способ получения 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов
Классы МПК: | C12P33/00 Получение стероидов C12P33/06 гидроксилирование C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них |
Автор(ы): | Ядерец Вера Владимировна (RU), Андрюшина Валентина Александровна (RU), Войшвилло Наталия Евгеньевна (RU), Двойников Павел Станиславович (RU), Дружинина Анна Викторовна (RU), Стыценко Татьяна Семеновна (RU), Зейналов Орхан Ахмедович (RU), Скрябин Константин Георгиевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Центр "Биоинженерия" РАН, ООО "НПК "СКиФФ" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2009-08-07 публикация патента:
27.12.2010 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407015/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксилирования -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407010/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3,17-дикетоандростенов с помощью нового штамма гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981. Мицелий гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981 суспендируют в водной среде, не содержащей компонентов, необходимых для роста гриба. Трансформируемый -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407010/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3,17-дикетоандростен вносят в водную среду либо в виде микрокристаллической суспензии, либо в виде водорастворимого комплекса с химически модифицированным -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407013/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклодекстрином. Выход 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407015/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксипроизводых андростендиона (АД) составляет 40-70%. Изобретение позволяет ускорить накопления 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407015/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксистероидов и упростить метод их выделения. 1 з.п. ф-лы.
Формула изобретения
1. Способ 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407015/945.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксилирования -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407010/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3,17-дикетоандростенов с помощью плесневого гриба Curvularia lunata, отличающийся тем, что для эффективного гидроксилирования указанных стероидов в качестве биокатализатора используют мицелий нового штамма гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981, суспендированный в водной среде, трансформируемый -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407010/916.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3,17-дикетоандростен вносят в водную фазу либо в виде микрокристаллической суспензии, либо в виде водорастворимого комплекса с химически модифицированным -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="/images/patents/53/2407013/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклодекстрином.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что водную фазу, содержащую солюбилизатор после выделения продуктов реакции, используют без регенерации полимера для повторного процесса трансформации.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к микробиологическим способам получения гидроксипроизводных стероидов, и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленности.
Практически все известные гидроксистероиды (моно-, ди-, тригидроксистероиды) обладают высокой физиологической активностью. Что касается некоторых 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксилсодержащих -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 4-3-кетостероидов, то у них установлено наличие противовоспалительной, контрацептивной и канцеролитической активностей. 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Гидроксистероиды перспективны в качестве исходных структур в синтезе новых физиологически активных соединений [1-3]. Например, 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксипроизводные андростендиона (АД) и кортексолона служат в качестве базовых соединений для двух альтернативных путей синтеза высокоактивного антигонадотропного препарата пролигестона, широко используемого в гинекологической и ветеринарной практике [1].
Несмотря на уникальную биологическую активность и огромный интерес исследователей к 14-гидроксилсодержащим стероидам, в мировой практике используется только несколько препаратов этого ряда, что объясняется сложностью введения гидроксильной группы в 14-положение.
Введение 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-группы химическим путем нецелесообразно вследствие токсичности используемых реагентов, жестких условий реакции и соответственно низких выходов. Поэтому стереоселективный, экологически безопасный и не требующий предварительной защиты функциональных групп и двойных связей микробиологический способ является в данном случае единственно возможным.
Известны работы, в которых с целью применения в качестве биокатализатора для введения в стероидную молекулу 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксигруппы изучены плесневые грибы Absidia coerulea [2], Acremonium strictum [3], Colletotrichum antirrhini [4], Cunninghamella blakesleeana [5], Curvularia clavata [6], C.lunata [7], Gongronella butleri [8], Mucor racemosus [9], M.piriformis [10], Neurospora crassa [11], Phycomyces blakesleeanus [12], Thamnostylum piriforme [13].
Однако с помощью указанных грибов получено ограниченное количество стероидов, содержащих 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксигруппу. По-видимому, это связано с очень высокой специфичностью стероидных гидроксилаз по отношению к структуре стероидной молекулы. Сообщается о 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксилировании стероидов ряда андростана и прегнана, причем в случае прегнанов, например кортексолона, 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксипроизводные образуются, как правило, в качестве побочных продуктов. Нагрузка трансформируемых субстратов в цитируемых работах (за исключением одного примера с АД [7]) составляла не более 2 г/л, а продолжительность процесса гидроксилирования достигала 120 ч.
Недостатками рассматриваемых процессов являются неполная конверсия субстрата при сокращении времени трансформации, низкий выход целевых 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксилированных производных, образование смеси побочных продуктов. Например, после гидроксилирования 1.0 г/л АД мицелием G. butleri из реакционной среды через 72 ч выделено 21.8% 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД и четыре побочных продукта. При гидроксилировании андростадиендиона (АДД) через 96 ч реакционная смесь состояла из 39% АДД, 16.6% 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АДД и двух побочных стероидов в суммарном количестве 28%. Даже в лучшем примере - трансформации 1.0 г/л 9 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД реакционная смесь после 96 ч инкубирования состояла из 8.1% исходного, 52% целевого 9 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -дигидрокси-АД и 29% побочного 6 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,9 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -дигидрокси-АД [8].
