используя профилактический режим введения - во всех случаях последнее введение проводилось за сутки (-1 день) до инокуляции возбудителя (0-день). Результаты испытаний приведены в табл.5.

Таким образом, как соединение I, так и эталонный препарат левамизол независимо от пути введения при использовании в дозах, равных 1/20 ЛД₅₀ , для соответствующего пути введения вызывали стимуляцию неспецифической резистентности животных, наиболее отчетливый эффект наблюдался при введении в мышцу и в вену. Существенных преимуществ соединения I в сравнении с левамизолом выявлено не было.

Для оценки влияния соединения I и левамизола на опухолевый процесс были использованы перевиваемые штаммы солидных опухолей - карциносаркома Уокера (W-256), саркома Крокера (S-180) и асцитная опухоль Эрлиха (АОЭ-дипл.), полученные из ОНЦ АМН СССР. Методические аспекты эксперимента разработаны, а оценка эффекта проводилась согласно общепринятым требованиям к оценке противоопухолевых препаратов.

Соединение I и левамизол вводили с +1 дня и после имплантации опухолевого материала по +7 день, внутрибрюшинно или в вену, 1 раз в три дня в дозе 1/20 ЛД₅₀ для соответствующего пути введения. Результаты испытаний приведены в табл.6 и 7.

По факту, соединение I угнетает развитие солидных опухолей при введении с 0 дня имплантации опухолевого материала, трехкратно, внутрибрюшинно и внутривенно в дозе 1/20 ЛД₅₀ .

Таким образом, как соединение I, так и левамизол угнетают развитие солидных опухолей при введении с 0 дня имплантации опухолевого материала, трехкратно, внутрибрюшинно и внутривенно в дозе 1/20 ЛД₅₀, причем на модели саркомы-180 соединение I существенно угнетало рост опухоли, в то время как левамизол вызывал лишь тенденцию к уменьшению роста. На модели карциносаркомы-256 как соединение I, так и левамизол существенно угнетали рост опухоли, однако эффект соединения I был более выражен. Как соединение I, так и левамизол вызывали тенденцию к уменьшению роста асцитной опухоли.

Антиагрегационная активность соединения I изучена на модели необратимой агрегации тромбоцитов, вызванной (конечная концентрация 2·10^-4 М) на плазме здоровых доноров по методу В.А.Люсова с незначительной модификацией (Люсов В.А., Белоусов Ю.Б., Савенков М.П. Метод определения агрегации тромбоцитов и эритроцитов // Лаб. дело. - 1976. - № 8. с.463-468). В качестве эталонного антиагреганта использован пентоксифиллин (3,7-дигидро-3,7-диметил-1-(5-оксогексил)-1Н-пурин-2,6-дион, Aventis, Германия), который длительное время используется в клинике как корректор реологических нарушений. Результаты испытаний приведены в таблице 8.

Таким образом, по антиагрегационной активности соединение 1 превосходит пентоксифиллин в 7,9 раз.

Таким образом, новое соединение обладает выраженной иммунотропной активностью, в ряде случаев (аутоиммунитет и опухолевый процесс) превосходящей активность эталонного иммуномодулятора левамизола, выраженной антиагрегационной активностью, также превосходящей активность эталонного дезагреганта пентоксифиллина, и может найти применение в практической медицине.

«Дигидрохлорид 3-циклогексиламинометилтиазоло[3,2-a]бензимидазола, проявляющий иммунотропную и антиагрегационную активность»
Таблица 1
Острая токсичность соединения I и левамизола
Соединение и путь введения	Острая токсичность ЛД50, мг/кг
мыши	крысы
Соединение I
1. Внутрибрюшинно	187 (174÷201)	180
2. Внутрь	737 (554÷980)
3. Под кожу	296 (272÷322)
4. В вену	50 (45÷56)
Левамизол
1. Внутрибрюшинно	43 (39÷47)	47
2. Внутрь*	210
3. Под кожу*	84
4. В вену*	22
* - известные данные

Таблица 2
Влияние соединения I и левамизола на развитие адьювантного артрита у крыс при введении в дозе 1/20 ЛД50 с+1 по+14 день
Соединение	n*	Доза, мг/кг	Тяжесть артрита, балл
+14 день	+22 день
Соединение I	10	9	3,3±0,8 1	3,9±0,7 1,2
Левамизол	10	2,5	5,5±1,3	7,2±1,4
Контроль	10	-	8,9±1,5	10,4±1,2
Примечание: * - здесь и далее количество животных в группе
1 - значение существенно (P<0,05) отличается от контроля
2 - значение существенно (P<0,05) отличается от «левамизольной» группы.

