способ оценки иммунного статуса крупного рогатого скота при лейкозе

Формула изобретения

Способ оценки иммунного статуса крупного рогатого скота (КРС) при лейкозе путем иммунологического исследования крови у КРС, обработки полученных значений с помощью компьютерной программы, отличающийся тем, что для оценки иммунного статуса КРС определяют концентрацию нейтрофилов, Т-лимфоцитов, Т-киллеров, Т-антиген-реактивных лимфоцитов, В-лимфоцитов, количество циркулирующих иммунных комплексов, оценивают функциональное состояние нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием в спонтанном и стимулированном вариантах с последующим подсчетом коэффициента стимуляции, исследуют полученные значения с помощью компьютерной программы с учетом базисных и вариабельных значений, причем выделяют те сочетания параметров, которые присущи здоровым, инфицированным и больным лейкозом животным, вычисляют коэффициент сопряженности (КС) по формуле при КС, равном или превышающем значение 0,24, считают признаком функционального напряжения иммунной системы, по значениям базисного и вариабельного параметров дифференциально-прогностической таблицы выделяют животных с функциональным напряжением иммунной системы, вызванным вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к технике оценки иммунного статуса у животных, и может быть использовано для выявления у крупного рогатого скота иммунной недостаточности, вызванной вирусом лейкоза.

Иммунная недостаточность - это способ функционирования иммунной системы, когда она не может эффективно выполнять свои функции уничтожения чужеродного или дефектного либо измененного своего.

Основными типами приобретенных иммунодефицитов, которые могут приводить к развитию иммунной недостаточности, являются: синдром приобретенного иммунодефицита человека, лучевая болезнь, лечебное применение иммуносупрессивных препаратов, лейкопролиферативные заболевания и другие (К.А.Лебедев, И.Д.Понякина. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). - М., Н.Новгород: Изд-во НГМА, 2003 - С.315-316).

Наиболее распространенной причиной возникновения иммунной недостаточности является дисбаланс взаимосвязей между компонентами иммунной системы, который имеет место при различных хронических заболеваниях. При иммунной недостаточности, связанной с дисбалансом взаимосвязей в иммунной системе, резко меняются количество, направление и интенсивность различных статистических связей. В состоянии нормы уровень связанности компонентов иммунной системы достаточно низок, с развитием патологического процесса происходит адаптационная перестройка иммунной системы, обусловливающая изменение характера взаимосвязей (К.А.Лебедев, И.Д.Понякина. Общий синдром иммунологической недостаточности // Иммунология. - ВИНИТИ. - 1988а. - Т.22. - С.147).

Возникшие сдвиги во взаимосвязях могут закрепиться в иммунном гомеостазе и обусловливать низкую эффективность работы иммунной системы в течение длительного времени. Обнаружение инфекционной иммунологической недостаточности складывается из одновременного определения уровня приобретенного ответа В- и Т-систем на антиген возбудителя и из оценки иммунного статуса организма.

Наиболее близким к изобретению является способ, основанный на составлении дифференциально-прогностических таблиц с использованием дискретно-динамического принципа оценки иммунного статуса человека (см. Лебедев К.А., Бабайцев В.А. Новый метод составления диагностических таблиц на основе дискретно-динамического принципа оценки иммунного статуса. Иммунология. - 1986. - № 5. - С.53-56; Лебедев К.А., Понякина И.Д. Дискретно-динамический анализ - новый подход к оценке иммунного статуса человека / Итоги науки и техники.- ВИНИТИ.- Иммунологии. - 1986. - Т.15. - С.64-91).

Однако известный способ оценки иммунного статуса инфицированных и больных лейкозом животных сопряжен с большой затратой времени и не нашел применения в ветеринарной научно-исследовательской практике, достоверность результатов при этом во многом зависит от человеческого фактора.

Задачей изобретения является повышение эффективности и точности оценки иммунного статуса зараженных и больных лейкозом животных.

Задача достигается путем иммунологического исследования крови у крупного рогатого скота, определения количества (тыс/мкл) в периферической крови животных лейкоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и наиболее активных иммунокомпетентных клеток: Т-лимфоцитов с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана; Т-киллеров - непрямого глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка; Т-антиген - реактивных лимфоцитов к вирусу лейкоза крупного рогатого скота с эритроцитами быка, адсорбировавшими антиген вируса лейкоза; В-лимфоцитов - комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка, а также определением циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом осаждения полиэтиленглюколем (ПЭГ-6000) и оценкой функционального состояния нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ) в спонтанном без нагрузки и стимулированном с использованием антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота с последующим подсчетом коэффициента стимуляции Кст. (Кст. ) (Сизякина Л.П., Андреева И.И. Справочник по клинической иммунологии / Серия «Больной вопрос». - Ростов н/Д: Феникс, 2005. - С.81-82) именуемые в тексте иммунологические параметры.

