способ биоразложения фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения вещества типа vx

Формула изобретения

1. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе реакционных масс, образующихся при химической детоксикации фосфорорганического нейротоксина, отличающийся тем, что проводят последовательное экспонирование разбавленных водных растворов реакционных масс в присутствии полигистидинсодержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы, выделенной из штамма бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29, и клеток индивидуальных культур микроорганизмов-деструкторов С-Р-связи, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что предварительно реакционные массы вещества типа Vx разбавляют в 10-100 раз в зависимости от химического состава, соответствующего примененному способу уничтожения фосфорорганического нейротоксина, одной из перечисленных сред: водопроводной водой, 50 мМ карбонатным буфером (рН 10), 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5), 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5).

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что для ферментативного гидролиза Vx в разбавленных реакционных массах используется полигистидинсодержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы в растворимой или иммобилизованной форме.

4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что для обработки ферментативных гидролизатов разбавленных реакционных масс используют биокатализатор на основе иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток бактерий или мицелиальных грибов, являющихся деструкторами С-Р-связи и выбранных из следующего ряда штаммов: Pseudomonas species 78Г, Escherichia coli DH5 /pTrcTE-OPH, Escherichia coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, Chryseomonas luteola, Comamonas teastosteroni B-1241, Sinorhizobium meliloti B-1010, Pseudomonas stutzeri B-1199, Aspergillus awamory F-9, Aspergillus terreus F-394, Mucor circinelloides F-1226.

5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что для ферментативного гидролиза разбавленных реакционных масс используется полигистидинсодержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, иммобилизованный на пористом носителе, представляющем собой криогель полимера, полученного при полимеризации мономеров, представляющих собой производные акриламида, поверхность которого модифицирована металл-хелатирующими лигандами в виде остатков иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Cu²⁺ или Со²⁺.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области обезвреживания реакционных масс (РМ), получаемых после химического уничтожения фосфорорганического боевого отравляющего вещества (ФОВ) типа Vx, а именно к способу биоразложения остаточных концентраций ФОВ и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции, в составе РМ.

Способ реализуется посредством проведения последовательной обработки разбавленных водных растворов РМ ферментом с активностью органофосфатгидролазы и биокатализатором на основе клеток микроорганизмов-деструкторов С-Р-связи, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта.

Согласно Международной конвенции о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и его уничтожении [ОЗХО, C.N.610, 2005] на территории Российской Федерации должно быть уничтожено 15,5 тыс. т смертельно опасного фосфорорганического отравляющего вещества типа Vx [Белецкая И.П., Новиков С.С., Химическое оружие в России // Вестн. РАН, 1995, Т.65, № 2, с.99-111].

Для химического уничтожения запасов вещества типа Vx, извлеченного из боеприпаса, в РФ принята рецептура РД-4М, согласно которой детоксикатором является водный раствор изобутилата калия, который смешивают с ФОВ в массовом соотношении 2:1 и проводят процесс дегазации при начальной температуре процесса 95°С [Уткин А.Ю., Либерман Б.М., Кондратьев В.Б., Капашин В.П., Холстов В.И. Математическое описание процессов детоксикации фосфорорганических отравляющих веществ.// Рос. хим. жур., 2007, т.L1 (2), с. 12-18].

Количество реакционных масс, которое, как ожидается, будет получено при уничтожении вещества типа Vx в РФ при использовании этой рецептуры, составляет 15,25 тыс. т (далее РМ-РД-4М) [Капашин В.П., Назаров В.Д., Голышков Д.В., Комиссаров, Никифоров Г.Е., Судаков А.Ю. Практические аспекты переработки реакционных масс после детоксикации фосфорорганических веществ. // Химическая и биологическая безопасность, 2006, № 4, с. 14-20].

