рекомбинантная плазмидная днк pfastbac-b17r, содержащая фрагмент генома вируса оспы коров, кодирующий альфа/бета-интерферонсвязывающий белок и штамм бакуловируса bvb17rg, продуцирующий растворимый альфа/бета-интерферонсвязывающий белок вируса оспы коров

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFastBac-В17R, предназначенная для транспозиции в бакуловирус и несущая фрагмент генома вируса оспы коров, кодирующий растворимый белок-аналог клеточного рецептора интерферонов 1-го типа, молекулярной массой 3,85 Мд и размером 5745 п.н., содержащая

ПСР-фрагмент генома вируса оспы коров штамма GRI-90, содержащий ген В 17R, полученный с использованием праймеров

1) 5' CGGGATCCTAGTGCCGTATAATGACGATGA 3',

2) 5' CCCAAGCTTGTATATAAAAATGCATTGTGTA 3',

кодирующий белок-аналог клеточного рецептора интерферонов 1-го типа, фланкированный сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII, размером 1073 п.н.;

BamHI- HindII- фрагмент векторной плазмиды pFastBac, размером 4672 п.н., включающий бакуловирусный промотор pPolh, мини-Тn7-транспазон и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40, обеспечивающий сайт-специфическую транспозицию ДНК гена В17R в геном бакуловируса;

генетические маркеры:

ген bla ( -лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину, и ген Gm^r, определяющий устойчивость к гентомицину, при трансформации E.coli;

уникальные сайты рестрикции:

BamHI (4032);

HindIII(5105);

EcoRI(4133;4550).

2. Штамм рекомбинантного бакуловируса BvB17RG, полученный с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-B17R по п.1, депонированный в коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-388, - продуцент растворимого белка-аналога клеточного рецептора интерферонов 1-го типа вируса оспы коров.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к субстанции, способной модулировать экзогенный синтез / -интерферона с целью создания лекарственных препаратов для иммунокоррекции или используемой как компонент тест-системы для определения интерферонового статуса человека в норме и патологии, в биологических образцах (кровь, ткани), и может быть использована в медицине и биотехнологии, в частности в генетической инженерии.

Интерфероны I-го типа ( - и -IFN) вырабатываются клетками теплокровных в ответ на вирусную инфекцию [1] и индуцируют экспрессию ряда генов, продукты которых обладают антивирусной активностью [2, 3]. В ряде случаев показана перспективность терапевтического использования интерферона-альфа [4-6].

Однако повышение уровня IFN наблюдается при ряде аутоиммунных заболеваний [7], на начальных этапах развития СПИДа [8]; при различных заболеваниях ЦНС и рассеянном склерозе усиливается продукция IFN [9, 10].

Поэтому поиск субстанций, способных модулировать эффекты IFN и IFN , представляет интерес для создания новых лекарственных препаратов для иммунокоррекции. Кандидатом на роль таких препаратов может быть / IFN- связывающий белок ортопоксвирусов. Этот белок также может быть использован как компонент тест-систем для определения содержания интерферонов в биологических образцах [11].

Известны аналоги, представленные в работах [12-14], описывающие белки, выделенные из биологических жидкостей человека, обладающие способностью связывать интерфероны I-го типа (IFN_I).

Наиболее близким аналогом (прототипом) заявляемого технического решения является интерферон-связывающий белок - продукт экспрессии гена B18R рекомбинантного штамма вируса осповакцины (BOB) Western Reserve [15].

Однако вирус осповакцины (ВОВ) непатогенен для человека, т.е. имеет недостаточно широкий круг хозяев. Известно, что ФНО- и комплемент-связывающие белки ортопоксвирусов, несмотря на высокую степень гомологии ортологичных генов, отличаются на биохимическом уровне, и большая биологическая активность соответствует белку более патогенного для человека вируса [16, 17].

Техническим результатом изобретения является расширение спектра препаратов (рекомбинантных / -интерферонсвязывающих белков) нового поколения, способных модулировать экзогенный синтез / -интерферона с целью создания лекарственных препаратов для иммунокоррекции, или используемых как компонент тест-систем для определения интерферонового статуса человека в норме и патологии.

Поставленная задача решается путем создания рекомбинантного бакуловируса - продуцента растворимого аналога клеточного рецептора интерферонов I-типа (IFN_I-BP) BOK. Первым этапом в создании штамма-продуцента является конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-B17R, содержащей фрагмент генома BOK, кодирующей аминокислотную последовательность аналога клеточного рецептора интерферонов I-го типа. Целевая плазмида pFastBac-B17R имеет размер 5913 п.о. и молекулярную массу 3,85 Мда и состоит из:

- фрагмента генома BOK штамма GRI-90 длиной 1161 п.о., кодирующего белок-аналог клеточного рецептора интерферонов I-го типа;

- векторной плазмиды pFastBac [19], длиной 4752 п.о., обеспечивающей сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в геном бакуловируса.

Рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате сайт-специфической транспозиции целевого фрагмента ДНК из донорной плазмиды pFastBac1-B17R в бакуловирусный вектор (бакмиду), находящийся в E.coli [19], после заражения им клеток насекомых Spodoptera frugiperda линии Sf21 продуцирует растворимый белок ВОК штамма GRI-90 (ИНФ_I-ВР) - аналог рецептора интерферонов I-го типа.

Заявляемый рекомбинантный штамм ВОК имеет более широкий круг хозяев среди животных и при контакте с больным животным может вызывать заболевание человека, а рекомбинантный штамм ВОВ-прототип непатогенен для человека. Как указывалось выше, известно, что ФНО- и комплемент-связывающие белки ортопоксвирусов отличаются на биохимическом уровне, и большая биологическая активность соответствует белку более патогенного для человека вируса [16, 17].

В качестве фрагмента генома ВОК используют фрагмент ДНК длиной 1161 п.о., полученный с помощью полимеразной цепной реакции. Матрицей для амплификации служит ДНК ВОК штамма GRI-90. Праймеры для амплификации гена-аналога рецептора ИНФ-гамма ВОК имеют следующую структуру:

1. 5' CGGGATCCTAGTGCCGTATAATGACGATGA 3'

2. 5' CCCAAGCTTGTATATAAAAATGCATTGTGTA 3'

В структуру праймера 1 и 2 заложены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIIII, соответственно. В качестве плазмидного вектора, обеспечивающего сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в бакмиду pMON14272 [18], используют плазмиду pFastBac [18], содержащую бакуловирусный специфический промотор pPolh для экспрессии белков в клетках насекомых, мини-Tn7-транспазон, ген устойчивости к гентамицину Gm^r, полилинкер для клонирования целевых генов и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40. Бакмида pMON14272 содержит низкокопийный мини-F репликон, ген устойчивости к канамицину и фрагмент ДНК, кодирующий -пептид гена -галактозидазы E.coli, и обеспечивает -комплементацию при размножении в штамме E.coli DH10Bac в присутствии хромогенного субстрата X-gal и индуктора IPTG.

Выбранная бакуловирусная система экспрессии обеспечивает высокий уровень синтеза целевого продукта и его правильную посттрансляционную модификацию по сравнению с другими системами экспрессии.

Сущность изобретения заключается в том, что из генома ВОК штамма GRI-90 методом ПЦР выделяется ген B17R, затем он клонируется в донорной плазмиде pFastBac и путем сайт-специфической транспозиции конструируется рекомбинантная бакмида, которая используется для трансфекции клеток насекомых, в результате чего генерируется рекомбинантный вирус BvB17RG, экспрессирующий указанный ген. Нуклеотидная последовательность встроенного фрагмента и кодируемая им аминокислотная последовательность приведены на фиг.1.

Штамм характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Штамм обладает свойствами типичного представителя бакуловирусов, но в отличие от векторного вируса имеет фенотип Lac^-.

Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного бакуловируса имеет длину около 140000 п.о. Наличие в его геноме целевой вставки длиной 1161 п.о подтверждено с помощью метода ПЦР. При размножении рекомбинантного бакуловируса на культуре клеток насекомых Spodoptera frugiperda линии Sf21 его титр не отличается от титра, получаемого при размножении вируса, не содержащего в своем геноме чужеродных фрагментов ДНК.

Основным отличием штамма является его способность синтезировать при инфицировании культуры клеток насекомых линии Sf21 белок IFN_I-BP/BOK, связывающий рекомбинантный интерферон 2В (IFNa2B). Уровень синтеза целевого белка составляет 2,5 мг/л культуральной жидкости инфицированных клеток Sf21.

Полученный штамм рекомбинантного бакуловируса BV-B17R депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора за номером V-388.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений:

Фиг.1. Нуклеотидная последовательность гена B17R ВОК (штамм GRI-90) [20] и аминокислотная последовательность рекомбинантного белка - аналога клеточного рецептора интерферонов I-го типа [GenBank, CAD90743]. Выделены жирным курсивом и подчеркнуты последовательности ДНК, комплементарные специфическим праймерам, использовавшихся для проведения ПЦР. Уникальные сайты эндонуклеазы рестрикции EcoRI выделены серым цветом.

