способ изготовления низкотитражной панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для диагностики антител к разным субтипам вгс

Формула изобретения

1. Способ получения низкотитражной панели сывороток для контроля качества тест-системы и иммуноблотов, используемых для диагностики антител к разным субтипам ВГС, включающий отбор иммуноспецифических сывороток, содержащих антитела ко всем основным антигенам вируса и имеющих разную концентрацию этих антител, а также отбор нативных донорских сывороток с нулевым титром, отличающийся тем, что отбор сывороток для панелей производят по результатам их исследования методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на наличие инфекционного материала и титрования в подтверждающем анализе, причем сыворотки секвенируют для определения генотипа HCV, и далее в качестве иммуноспецифических сывороток выбирают только те сыворотки, которые в процессе титрования закономерно уменьшают величину оптической плотности (ОП) в ИФА и величину аналитического сигнала в ПЦР, а в качестве донорских сывороток с нулевым титром - только те, которые имеют отрицательный результат в ОТ-ПЦР, а в ИФА - значение ОП меньше оптической плотности критической (ОП кр), кроме того, отобранные иммуноспецифические сыворотки разводят разбавителем, не содержащим антитела к тестируемому вирусу, с получением разной концентрации антител; в качестве иммуноспецифических сывороток отбирают сыворотки с ОП более 1,6 оптических единиц (о.е.), а в качестве нативных донорских сывороток с нулевым титром - сыворотки с ОП в диапазоне от 0,02 о.е. до ОП кр; разведение иммуноспецифических сывороток производят в пуле донорских сывороток, причем во все сыворотки панели вводят стабилизатор; для формирования стандартной панели отбирают 25-30% сывороток с нулевым титром, не менее 60% сывороток с титром от 1:20 до 1:40 и не более 25-30% сывороток с титром выше 1:200 при общем количестве сывороток в стандартной панели не менее 20.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения панели отбирают методом ИФА 25 иммуноспецифических сывороток крови ВГС-инфицированных лиц с ОП больше 2 о.е. титр не менее 1:3200 и 10 донорских сывороток ОП в диапазоне от 0,02 до ОПкр, антитела в которых не диагностировались используемыми для отбора тест-системами.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что во время приготовления сыворотки стандартной панели вводят стабилизатор и высушивают до остаточной влажности менее 2,0 мас.% путем лиофилизации.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммуноспецифические сыворотки отбирают с ОП больше 2,0 о.е.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения разводящего раствора используют пул отрицательных сывороток.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что сыворотки панели инактивируют прогреванием при 56°С в течение 120 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления стандартных панелей сывороток, содержащих или несодержащих антитела к определенному антигену, для контроля качества тест-наборов и в научно-исследовательских целях. Из источников патентной информации известны способы получения контрольных сывороток, используемых в диагностических анализах [1, 10]. Однако такие сыворотки не могут быть использованы для контроля качества тест-систем и иммуноблотов (ИМБ), т.к. они не отражают все характеристики сывороток, соответствующих возникновению и развитию вирусной инфекции. Именно с этой целью формируют стандартные панели сывороток.

Из литературы известен способ приготовления стандартных панели позитивных к ВИЧ или ВГС сывороток крови для оценки чувствительности диагностических иммуноферментных тест-систем [2]. Способ включает приготовление набора иммунных сывороток, содержащих специфические антитела к основным белкам HIV-I или ВГС и имеющих разную концентрацию этих антител. Полученная таким способом, например, стандартная панель ОСО 42-28-212-02П включает 16 сывороток крови больных СПИД и носителей ВИЧ-1, выявленных на территории России. Недостатками способа получения указанной панели сывороток являются:

1) панель составлена из нативных сывороток, имеющих обычно высокие титры;

2) образцы панели не сертифицированы на субтипы вируса;

3) панель не позволяет контролировать специфичность тест-систем, так как составлена из положительных сывороток.

Стандартная панель ОСО 42-28-212-02П из-за малого количества сывороток с низким содержанием антител (1-2 сыворотки из 16) малопригодна для оценки достоверности результатов анализов, например, при дискриминации ложноположительных сывороток, имеющих значения ОП, близкие или совпадающие с ОПкрит. Наконец, для HCV чрезвычайно важно определять генотип, которым инфицирован пациент, так как именно генотип во многих случаях определяет способ лечения и вероятность выздоровления [3].

