устройство и способ ввода жидкой пробы в поток флюидного носителя и их применение для амплификации нуклеиновой кислоты

Формула изобретения

1. Устройство ввода жидкой пробы в поток флюидного носителя, протекающего через трубку непрерывного потока, имеющую выпуск и общий впуск, в которую введены как указанный поток носителя, так и указанная жидкая проба, причем устройство содержит резервуар для непрерывного снабжения указанного впуска указанным флюидным носителем, указанный резервуар приспособлен для поддержания главным образом постоянного уровня флюидного носителя над указанным впуском и флюидно связан с указанным впуском указанной трубки непрерывного потока таким образом, что при использовании указанный поток флюидного носителя и указанную жидкую пробу всасывают через указанную трубку непрерывного потока, когда указанный резервуар находится главным образом под атмосферным давлением и когда указанный флюидный носитель представляет собой гидрофобную жидкость, а жидкая проба представляет собой водную пробу.

2. Устройство по п.1, в котором гидрофобная жидкость представляет собой масло.

3. Устройство по п.2, в котором масло представляет собой силиконовое масло или масло на базе силикона.

4. Способ введения жидкой пробы в поток флюидного носителя, протекающего через трубку непрерывного потока, имеющую выпуск и общий впуск, в которую введены как указанный поток носителя, так и указанная жидкая проба, причем указанный способ включает в себя следующие операции:

использование устройства по п.1,

создание флюидной связи указанного впуска указанной трубки непрерывного потока с указанным резервуаром,

введение указанного флюидного носителя в указанный резервуар и введение указанной жидкой пробы в указанный флюидный носитель, причем указанный поток флюидного носителя и указанную жидкую пробу всасывают через указанную трубку непрерывного потока, когда указанный резервуар находится главным образом под атмосферным давлением, при этом указанный флюидный носитель представляет собой гидрофобную жидкость, а жидкая проба представляет собой водную пробу.

5. Способ введения объема жидкой пробы в поток флюидного носителя, протекающего через трубку непрерывного потока, имеющую выпуск и общий впуск, в которую введены как указанный поток носителя, так и указанная жидкая проба, причем указанный способ включает в себя следующие операции:

использование устройства по п.1,

создание флюидной связи указанного впуска указанной трубки непрерывного потока с указанным резервуаром,

введение указанного флюидного носителя в указанный резервуар,

погружение распределителя жидкой пробы в указанный флюидный носитель, который содержится в указанном резервуаре,

распределение указанной жидкой пробы в указанный впуск и перемещение указанной распределяемой дозируемой жидкой пробы при помощи указанного распределителя жидкой пробы, так чтобы вводить указанную распределяемую жидкую пробу в указанный впуск и всасывать ее через указанную трубку непрерывного потока, причем указанный поток флюидного носителя и указанную жидкую пробу всасывают через указанную трубку непрерывного потока, когда указанный резервуар находится главным образом под атмосферным давлением, при этом указанный флюидный носитель представляет собой гидрофобную жидкость, а жидкая проба представляет собой водную пробу.

6. Система непрерывного потока, которая содержит устройство по п.1.

7. Система по п.6, которая представляет собой устройство термоциклирования для осуществления реакций амплификации нуклеиновой кислоты.

8. Способ амплификации нуклеиновой кислоты в PCR- или LCR-формате с использованием системы непрерывного потока по п.6 или 7.

Описание изобретения к патенту

Область применения изобретения

Настоящее изобретение, в общем, имеет отношение к термоциклерам, в частности к термоциклерам для автоматического и непрерывного циклирования флюида между множеством температурных зон, предназначенным в первую очередь для амплификации нуклеиновой кислоты. Однако следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничено только этой специфической областью использования.

Более конкретно, настоящее изобретение также имеет отношение к системе непрерывного потока и, в частности, к устройству для ввода объема жидкой пробы в систему непрерывного потока.

Предпосылки к созданию изобретения

Системы, которые требуют проведения многократных или циклических химических реакций для создания желательного продукта, часто требуют тщательного контроля температуры, и поддержания воспроизводимого и точного контроля температуры в течение времени реакции. Такие реакции включают в себя, например, реакции амплификации нуклеиновой кислоты, такие как цепная реакция полимеразы (PCR) и цепная реакция лигазы (LCR).

PCR предусматривает использование множества циклов, которые приводят к геометрической амплификации определенных полинуклеотидных последовательностей, всякий раз, когда цикл завершается. Техника PCR хорошо известна и описана в различных книгах, в том числе PCR: A Practical Approach M.J. McPherson, et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications by Innis, et al., Academic Press (1990), and PCR Technolog): Principals and Applications for DNA Amplification H.A.Eriich, Stockton Press (1989). PCR также описана во многих патентах США, в том числе 4683195; 4683202; 4800159; 4965188; 4889818; 5075216; 5079352; 5104792; 5023171; 5091310; и 5066584.

PCR техника типично предусматривает операцию денатурации полинуклеотида, за которой следует операция отжига по меньшей мере пары олигонуклеотидных праймеров в денатурированный полинуклеотид, то есть скрещивание праймера с матрицей денатурированного полинуклеотида. После операции отжига фермент с активностью полимеразы катализирует синтез новой полинуклеотидной цепи, которая содержит олигонуклеотидный праймер и использует первичный денатурированный полинуклеотид как матрицу синтеза. Эти серии операций (денатурирование, отжиг праймера и расширение праймера) образуют PCR цикл.

По мере того как циклы повторяются, количество вновь синтезированного полинуклеотида возрастает геометрически, так как вновь синтезированные полинуклеотиды из более ранних циклов могут служить в качестве матриц для синтеза в последующих циклах. Олигонуклеотидные праймеры типично выбирают парами, которые могут отжигать противоположные цепи данной двухцепочечной полинуклеотидной последовательности, так что область между двумя сайтами отжига расширяется.

Денатурирование ДНК типично имеет место в диапазоне ориентировочно от 90 до 95°C, отжиг праймера в денатурированную ДНК типично осуществляют в диапазоне ориентировочно от 40 до 60°C, а операцию расширения отожженных праймеров с полимеразой типично осуществляют в диапазоне ориентировочно от 70 до 75°C. Следовательно, во время PCR цикла температуру реакционной смеси необходимо изменять, причем изменять много раз во время мультицикла PCR эксперимента.

Уже известно множество термических "циклеров", использованных для ДНК амплификации и задания последовательности операций, в которых один или несколько контролируемых (регулируемых) элементов или "блоков" поддерживают и регулируют температуру реакционной смеси, причем задаваемая блоком температура изменяется во времени. Недостатком таких устройств является то, что они медленно осуществляют циклирование реакционных смесей, причем контроль температуры далек от идеального. Чтобы исключить необходимость циклического повышения и понижения температуры блоков нагрева, уже разработано устройство, известное как термоциклер. В этом устройстве множество блоков контроля температуры создают различные желательные температуры и используют руку (манипулятор) робота для перемещения реакционных смесей от одного блока к другому. Типичные системы термоциклера раскрыты в патентах США 5443791. 5656493 и 6656724. Однако следует иметь в виду, что эти системы также имеют собственный набор недостатков. Например, они имеют относительно низкую производительность, большие габариты, склонны к отказам, являются дорогими и требуют постоянного текущего технического обслуживания.