Фиг.2. Представлена физическая карта плазмиды pFastBac-B17R. За первый нуклеотид плазмиды принимается первый нуклеотид межцистронной области фага fl; Tn7L, Тn7R-сайты встраивания транспазона Tn7; SV40polyA- сайт полиаденилирования вируса SV40; B17R - ген IFN_I-связывающего белка ВОК штамма GRI-90; pPolh- промотор полиэдрина; Ori-сайт инициации репликации; Ар^r, Gm^r- маркеры устойчивости к антибиотикам.

Фиг.3. Приведен электрофоретический анализ в 1% агарозе ПЦР-фрагментов, содержащих ген B17R, амплифицированных с помощью специфических праймеров с ДНК ВОК (GRI-90) (дорожка 1) и с бакмиды bMON14272-B17R (дорожка 2) и BamH/HindIII-гидролизатов рекомбинантных ДНК pFastBac и pFastBac-B17R (дорожки 3 и 4, соответственно). Дорожка М - ДНК-маркеры (100b.p.+1.5 Kb+3 Kb, НПО «Сибэнзим», Россия).

Фиг.4. Представлен электрофоретический анализ в 10% ПААГ рекомбинантного белка IFNJ_BP/BOK, выделенного методом аффинной хроматографии из клеток насекомых линии Sf-21 (дорожка 1); дорожка 2 - М - маркеры молекулярных масс белков (103.7 кДа, 81.1 кДа, 47.7 кДа, 35.8 кДа, 27.1 кДа и 19.3 кДа, Prestained SDS-PAGE Standarts, «BioRad», США).

Фиг.5. Представлен график 2В-интерферон- и дельтаферон-связывающие активности лизатов клеток Sf-21, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом BvB17RG (-о- и -, соответственно) и 2В-интерферон-связывающая активность лизатов клеток Sf-21.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже приведены примеры его осуществления.

Пример 1. Способ амплификации фрагмента ДНК, содержащего ген B17R BOK.

Реакцию амплификации проводят в пробирках Eppendorf под слоем минерального масла в объеме 50 мкл. Реакционная смесь содержит 10 мМ Tris-HCl рН 8.8, 50 мМ KCl, 2.5 мМ MgCl₂, 0.1% Tween 20, 0.2 мМ dATP, 0.2 мМ dCTP, 0.2 мМ dGTP, 0.2 мМ dTTP, олигонуклеотидные праймеры в количестве 40 пмол каждого, 2 ед.а. Tth-полимеразы, 2-10 нг ДНК-матрицы. Амплификацию ведут в течение 20 циклов по схеме:

Номер цикла	Температура (°C)	Время (мин)
1	93	2 мин
	53	1 мин
	72	1 мин
2-19	93	1 мин
	53	1 мин
	72	1 мин
20	93	1 мин
	53	1 мин
	72	10 мин

Далее в реакционную смесь добавляют хлороформ, отбирают водную фазу и переносят в чистую пробирку. Наличие амплифицированного продукта проверяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (фиг.3, дорожка 1).

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-B17R.

5-10 мкг плазмиды pFastBac [18] и 1-5 мкг амплифицированного продукта, соответствующего гену B17R BOK, гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIII в стандартных условиях. Полученные фрагменты выделяют электрофорезом в 1% агарозном геле с последующей элюцией. 0,2 мкг вектора и 0,6 мкг фрагмента лигируют в стандартных условиях и полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli штамма XL-blue. Клеточные Ap^r-клоны выращивают при 37°С в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Рекомбинантную плазмидную ДНК выделяют по стандартной методике и анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII. Из клонов, содержащих встроенный фрагмент, выделяют плазмидную ДНК, структуру которой в районе встройки подтверждают определением нулеотидной последовательности методом терминации синтезируемой цепи на автоматическом секвенаторе АВМ PRISM 310 (Perkin Elmer, Германия) (фиг.1).

Полученную таким образом целевую плазмиду, физическая карта которой представлена на фиг.2, обозначают pFastBac-B17R.

Пример 3. Получение бакмиды pMON14272-B17R.

