способ получения igal-протеазы из культуры neisseria meningitidis серогруппы а и иммуногенный препарат на ее основе

Формула изобретения

1. Способ получения IgAl-протеазы из N. meningitidis, заключающийся в выращивании культуры N. meningitidis серогруппы А штамм А 208, с последующей инактивацией культуральной жидкости и осаждением микробной массы центрифугированием, выделением IgAl-протеазы путем очистки, включающей ультрафильтрацию, абсорбционную колоночную хроматографию на сорбентах силохром-80 и фенил-сефарозе, концентрирование и лиофильное высушивание продукта,

отличающийся тем, что

для выращивания культуры N. meningitidis серогруппы А используют модифицированную питательную среду Франца,

инактивацию микроорганизмов осуществляют путем добавления в культуральную жидкость цетавлона до конечной концентрации 0,1%,

после разделения полученной смеси центрифугированием для выделения IgAl-протеазы используют обе фракции - цетавлоновый супернатант и цетавлоновый осадок,

полученный осадок многократно экстрагируют, экстракты осадка и супернатант концентрируют методом ультрафильтрации,

полученные концентраты фракционируют методом абсорбционной хроматографии на колонке с сорбентом силохром-80 при температуре +8°С, уравновешенной 0,02 М фосфатно-солевым буферным раствором, рН 7,0, причем IgAl-протеазу получают при промывке сорбента указанным буферным раствором.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осадок экстрагируют буферным раствором 0,05 М Трис-HCl, рН 7,0 при перемешивании при температуре +8°С, затем суспензию центрифугируют при 11000 g при температуре +4°С.

3. Препарат, содержащий IgAl-протеазу, полученный из культуры N. meningitidis серогруппы А способом по любому из пп.1 и 2, который представляет собой компонент вакцины для профилактики инфекции, вызываемой бактериями N. meningitidis серогруппы В.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, иммунохимии и вакцинологии, а именно к получению и очистке IgAl-протеазы, которая может быть использована как самостоятельный препарат, так и для приготовления менингококковой поливалентной вакцины.

Описаны различные способы получения IgAl-протеазы менингококков. В заявке (WO 9011367, Kilian М. et al., 04.10.1990) описан способ получения менингококковой рекомбинантной IgAl-протеазы и ее фрагментов, полученных при клонировании гена IgAl-протеазы из микроорганизма, прежде всего Н. influenzae серотипа В и N.meningitidis штамма HF13, в клетках Е. coli. Предполагается, что указанный рекомбинантный фермент и его фрагменты можно использовать для получения вакцин, предназначенных для профилактики менингита всех типов менингококка и гонококка, однако не приводится данных по иммуногенной или протективной активности полученных препаратов фермента.

В патенте (US 7235242, Achtman et al., 26.06.2007) также описано получение фрагмента IgAl-протеазы, который используют в качестве пептида-носителя. Описан синтез фрагмента IgAl-протеазы, содержащего от 40 до 200 аминокислотных остатков и включающего 40 аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO:1, с использованием автоматического синтезатора. Однако при конъюгации с полисахаридом IgAl-протеаза обеспечивает защиту только от менингококка серогруппы С и не эффективна против менингококков серогруппы В.

В патенте (US 7407653, Plaut et al., 05.08.2008) описано применение бактериальных IgAl-протеаз для лечения заболеваний, связанных с отложениями IgAl в тканях и органах организма. Растворимые IgAl-протеазы, содержащие различные метки, например полигистидиновый фрагмент, получают рекомбинантным способом. Фермент выделяют по известной методике с использованием ультрафильтрации, ионообменной и металл-хелатной хроматографии. Полученные ферменты можно использовать для получения терапевтических агентов, предназначенных для лечения заболеваний, связанных с накоплением IgA. Однако не приводится выход активного фермента, хотя указано, что для выделения используют приблизительно 20 л культуральной среды, содержащей рекомбинантную IgAl-протеазу.