Другой способ химического уничтожения вещества типа Vx, проводимый непосредственно в боеприпасе, принятый в РФ, заключается в том, что в боеприпас с ФОВ заливают в количестве 3-7% от объема ФОВ водный раствор, содержащий 13 мас.% моноэтаноламина, 7 мас.% хлорида триэтилбутиламмония, 4 мас.% диоксида углерода, и выдерживают 80-100 сут для химического гидролиза ФОВ [Патент РФ № 2042368 (1995) Способ уничтожения отравляющего вещества; Заявка РФ на патент № 2006133269/02 (20.03.2008, Бюл. № 8) Способ уничтожения боеприпасов, снаряженных фосфорорганическими отравляющими веществами и имеющих в корпусе технологические резьбовые отверстия]. Количество реакционных масс, которое, как ожидается, будет получено при уничтожении вещества типа Vx в РФ при использовании этой «гидролизной» рецептуры, составляет 10,4 тыс. т (далее РМ-ГД) [Капашин В.П., Назаров В.Д., Голышков Д.В., Комиссаров, Никифоров Г.Е., Судаков А.Ю. Практические аспекты переработки реакционных масс после детоксикации фосфорорганических веществ. // Химическая и биологическая безопасность, 2006, № 4, с. 14-20].

Поскольку согласно Международной конвенции о химическом разоружении должно быть уничтожено не только само вещество типа Vx, но и продукты его гидролиза, на основании которых данное ФОВ может быть синтезировано заново, то последующей деградации подлежат образующиеся РМ (РМ-РД-4М и РМ-ГД), содержащие не только остаточные количества неразложившегося ФОВ, но и продукты разложения ФОВ - все фосфорорганические соединения с С-Р связью: диизобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты (ДЭМФК), моноизобутиловый эфир метилфосфоновой кислоты (МЭМФК), метилфосфоновая кислота (МФК)): (вещество типа Vx ДЭМФК МЭМФК МФК).

Среди способов разложения фосфорорганических компонентов РМ, получаемых после уничтожения вещества Vx или вещества типа Vx, наиболее эффективными являются биокаталитические способы, поскольку они предполагают проведение биодеградации компонентов РМ в экологически безопасных условиях (без применения сильных химических окислителей и концентрированных щелочных растворов), а также в технологическом плане не требуют применения высоких температур, повышенного давления и использования оборудования, изготовленного из дорогих коррозионностойких материалов.

Основными показателями эффективности реализации тех или иных способов биоразложения фосфорорганических компонентов РМ, по которым можно их было бы сравнивать, являются:

- исходная суммарная концентрация фосфорорганических соединений, присутствующих в разбавленных РМ, подлежащих биоразложению (г/л);

- достигаемое снижение концентрации фосфорорганических компонентов РМ (%),

- продолжительность процесса реализации способа (сут),

- объемы стоков, образующихся после реализации способа (л).

Так известен способ биоразложения остаточных концентраций ФОВ в составе реакционных масс вещества типа Vx [Патент РФ № 2296164 (2007) Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических боевых отравляющих веществ], основанный на введении полигистидинсодержащего пептида со свойствами органофосфатгидролазы (ОРН) в виде высокоочищенного растворимого препарата (2,5 мг белка на 1 л разбавленного раствора РМ), выделенного из клеток Escherichia coli ЦКМИБХ 29, или в виде клеточного гомогената (9 мг общего белка на 1 л разбавленного раствора РМ) в реакционную массу РМ-РД-4М, разбавленную до концентрации ФОВ 6×10^-8÷7×10^-6 М с целью гидролиза вещества типа Vx. Данный способ обеспечивает 100% ферментативное разложение указанных концентраций ФОВ как компонента РМ в течение 30 мин.

Несмотря на высокую эффективность действия фермента в отношении остаточных количеств самого вещества типа Vx, присутствующего в составе реакционных масс РМ-РД-4М, способ обладает явным недостатком, заключающимся в том, что все остальные фосфорорганические компоненты РМ, являющиеся продуктами разложения Vx и подлежащие обязательному разложению, остаются в реакционной среде неразложившимися.

Известен другой способ биоразложения фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx [Патент WO 2007/011251 А1 (2007) Способ обезвреживания отравляющих веществ в безопасные нетоксичные продукты], согласно которому проводят первоначальную обработку реакционной массы РМ-ГД, содержащей остаточные концентрации ФОВ и высокие концентрации ди- и моноэфира МФК, смешивая ее в соотношении 1:1-1:3 (по массе) и выдерживая в течение 0,5 ч при рН 8-12 с аминокислотным реагентом, образующим комплексные соединения с фосфорорганическими компонентами РМ, а затем вводят полученные комплексные соединения в среды для культивирования клеток бактерий Streptococcus thermophylus или активного ила. Согласно этому способу в качестве аминокислотного реагента (АКР) применяют индивидуальные аминокислоты или щелочной гидролизат белоксодержащих промышленных отходов, а о биоразложении фосфорорганических компонентов РМ судят по наличию роста бактерий через 1 сутки в исследуемых образцах клеток.