Это послужило основанием при решении проблемы создания национальной панели сывороток для контроля диагностики гепатита С в качестве прототипа выбрать способ приготовления панели сывороток фирмой Boston Biomedica Inc., именуемой Anti-HCV Low Titer Performance Panel [4].

Способ включает:

1) отбор иммунных сывороток, содержащих специфические антитела к основным антигенам тестируемого вируса и имеющих разную концентрацию этих антител;

2) аттестацию генотипа ВГСа в иммунных сыворотках; и

3) включение в состав панели донорских сывороток с нулевым титром.

Каждая панель BBI PHV106 включает 15 нативных сывороток в жидкой форме (13 положительных и 2 отрицательных). Сыворотки панели не стабилизированы. По этой причине сыворотки панели должны храниться при минус 10°С или ниже. Запрещено замораживание-размораживание сывороток. Характеристики сывороток панели служат только для информационных целей и фирма не гарантирует воспроизведение указанных характеристик при проведении анализов пользователями и область их применения ограничена рамками решения исследовательских задач. Стоимость панелей колеблется от 1200 до 1700 долларов США.

К недостаткам прототипа следует отнести следующее:

- панели составлены из нативных сывороток, имеющих обычно высокие титры;

- сыворотки панели не содержат антитела к NS5 антигену;

- сыворотки находятся в жидком состоянии;

- сыворотки не стабилизированы.

При развитии инфекции гепатита С очень трудно выявить пациента в острый период из-за полного отсутствия каких-либо внешних признаков и болезненных ощущений. Большей частью инфицированные пациенты обращаются с жалобами, когда прошла сероконверсия и титры антител очень высоки [5]. Поэтому нативные сыворотки панели оказываются малоэффективными в области значений ОП, близких к критическим значениям (ОП крит). Именно из-за малого количества сывороток с низким содержанием антител (3 сыворотки из 13) панель, изготовленная по способу-прототипу, малопригодна для оценки правильности результатов анализов, например, при дискриминации ложноположительных сывороток, имеющих значения ОП, близкие или совпадающие с ОП кр (Cut off). Но основным недостатком панели BBI является отсутствие образцов, содержащих антитела к NS5. Панель такого состава может быть только ограничено использована для целей контроля качества диагностики гепатита С. Кроме того, большое неудобство доставляет транспортировка и хранение панелей при температурах ниже минус 10°С, но не ниже минус 25°С (т.к. запрещено замораживание-оттаивание сывороток). При условиях перевозок, существующих в России и странах СНГ, такие панели быстро становятся непригодными. Все это, несомненно, связано с тем, что сыворотки панели не стабилизированы. Практически, нестабилизированные сыворотки не могут быть аттестованы, т.к. по правилам ВОЗ биологические референс-материалы должны иметь срок сохранения более 2-х лет.

Подводя итоги изложенному выше, следует отметить, что производимые за границей панели сывороток не могут быть рекомендованы к использованию российским производителям тест-систем или работникам станций переливания крови (гематологических центров), т.к. зарубежные панели очень чувствительны к температурным условиям транспортировки и хранения, и цены на них традиционно велики.

В основу настоящего изобретения поставлена задача создания такого способа, который обеспечивал бы изготовление стандартных низкотитражных панелей сывороток, позволяющих достоверно оценивать качество тест-систем и ИМБ в области значений ОП, близких к ОПкр разных субтипов, т.е. способных повысить контроль чувствительности тест-систем и возможность контроля их специфичности относительно различных субтипов ВГС.