С использованием дискретно-динамического анализа и специально составленной программы для ПК определяют те сочетания иммунологических параметров, которые присущи здоровым, инфицированным и больным животным. На основании выявленных со степенью достоверности (Р<0,05) значимых сочетаний параметров составляют с использованием компьютерной программы дифференциально-прогностическую таблицу, которая дает возможность оценить степень защищенности от заболевания отдельного животного и стада в целом (патент РФ RU № 2257913, кл. А61К 39/00, G01N 33/53, 2003).

Далее вычисляют коэффициент сопряженности (КС) по формуле

Вычисление коэффициента сопряженности (КС) применяется для выявления скрытого дисбаланса иммунной системы, который не тестируется определением у больных содержания тех или иных клеток и прочих параметров (Клиническая иммунология и аллергология: Учебное пособие / Под ред. А.В.Караулова. - М., 2002. - С.430).

Используя дискретно-динамический анализ, автоматизированный специальной программой для ПК, выведен коэффициент сопряженности, соответствующий функциональному напряжению иммунной системы, равный или превышающий значение 0,24.

По значениям базисного и вариабельного параметров дифференциально-прогностической таблицы выделяют животных с функциональным напряжением иммунной системы, вызванным вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Предлагаемый способ оценки иммунного статуса позволяет выявить до 100% животных с гемограммой, характерной для гематологической стадии лейкоза, и на 22,5% больше животных с иммунной недостаточностью, вызванной вирусом лейкоза крупного рогатого скота в условиях неблагополучной фермы, является достаточно достоверным, точным и позволяет вести контроль за развитием инфекции в стаде.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. В опыт берут 60 голов крупного рогатого скота, которых разделяют на 3 группы. 1-ю группу составляют 20 голов интактного (здорового) крупного рогатого скота. 2-ю группу 20 инфицированных животных (РИД-положительных на лейкоз) и 3-ю 20 больных, выявленных гематологическим способом. В периферической крови определяют число иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании (тыс/мкл), количество циркулирующих иммунных комплексов в условных единицах (у.е.) и функциональную активность нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием в спонтанном и стимулированном вариантах с последующим подсчетом коэффициента стимуляции (Кст. НСТ).

Анализируют полученные данные (табл.1) и устанавливают, что у РИД-положительных животных наблюдается достоверное увеличение числа Т-киллеров, В-лимфоцитов, Т-антиген-реактивных лимфоцитов и ЦИК, в то время как число Т-лимфоцитов достоверно снижается. В группе больных животных отмечается достоверное увеличение числа Т-лимфоцитов, Т-киллеров, Т-антиген-реактивных лимфоцитов и ЦИК.

В дальнейшем проводят дискретно-динамический анализ иммунологических параметров. С этой целью, по условию метода, например, здоровых животных разделяют на 3 приблизительно равные группы по значениям базисного параметра: 1 - с минимальными значениями базисного параметра, 2 - с максимальными значениями и 3 - со средними (в дальнейшем не учитывалась). В 1 и 2 группах рассчитали средние значения остальных (вариабельных) параметров и с помощью вариационной статистики изучают достоверность их различий. В тех случаях, когда средние значения вариабельного параметра в группах с минимальными и максимальными значениями базисного параметра достоверно (Р<0,05) различаются, констатируют наличие взаимосвязей между ними. Взаимосвязь положительна, если при увеличении базисного параметра уровень вариабельного также увеличивается; отрицательна, если при увеличении базисного параметра уровень вариабельного снижается. При этом каждый из параметров берут в качестве базисного, где ведется подобный анализ с помощью вариационной статистики.

Аналогичному анализу подвергают иммунологические параметры РИД-положительных и больных лейкозом животных и составляют дифференциально-прогностические таблицы, суть которых представлена в табл. 2-4.

Таблица 2
Дифференциально-прогностическая таблица по оценке иммунного статуса здоровых животных, тыс./мкл
№ п/п	Сочетание базис (вариабельный параметр)	n	t - критерий по Стьюденту	базис	вариабельный
1	Т-антиген-реактивные лимфоциты (нейтрофилы)	20	3,87	1,61	2,38
Количество животных с функциональным напряжением иммунной системы	0	0

У здоровых коров выявлено 1 значимое сочетание параметров (табл.2). Так, Т-антиген-реактивные лимфоциты в качестве базисного параметра взаимосвязаны с нейтрофилами.