Таблица 3
Влияние соединения I и левамизола на течение адьювантного артрита при введении в дозе 1/9 ЛД50 c +14 по +22 день
Соединение	n*	Доза, мг/кг	Тяжесть артрита, балл
Соединение I	8	20	4,8±1,6
Левамизол	8	5	5,3±2,0
Контроль	9	-	6,0±1,8

Таблица 4
Влияние соединения I и левамизола на развитие экспериментального энцефалита у крыс
Соединение	n*	Доза, мг/кг	Тяжесть артрита, балл
Соединение I	9	9	0,0±0,0
Левамизол	10	2,5	85,7±14,3
Контроль	10	-	100,0±14,3

Таблица 5
Влияние соединения I на резистентность мышей к летальной инфекции, вызванной синегнойной палочкой
Соединение	Схема введения и доза, мг/кг	Выживаемость животных, %	Средняя продолжительность жизни, сут.
+2 день	+7 день
1	2	3	4	5
Введение внутрь
Соединение I	ежедневно:	с -7 по -1,
	37 мг/кг	46	31	2,7±0,3*
	Трехкратно:	-7, -4, -1 день,
	37 мг/кг	35	25	3,0±0,5*
Левамизол	ежедневно:	с -7 по -1,
	11 мг/кг	20	8	1,6±0,2
Трехкратно:	-7, -4, -1 день,
11 мг/кг	44	33	3,5±0,5*
Контроль	-	23	14	1,8±0,2
Введение внутрибрюшинно
Соединение I	ежедневно:	с -7 по -1,
9 мг/кг	60	30	3,9±0,5*
Трехкратно:	-7, -4, -1 день,
9 мг/кг	100*	25	5,9±0,3*
Левамизол	ежедневно:	с -7 по -1,
2,5 мг/кг	70*	20	3,7±0,5*
Трехкратно:	-7, -4, -1 день,
2,5 мг/кг	90*	20	4,9±0,3*
Контроль	-	27	4	2,2±0,3
Введение в мышцу
Соединение I	ежедневно:	с -7 по -1,
15 мг/кг	90*	90*	6,4±0,7
трехкратно:	-7, -4, -1 день,
15 мг/кг	90*	90*	6,4±0,7*
двукратно:	-4, -1 день,
15 мг/кг	90*	90*	5,5±0,5*
однократно: -1,15 мг/кг	50	40	3,7±0,7
Левамизол	ежедневно:	с -7 по -1,
4 мг/кг	100*	100*	7,0±0,0*
трехкратно:	-7, -4, -1 день,
4 мг/кг	100*	70	6,4±0,2*
двукратно:	-4, -1 день,
4 мг/кг	75	75	5,5±0,7*
однократно: -1,4 мг/кг	60	50	4,4±0,7
Контроль	-	33	28	2,9±0,4
Введение под кожу и в вену
Соединение I	ежедневно под кожу:	с -7 по -1,
15 мг/кг	90*	56	5,6±0,7*
	двукратно в вену:	-4, -1 день,
2,5 мг/кг	100*	100*	7,0±0,0*
Левамизол	ежедневно под кожу:	с -7 по -1,
4 мг/кг	80*	40	4,4±0,7
	двукратно в вену: -4, -1 день, 1,1 мг/кг
100	100	7,0±0,0
Контроль	-	33	28	2,9±0,4
* - значение существенно отличается от контрольной группы (выживаемость оценивалась по критерию X2 Пирсона, средняя продолжительность жизни по критерию Стьюдента)

Таблица 6
Влияние соединения I и левамизола на рост перевиваемых солидных опухолей w-235 (крысы-самки) и s-180 (белые мыши-самцы)
Соединение	n	Доза и схема введения	Объем опухоли, на +7 день наблюдения, см3	Подавление роста, %
1	2	3	4	5
Карциносаркома w-235
Соединение I	10	9 мг/кг в/б 0, +3, +6,	0,03±0,0	88
Левамизол	10	2,5 мг/кг в/бр 0, +3, +6	0,05±0,02*	75
Контроль	10	-	0,21±0,04
Технический контроль
10	-	Спонтанных опухолей нет
Саркома s-180
Соединение I	14	9 мг/кг в/б 0, +3, +6,	0,50±0,09*	56
14	2,5 мг/кг в/бр 0, +3, +6	0,46±0,12	59
Левамизол	14	9 мг/кг в/б 0, +3, +6,	0,74±0,11	35
14	2,5 мг/кг в/бр	0,56±50,11	50
		0, +3, +6
Контроль	14	-	1,13±0,24
Технический контроль
	-	Спонтанных опухолей нет
* - значение существенно (P<0,05) отличается от контроля

Таблица 7
Влияние соединения I и левамизола на рост асцитной опухоли (АОЭ-дипл.) у мышей самцов при внутрибрюшинном введении
Соединение	n	Доза и схема введения	Объем асцита, мл	Подавление, %
I	10	9 мг/кг в/б 0, +3, +6,
4,2±0,8	30
Левамизол	10	2,5 мг/кг в/бр 0, +3, +6
3,6±1,2	40
Контроль	10	-	6,0±0,9
Технический контроль	10		Спонтанных опухолей нет

Таблица 8
Влияние соединения I на агрегацию тромбоцитов, вызванную АДФ
Соединение	EC50-концентрация, вызывающая 50% дезагрегацию тромбоцитов, мкмоль/мл
Соединение I	0,17(0,14÷0,19)
Левамизол	2,56(1,87÷3,50)
Пентоксифиллин	1,34(0,79÷2,25)