Недостатки этих известных устройств частично устранены при помощи патента США 5270183. По существу, это изобретение направлено на пропускание реагентов через непрерывную трубку, в которой создают различные температуры при помощи обмоток в виде цилиндра, намотанных вокруг трубки и создающих различные температуры. Для того чтобы исключить перекрестное загрязнение между пробами, реакционную смесь впрыскивают в поток флюидного носителя, который разделяет индивидуальные реакционные смеси, и пропускают через две или три отдельные зоны нагрева. Флюидный носитель и реакционная смесь являются несмешивающимися, так что каждая проба чисто разделяется от предыдущей и последующей пробы при помощи сегментов флюидного носителя. Такая схема построения позволяет производить последовательную обработку ряда проб. Однако это устройство имеет недостатки, например, за счет того, что зоны нагрева разделены в пространстве, что неудобно для контроля в реальном времени хода реакции. Кроме того, разделение друг от друга зон нагрева увеличивает габариты устройства.

Усовершенствование устройства, раскрытого в патенте США 5270183, описано в публикации WO 03/016558, в которой используют единственный цилиндр, который в продольном направлении разделен по меньшей мере на два сегмента, которые могут быть нагреты до различных температур, так что цилиндр может иметь внешние поверхности, нагретые до различных температур. Когда реагенты проходят через непрерывную трубку с расположенной вокруг нее обмоткой, они подвергаются воздействию чередующихся температур. Однако этот термоциклер имеет недостаток, связанный с тем, что трудно обеспечить достаточно быстрое считывание данных с использованием линейного устройства слежения, которое сканирует периферию цилиндра.

Что касается в целом систем и устройств непрерывного потока, в том числе и описанных здесь выше термоциклеров, то они типично работают под положительным давлением и требуют использования насосов для нагнетания флюидного носителя через непрерывную трубку, такую как реакционная трубка. Типично, такими насосами являются насосы высокого или сверхвысокого давления. Следовательно, эти известные устройства непрерывного потока требуют использования специализированных нагнетательных портов высокого давления для впрыскивания жидкой пробы в поток флюидного носителя, который нагнетают под высоким давлением через трубку. Эти нагнетательные порты высокого давления имеют различные недостатки, однако их основным недостатком является склонность к перекрестному загрязнению между пробами, например загрязнение проб во время загрузки, в значительной степени вызванное использованием перегородки и иглы (septum-needle) для впрыскивания проб, или между пробами, когда они проходят по трубке.

Таким образом, остается необходимость в создании усовершенствованных систем непрерывного потока, а также средств обработки и доставки проб.

Задачей настоящего изобретения является устранение или смягчение по меньшей мере одного из указанных недостатков.

Сущность изобретения

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается устройство для ввода объема жидкой пробы в поток флюидного носителя, протекающего через трубку непрерывного потока, имеющую выпуск и общий впуск, в которую введены указанный поток носителя и указанная жидкая проба, причем указанный порт содержит: резервуар для непрерывной подачи на указанный впуск указанного флюидного носителя, причем указанный резервуар выполнен с возможностью поддержания главным образом постоянного уровня флюидного носителя над указанным впуском и флюидно связан с указанным впуском указанной трубки непрерывного потока таким образом, что при использовании указанный поток флюидного носителя и указанная жидкая проба всасываются через указанную трубку непрерывного потока, когда указанный резервуар находится главным образом под атмосферным давлением и когда указанный флюидный носитель выбран так, что его свойства достаточны для поддержания физической формы жидкой пробы, введенной в него. Жидкой пробой является водная проба, а флюидным носителем является гидрофобная жидкость. Флюидным носителем может быть подходящее масло, такое как силиконовое масло.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается устройство непрерывного потока, которое содержит описанное выше устройство ввода жидкой пробы в поток флюидного носителя.

Преимущественно устройством непрерывного потока является устройство термоциклирования для осуществления реакций амплификации нуклеиновой кислоты. Предпочтительным способом амплификации нуклеиновых кислот является PCR или LCR-форма.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ введения объема жидкой пробы в поток флюидного носителя, протекающего через имеющую выпуск и общий впуск трубку непрерывного потока, в которую введены как указанный поток носителя, так и указанная жидкая проба, причем указанный способ включает в себя следующие операции: использование устройства ввода пробы в соответствии с изобретением; создание флюидной связи указанного впуска указанной трубки непрерывного потока с указанным резервуаром; введение указанного флюидного носителя в указанный резервуар и введение указанной жидкой пробы в указанный флюидный носитель, причем указанный флюидный носитель выбран так, что его свойства достаточны для поддержания физической формы жидкой пробы, и так, что указанный поток флюидного носителя и указанную жидкую пробу всасывают через указанную трубку непрерывного потока, когда указанный резервуар находится главным образом под атмосферным давлением.

В качестве варианта предлагается способ введения объема жидкой пробы в поток флюидного носителя, протекающего через имеющую выпуск и общий впуск трубку непрерывного потока, в которую введены как указанный поток носителя, так и указанная жидкая проба, причем указанный способ включает в себя следующие операции: использование устройства ввода пробы в соответствии с изобретением; создание флюидной связи указанного впуска указанной трубки непрерывного потока с указанным резервуаром; введение указанного флюидного носителя в указанный резервуар; погружение распределителя (дозатора) жидкой пробы в указанный флюидный носитель, содержащийся в указанном резервуаре; распределение (дозирование) указанной жидкой пробы поблизости от указанного впуска и, возможно, перемещение указанной распределенной жидкой пробы при помощи указанного распределителя жидкой пробы таким образом, что указанную распределенную жидкую пробу вводят в указанный впуск и всасывают через указанную трубку непрерывного потока, причем указанный флюидный носитель выбран так, что его свойства достаточны для поддержания физической формы жидкой пробы, и так, что указанный поток флюидного носителя и указанную жидкую пробу всасывают через указанную трубку непрерывного потока, когда указанный резервуар находится главным образом под атмосферным давлением.

Если из контекста четко не следует иное, то во всем описании и в формуле изобретения слова "содержит", "содержащий" и производные от них следует понимать как "включает в себя, но без ограничения ".

Кроме рабочих примеров, или если из контекста четко не следует иное, то все числа, указывающие количества ингредиентов или условия реакции, следует понимать во всех случаях как ориентировочные. Примеры не следует толковать в смысле, ограничивающем объем изобретения. Далее во всех случаях, если четко не указано иное, "%" означает "вес.%", "отношение" означает "весовое отношение " и "доли" означают "весовые доли ".

Определения

В описании и в формуле изобретения будет использована терминология в соответствии с приведенными ниже определениями. Также следует иметь в виду, что эта терминология использована здесь только для описания специфических вариантов изобретения и не имеет ограничительного характера. Если четко не указано иное, то все использованные здесь технические и научные термины имеют значение, понятное специалистам в данной области, для которых и предназначено настоящее изобретение. При этом для краткости устройство для ввода жидкой пробы называется «порт пробы».