У животных, положительно реагирующих в РИД, число значимых сочетаний по сравнению со здоровыми увеличивается до 10 (табл.3). Изучение числа связей каждого определяемого показателя с другими позволило установить, что наибольшим их числом обладают Т-киллеры и Т-антиген-реактивные лимфоциты (по 3 раза в качестве базисного и вариабельного параметров), наименьшим числом - Т-лимфоциты (4) и В-лимфоциты (4). Это свидетельствует о функциональном напряжении иммунной системы за счет потребности подключения большего количества взаимосвязей ее структурных компонентов по сравнению со спокойным функционированием (здоровые животные).

Таблица 4
Дифференциально-прогностическая таблица по оценке иммунного статуса у больного лейкозом крупного рогатого скота, тыс./мкл
№ п/п	Сочетание базис (вариабельный параметр)	n	t - критерий по Стьюденту	базис	вариабельный
1	Т-киллеры (Кст. НСТ)	20	4,93	5,66	0,97
2	В-лимфоциты (Кст. НСТ)	4,89	2,93	0,80
3	ЦИК (Т-киллеры)	4,57	838,0	2,48
4	Т-киллеры (ЦИК)	3,76	5,66	921,7
5	Кст. НСТ (ЦИК)	3,12	1,36	865,8
6	В-лимфоциты (Т-киллеры)	2,86	2,93	7,35
7	Т-киллеры (В-лимфоциты)	2,75	5,66	1,68
8	Кст. НСТ (В-лимфоциты)	2,64	1,36	1,19
9	Кст. НСТ (Т-антиген-реактивные лимфоциты)	2,49	1,36	3,82
10	Т-антиген-реактивные лимфоциты (В-лимфоциты)	2,41	3,36	3,88
11	В-лимфоциты (Т-антиген-реактивные лимфоциты)	2,31	2,93	5,13
12	Т-лимфоциты (Кст. НСТ)	2,26	0,34	1,37
Количество животных с функциональным напряжением иммунной системы	18	90%

У больных животных число значимых сочетаний по сравнению со здоровыми увеличивается до 12, что также свидетельствует о функциональном напряжении иммунной системы (табл.4). Устанавливается много отличительных специфических связей. Наибольшим числом стали обладать Кст. НСТ (6) и В-лимфоциты (6).

Затем вычисляют коэффициент сопряженности (КС) у здорового, РИД-положительного и больного лейкозом крупного рогатого скота по формуле

Например, у здоровых коров количество достоверных взаимосвязей между иммунологическими показателями составляет 1 пару из 42 возможных, подставляем полученные данные в формулу

Аналогичным образом вычисляют коэффициент сопряженности у РИД-позитивных и у больных лейкозом коров .

В дальнейшем, используя значения базисного и вариабельного параметров таблицы, оценивают каждого животного исследуемых групп по всем значимым сочетаниям параметров. Если показатели числа иммунокомпетентных клеток животного соответствуют интервалам хотя бы одного из сочетаний (базисного, вариабельного) таблицы, таких животных признают с функциональным напряжением иммунной системы или с наличием иммунной недостаточности, вызванной вирусом лейкоза крупного скота.

Проводя подобный анализ иммунологических параметров дифференциально-прогностических таблиц по оценке иммунного статуса, было выявлено 90% среди больных животных и 55% среди РИД-положительных животных с функциональным напряжением иммунной системы. Среди здоровых с функциональным напряжением иммунной системы не выявлено.

Таким образом, малое число взаимосвязей изученных иммунологических показателей, а следовательно, низкое значение коэффициента сопряженности (КС=0,02) - свидетельство спокойного функционирования иммунной системы (более высокого уровня здоровья), большее число взаимосвязей и значение КС от 0,24 и выше - признак функционального напряжения иммунной системы.

Следовательно, на основании анализа дифференциально-прогностических таблиц можно заключить, что у здоровых животных количество статистически достоверных взаимосвязей между параметрами находится на низком уровне (спокойное функционирование иммунной системы). В период активной работы (вирусоносители, больные) количество взаимосвязей повышается.

Пример 2. В хозяйстве, неблагополучном по лейкозу, берут пробы крови у 28 голов крупного рогатого скота.