К 100 мкл компетентных клеткок E.coli штамма DH10Bac добавляют 1 нг плазмиды pFastBac-B17R. Полученную смесь инкубируют во льду в течение 30 мин, затем при 42° в течение 45 сек с последующим охлаждением во льду в течение 2 мин. Реакционную смесь разводят 1:10 LB-бульоном и подращивают на качалке при интенсивной аэрации при 37° в течение 4-х часов. Далее клетки высевают на селективные чашки Петри с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл X-gal, 40 мкг/мл IPTG, 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, в термостате при 37°С и инкубирют в течение суток. Клоны с фенотипом Lac^- засевают в пробирки с 5 мл LB-бульоном, содержащим 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина и выращивают при интенсивной аэрации при 37° до стационарной фазы. Культуру переносят в 1,5 мл пробирки Eppendorf, осаждают клетки центрифугированием в течение 40 секунд при 14000g, удаляют среду. Процедуру добавления культуры, осаждения и удаления среды повторяют еще два раза. Осадок ресуспендируют в 0.3 мл раствора 1 (10 мМ ЭДТА, 15 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мкг/мл РНКазы), добавляют 0.3 мл раствора 2 (0.2 М NaOH, 1% SDS) и инкубируют при комнатной температуре 5 минут. К смеси медленно добавляют 0.3 мл раствора 3 (3 М KAc pH 5.2). Инкубируют во льду 10 минут. Центрифугируют при 14000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносят в чистую пробирку, добавляют 0.8 мл изопропанола, перемешивают и охлаждают при -20°С 5 минут, затем осаждают при 14000 об/мин 15 минут. Осадок промывают два раза этанолом, высушивают, растворяют в 40 мкл буфера ТЕ. Наличие в геноме бакмиды интегрированного фрагмента ДНК подтверждают с помощью ПЦР (Фиг.3, дорожка 2). Полученную бакмидную ДНК pMON14272-B17R используют для трансфекции клеток насекомых линии Sf21.

Пример 4. Трансфекция клеток насекомых Sf21 рекомбинантной бакмидной ДНК pMON14272-B17R и получение рекомбинантного вируса BvB17RG.

Клетки Sf21 засевают в лунки 6-луночного планшета из расчета, чтобы на следующий день был монослой (2×10 ⁶ клеток/лунку), в 2 мл среды Грейса, содержащей 10% эмбриональной сыворотки коров (ЭСК) (ООО «БиолоТ», Россия). На следующий день готовят два раствора: 10 мкл вирусной ДНК + 100 мкл среды Грейса и 6 мкл реактива CellFECTIN (« LifeTechnologies», США) + 100 мкл среды Грейса. Растворы смешивают, инкубируют при комнатной температуре 25 минут. В это время промывают монослой клеток два раза средой Грейса. К клеткам добавляют по 0,8 мл/лунку среды Грейса и 200 мкл приготовленного раствора. Инкубируют клетки при 28°С в течение 5 ч. После этого отбирают среду и добавляют к клеткам по 2 мл среды Грейса с 10% ЭСК. Клетки инкубируют при 28°С в течение 2-5 суток. Далее клетки ресуспендируют (интенсивным пипетированием), центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин и осветленный супернатант расфасовывают в стерильные пробирки. Титр вируса определяют следующим образом. К монослою клеток Sf21 добавляют 200 мкл разведения вируса и проводят адсорбцию в течение 60 минут при комнатной температуре. Далее готовят 2% легкоплавкую агарозу (Sigma, США) и смешивают ее в расплавленном виде со средой Грейса (10% ЭСК) в соотношении 1:1. Полученную среду охлаждают в термостате до 37°С и добавляют по 2 мл на лунку, а после застывания добавляют по 2 мл на лунку среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют в термостате при 28°С 5 суток. Далее добавляют по 2 мл на лунку краситель нейтральный красный (0,6% водный раствор), разведенный в среде Грейса с 10% ЭСК, в соотношении 1:20. Инкубируют при 28°С в течение суток. Титр определяют путем подсчета окрашенных бляшек. Последний составляет 10⁷ БОЕ/мл. Суспензию рекомбинантного вируса титруют и хранят при -20°С.

Пример 5. Заражение клеток насекомых Sf21 рекомбинантным вирусом.

200 мкл размороженного вирусного материала с титром 10⁷ наносят на монослой клеток насекомых Sf21 в матрасе для культивирования объемом 250 мл. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации добавляют 25 мл среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют при 28°С в течение 2-3 суток. Далее клетки ресуспендируют интенсивным пипетированием и центрифугируют. Осветленный супернатант используют для выделения продукта экспрессии гена B17R BOK в клетках насекомых методом аффинной хроматографии.

Пример 6. Выделение методом аффинной хроматографии белка IFN_I-BP/BOK - продукта экспрессии гена B17R ВОК в клетках насекомых.