Описан также способ выделения IgAl-протеазы (M.S.Blake and C.Eastby. Studies on the gonococcal IgAl-protease II. Improved methods of enzyme purification and production of monoclonal antibodies to the enzyme. J. Immunol. Meth., 1991, 144, 215-221), включающий фракционирование культуральной жидкости, содержащей IgAl-протеазу, хроматографией на фенил-сефарозе, затем на ионообменной колонке Mono S. Супернатант, полученный при центрифугировании культуральной жидкости после наращивания биомассы N. Meningitides и N. Gonorrhoeae наносили на колонку с фенил-сефарозой. Фракции, обладающие ферментативной активностью, объединяли и наносили на колонку Mono S, при этом получали высокоочищенную IgAl-протеазу с выходом 0,4 мг из 1 л культуральной жидкости.

Описаны другие способы получения менингококковой IgAl-протеазы (см., например, В.И.Суровцев и др. Бактериальные IgAl - получение, свойства, перспективы применения // Вестник РАМН, 2001, № 5, с.39-42). Протеазу выделяли из бульона Хоттингера, на котором выращивали культуру N. meningitidis. Клетки удаляли центрифугированием и фермент выделяли высаливанием (NH₄)₂SO ₄ гидрофобной хроматографией на фенил-сефарозе, хроматографией на ионообменном носителе и ультрафильтрацией с последующим лиофильным высушиванием. Выход очищенного фермента составлял 1-2 мг из 50 л культуральной жидкости.

Наиболее близким аналогом первого изобретения группы является способ получения менингококковой IgAl-протеазы (см. В.И.Суровцев и др. Получение IgAl-протеазы, секретируемой клетками Neisseria meningitidis // Биотехнология, 2006, № 3, С.62-67 - прототип). Описана технология получения высокоочищенной менингококковой IgAl-протеазы. Метод основан на выращивании бактерий в культуральной жидкости и ее концентрировании, использовании для очистки IgAl-протеазы хроматографии на силохроме С-80, гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе и гель-фильтрации на сефарозе CL 6В-200. Выход очищенного фермента составлял 15,0 мг из 50 л культуральной жидкости. Однако этот способ сложен и использует многостадийную инактивацию возбудителя с использованием антибиотика, мертиолята и ЭДТА.

Описаны вакцины, предназначенные для профилактики менингококковых инфекций. Так в патенте (RU 2333007 С2, ПИЦЦА, НОВАРТИС ВЭКСИНЕС ЭНД ДАЙЭГНОСТИКС С.Р.Л. (IT), 10.09.2008) описана вакцина, которая после введения способна индуцировать гуморальный иммунный ответ и обеспечивать защиту организма от некоторых высоковирулентных штаммов (А4, ЕТ5) N. meningitidis серогруппы B. Используются пять белковых антигенов наружной мембраны, в частности: (1) белок "NadA"; (2) белок «741»; (3) белок «936»; (4) белок «953» и (5) белок «287».

В другом изобретении (RU 2343159 С2, МАСИНЬЯНИ и др., 10.01.2009) описаны белки с установленными аминокислотными последовательностями, полученные из бактерий преимущественно штаммов А и В, которые проявляют свойства антигена. Белки могут быть использованы в качестве антигенов для получения специфических антител и изготовления композиций для лечения, профилактики или диагностики инфекции, вызванной N. meningitidis. Композиции, приготовленные на основе белка, фрагментов нуклеиновой кислоты или антител с добавлением фармацевтически приемлемого носителя, представляют собой вакцинные, диагностические или фармацевтические препараты.

В изобретении (RU 2361609 С2, ДЖУЛИАНИ и др., 20.07.2009) предложена вакцинная композиция, обладающая иммуногенной активностью в отношении серогрупп В и С N. meningitidis, содержащая иммуногенное количество олигосахарида N. meningitidis серогруппы С, белка наружной мембраны менигококка серогруппы В в виде белково-липидных везикул. Указанная композиция обеспечивает высокие титры антител, определенных методом ИФА, и бактерицидных антител, что может найти применение в качестве протективной вакцины в отношении N. meningitidis серогрупп В и С.