Поставленная задача решается тем, что в способе изготовления НКП анти-ВГС стандартной панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов (иммуноферментных и хемилюминесцентных), включающем отбор иммуноспецифических сывороток, содержащих антитела ко всем основным антигенам тестируемого вируса и имеющих разную концентрацию этих антител, а также отбор нативных донорских сывороток с нулевым титром, согласно изобретению отбор сывороток для панелей производят по результатам их исследования методом ИМБ и/или полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на наличие вирусного материала и титрование положительных образцов в ИФА. Причем в качестве иммуноспецифических сывороток выбирают только те, которые в процессе титрования закономерно снижают величину ОП в ИФА и значение аналитического сигнала в ОТ-ПЦР. Отобранные иммуноспецифические сыворотки сиквенируют и типируют для определения генотипа ВГС. По результатам генотипирования формируют состав панели в соответствии с распространенностью субтипов ВГС в России (60% - 1b, 35% - 3а и 5% - 2). На следующем этапе титруют кандидаты в панель в иммуноблоте для определения спектра антител к отдельным белкам: Core, NS3, NS4 & NS5. В соответствии с величиной титров разводят кандидаты до получения искомой концентрации антител разводящим буфером, приготовленным из пула сывороток здоровых доноров с бактерицидной добавкой для долгого хранения. Спектр антител тщательно формируют в соответствии с встречаемостью в России: антитела к Core & NS3 встречаются примерно в равном количестве и в 2 раза превышают встречаемость анти-NS4 и в 3-4 раза - встречаемость анти-NS5. Окончательно для формирования стандартной панели отбирают 25-20% сывороток с нулевым титром, не менее 50% сывороток с титром анти-ВГС от 1:20 до 1:40 и не более 20-25% сывороток с титром выше 1:100 при общем количестве сывороток в стандартной панели от 20 до 24. Отобранные сыворотки-кандидаты высушивают до остаточной влажности не более 2,0 мас.% путем лиофилизации для длительного хранения.

Важной проблемой при аттестации сывороток панели на антитела к некоторым тестируемым вирусам, например к вирусу гепатита С (ВГС), является процедура дифференциации специфических антител относительно специфических антител к другим вирусным агентам того же или родственного семейства, например выявление антител к ВГС относительно антител к некоторым видам флавивирусов. В [6] проведено сравнительное изучение качества тест-систем на антитела к ВГС 1-го поколения, построенных на одном рекомбинантном белке С100, и тест-систем 2-го поколения, построенных на 3-х рекомбинантных белках: С100, С33-с и коровом, при анализе сывороток, полученных из крови больных гемофилией и пациентов с диагнозом гепатит ни А, ни В. Чувствительность при переходе к тест-системам 2-го поколения увеличилась от 0,92 до 0,98, а вероятность ложноотрицательных результатов уменьшилась от 0,37 до 0,05. Показано, что антитела к ВГС обнаруживаются у американских доноров, проверенных тест-системами 1-го поколения: 0,36% (22 подтвержденных позитива из 6 III образцов) среди доноров крови и 10,08% (375 подтвержденных позитивов из 3718 образцов) среди доноров плазмы. Как следует из приведенных примеров, в научной литературе и лечебной практике отсутствуют критерии однозначной идентификации антител к ВГС или диагноза гепатита С, а также к другим вирусам, которые не могут быть наработаны in vitro. В этих случаях следует руководствоваться рекомендациями CDC (Atlanta, US).

Для сокращения числа дорогостоящих подтверждающих тестов и ПЦР анализов авторы рекомендуют использовать коэффициент позитивности (К=ОП/ОПкр) по результатам скриннинговых анализов анти-ВГС антител:

1) при использовании иммуноферментного метода анализа значение К>3,8 соответствует 95% вероятности наличия антител к ВГС, т.е. инфекции гепатита С. Для большей надежности авторы выбирают К>4,0 или ОП>1,6 о.е. для отбора сывороток, позитивных на содержание антител к ВГС.

2) при использовании иммунофлюоресцентного метода анализа значение К должно превышать 8,0 для достижения 95% вероятности инфекции гепатита С [7].

В настоящем изобретении предлагается для исследования иммуноспецифических сывороток к HCV использовать в качестве подтверждающего теста результаты анализа в тест-системах 3-го поколения и в ОТ-ПЦР. При использовании тест-систем 3-го поколения ИФА (ORTHO HCV Version 3.0 ELISA) или хемилюминесцентной (VITROS anti-HCV, ORTHO Clinical Diagnostics) чувствительность тест-систем достигла 99,5% и специфичность 99,0% [8].