Использованный здесь термин "навитый", "намотанный" и их производные относятся к реакционной трубке, вводимой в контакт с теплообменниками. Таким образом, например, реакционная трубка расположена внутри или намотана через туннели теплообменников, как это четко показано на фиг.3. Термин "навитый" также относится к вариантам, в которых реакционная трубка поочередно входит в поверхностные канавки, расположенные на поверхности теплообменников, то есть она плотно (с защелкиванием) входит в указанные канавки или намотана вокруг теплообменников.

Термин "туннель", использованный в контексте настоящего изобретения, включает в себя все конфигурации, в которых отверстие полностью находится внутри стенки теплообменников, то есть полностью закрыто, а также полукруглые отверстия, каналы и/или канавки в или на поверхности теплообменников, в которые вводят реакционную трубку, чтобы создать связь теплоотдачи. Термины "туннель" и "канавка" могут быть использованы, заменяя друг друга.

Термин "вложенный один в другой", использованный в контексте настоящего изобретения, включает в себя конфигурацию теплообменников, в которой по меньшей мере один теплообменник главным образом охватывает другой теплообменник или расположен главным образом внутри границ другого теплообменника. Например, в предпочтительном варианте, показанном на фиг.1, предусмотрена пара колец, причем диаметр одного кольца меньше диаметра другого кольца, так что кольцо меньшего диаметра может быть введено внутрь границ кольца большего диаметра.

Термин "всасывать" и его производные, которые используют в отношении потока флюидного носителя, который всасывают через трубку непрерывного потока, когда всасывающая сила приложена к выпуску трубки непрерывного потока, следует различать от термина "нагнетать" поток флюидного носителя через трубку непрерывного потока, когда сила нагнетания приложена к впуску. Силу нагнетания типично создают за счет использования насоса высокого давления, такого как насос высокого давления (HPCL насос). В отличие от этого всасывающую силу типично создают за счет использования всасывающего/вакуумного насоса, при необходимости совместно с устройством типа термос (vacuum bottle). В контексте настоящего изобретения силу нагнетания можно считать положительной силой, а всасывающую силу отрицательной силой. Более того, в контексте настоящего изобретения резервуар считают не имеющим приложенного давления, главным образом превышающего атмосферное давление, когда флюидный носитель всасывают через трубку непрерывного потока. Флюид также может "всасываться" через трубку непрерывного потока за счет действия силы тяжести (когда используют некоторые флюидные носители).

Использованный здесь термин "атмосферное давление" имеет отношение к атмосферному давлению, составляющему главным образом 101.325 кПа (то есть 760 мм рт. столба) или к его эквиваленту на разных высотах над уровнем моря. Однако специалисты легко поймут, что этот термин подвержен вариации и указанное число не следует понимать как точное значение.

Указанные ранее и другие характеристики изобретения будут более ясны из последующего детального описания, приведенного со ссылкой на сопроводительные чертежи.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показан вид сверху в перспективе термоциклера в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг.2 показан вид снизу в перспективе термоциклера, показанного на фиг.1.

На фиг.3 показан вид сверху термоциклера, показанного на фиг.1, где можно видеть участок реакционной трубки, с навивкой (threadedly), введенной в туннели.

На фиг.4 показан вид в перспективе термоциклера, установленного в PCR-устройстве.

На фиг.5 показан вид, аналогичный показанному на фиг.4, но содержащему вращаемый сканирующий детектор, установленный над кольцами теплообменника.

На фиг.6 показан вид, аналогичный показанному на фиг.5, со сканирующим детектором, повернутым на 90°.

На фиг.7 показан вид, аналогичный показанному на фиг.6, где можно видеть каналы обнаружения.

На фиг.8 показан вид, аналогичный показанному на фиг.7.

На фиг.9 показан вид сверху в перспективе термоциклера, установленного в PCR-устройстве, с внутренним теплообменником, условно показанным (ghosted-out) для ясности (для упрощения понимания).

На фиг.10 показан вид сбоку PCR-устройства, показанного на фиг.9.

На фиг.11 показан вид, аналогичный показанному на фиг.10, но с внешним теплообменником, удаленным для упрощения понимания, и с условно показанным внутренним теплообменником, чтобы показать 45° вращающееся зеркало и щель для проведения оптических измерений реакционной трубки.

На фиг.12 показан вид снизу в перспективе, соответствующий показанному на фиг.9, где можно видеть дихроичное зеркало и связанную с ним оптику.

На фиг.13 показан вид в перспективе, где можно видеть дихроичное зеркало и связанную с ним оптику, показанные на фиг.12.

На фиг.14 показан вид в перспективе устройства, содержащего 45° вращающееся зеркало.

На фиг.15 показан растровый образ, собранный из последовательных циклов сканирования проб, проходящих через реакционную трубку.

На фиг.16 показаны данные, аналогичные показанным на фиг.15, преобразованные в график зависимости относительной интенсивности от числа оборотов трубки.

На фиг.17 показаны кривые плавления ДНК для проб, проанализированных с матрицей (эти кривые превышают порог) и без матрицы (которые не превышают порог).

На фиг.18 показан вид сбоку устройства в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения, ранее введения жидкой пробы во впуск трубки непрерывного потока.

На фиг.19 показан вид, аналогичный показанному на фиг.1, но с жидкой пробой, введенной в резервуар флюидного носителя.

На фиг.20 показан вид, аналогичный показанному на фиг.2, но с жидкой пробой после ее всасывания во впуск трубки непрерывного потока.

На фиг.21 показан вид сбоку альтернативного устройства.

Подробное описание изобретения

Обратимся сначала к рассмотрению фиг.1-3, на которых показан термоциклер, который содержит пару отдельных вложенных один в другой колец 1 и 2 теплообменника в виде прямых цилиндров, а именно внутреннее кольцо и внешнее кольцо. Каждое кольцо содержит множество туннелей 3, идущих продольно через его стенку. Число туннелей может составлять ориентировочно от 15 до 70, однако в типичной конфигурации предусмотрены около 40 туннелей. Каждое кольцо 1 и 2 теплообменника выполнено с возможностью поддержания различной заданной температуры, за счет чего образуются две температурные зоны. Температуру поддерживают с использованием средств нагрева и/или охлаждения в виде одной или нескольких проволок высокого сопротивления или одного или нескольких устройств Пельтье (не показаны). Профиль температур вдоль осевой длины колец 1 и 2 теплообменника поддерживают главным образом на постоянном значении. Внутреннее кольцо 1 и/или внешнее кольцо 2 теплообменника могут быть также разделены на пару отдельных смещенных по оси подколец (не показаны). Каждое из подколец может быть выполнено с возможностью поддержания различной заданной температуры, за счет чего образуются третья и/или четвертая температурные зоны. Температурные зоны могут поддерживаться при любой температуре, но для амплификации нуклеиновой кислоты с использованием PCR-методологии типично выбирают температуры около 95°C, около 60°C и около 72°C. Однако, в альтернативных вариантах, термоциклер может иметь один или несколько дополнительных теплообменников, охватывающих внешний теплообменник для создания дополнительных температурных зон.