Однако для изготовления вышеописанных вакцин используются рекомбинантные продукты, для получения которых требуется проведение сложного многостадийного технологического процесса. В то же время для получения компонентов вакцин и препаратов не известно использование менингококковой IgAl-протеазы, которая, как установлено, является иммуногенным и протективным препаратом в отношении менингококковой инфекции гетерологичной серогруппы В.

Задачей настоящей группы изобретений является усовершенствование способа получения менингококковой IgAl-протеазы и создание иммуногенного препарата на ее основе.

Способ получения IgAl-протеазы из N. meningitidis состоит в выращивании культуры N. meningitidis серогруппы А штамм А 208, с последующей инактивацией культуральной жидкости и осаждением микробной массы центрифугированием, выделением IgAl-протеазы путем очистки, включающей ультрафильтрацию, абсорбционную колоночную хроматографию на сорбентах силохром-80 и фенил-сефарозе, концентрирование и лиофильное высушивание продукта.

Патентуемый способ отличается тем, что для выращивания культуры N. meningitidis серогруппы А используют модифицированную питательную среду Франца, инактивацию микрорганизмов осуществляют путем добавления в культуральную жидкость цетавлона до конечной концентрации 0,1%. Полученную смесь разделяют центрифугированием, причем для выделения IgAl-протеазы используют обе фракции - цетавлоновый супернатант и цетавлоновый осадок. Полученный осадок многократно экстрагируют, экстракты осадка и супернатант концентрируют методом ультрафильтрации. Полученные концентраты фракционируют методом абсорбционной хроматографии на колонке с сорбентом силохром-80 при температуре +8°C, уравновешенной 0,02 М фосфатно-солевым буферным раствором, pH 7,0, причем IgAl-протеазу получают при промывке сорбента указанным буферным раствором.

Способ может характеризоваться тем, что осадок экстрагируют буферным раствором 0,05 М Трис-HCl, pH 7,0 при перемешивании при температуре +8°C, затем суспензию центрифугируют при 11000 g при температуре +4°C.

Иммуногенный препарат, содержащий IgAl-протеазу, полученную из культуры N. meningitidis серогруппы А, который представляет собой компонент вакцины для профилактики инфекции, вызываемой бактериями N. meningitidis серогруппы В.

Технический результат первого изобретения группы - упрощение способа за счет замены многостадийной инактивации возбудителя с использованием антибиотика, мертиолята и ЭДТА на одностадийную обработку цетавлоном, исключения стадии гель-проникающей хроматографии и повышение экологической безопасности указанного процесса в целом.

Технический результат второго изобретения группы - получение компонента вакцины неполисахаридной природы для защиты от заражения не только менингококком серогруппы A, но и от заражения менингококком серогруппы В. Такая возможность впервые установлена экспериментальным путем авторами заявки и не следует из уровня техники.

На чертежах приведены результаты очистки и характеристики полученной менингококковой IgAl-протеазы, а также результаты микробиологических экспериментов:

фиг.1 - результаты хроматографии супернатанта на первой стадии;

фиг.2 - результаты хроматографии супернатанта на второй стадии;

фиг.3 - результаты белкового электрофореза в ПААГ образцов, содержащих IgAl протеазу до и после проведения хроматографии;

фиг.4 - динамика формирования антител к IgAl-протеазе;

фиг.5 - защищенность мышей, иммунизированных IgAl-протеазой от заражения менингококком серогруппы В;

фиг.6 - уровень бактериемии у мышей, иммунизированных IgAl-протеазой, через 4 часа после заражения менингококком серогруппы В.

Способ может быть реализован следующим образом.

Микробную массу N. meningitidis серогруппы A штамм A 208 (Институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича) выращивают в бутылях, содержащих модифицированную полусинтетическую среду Франца (см. Frantz I.D. Growth requirements of the meningococcus. - J.Bacteriol. - 1942. - N6. - P.757-761; US 4123520, Hagopian et al., 31.10.1978; Кувакина В.И. Менингококковые полисахаридные вакцины групп A и C // Дисс. докт. биол. н., МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского, М., 1989).