Известен способ гидроксилирования АД растущей культурой С.lunata NRRL 2380 [7], согласно которому трансформацию осуществляют в ферментере при нагрузке субстрата 5.0 г/л в среде, содержащей кукурузный экстракт и соевую муку. Стероиды экстрагируют из культуральной жидкости, не отделяя мицелий, метилизобутилкетоном, экстракт упаривают и выделяют 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД с выходом 60% методом препаративной хроматографии на колонке.
Необходимость использования колоночной хроматографии, нежелательной при масштабировании процесса, вызвана, по-видимому, наличием в реакционной смеси побочных гидроксистероидов, а также содержанием в экстракте продуктов метаболизма гриба и липидных компонентов среды, что может быть следствием использования в этом способе культуры гриба, растущей в богатой органическими компонентами питательной среде.
Поскольку указанный способ иллюстрирован одним примером, не известно об эффективности 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксилазной системы используемого штамма гриба в отношении других стероидов.
Сущность заявляемого способа заключается в использовании в качестве биокатализатора для введения 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксигруппы в 3,17-дикетоандростаны отмытого от питательной среды мицелия нового штамма гриба С.lunata ВКПМ F-981, не образующего других гидроксистероидов, кроме как содержащих 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксигруппу.
Трансформацию с помощью указанного штамма проводят в водной среде, в которой отсутствуют компоненты, необходимые для роста гриба. Стероиды для трансформации вносят в количестве не менее 2.0 г/л либо в виде водной суспензии микрокристаллов, либо в виде водорастворимого комплекса с химически модифицированным -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -циклодекстрином (ЦД), например метил-ЦД, оксипропил-ЦД.
Максимальное время трансформации не превышает 45 ч. Конверсия стероидов в конце процесса 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксилирования составляет 85-95%. В зависимости от структуры, количества и формы внесения субстратов (в виде микрокристаллов или в виде водорастворимого комплекса с ЦД) 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксипродукты преимущественно находятся либо на мицелии, либо в водной фазе, что существенно облегчает их выделение.
При трансформации андростенов в виде комплекса с ЦД водную фазу после извлечения стероидных метаболитов используют повторно для трансформации без регенерации ЦД.
Выход 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидроксипродуктов в зависимости от структуры исходного субстрата, количества и формы его внесения в реакционную среду составляет 40-70%.
Способ иллюстрируется следующими примерами, выход выделенного продукта в которых выражен в % от теоретически возможного.
Пример 1. Трансформация АД при нагрузке 2.0 г/л в виде микрокристаллов.
Споры гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981 переносили со скошенного агара в жидкую среду, содержащую: (г/л) глюкозу - 20.0, пептон - 5.0, дрожжевой экстракт - 5.0, соевую муку - 10.0, КН2 РO4 - 4.0, рН 6.2-6.5. Выращивали культуру в течение 3 сут. на качалке при 28°С, после чего полученный вегетативный посевной материал переносили в такую же среду и инкубировали в тех же условиях 30-35 ч. Мицелий отделяли от среды, промывали фосфатным буфером, полученную биомассу распределяли в качалочные колбы с фосфатным буфером, в которые добавляли водную суспензию АД с размером частиц до 20 мкм в присутствии твина-80. Трансформацию 2.4 г АД осуществляли в течение 26 ч. Анализировали содержание стероидных метаболитов на мицелии и в водной фазе. Продукт 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД извлекали из мицелия экстракцией этилацетатом. Отдельно экстрагировали водную фазу. Определяли отсутствие в ней побочных продуктов, после чего экстракты объединяли, упаривали и получали 1.9 г технического продукта. Кристаллизацией из этилацетата получали 1.3 г 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД, т.пл. 257-261°С. Лит. 259- 262°С [9], выход 54%.
Пример 2. Трансформация АД при нагрузке 6.0 г/л в виде комплекса с метил- -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД.
Мицелий для трансформации 3.0 г АД получали аналогично примеру 1, но АД подвергали гидроксилированию в течение 42 ч в виде комплекса с метил- -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД в фосфатном буфере, используя мольное отношение АД/ЦД 1:1.
Мицелий отделяли от водной фазы и экстрагировали этилацетатом. Отдельно экстрагировали водную фазу. Экстракты объединяли и упаривали. Получали 2.53 г технического продукта, перекристаллизацией которого в этилацетате получали 2.1 г 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД, идентичного ранее выделенному, т.пл. 258-263°С, выход 62%.
Пример 3. Трансформация АД при нагрузке 4.0 г/л в виде комплекса с повторно используемым метил- -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД.
Трансформацию АД и выделение 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД проводили согласно примеру 2, но в качестве реакционной среды использовали водную фазу после выделения продуктов трансформации примера 2, в которую добавляли АД и свежую порцию мицелия, приготовленного для первого цикла трансформации по примеру 2 и хранившегося сутки при 4-5°С, либо выращенного повторно согласно примеру 1. Трансформацию проводили в течение 24 ч. Продукт, идентичный ранее выделенному, получали с выходом 52%.