Реакционная трубка 4 с навивкой введена при тесной пригонке с туннелями 3, что позволяет проводить тепло от колец 1 и 2 теплообменника во флюид в реакционной трубке. Реакционная трубка почередно навита (alternatingly threaded) через последовательные туннели каждого кольца 1 и 2, так что флюид, проходящий через реакционную трубку 4, циклически проходит через температурные зоны.

Типично, реакционная трубка 4 является прозрачной и изготовлена из инертного материала, такого как Teflon, Tefzel или другой аналогичный материал, причем трубка преимущественно является упругой, чтобы позволить навивать ее через туннели. Более того, внутренняя поверхность трубки 4 должна быть гидрофобной, чтобы исключить прилипание пробы, ее составляющих или других потенциальных загрязняющих веществ.

Каждое кольцо 1 и 2 содержит соответствующую матрицу 5 и 6 взаимно противоположных формаций 7 для совмещения реакционной трубки, на соответствующих торцевых поверхностях 8 и 9 указанных колец. Формации 7 расположены на внутренней периферийной кромке 10 внешнего кольца 2 и на внешней периферийной кромке 11 внутреннего кольца 1. Формации 7 преимущественно представляют собой продольно заглубленные идущие по радиусу пазы для установки трубки 4, так что трубка сидит главным образом заподлицо с каждой торцевой поверхностью 8 и 9 каждого кольца 1 и 2.

Реакционная трубка 4 дополнительно содержит впускной порт для введения флюидов в трубку и устройство нагнетания для поддержания постоянного потока через трубку (не показаны). Подходящим устройством нагнетания является объемный насос, который поддерживает поток около 100-200 мкл/ мин через реакционную трубку, под давлением ориентировочно от 70 до 700 кПа. Противодавление также может быть приложено к концу реакционной трубки и может составлять ориентировочно от 30 до 70 кПа, однако система также хорошо работает и без противодавления. Если противодавление приложено, то флюиды удерживают под давлением, чтобы исключить или свести к минимуму обезгаживание или испарение потока флюида.

Флюиды, введенные в реакционную трубку, содержат пробу, подлежащую анализу или введению в реакцию, реагенты, подлежащие использованию в анализе или реакции, и флюидный носитель. Флюидный носитель разделяет подлежащую анализу или введению в реакцию пробу от следующей пробы и главным образом предотвращает загрязнение между пробами. Флюидный носитель типично представляет собой силиконовое масло, однако также может быть использовано любое синтетическое масло, не содержащее биологических загрязняющих веществ, таких как РНК или ДНК.

Типичная проба для амплификации нуклеиновой кислоты может содержать ДНК, олигонуклеотидные праймеры, дезоксиаденозин трифосфат (dATP), дезоксицитидин трифосфат (dCTP), дезоксигуанозин трифосфат (dGTP), дезокситимидин трифосфат (dTTP) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, в которую входят термостабильная ДНК-полимераза, ферментно активные ее фрагменты, ферментно активные ее производные и обратная транскриптаза.

Специалисты легко поймут, что скорость потока, относительная осевая длина колец 1 и 2 теплообменника и/или диаметр реакционной трубки 4 могут влиять на время, в течение которого пробу поддерживают при заданной температуре. При типичной реакции амплификации нуклеиновой кислоты время выбирают так, чтобы оно было достаточным для того, чтобы протекали следующие реакции:

(a) денатурирование ДНК в цепи ее компонентов;

(b) отжиг олигонуклеотидных праймеров в комплементарные последовательности в ДНК; и

(c) синтез новых цепей ДНК.

Эти три этапа повторяют, когда проба постепенно проходит (нагнетается) через температурные зоны, до тех пор, пока не будет достигнут желательный уровень амплификации. Число этапов амплификации пропорционально числу туннелей, предусмотренных в термоциклере, то есть числу проходов пробы через заданные температурные зоны.

Маркерный реагент для текущего контроля химических реакций в реакционной трубке также может быть добавлен в пробу. Маркерный реагент типично представляет собой флуоресцентный краситель, однако это может быть добавочный краситель, хромогенный субстрат или олигонуклеотидные пробы, ковалентно связанные с флуоресцентными компонентами.

В соответствии с другими вариантами термоциклер содержит С-образный теплообменник (не показан), охватывающий внешний теплообменник 2 для последующего плавления продукта после амплификации. Кольцевой зазор С-образного теплообменника типично составляет около 20° и теплообменник содержит изменяющийся по окружности профиль температур ориентировочно от 70°C до 95°C. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом трубка 4 расположена вокруг внешней окружности С-образного теплообменника, так что проба, нагнетаемая по окружности, подвергается профилю плавления. Однако в соответствии с наиболее предпочтительным вариантом реакционная трубка 4 удерживается в канавке, расположенной на наружной поверхности С-образного теплообменника.

В альтернативных вариантах, термоциклер может содержать сканирующий детектор для обнаружения маркерного реагента и, следовательно, для текущего контроля хода реакции, протекающей в реакционной трубке 4. В одной конфигурации лучше всего показанной на фиг.5-8, сканирующий детектор содержит вращаемый блок 12, установленный над (или под) кольцами 1 и 2, для прямого сканирования трубки 4 в кольцевом зазоре 13 между теплообменниками, или же формации 7, или канавки, расположенные на наружной поверхности С-образного теплообменника. Например, источник падающего света и система обнаружения могут быть установлены на краю вращающегося блока, установленного над кольцами 1 и 2 теплообменника. Могут быть установлены четыре канала обнаружения (с СИД или лазерными диодами), так что до четырех флуорофоров могут быть использованы (объединены) в одной пробе, причем все четыре канала могут получать данные одновременно. Оптически связанные устройства, такие как ИК-диоды, по оси вращения могут передавать поток данных от средств обнаружения к основному блоку обработки данных, или же данные могут поступать в средства обнаружения. Однако может быть использована любая другая подходящая беспроводная передача данных. Данные плавления собирают от канала 20 "плавления", предусмотренного на вращаемом блоке 12.

Сканирующий детектор преимущественно получает питание от небольшого генератора, расположенного во вращающейся детекторной головке. Альтернативно, могут быть использованы вращающиеся щетки. Однако также может быть использовано любое другое средство, позволяющее подавать питание на детектор, например шаговый электродвигатель 21.

В других конфигурациях внутреннее кольцо теплообменника имеет кольцевой зазор 14 для оптического текущего контроля реакционной трубки. Как это лучше всего показано на фиг.10, дихроичное зеркало 15 установлено по оси на одной стороне PCR-устройства, а вращаемое относительно оси 45° зеркало 16 расположено внутри внутреннего кольца, чтобы контролировать ход реакции в реакционной трубке через кольцевой зазор 14. Сканирующий детектор направляет падающий свет по оси термоциклера, который отражается при каждом обороте трубки, когда зеркало 16 совершает один оборот. Трубку можно непрерывно сканировать и обнаруживать каждую реакцию, когда она (трубка) проходит через вращающийся световой пучок. Эрифлуоресцентный свет возвращается назад по тому же оптическому пути и проходит через дихроичное зеркало 16 на детектор (не показан). Быстрое вращение зеркала при помощи двигателя 17 позволяет непрерывно сканировать трубку и обнаруживать каждую реакцию, когда она (трубка) проходит через вращающийся световой пучок. Обнаружение флуоресценции может происходить одновременно с освещением или с задержкой с использованием альтернативного освещения и сканирующих детекторов.