Бутыли с культуральной жидкостью, представляющей собой взвесь бактерий в среде Франца, инкубируют при температуре 37±1°C при постоянном встряхивании в течение 12-16 час. Затем содержимое бутылей объединяют и добавляют 10%-ный раствор цетавлона (гексадецилтриметиламмониябромида, cetavlon) до конечной его концентрации во взвеси 0,1%, взвесь тщательно перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2-3 ч. Полученную смесь разделяют центрифугированием с получением цетавлонового супернатанта и цетавлонового осадка.

Указанный супернатант в количестве 2,5 л (общее содержание белка 27500 мг) концентрировали в 10 раз методом ультрафильтрации на мембране Халипор-1 с номинальной отсекаемой молекулярной массой 65 кДа, а затем несколько раз отмывали водой от солей и реагентов методом диафильтрации на указанной мембране. В результате получено 35 мл концентрата с общим содержанием белка 55 мг и ферментативной активностью 0,775 тыс.ед./мг (см. табл.1). Затем проводили диализ полученного концентрата (35 мл) против исходного буферного раствора I (см. ниже) для хроматографии на силохроме (2,0 л).

Полученный концентрат в количестве 35 мл далее фракционировали методом двухстадийной колоночной хроматографии. На первой стадии указанный концентрат наносили на колонку объемом 70 мл (30×130 мм), заполненную сорбентом силохром-80 и уравновешенную 0,02 М ФСБ, pH 7,0 (фосфатно-солевой буферный раствор, исходный буферный раствор I). Колонку промывали исходным буферным раствором I, затем 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 8,2 и, наконец, 0,2 М буферным раствором глицин /NaOH/ 0,3 М NaCl, pH 9,2, скорость элюции 2,5 мл/мин. Хроматографию проводили при температуре +8°C, собирали фракции объемом 10 мл, во фракциях определяли содержание белка и активность IgAl-протеазы в условных единицах на мг белка методом иммуноферментного анализа (RU 2310853, Козлов и др., 20.11.2007). Полученные результаты представлены на фиг.1 и в таблице 1.

Фракцию 1, полученную после первой стадии очистки и содержащую активную IgAl-протеазу (объем 35 мл, содержание белка 0,385 мг, ферментативная активность 47,3 тыс. ед./мг, выход по белку 0,001%, степень очистки 61) очищали методом гидрофобной хроматографии (вторая стадия очистки) на колонке (10×90 мм) с фенил-сефарозой объемом 5 мл, уравновешенной буферным раствором 0,05 М трис-HCl, ppH 9,2, содержащим 0,7 М сульфат аммония (исходный буферный раствор II). Указанную фракцию концентрировали методом ультрафильтрации до объема 2-3 мл, добавляли в нее сульфат аммония до концентрации 0,7 М и полученный раствор наносили на колонку. Колонку промывали исходным буферным раствором, а затем 0,05 М натрий-ацетатным буферным раствором, pH 6,0, до отсутствия поглощения при =280 нм. IgAl-протеазу элюировали при промывке колонки деминерализованной водой. Ферментативная активность IgAl-протеазы с высокой специфичностью обнаружена только во фракции 1-3 (содержание белка 0,012 мг, выход по белку 0,0004%, ферментативная активность 640 тыс.ед./мг, степень очистки 824). Полученные результаты представлены на фиг.2 и в таблице 2.

Результаты хроматографии на силохроме (первая стадия очистки) свидетельствуют об изменении свойств фермента по сравнению со свойствами, описанными в прототипе-статье (В.И.Суровцев и др. // Биотехнология, 2006, № 3. - С.62-67), вследствие присутствия в исходном материале цетавлона - поверхностно-активного вещества (ПАВ). Выделяемый фермент не сорбируется на силохроме и элюируется в исходном буферном растворе, тогда как значительная часть примесей сорбируется на силохроме и элюируется в указанных растворах.

Приведенные экспериментальные данные показывают, что из указанного количества культуральной жидкости (2,5 л) получен фермент с достаточно высокой степенью очистки, но с низким выходом IgAl-протеазы. Однако для специалиста представляется очевидным, что выход продукта может быть повышен при использовании более эффективных установок для ультрафильтрации, позволяющих сократить время пребывания фермента в растворенной форме.