В крови животных определяют число иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании (тыс./мкл), количество циркулирующих иммунных комплексов в условных единицах (у.е.) и функциональную активность нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием в спонтанном и стимулированном вариантах с последующим подсчетом коэффициента стимуляции (Кст. НСТ). Далее иммунологические параметры подвергают дискретно-динамическому анализу. По результатам проведенного анализа составляют дифференциально-прогностическую таблицу (табл.5), в которой показаны 16 значимых сочетаний параметров (вариабельный, базис).

Таблица 5
Дифференциально-прогностическая таблица по оценке иммунного статуса у РИД-положительного и больного лейкозом крупного рогатого скота, тыс./мкл
№ п/п	Сочетание базис (вариабельный параметр)	n	t - критерий по Стьюденту	базис	вариабельный
1	Кст. НСТ (Т-лимфоциты)		7,81	1,4	1,62
2	Т-киллеры (Т-антиген-реактивные)	5,62	3,36	3,55
3	Т-антиген-реактивные (Т-лимфоциты)	4,65	3,18	1,90
4	Т-киллеры (Т-лимфоциты)	4,21	3,36	1,76
5	Т-антиген-реактивные (В-лимфоциты)	3,95	3,13	3,10
6	В-лимфоциты (Т-антиген-реактивные)	3,58	1,83	4,09
7	Т-лимфоциты (Т-антиген-реактивные)	3,48	1,64	4,17
8	Т-антиген-реактивные (Т-киллеры)	28	3,32	3,18	5,53
9	ЦИК (Т-киллеры)		3,16	559,0	2,29
10	Т-киллеры (В-лимфоциты)	2,85	3,36	2,39
11	В-лимфоциты (Т-лимфоциты)	2,73	1,83	1,56
12	Кст. НСТ (Т-антиген-реактивные)	2,63	1,4	1,98
13	Т-лимфоциты (В-лимфоциты)	2,23	1,64	2,41
14	В-лимфоциты (Т-киллеры)	2,21	1,83	4,4
15	Т-киллеры (Кст. НСТ)	2,17	3,36	1,46
16	В-лимфоциты (Кст. НСТ)	2,14	1,83	2,01
Количество животных с функциональным напряжением иммунной системы	20	71,4%

Изучение числа связей каждого определяемого показателя с другими позволило установить, что наибольшим их числом обладают Т-киллеры (7), Т-антиген-реактивные лимфоциты (7) и В-лимфоциты (7). Количество достоверных взаимосвязей между иммунологическими показателями составило 16 пар из 42 возможных (КС=0,38), что свидетельствует о функциональном напряжении иммунной системы в данной группе.

В дальнейшем, используя значения базисного и вариабельного параметров дифференциально-прогностической таблицы, оценивают каждого животного исследуемой группы по всем значимым сочетаниям параметров и выявляют с функциональным напряжением иммунной системы 20 из 28 животных (71,4%). Необходимо отметить, что у всех 20-ти голов крупного рогатого скота с функциональным напряжением иммунной системы заражение было выявлено серологическим методом, в том числе у 14-ти подтверждено гематологическим методом, у остальных 8-ми животных заражение было выявлено только серологическим методом.

Проводя аналогичную работу в нескольких хозяйствах, неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота, было исследовано с помощью предлагаемого способа оценки иммунного статуса и известных методов диагностики лейкоза (серологический и гематологический) 118 голов крупного рогатого скота (табл.6).

Таблица 6
Результаты оценки иммунного статуса у животных из ферм, неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота
Серологические исследования	Количество животных	Выявлено предлагаемым способом
здоровых	с функциональным напряжением	в %
РИД (-)	40	31	9	22,5
РИД (+)	78	9	69	85,5
в т.ч. гематологически	37	-	37	100
Всего	118	40	78	66,1

Из таблицы видно, что предлагаемый способ оценки иммунного статуса при лейкозе крупного рогатого скота позволил выявить 78 животных с функциональным напряжением иммунной системы, вызванным вирусом лейкоза (66,1% от общего числа), что подтвердило диагноз у всех 37-ми коров с гемограммой, характерной для гематологической стадии лейкоза, а также у 69-ти из 78-ми (85,5%) у РИД-положительного крупного рогатого скота. Кроме того, удалось дополнительно выявить 9 из 40 РИД (-) животных (22,5%) с иммунной недостаточностью, вызванной вирусом лейкоза крупного рогатого скота в условиях неблагополучной фермы. Необходимо отметить, что во всех исследованных группах КС варьировал от 0,31 до 0,38.

Таким образом, заявленный способ оценки иммунного статуса является достаточно достоверным, точным и позволяет вести контроль за развитием инфекции в стаде.