В соответствии с еще одним вариантом при каждом сканировании сканирующий детектор посылает данные относительно силы света в компьютер обработки данных для идентификации пробы. Число байтов при каждом сканировании является одинаковым, что позволяет хранить данные в буфере и сдвигать данные на одну строку при каждом новом сканировании. Это создает динамическое отображение флуоресценции трубки, вытянутое в линейной плоскости. Затем отдельный компьютерный процесс (алгоритм) позволяет идентифицировать пробы при помощи техники анализа с выделением контуров изображения. Точки данных внутри массива информации усредняют и получают уровень флуоресценции для этого массива при этом номере цикла. Эти уровни флуоресценции и номера циклов затем используют для выработки стандартного формата данных в виде файла Rotor-gene REX при помощи программного обеспечения Rotor-gene, однако может быть использован и любой другой подходящий формат данных.

Обратимся теперь к рассмотрению узла порта пробы и к его использованию с системами непрерывного потока. Специалисты легко поймут, что порт в соответствии с настоящим изобретением позволяет вводить жидкие пробы в колонку непрерывного потока без использования известных ранее портов для впрыскивания под высоким давлением или специализированных устройств для впрыскивания. Порт представляет собой относительно дешевое устройство по сравнению с известными ранее портами для впрыскивания под высоким давлением, не имеет подвижных деталей и подверженных износу компонентов (таких как перегородка). Кроме того, порт в соответствии с настоящим изобретением позволяет производить загрузку пробы под атмосферным давлением при помощи наконечников стандартных пипеток с вытеснением воздуха, которые, так как они являются относительно дешевыми по сравнению с устройством инъекции типа игла-шприц, легко могут быть подвергнуты стерилизации партиями, причем каждый наконечник выбрасывают после разового использования, за счет чего предотвращается перекрестное загрязнение проб. В отличие от этого известное ранее устройство инъекции типа игла-шприц необходимо чистить/ стерилизовать между инъекциями проб. Кроме того, техника загрузки "без касания" создает "нулевой контакт", так что отсутствует загрязнение в порту загрузки. Кроме того, порт в соответствии с настоящим изобретением особенно хорошо подходит для автоматической загрузки проб, практически при помощи любой имеющейся в продаже лабораторной робототехнической системы.

Преимущественно флюидный носитель "всасывают" (в отличие от "нагнетания" насосом под высоким давлением) через трубку непрерывного потока за счет приложения силы всасывания к выпуску трубки. Всасывание потока флюидного носителя через трубку непрерывного потока является более дешевым в сравнении с известными ранее устройствами, так как при этом нет необходимости в использовании насосов высокого давления и, что более важно, нет необходимости в использовании портов впрыскивания под высоким давлением. Однако, в альтернативном варианте, флюидный носитель выбран так, что его можно всасывать через трубку непрерывного потока под действием силы тяжести.

Сила всасывания, приложенная к выпуску трубки непрерывного потока, относительно легко может быть создана, например, за счет соединения выпуска трубки непрерывного потока с простым вакуумным насосом. Например, за счет приложения вакуума ориентировочно от 10 до 100 кПа к трубке непрерывного потока длиной 15 метров, имеющей внутренний диаметр 1 мм, можно получить поток ориентировочно от 50 до 500 мкл/мин. Однако следует иметь в виду, что скорость потока пропорциональна внутреннему диаметру трубки, и/или марке масла, и/или уровню вакуума, приложенного к выпуску трубки. Трубку даже можно заполнять под действием силы тяжести за счет соответствующего выбора марки масла и внутреннего диаметра трубки. Специалисты легко поймут, что могут быть использованы и другие уровни вакуума и скорости потока в соответствии с конкретным применением. Преимущественно вакуум следует контролировать, чтобы поддерживать равномерную скорость потока через трубку непрерывного потока.

Преимущественно резервуар является открытым или удерживается под атмосферным давлением, за счет чего создается "порт загрузки с нулевым давлением". Предпочтительный резервуар содержит основание с конусом по центру, позволяющим захватывать трубку непрерывного потока. Однако, в альтернативном варианте, резервуар может быть снабжен предварительно подогнанным отрезком трубопровода, так что выпуск предварительно подогнанного отрезка трубопровода может быть флюидно связан со впуском уже имеющейся трубки непрерывного потока. Для исключения поступления воздуха в трубку непрерывного потока резервуар выполнен так, что впуск трубки погружен в объем флюидного носителя, содержащегося в резервуаре, когда резервуар полностью загружен флюидным носителем. Впуск трубки преимущественно главным образом вертикально конфигурирован, чтобы получать жидкую пробу сверху. Преимущественно участок трубки непрерывного потока введен в резервуар, так что впуск трубки непрерывного потока находится у центра высоты объема флюидного носителя, содержащегося в резервуаре, когда резервуар полностью загружен флюидным носителем. Подходящий насос, такой как шланговый насос, питает резервуар флюидным носителем, причем оптический датчик позволяет поддерживать заданный уровень флюида путем управления скоростью поступления флюидного носителя в резервуар. Альтернативно, устройство типа водослива может быть предусмотрено для поддержания уровня флюида. Однако могут быть использованы и другие устройства, известные специалистам в данной области, которые позволяют поддерживать главным образом атмосферное давление флюидного носителя в резервуаре.

Жидкая проба может быть введена в трубку непрерывного потока, во-первых, за счет установки наконечника средства дозирования пробы, такого как наконечник пипетки, непосредственно над впуском трубки непрерывного потока, после чего медленно вводят жидкую пробу. Преимущественно объем жидкой пробы составляет около 20 мкл. Однако можно также использовать малую жидкую пробу с таким объемом, как 1 мкл, или большую жидкую пробу с таким объемом, как 50 мкл. За счет эффектов поверхностного натяжения водная жидкая проба, которую вводят в гидрофобный масляный носитель, является главным образом сферической по форме. При необходимости, наконечник пипетки остается в контакте со сферой жидкой пробы, чтобы содействовать перемещению сферы к впуску трубки непрерывного потока и исключить ее падение на стенку резервуара. Так как имеется поток флюидного носителя на впуске трубки непрерывного потока, то сфера жидкой пробы затем может быть введена без касания во впуск, откуда пробу всасывают в трубку непрерывного потока при помощи силы всасывания, приложенной к выпуску. Следует иметь в виду, что множество жидких проб могут быть введены в трубку непрерывного потока с заданными временными интервалами. Жидкие пробы могут быть одинаковыми или различными пробами. Преимущественно, хотя и не обязательно, между пробами добавляют промежуточный "промывочный" флюид. Предпочтительная загрузка пробы содержит следующую последовательность: промывка - проба - промывка - проба - промывка и т.д. Само собой разумеется, что все флюиды промывки/ пробы разделены друг от друга при помощи флюидного носителя. Эта последовательность позволяет снизить перекрестное загрязнение пробы, так как любой участок пробы, который может сместиться, "перехватывается" промывочным флюидом, а не предыдущей пробой.