Цетавлоновый осадок в количестве 103 г, полученный из 36 л культуральной жидкости, суспендировали в 2 л буферного раствора 0,05 М Трис-HCl, pH 7 и перемешивали в течение ночи при температуре +8°C, затем суспензию центрифугировали при 11000 g при температуре +4°C. Полученный супернатант концентрировали на мембране и подвергали диафильтрации, как описано выше. Концентрат (40 мл, 10,9 тыс. ед./мг) диализовали против 2 л 0,02 М PBS, pH 7, в течение ночи при температуре +8°C, затем проводили очистку фермента двухстадийной колоночной хроматографией, как описано выше для цетавлонового супернатанта. Осадок экстрагировали в общей сложности пять раз и из каждого экстракта выделяли фермент, как описано выше. Результаты приведены в таблице 2.

Было установлено, что в качестве сырья для получения IgAl-протеазы могут быть использованы также готовые полупродукты - цетавлоновый супернатант и осадок, полученные после инактивации микробной культуры в процессе производства полисахаридов менингококков серогрупп A и C (RU 2283135 C1, Аваков и Аллилуев, 10.09.2006). Использование супернатанта тем более целесообразно, поскольку он представляет собой отход производства на Предприятии по производству бактерийных препаратов им. Г.Н.Габричевского, никоим образом не используемый и сливаемый в отбросы. Преимущество осадка состоит в том, что его можно хранить в замороженном состоянии при низкой температуре -80°C в течение длительного времени и использовать как для производства полисахаридной менингококковой вакцины, так и очищенной IgAl-протеазы. Кроме того, в осадке содержится примерно 24% активности IgAl-протеазы в расчете на общую активность IgAl-протеазы в исходной культуральной жидкости.

Препараты IgAl-протеазы, полученные в ходе очистки, анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в додецилсульфате Na (ЭФ в ПААГ - ДСН, восстанавливающие условия, проявление серебром - см. фиг.3), а также определяли ферментативную активность (см. таблицы 1, 2) методом иммуноферментного анализа IgAl-протеазы.

На фиг.3 представлены результаты белкового электрофореза в ПААГ образцов, содержащих IgAl протеазу до и после проведения хроматографии. Цетавлоновый супернатант: дорожка 1 - исходный, 2 - фр.1; 3 - фр.3 (фенил-сефароза). Цетавлоновый осадок: 4 - исходный экстракт, 5 - фр.1; 6 - фр.2; 7 - фр.3 (силохром); 8 - фр.1-1; 9 - фр.1-2; 10 - фр.1-3 (фенил-сефароза). Дорожка 11 - контрольная смесь белков-маркеров HMW с молекулярными массами 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 30, 15 и 10 кДа.

В очищенном препарате IgAl-протеазы (дорожка 3) наблюдается зона с молекулярной массой около 120 кДа, что соответствует литературным данным о молекулярной массе интактного фермента [см. прототип, а также Таймуразов М.Г. Диссертация канд. биол. наук., Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск, 2006], а также некоторое количество примесей на уровне 50 кДа.

Результаты электрофореза свидетельствуют о том, что в полученном препарате по настоящему изобретению содержится IgAl-протеаза с молекулярной массой - 120 кДа и низкомолекулярные примеси в значительно меньшем количестве. Наличие таких примесей можно объяснить тем, что, согласно литературным данным (см., например, WO 9011367), IgAl-протеаза может расщепляться в процессе очистки на более низкомолекулярные фрагменты, которые также обладают ферментативной активностью.

Иммуногенную и протективную активность полученной IgAl-протеазы оценивали на мышах линии Balb/C. Для оценки этих показателей животных иммунизировали IgAl-протеазой дважды внутривенно с интервалом 45 дней. Для первой иммунизации мышей в дозе 10 мкг/мышь использовали препарат, полученный после второй экстракции цетавлонового осадка и хроматографии на силохроме С-80, диализа и лиофильной сушки (100 мкг IgAl-протеазы, с ферментативной активностью 3·10⁵ ед./мг). Для реиммунизации мышей использовали препарат, полученный после двухстадийной хроматографии (195 мкг IgAl-протеазы с активностью 5,36·10⁵ ед./мг) в той же дозе.