Для приготовления аффинного носителя 1 г CNBr-активированной сефарозы 4В ("Sigma", США) промывают на стеклянном фильтре 3 мМ HCl и ресуспендируют в 3,5 мл 50 мM натрий-бикарбонатного буфера (рН 8.0), содержащего рекомбинантный 2В-интерферон (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия, [20]). Иммобилизацию интерферона проводят 18 часов при температуре 5°С при мягком перемешивании. Полученной суспензией заполняет колонку размером 0,5×4 см, промывают ее 10-ю мл 0,2 М глицин-HCl (рН 2,5) и уравновешивают 10 мМ трис-HCl (рН 8,0). 200 мл осветленного супернатанта клеток линии Sf21, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, наносят на подготовленную колонку с 2В-интерферон-сефарозой. Колонку промывают 30 мл буфера (10 мМ трис-HCl, рН 6,0). Рекомбинантный белок IFN_I-BP/BOK элюируют с колонки буфером, содержащим 0,2 М глицин-HCl (рН 2,5). Все операции выполняют при температуре 8°С и скорости элюции 4 мл/час. Объем фракций при элюировании составляет 2,5 мл. Детекцию целевого продукта проводят спектрофотометрически на спектрофотометре «Perlin-Elmer 550» (Германия), а затем электрофоретическим анализом фракций по методу Лэмли [21] (Фиг.4). Выход целевого продукта IFN_I-BP/BOK составляет 2,5 мг из 200 мл осветленного лизата. Полученный рекомбинантный белок используют для получения поликлональных антител.

Пример 7. Получение поликлональных антител к рекомбинантному белку IFN_I-ВР/ВОК.

Для получения поликлональных антител проводят 3-кратную иммунизацию беспородных кроликов массой 2-3 кг инъекциями подкожно в области спины полученным рекомбинантным белком. При первом введении антиген эмульгируют в полном адъюванте Фрейнда («Sigma», США), при последующих иммунизациях с интервалами в 7 дней вводят антиген в физиологическом растворе. Через неделю после последней инъекции у животных отбирают кровь из краевой вены уха и отделяют сыворотку. Иммуноглобулины из сыворотки кролика 3-кратно высаливают сульфатом аммония при конечном насыщении 33%.

Пример 8. Определение интерферон-связывающей активности продукта экспрессии гена B17R методом твердофазного иммуноферментного анализа.

В лунки 96-луночного полистирольного планшета вносят для адсорбции по 100 мкл раствора 2В-интерферона или аналога гамма-интерферона - дельтаферона [22] (оба цитокина - производства ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) в 50 мМ бикарбонате натрия (концентрация интерферонов 2 мкг/мл) и инкубируют 18-20 часов при температуре 8°С. Затем лунки планшета промывают буфером В (10 мМ калий-фосфат, рН 7,4, содержащий 0,8% NaCl и 0,05% твин-20). После удаления содержимого планшета для подавления неспецифичного связывания в лунки вносят 0,1% БСА («Sigma», США) в буфере В и инкубируют при комнатной температуре 2 часа, удаляя затем раствор из лунок аспирацией. В лунки планшета вносят по 100 мкл различных разведении осветленных супернатантов неинфицированных и инфицированных рекомбинантным бакуловирусом BV-B17R клеток Sf21. Для приготовления разведении используют 0,1% БСА в буфере В. Планшет инкубируют в 18 ч при 8°С. После трехкратной промывки буфером B в лунки планшета вносят по 100 мкл поликлональной антисыворотки к рекомбинантному белку IFN_I-BP/BOK, разбавленной 0,1% БСА в буфере в соотношении 1:10000. Планшет инкубируют в 18 ч при 8°С. После трехкратной промывки буфером B в каждую лунку вносят по 100 мкл рабочего раствора коньюгата белка А с пероксидазой хрена («Sigma», США), инкубируют 2 часа при комнатной температуре. По окончании инкубации лунки планшета трижды промывают буфером В, затем в каждую лунку вносят по 100 мкл свежеприготовленного 0,04% раствора о-фенилендиамина («Sigma», США) в 25 мМ цитратно-фосфатном буфере (рН 4,5), содержащем 0.012% перекиси водорода. Планшет инкубируют 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл/лунка 1 М HCl. Результаты иммуноферментного анализа регистрируют, измеряя оптическую плотность при длине волны 495 нм на приборе Microplate Reader EL_X808 («BIO-TEK INSTRUMENTS, INC», США) (Фиг.5).

Таким образом, получен рекомбинантный бакуловирус BvB17RG, обеспечивающий экспрессию гена B17R вируса оспы коров штамма GRI-90 - аналога гена клеточного рецептора интерферонов I-го типа в клетках насекомых линии Sf21. Полученный штамм может быть использован для получения рекомбинантного белка IFN_I-BP/BOK, который, в свою очередь, может быть использован для разработки лекарственных препаратов, способных модулировать экзогенный синтез интерферона, либо новой отечественной тест-системы для определения интерферонового статуса человека в норме и патологии.