При этом сама процедура исследования предусматривает обязательное титрование сывороток от высоких значений оптической плотности (ОП) до ОПкр. И только в том случае, когда аналитический сигнал закономерно уменьшается с разведением в обоих видах анализа, принимается, что регистрируемые антитела являются антителами именно к тестируемому вирусу, например ВГС, а сама сыворотка содержит инфекционный материал. Дополнительным подтверждением этому служит спектр антител к ВГС, который определяют путем постановки подтверждающего рекомбинантного иммунного блотинга (LIA или СПЕКТР). Из научной литературы известно [8], что около 70% больных гепатитом С или хронических больных имеют антитела к коровому антигену и NS3, а представительство антител к неструктурным антигенам NS4 & NS5 значительно ниже (20-30%) и варьируется в широких пределах.

Таким образом, процедура отбора сывороток-кандидатов для референс панели включает три этапа, результаты которых независимы и позволяют надежно идентифицировать антитела к тестируемому вирусу. Далее стандартную низкотитражную панель формируют из отобранных на трех этапах сывороток кандидатов с различной концентрацией антител и содержащих различные субтипы ВГС.

При этом концентрация антител в сыворотках панели нормируется по показателям титра и оптической плотности в ИФА в трех диапазонах:

1. Оптическая плотность сывороток в ИФА от 0,02 до ОП Крит, титр нулевой (20-25% сывороток).

2. ОП в ИФА - от ОП крит до 0,7, титр 1:20-1:40 (не мене 50% сывороток).

3. ОП в ИФА - от 0,7 до 2,0, титр 1:100-1:400 (не более 20-25% сывороток).

Нормировку антител в сыворотках осуществляют путем разведения аттестованных кандидатов в пуле донорских сывороток, не содержащих антитела к тестируемому вирусу, отрицательных в ОТ-ПЦР и имеющих нормальный уровень АЛТ. По результатам анализа иммунных сывороток в панель собирают кандидатов, имеющих в сумме антитела ко всем антигенам вируса субтипов 1, 2 и 3.

Для сохранения неизменными значений специфических показателей сывороток панели в последние добавляют стабилизатор. Стабилизированные сыворотки обезвоживают по специальному режиму методом лиофилизации до уровня остаточной влажности менее 2 мас.% [9].

Сравнение панели сывороток, приготовленной в соответствии с заявляемым способом, с панелью фирмы Boston Biomedica Inc. того же назначения, приготовленной по способу-прототипу [4], показывает, что отличная от прототипа совокупность существенных признаков обеспечивает новое раннее не известное свойство: возможность формирования стандартной панели из исследованных (аттестованных) сывороток, что позволяет более надежно и правильно контролировать качество изготовляемых тест-систем и иммуноблотов, особенно в области значений ОП, близких к ОПкр. В качестве примеров использования панелей сывороток для контроля качества тест-систем приведены данные для стандартной панели НКП анти-ВГС сер. 02 в скриннинговом и в подтверждающем форматах.

Работу с сыворотками панели следует проводить в асептических условиях, используя автоматические пипетки и одноразовые сменные наконечники. Во флакон с лиофильно высушенной сывороткой вносят 300 мкл дистиллированной воды. Раствор тщательно перемешивают до полного растворения сыворотки. При проведении контроля качества диагностических тест-систем, применяемых для определения антител к ВГС, по тесту чувствительности используют полный комплект - 20 сывороток из стандартной панели. Рабочие разведения сывороток готовят в соответствии с инструкцией по применению контролируемой тест-системы. Затем вносят каждую сыворотку панели в две лунки планшета с иммуносорбентом как неизвестные образцы и проводят анализ. Учет результатов по образцам из панели следует проводить только в том случае, если величины оптической плотности (ОП), контроля конъюгата и контрольных сывороток укладываются в пределы, регламентированные ТУ на испытуемую тест-систему.

ОП кр (критическая оптическая плотность или Cut off) вычисляют в соответствии с формулой, приведенной в инструкции по применению тест-системы. Если ОП сывороток панели 1-7 и 10-18 выше значения ОП крит, чувствительность тест-системы принимается за 100%.