Преимущественно промывочным флюидом является вода.

Порт пробы в соответствии с настоящим изобретением особенно хорошо подходит для автоматизированных систем с высокой производительностью. В варианте настоящего изобретения порт пробы может быть загружен множеством последовательных проб (и промывочным флюидом, если это требуется) при помощи роботизированной системы обработки проб. В соответствии с другими вариантами порта пробы для применений с высокой производительностью могут быть предусмотрены множество трубок непрерывного потока. Впуски трубок непрерывного потока преимущественно смещены друг от друга и образуют матрицу внутри резервуара. Этот вариант также подходит для роботизированной обработки проб, когда при помощи роботизированной системы можно вводить множество жидких проб во множество впусков трубок непрерывного потока. Альтернативно, матрица трубок непрерывного потока может сходиться ниже по течению в параллельной конфигурации в единственную трубку непрерывного потока, так что образуется "параллельный" коллектор. В этом варианте жидкие пробы загружают последовательно с одного конца коллектора на другой, что позволяет равномерно распределять жидкие пробы, когда их всасывают в трубку непрерывного потока и пропускают через нее. Однако в других вариантах матрица отверстий трубок непрерывного потока может сходиться ниже по течению в единственную трубку непрерывного потока последовательно, за счет чего образуется "последовательный" коллектор. В этом варианте жидкие пробы преимущественно загружают одновременно.

В альтернативном аспекте порт низкого давления загрузки проб используют в системе непрерывного потока высокого давления. В этом аспекте предусмотрена пара смещенных друг от друга трубок, которые расположены между парой смещенных друг от друга вращаемых пластин, чтобы образовать вращаемый каскад. В одном положении одна из трубок открыта в атмосферу, в то время как другая расположена по оси проточной трубки непрерывного потока высокого давления. Трубка, которая открыта в атмосферу, содержит флюидный носитель и может получать жидкую пробу. После того как жидкая проба загружена, каскад поворачивают так, что ранее открытая в атмосферу трубка будет установлена по оси, что позволяет другой трубке получать следующую жидкую пробу. После этого процесс повторяют. Следует иметь в виду, что эта конфигурация порта обеспечивает введение пробы при помощи одноразового наконечника и не требует использования устройства типа игла/ шприц, так как нет прокалываемой перегородки и, следовательно, снижена вероятность перекрестного загрязнения пробы.

Следует иметь в виду, что порт в соответствии с настоящим изобретением может быть приспособлен для использования с различными типами устройств непрерывного потока. Само собой разумеется, что необходимо приложить силу всасывания к выпуску трубки непрерывного потока, чтобы всасывать флюиды/жидкости через трубку, а не "нагнетать" поток флюида за счет нагнетания с высоким давлением. Однако, так как вакуумные насосы являются относительно простыми и дешевыми лабораторными устройствами, которые относительно просто могут быть приспособлены для создания силы всасывания на выпуске трубки непрерывного потока, Заявитель полагает, что стоимость модификации существующих систем непрерывного потока для использования устройства в соответствии с настоящим изобретением будет относительно небольшой.

В соответствии с одним из вариантов настоящее изобретение подходит для применения с любым устройством непрерывного потока, работающим с использованием силы всасывания. Например, оно может быть приспособлено для использования с устройствами непрерывного потока, описанными в РСТ публикации WO 03/016558. В соответствии с WO 03/016558 поток флюидного носителя, разделенный на множество жидких проб, нагнетают под давлением через трубку непрерывного потока, навитую вокруг цилиндрического теплообменника, имеющего множество различных температурных зон. Температурные зоны выбраны так, чтобы обеспечивать: денатурирование нуклеиновой кислоты в цепи ее компонентов; отжиг олигонуклеотидных праймеров в комплементарные последовательности в нуклеиновой кислоте; и синтез новых цепей нуклеиновой кислоты. Жидкие пробы, протекающие через трубку непрерывного потока, циклически подвергаются воздействию указанных переменных температур, пока не будет достигнут желательный уровень амплификации (масштабирование амплификации в соответствии с числом витков намотки трубки непрерывного потока на теплообменник). Эти и другие аналогичные известные устройства обязательно требуют использования насосов высокого давления, чтобы принудительно нагнетать поток флюидного носителя через трубку непрерывного потока, и наличия инжекционного порта высокого давления, чтобы вводить жидкие пробы в поток флюидного носителя. Такое оборудование является относительно сложным, дорогим, требует регулярного техническое обслуживания и опытных операторов. В отличие от этого настоящее изобретение преимущественно позволяет избежать использования такого оборудования высокого давления за счет использования нового описанного здесь порта и использования скорее всасывания, а не нагнетания потока флюидного носителя через трубку непрерывного потока.

Когда проводят PCR с использованием системы непрерывного потока, использованный флюидный носитель преимущественно не содержит биологических загрязняющих веществ, например посторонних нуклеиновых кислот, таких как РНК или ДНК, причем его выбирают так, чтобы главным образом предотвращать загрязнение между жидкими пробами, протекающими через трубку непрерывного потока. Однако в соответствии с настоящим изобретением флюидный носитель также преимущественно выбирают так, чтобы поддерживать физические свойства жидкой пробы. Заявитель обнаружил, что силиконовые масла особенно хорошо подходят для использования в соответствии с настоящим изобретением. Идеальным флюидным носителем является силиконовое масло, имеющее вязкость ориентировочно от 5 до 50 сантистокс. Однако следует иметь в виду, что вязкость масла не ограничена этим диапазоном. Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, все же можно полагать, что полезность силиконовых масел в первую очередь связана с одинаковыми длинами ее цепей. Таким образом, любое масло с подходящей вязкостью и имеющее одинаковые длины цепей может быть использовано в качестве флюидного носителя. Заявитель обнаружил, что предпочтительными силиконовыми маслами являются такие масла, которые создают нейтральную плавучесть жидкой пробы, то есть имеющие плотность ориентировочно от 0.95 до 0.99 г/см³. Однако следует иметь в виду, что плотность масла не ограничивается только этим диапазоном.

Преимущественно жидкая проба представляет собой смесь компонентов для PCR эксперимента. Например, жидкая проба содержит пробу, подлежащую анализу или введению в реакцию, и реагенты, которые подлежат использованию в анализе или реакции. Преимущественно проба, подлежащая анализу или введению в реакцию, представляет собой пробу, содержащую нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК. Другие компоненты пробы типично содержат олигонуклеотидные праймеры, дезоксиаденозин трифосфат (dATP), дезоксицитидин трифосфат (dCTP), дезоксигуанозин трифосфат (dGTP), дезокситимидин трифосфат (dTTP) и по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, в которую входят термостабильная ДНК полимераза, ферментно активные ее фрагменты, ферментно активные ее производные и обратная транскриптаза.

Преимущественно трубка непрерывного потока является главным образом прозрачной, упругой, изготовлена из инертного материала и имеет гидрофобную внутреннюю поверхность. Например, трубка непрерывного потока может быть преимущественно изготовлена из такого материала, как Teflon или Tefzel, или из другого аналогичного материала. Однако трубка непрерывного потока может быть изготовлена и из другого подходящего материала, который позволяет всасывать флюиды под действием силы всасывания. Преимущественно внутренний диаметр трубки составляет ориентировочно от 1 до 1.6 мм.