Пример 4. Трансформация АД при нагрузке 6.0 г/л в виде комплекса с оксипропил- -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД.
Трансформацию 1.6 г АД осуществляли согласно примеру 2, но в качестве солюбилизатора использовали оксипропил- -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД в мольном отношении АД/ЦД 1:1. Через 45 ч инкубации, когда конверсия достигла 98%, мицелий отделяли от водной фазы. Экстракцией мицелия этилацетатом выделено 0.68 г 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД, т.пл. 258-262°С, выход 40%. Из водной фазы выделено также 0.17 г 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АДД (выход 10%), т пл. 282-285°С. Лит. 284-287°С [14].
Пример 5. Трансформация АДД при нагрузке 3.0 г/л в виде комплекса с оксипропил- -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД.
Трансформацию 2.1 г АДД и выделение продуктов гидроксилирования осуществляли согласно примеру 4. Полную конверсию АДД наблюдали через 24 ч. Из мицелия выделено 1.55 г 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АДД, из водной фазы - 0.85 г смеси 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АДД и дегидротестостерона в отношении 1:1. После кристаллизации 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АДД из экстрактов мицелия и водной фазы его выход составил 69.8%. Т.пл. 283-285°С.
Пример 6. Трансформация 9 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД в виде микрокристаллов при нагрузке 2.0 г/л.
Трансформацию и выделение продукта гидроксилирования проводили согласно примеру 1. Через 40 ч трансформации конверсия составила 95%, выход кристаллического 9 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -дигидрокси-АД 52%, т.пл. 240-243°С. Лит. данные 241-244°С [15].
Пример 7. Трансформация 9 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД при нагрузке 2 г/л в виде комплекса с оксипропил- -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -ЦД.
Трансформацию 2.8 г 9 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -гидрокси-АД и выделение продукта реакции осуществляли согласно примеру 4. Получено 55% кристаллического 9 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -дигидрокси-АД, т.пл. 241-244°С.
Литература
1. Smid P.M., van Zoest W.J., Weber P.O., Marx A.F. // 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> ,17 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Dihydroxy-17 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -substituted steroids. US Patent 5 093 502. 1992.
2. Brzezowska E., Dmochowska-Gladysz J., Kolek T. J.Steroid Biochem. Mol. Biol. V.57, no.5-6, pp.357-362. 1996.
3. Yoshihama M., Tamura К., Miyata N., Nakayama S., Nakakoshi M. Novel androst-4-ene-3,17-dione derivatives and process for their preparation. EP 0 300 062.1988.
4. Niar V.C., Shapiro S., Arunachalam Т., Caspi E. //Biotransformation of progesterone to 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -hydroxypregna-l,4-diene-3,20-dione, a novel fungal metabolite, by Colletotrichum antirrihini. J.Steroid Biochem. V. 22, no.3, pp.399-400. 1985.
5. Chincholkar S.B., Laxman R.S., Wakharkar R.D. // Hydroxylation of progesterone by Cunninghamella blakesleeana NCIM 687. World J. Microbiol. Biotechnol. V.11, pp.357-358. 1995.
6. Vujic M., Jankov R.M. // Microbiologic transformation of progesterone by Curvularia clavata. Steroids, V.55, no. 1, pp.17-21. 1990.
7. Weber A., Kennecke M. //Verfahren zu herstellung von 14 -гидроксипроизводных 4-3,17-дикето-андростенов, патент № 2407800" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -hydroxy-4-androsten-3,17-dion. WO 93/05170. 1993.
8. Kollerov V.V., Shutov A.A., Fokina V.V., Sukhodolskaya G.V., Donova M.V. // Biotransformation of 3-ketoandrostanes by Gongronella butleri VKMF-1033. J.Mol.CatalysisB: Enz. V.55, pp.61-68. 2008.
9. Faramazzi M.A., Badiee M., Yazdi M.T., Amini M., Torshabi M. // Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3,17-dione by filamentous fungus Mucor racemosus. J. Molec.Catalysis B: Enz. V.50, no.5. 2008.
10. Madyashta K.M., Joseph TV/Study on the 14a-hydroxylation of progesterone in Mucor piriformis. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., V.45, no.6, pp.563-569. 1993.
11. Smith К., Kirk D., Latif S. // Transformation of progesterone, testosterone and androstenedione by Phycomyces blakesleeanus. J. Steroid Biochem. V.32, no.3, pp.445-451. 1989.
12. Hu S.-H., Genain G., Azerad R. // Microbial transformation of steroids: Contribution to 14a-hydroxylations. Steroids, V.60, no.4, pp.337-352. 1995.
13. Steroids, V.73, pp.13-18. 2008.
14. Iizuka H., Naito A., Sato Y. J.Gen.Appl. Microbiol. V.7, p.118, 1961.
15. Kondo E., Tori К. // J.Am.Chem.Soc. V.86, p.736, 1964.
Класс C12P33/00 Получение стероидов
Класс C12P33/06 гидроксилирование
Класс C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них