В случае, когда несколько значений ОП оказываются меньше или равными ОПкр, тест-система направляется на повторный контроль, и в случае повторного неузнавания хотя бы одной сыворотки панели - бракуется.

На основе аттестованных свойств панелей сывороток оцениваются качество и годность тест-систем, используемых в практической медицине. При проведении контроля качества тест-систем, основанных на других принципах (иммуноблот, иммунофлуоресценция, агглютинация и др.), количество используемых сывороток стандартной панели и проведение испытаний регламентируются соответствующей НТД на тест-системы.

Пример выполнения способа

Для приготовления низкотитражной панели сывороток с различными генотипами ВГС отбирают в процессе первичного скрининга (методом ИФА) 25 иммуноспецифических сывороток крови ВГС-инфицированных лиц с ОП>2 о.е. (титр не менее 1:3200) и 10 донорских сывороток (ОП в диапазоне от 0,02 до ОПкр), антитела, в которых не диагностировались используемыми для отбора (скрининга) тест-системами [9]. Отобранные после первичного скрининга кандидаты сиквенируют с помощью набора Qiagen. Аликвоты сывороток крови для анализа методом ОТ-ПЦР хранят, при минус 70°С, в микропробирках по 1 мл. Выделение РНК ВГС проводят из 200 мкл сыворотки набором QIAamp MinElute Virus Spin Kit (QIAGEN, Cat # 57704) согласно инструкции производителя. Обратную транскрипцию и первый раунд полимеразной цепной реакции проводят набором QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (QIAGEN, Cat # 210212) с последующей постановкой второго раунда ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы (СибЭнзим). Анализ осуществляют независимо по трем генам: 5'UTR, Core и NS5B.

Из 25 кандидатов отбирают 14 образцов для формирования панели субтипов. Эти образцы далее титруют в тест-системах Бест анти-ВГС (АО ВекторБест ) и ИФА-анти-HCV (ЗАО «Диагностические Системы»). Причем сыворотки титруют в 3-х параллельных определениях на двух планшетах одновременно. Затем сыворотки исследуют в реакции иммунного блотинга ( Бест анти-ВГС-спектр» (АО ВекторБест) и «ИФА-анти-НСV-Спектр-GM (ЗАО «Диагностические Системы»)). Определено, что в девяти иммуноспецифических сыворотках-кандидатах присутствуют антитела ко всем основным белкам Core, NS3, NS4 и NS5. Это служит дополнительным доказательством, что сыворотки, отобранные для приготовления панели, являются гомоспецифичными к вирусу гепатита С. Готовят пул отрицательных сывороток для изготовления разводящего раствора. Сыворотки пула аттестуют дополнительно на их способность подавлять анти-ВГС по методике [2]. По результатам титрования в пуле отрицательных сывороток с помощью статистической обработки строят усредненные кривые титрования для каждой имуноспецифической сыворотки. По кривым титрования определяют коэффициенты степени разведения для каждого кандидата в панель. На этапе разведения 9 положительных кандидатов каждого номера смешивают с разводящим раствором, в который заранее добавляют стабилизатор. Смешивание для каждого номера от № 1 до № 7 и № 10-18 осуществляют в течение 15-20 мин в колбе объемом 250 см³, установленной на магнитной мешалке. При этом получено:

4 иммуноспецифических сывороток с титром в диапазоне от 1:10 до 1:40 и 5 иммуноспецифических сывороток с титром в диапазоне от 1:40 до 1:100 и 2 сыворотки с титром >1:400. Сыворотки панели инактивированы прогреванием при 56°С в течение 120 мин, но с ними необходимо обращаться как с потенциально инфекционным материалом.

Все сыворотки разливают по 300 мкл во флаконы R2 и лиофильно высушивают на установке TG-50 (ФРГ). Режим лиофилизации подбирают по результатам предварительного физико-химического анализа фазовых превращений в разводящей донорской сыворотке со стабилизатором при замораживании [9]. Подготовленные сыворотки панели замораживают со скоростью 0,3-0,5°С/мин до температуры -60°С и выдерживают при этой температуре в течение 10 ч. На этапе сублимации воды температуру материала поддерживают ниже температуры его стеклования (-30°С). Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет 6°С/мин, время выдерживания при 27°С составляет 10 ч.