Следует иметь в виду, что в то время как порт пробы в соответствии с настоящим изобретением особенно хорошо подходит для использования с PCR-устройством непрерывного потока, устройство и способ в соответствии с настоящим изобретением не ограничены только таким случаем использования. Например, настоящее изобретение подходит для использования в системах диссоциации протеина и в изотермических реакциях, в которых флуоресценцию пробы измеряют в каждом цикле. Однако настоящее изобретение особенно хорошо подходит для использования в роботизированных способах снижения загрязнений при загрузке пробы в системы непрерывного потока.

Далее описание будет проведено со ссылкой на чертежи, где показан порт пробы и его использование в системах непрерывного потока, причем на всех чертежах аналогичные детали имеют одинаковые позиционные обозначения. Обратимся сначала к рассмотрению на фиг.18, где в соответствии с настоящим изобретением предлагается устройство в виде порта 1 и способ введения объема жидкой пробы 2 в поток 3 флюидного носителя, протекающего в и через трубку непрерывного потока 4. Трубка 4 непрерывного потока преимущественно изготовлена из тефлона и содержит выпуск (не показан) и общий впуск 5, в который вводят как поток 3 флюидного носителя, так и жидкую пробу 2. Порт 1 содержит резервуар 6 для непрерывной подачи на впуск 5 потока 3 флюидного носителя. Так как резервуар 6 преимущественно является открытым в атмосферу, то поток 3 флюидного носителя может всасываться через трубку 4 непрерывного потока за счет силы тяжести или когда достаточная сила всасывания приложена к выпуску.

Как уже было указано здесь выше, настоящее изобретение особенно хорошо подходит для использования с устройством непрерывного потока для амплификации нуклеиновых кислот с использованием PCR, а также особенно хорошо подходит для автоматизированной обработки проб с высокой производительностью при помощи робототехнических систем. Типично, в таких устройствах множество жидких проб 2 вводят в трубку 4 непрерывного потока, причем все жидкие пробы 2 разделены друг от друга при помощи объема флюидного носителя 3, чтобы предотвратить загрязнение между жидкими пробами 2. В известных ранее устройствах этот поток жидких проб 2 и флюидного носителя 3 нагнетали через трубку 4 непрерывного потока и трубку 4 непрерывного потока вводили по меньшей мере в одну температурную зону, созданную при помощи соответствующего теплообменника 7. Однако в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предлагается всасывать поток жидких проб 2 и флюидный носитель 3 через трубку непрерывного потока 4 за счет приложения силы всасывания к выпуску трубки непрерывного потока, например, за счет устройства 8 типа термоса. Жидкой пробой 2 может быть смесь жидкостей для PCR-эксперимента, а флюидный носитель 3 представляет собой гидрофобный флюид, такой как масло, который преимущественно не содержит посторонних биологических загрязняющих веществ, например нуклеиновых кислот, таких как РНК или ДНК.

Обратимся опять к рассмотрению фиг.18, где резервуар 6 преимущественно содержит основание 9 в виде конуса. Впуск 5 трубки непрерывного потока погружен в объем флюидного носителя 3, содержащегося в резервуаре 6, и расположен вертикально, чтобы получать жидкую пробу 2 сверху. Водослив 10 предусмотрен для поддержания уровня флюидного носителя 3.

Поверхность 11 резервуара 6 открыта для атмосферного давления и насос (не показан), такой как шланговый насос, подает в резервуар 6 флюидный носитель 3 через впуск 12. Перелив (избыток) 13 флюидного носителя 3 в водосливе 14 возвращается в насос для рециркуляции.

Обратимся теперь к рассмотрению фиг.18-20, со ссылкой на которые поясняется способ в соответствии с настоящим изобретением, который предусматривает сначала введение трубки 4 непрерывного потока в резервуар 6, содержащий флюидный носитель 3, и приложение силы всасывания к выпуску, за счет чего флюидный носитель 3 равномерно всасывают через трубку 4 непрерывного потока. Затем жидкую пробу 2 вводят в трубку 4 непрерывного потока за счет установки наконечника 15 пипетки 16 над впуском 5 трубки непрерывного потока и дозирования около 10 мкл жидкой пробы 2. Водная жидкая проба 2, введенная в силиконовое масло 3, является главным образом сферической по форме. Преимущественно наконечник 15 пипетки 16 остается в контакте со сферой жидкой пробы 2, чтобы содействовать перемещению сферы на впуск 5 трубки непрерывного потока и исключать ее падение на стенки резервуара 6. Так как имеется поток флюидного носителя 3 во впуск 5 трубки непрерывного потока, сфера жидкой пробы 2 может быть без касания введена во впуск 5 (см. фиг.20), откуда ее всасывают в трубку 4 непрерывного потока за счет силы всасывания, приложенной к выпуску.

Как уже было указано здесь выше, в то время как флюидный носитель 3 предотвращает загрязнение между жидкими пробами 2, протекающими через трубку 4 непрерывного потока, Заявитель настоящего изобретения обнаружил, что флюидный носитель 3 также следует выбирать так, чтобы поддерживать физические свойства жидкой пробы 2. Флюидным носителем 3 преимущественно является силиконовое масло, имеющее вязкость ориентировочно от 5 до 50 сантистокс и плотность около 0.98 г/см³, за счет чего создается нейтральная плавучесть жидкой пробы 2. Заявитель обнаружил, что сфера жидкой пробы 2 стремится упасть на стенки резервуара 6 и прилипает к этим стенкам, если используют неподходящее масло. Более того, если сфера опускается слишком быстро, она может быть захвачена поблизости от впуска 5 трубки непрерывного потока и может не полностью всасываться в трубку 4 непрерывного потока.

Обратимся теперь к рассмотрению фиг.21, где предусмотрены пара пробоотборных трубок 17, 18 в альтернативной конструкции порта. Пробоотборные трубки 17, 18 размещены между парой смещенных друг от друга параллельных пластин 19 и образуют вращаемый каскад 20. Одна пробоотборная трубка 17 непрерывно пополняется флюидным носителем 3 от насоса, в то время как другая пробоотборная трубка 18 является свободной для приема жидкой пробы 2 под атмосферным давлением. После того как жидкую пробу 2 вводят в пробоотборную трубку 18, ее (трубку) затем переключают за счет вращения вращаемого каскада 20 и устанавливают по оси трубки 4 непрерывного потока, чтобы ввести жидкую пробу 2 в указанную трубку 4. Пробоотборная трубка 17 за счет указанного вращения "замененная" пробоотборной трубкой 18 (которая теперь переключена в положение по оси) теперь может принимать следующую жидкую пробу 2.