Показателем иммуногенности полученной IgAl-протеазы служило нарастание специфических антител, определяемых методом ИФА, в крови мышей в различные дни после иммунизации.

На 12-й день после реиммунизации мышей заражали живой вирулентной культурой менингококка серогруппы В штамм Н44/47.

Протективную активность IgAl-протеазы оценивали по уровню бактериемии у иммунизированных животных через 4 часа после заражения менингококком серогруппы В, а также по числу животных, выживших на 5-й день после заражения, по сравнению с этими же показателями для контрольных неиммунизированных мышей.

На фиг.4 показана диаграмма иммуногенной активности IgAl-протеазы. По оси абсцисс цифрами обозначен срок после иммунизации: 1 - 6-й день; 2 - 13-й день; 3 - 20-й день; 4 - 28-й день; 5 - 35-й день и 6 - 41-й день после первой иммунизации соответственно; 7 - 12-й день после повторной иммунизации; 8 - контрольная группа. По оси ординат - оптическая плотность сывороток в разведении 1:80 при =492 нм. Видно, что нарастание специфических антител наблюдается на 13-й день после однократной иммунизации и достигает максимального значения к 35-му дню. Максимальный уровень антител отмечен на 12-й день после реиммунизации.

На диаграмме фиг.5 представлен уровень бактериемии (в %) у иммунизированных мышей (заштрихованный столбик) по сравнению с контрольными, неиммунизированными животными (черный столбик). Уровень бактериемии в группе иммунизированных мышей снижен на 35% (65 КОЕ) по сравнению с контрольными неиммунизированными мышами (100 КОЕ).

На диаграмме фиг.6 показана защищенность мышей от заражения менингококком серогруппы B. По оси ординат - число выживших мышей (в %): иммунизированные мыши - заштрихованный столбик, контрольные - черный. При заражении мышей менингококком в дозе 25·10⁴ микробных клеток в контрольной группе выжило только одно животное из 10-ти (10%), тогда как в группе иммунизированных IgAl-протеазой - выжило 9 мышей (90%).

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности препарата IgAl-протеазы, выделенного из культуры менингококка серогруппы A и способного защищать животных от заражения живой менингококковой культурой гетерологичного штамма - менингококка серогруппы B. Кроме того, полученный препарат может быть использован для защиты от менингококка гомологичной серогруппы A.

Таким образом, приведенные экспериментальные данные показывают перспективность патентуемого способа для приготовления активного компонента поливалентной вакцины против менингококковой инфекции на основе IgAl-протеазы для профилактики основных эпидемически значимых возбудителей менингококковой инфекции. Кроме того, полученный субстрат может быть использован в качестве фермента в экспериментальных целях.

Таблица 1
ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТОВ ОЧИСТКИ ЦЕТАВЛОНОВОГО СУПЕРНАТАНТА НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ
Стадии очистки	Объем, мл	Белок	Активность IgAl-протеазы
мг	%	Специфическая активность, тыс. ед./мг	Степень очистки*
Исходный супернатант	2500	27500	100
Концентрат супернатанта	35	55	0,2	0,775	1,0
	Хроматография на силохроме C-80
Фракция 1 pH 7,0	35	0,385	0,001	47,3	61
Фракция 2 pH 8,0	45	0,540	0,002	0
Фракция 3 pH 9,0	1	0,012	0,0001	0
Хроматография на фенил-сефарозе фракции 1
Концентрат фракции 1 до хроматографии	2,5	0,385	0,0014	47,3	61
Фракция 1-1 pH 9,2	5	0,2	0,0007	0
Фракция 1-2 pH 6,0	6	0,1	0,0004	0
Фракция 1-3 H2O	3	0,012	0,0004	638,9	824
* отношение удельной активности очищенного фермента к удельной активности исходного концентрата