Лиофильно высушенные сыворотки панели имеют остаточное содержание воды около 1,0 мас.%. Флаконы с сыворотками укупоривают под вакуумом. Все сыворотки панели аттестовывают после лиофилизации в тест-системах: РекомбиБест анти-ВГС (АО ВекторБест ); ИФА ВГС (АО МБС ); ИФА анти-HCV (АО ДС ). Далее проверяют, что в процессе лиофилизации специфическая активность сывороток не изменяется. Стабильность сывороток в различных условиях хранения во флаконах определяют по результатам теста термодеградации при температурах: -20, +4, +37°С и 50°С.

По результатам теста установлено, что сыворотки панели должны сохранить неизменной специфическую активность в течение не менее 2,5 лет при хранении при температуре от 2 до 6°С.

Экономическая эффективность применения предлагаемого способа изготовления образцов низкотитражной панели анти-ВГС различных субтипов заключается в том, что указанные антитела используются как прогностические маркеры гепатита С. Они циркулируют в крови инфицированных на острой стадии и в хронике. Раннее обнаружение анти-ВГС обусловлено высокой чувствительностью тест-систем к антителам различных субтипов. Прогностическое значение субтипа ВГС чрезвычайно важно для выбора курса лечения. Именно сокращение сроков установления диагнозов для инфицированных пациентов и более ранняя медицинская помощь и контролируемое по количеству и субтипам анти-ВГС лечение составляют социально-значимую и экономическую эффективность, связанную с сокращением сроков лечения и сроков трудовой недееспособности людей. Введение российской панели субтипов значительно уменьшит расходы средств контрольных организаций здравоохранения на приобретение дорогостоящих заграничных аналогов.

Источники информации

1. Европейская заявка № 0062227 »Artificial control and reference serum, method of making the same and its use.» G01N 33/531; A61K 39/395.

2. Международная заявка № 0131826 «Storage-stable universal control serum» G01N 33/96.

3. Заявка Германии № 3324626 «Storage-stable universal control serum». G01N 33/96.

4. Канев A.H., Воробьева M.C, Шалунова Н.В.,.Карпович Л.Г., Нетесов С.В., Максютов А.З., Усова С.В. Разработка референс панелей сывороток для анализа контроля качества ELISA тест-систем в России // Вестник РАМН. 1998, № . 3, 47-52.

5. Koch W. Diagnostics and therapeutics in partnership.IllVD technology 2008, 14, 24-31.

6. Информационный бюллетень фирмы Boston Biomedica, Inc., Anti-HCV Low Titer Performance Panel. PHV 106. BBI Diagnostics. A Sera Care Company. 02.2006.

7. Bush M.P., Glynn S.A., Stramer S.L. et al. Correlates of hepatitis С virus RNA negativity among HCV - seropositive blood donors. // Transfusion 2006, 46, 1537-2995.

8. Bresters D., Cuypers HT., Reesink HW., Schaasberg WP., van-deer-Po-1CL., Mauser-Bunschoten EP., Houghton M, Choo QL., Kuo G., Lesniewski R. et al. -Enhanced sensitivity of a second generation ELISA for antibody to hepatitis С virus. - Vox-Sang . 1992, v.62, N 4, p.213-7.

9. Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Guidelines for laboratory testing and result reporting antibody to hepatitis С virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep 2003, 52: 1013, 15.

10. Потапова A.A., Богуш П.Г., Редченко Е.Б., Дронова В.М. Способы оптимизации внутрилабораторного контроля качества при массовом скриннинговом исследовании на антитела к вирусу гепатита С. // Клин. Лабор. Диагностика 2008, 3, 35-38).

11. Патент РФ № 2010220»Способ определения технологических параметров процесса лиофилизации биоматериалов».

12. Патент США № 71796000 Oligonucleotide chip composition for analyzing hepatitis с virus (hcv) genotype and detecting method thereof» C12N 15/09; C12Q 1/68; C12Q 1/70.