В альтернативной конфигурации для применений с высокой производительностью, множество трубок 4 непрерывного потока могут быть предусмотрены для одновременного проведения множества амплификаций нуклеиновых кислот. Впуски 5 трубок непрерывного потока преимущественно смещены друг от друга и образуют матрицу внутри резервуара 6. Этот вариант также подходит для роботизированной обработки проб, когда при помощи роботизированной системы можно вводить множество жидких проб 2 во множество впусков 5 трубок непрерывного потока. Альтернативно, матрица трубок непрерывного потока может сходиться ниже по течению в параллельной конфигурации в единственную трубку 4 непрерывного потока, так что образуется "параллельный" коллектор. В этом варианте жидкие пробы 2 загружают последовательно с одного конца коллектора на другой, что позволяет равномерно распределять жидкие пробы 2, когда их всасывают в трубку непрерывного потока и пропускают через нее. Однако в других вариантах матрица отверстий (впусков) 5 трубок непрерывного потока может сходиться ниже по течению в единственную трубку 4 непрерывного потока последовательно, за счет чего образуется "последовательный" коллектор. Легко можно понять, что в этом варианте жидкие пробы 2 преимущественно загружают одновременно.

Порт пробы в соответствии с настоящим изобретением легко может быть приспособлен для использования с различными типами устройств непрерывного потока. Кроме собственно порта единственным существенным изменением этих существующих устройств является приложение силы всасывания к выпуску трубки непрерывного потока, если сила тяжести является недостаточной, для всасывания флюидов через трубку, вместо нагнетания флюидов при помощи насоса высокого давления. Сила всасывания, когда она необходима, может быть создана при помощи стандартного вакуумного насоса или другого аналогичного устройства.

Дале настоящее изобретение будет описано со ссылкой на примеры, которые являются пояснительными и не имеют ограничительного характера.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Впрыскивание пробы (система с положительным давлением)

Важным аспектом настоящего изобретения является впрыскивание пробы без загрязнения, то есть возможность полного разделения проб, когда они проходят через устройство, без прерывания водной пробы в потоке масла и без флуоресценции одной пробы, воздействующей на следующую. На практике важно производить промывку внутри и снаружи шприца из нержавеющей стали, затем впрыскивать пробу, после чего производят дополнительную операцию промывки. Например, предположим, что используют иглу из нержавеющей стали, имеющую длину 300 мм, которая установлена в CAS робототехнической головке, для отбора и загрузки проб. Преимущественно внутренний объем иглы превышает объем пробы, чтобы свести к минимуму загрязнение. В этих вариантах внутренний объем иглы составляет около 8 мкл, так что до 5 мкл пробы могут быть надежно загружены (введены) без обратного всасывания пробы назад в иглу и в цилиндр иглы. Систему загрузочного шприца очищают при помощи milliQ воды и пробу вводят в иглу следующим образом:

1) Загрузка 2 мкл масла.

2) Загрузка 5 мкл пробы.

3) Промывка снаружи иглы при помощи водного барботера.

4) Загрузка 2 мкл масла.

Масло загружают из статической трубки, однако в альтернативных вариантах может быть использован масляный барботер, чтобы исключить необходимость промывка снаружи иглы при помощи водного барботера.

5) Загрузка 8 мкл в порт загрузки системы.

6) Удаление иглы из порта загрузки.

7) Очистка иглы с использованием 100 мкл воды для очистки внутри и снаружи иглы.

8) Ожидание 15-30 секунд.

9) Впрыск 20 мкл milliQ воды в порт загрузки.

10) Ожидание 15-30 секунд.

11) Повтор 1)

Пример 2: Текущий контроль в реальном времени реакционной трубки

Обратимся теперь к рассмотрению фиг.15, на которой показан растровый образ, собранный из последовательных сканирований проб, проходящих через реакционную трубку. По горизонтальной линии указана флуоресценция при помощи увеличивающейся плотности серой шкалы для каждого сканирования. Цифрами на фиг.15 обозначены три пробы, проходящие через трубку. Показаны только несколько последних витков трубки после развития флуоресценции в пробе.

Данные, показанные на фиг.15, могут быть трансформированы в фиг.16, на которой показана зависимость относительной интенсивности пробы от числа витков трубки. Данные, показанные на фиг.16, позволяют проводить кинетический анализ изменений флуоресценции в пробах, проходящих через проточное устройство. В этом конкретном примере, пробы C2, C4 и C6 содержат ДНК-матрицу для специфического ампликона, а чередующиеся пробы С1, С3, С5 и С7 не содержат матрицу.

Пример 3: Исследования по обнаружению плавления ДНК

Обратимся теперь к рассмотрению фиг.17, на которой показаны кривые плавления ДНК для проб, проанализированных с матрицей (эти кривые превышают порог) и без матрицы (которые не превышают порог). Температура, при которой плавится продукт, может быть использована для подтверждения того, что был образован главным образом надлежащий продукт.

Пример 4: Порт пробы с атмосферным давлением (инжектор пробы с нулевым загрязнением)

Использование порта пробы в соответствии с настоящим изобретением позволяет применить усовершенствованный способ введения не содержащих загрязнений проб, а также использовать стандартные наконечники пипетки для введения проб, которые легко могут быть стерилизованы, причем, при необходимости, наконечник может быть выброшен после однократного введения пробы.

Порт пробы в соответствии с настоящим изобретением флюидно связан с ETFE (Tefzel) трубкой непрерывного потока, имеющей внутренний диаметр 1.0 мм, внешний диаметр 1.6 мм и длину около 15 м. Используют силиконовое масло, имеющее плотность, аналогичную воде, и вязкость 5 сантистокс. Это масло может протекать через трубку под действием силы тяжести, причем масло имеет расход 100 мкл/мин, когда порт расположен ориентировочно на 50 см выше выпуска трубки непрерывного потока. Когда используют силиконовое масло, имеющее плотность, аналогичную воде, и вязкость 5 сантистокс, требуется вакуум 20 кПа, приложенный к выпуску трубки, чтобы получить расход 200 мкл/мин.

Имеющиеся на рынке PCR-буферы и TAQ содержат поверхностно-активное вещество. Это поверхностно-активное вещество побуждает ДНК мигрировать из водной фазы в фазу масла в процессе течения. Прогон положительной и отрицательной PCR контрольных проб позволяет получить загрязнение в отрицательной пробе ориентировочно через 20 циклов после положительной пробы (то есть загрязнение 1 на миллион). Этот уровень загрязнений неприемлем для PCR-применений, так как типично получают уровень амплификации 1 к миллиарду.

В отдельном наборе экспериментов каждую пробу после промывки milliQ водой загружают следующим образом:

1) Загрузка 5 мкл воды

2) Загрузка 5 мкл пробы

3) Повтор 1)

За счет введения проб чистой воды (то есть промывочного флюида) между всеми пробами PCR-реакции загрязнение не наблюдали между положительной пробой в цикле 3 амплификации и отрицательной пробой после прогона 43 циклов. Вводили следующие пробы: H₂O - положительная проба - H₂O - отрицательная проба - H₂O - положительная проба и т.д.). Следовательно, введение воды между всеми пробами позволяет получить уровень загрязнения лучше чем 1 на миллиард.

Несмотря на то что были описаны специфические варианты осуществления изобретения, совершенно ясно, что в него специалистами в данной области могут быть внесены изменения и дополнения, которые не выходят, однако, за рамки формулы изобретения.