К очевидным недостаткам этого способа следует отнести следующее:

- согласно этому способу фосфорорганические соединения не биоразлагаются под действием АКР, а вступают с ним в реакции образования новых производных, что противоречит основным положениям Международной конвенции о химическом разоружении, требующим уничтожения фосфонатов;

- отсутствуют какие-либо характеристики способа, подтверждающие эффективность биодеградации комплексов аминокислотного реагента с фосфорорганическими компонентами РМ, поскольку только факт наличия роста клеток в среде, содержащей эти комплексы, не свидетельствует об их биоразложении, ввиду того, что помимо образовавшихся комплексов в смесях, вносимых в среды с клетками, могут присутствовать свободные аминокислоты и белки, не вступившие в реакции комплексообразования и которые могут использоваться клетками в качестве источников углерода и азота, необходимых для их роста. При этом клетки могут расти в присутствии токсичных веществ, не подвергая их деструкции или, наоборот, утилизируя их путем прямого встраивания в клеточные структуры. В последнем случае все фосфонаты накапливаются в биомассе клеток микроорганизмов и представляют собой токсичный отход;

- согласно данному способу требуется использование больших количеств АКР или дорогостоящих индивидуальных аминокислот, превышающих объемы самих РМ в 2-3 раза при соблюдении рекомендованных массовых соотношений РМ и АКР, что делает экономическую сторону реализации данного способа малопривлекательной.

Известен способ биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ вещества Vx [Патент США № 6080906 (2000) Demilitarization of chemical munitions; Патент РФ № 2203116 (2003) Способ уничтожения химического ружия; DeFrank J.J., Guelta М., Harvey S., Fry I.J., Earley J.P., Lupton F.S. Biodegradation of hydrolyzed chemical warfare agents by bacterial consortia. // В книге: «Enzymes in Action: Green Solution for Chemical Problems», Netherlands: Kluwer Acad. Publ. (Eds.-B. Zwanenburg et al.), 2000, p. 193-209; Патент США № 7001758 (2006) Microbial biodegradation of phodphonates], согласно которому разбавленные реакционные массы обрабатывают в реакторе с иммобилизованным искусственным микробным консорциумом GB2, в который входят бактериальные культуры, представленные множеством различных штаммов: Methylobacterium radiotolerans штамм GB21, Agrobacterium tumefaciens штамм GB2GA, Klebsiella oxytoca штамм GB2CS и GB272, Aureobacterium sp. штаммы GB2, GB23, GB272 и GB292. Применение клеток микроорганизмов в иммобилизованном виде имеет целью использовать их многократно для проведения одного и того же процесса, а также повысить их устойчивость к воздействию различных неблагоприятных факторов, в частности высоких концентраций токсичных субстратов. В качестве носителя для адсорбционной иммобилизации клеток консорциума используют кубические гранулы из вспененного полиуретана с линейным размером 1,27 см, содержащие включенные в полиуретановую матрицу частицы активированного угля. В ходе такой обработки иммобилизованные клетки микроорганизмов с помощью своих внутриклеточных ферментов осуществляют биоразложение остаточных концентраций Vx и эфиров МФК в составе РМ.

Для реализации этого способа применяют РМ вещества Vx, которые получают в результате смешивания Vx и 11% раствора NaOH с небольшим молярным избытком NaOH и их последующего выдерживания при 90°С в течение 6 ч. Образующиеся РМ содержат 20 мкг/л неразложившегося вещества Vx и суммарно фосфорорганических соединений - 400 г/кг.

Для иммобилизации бактерий пористый носитель удерживают в реакторе с помощью полипропиленовых полых цилиндров, и через его слой прокачивают суспензию клеток, составляющих консорциум. Перед использованием иммобилизованных клеток в процессе биоразложения фосфорорганических компонентов РМ проводят их адаптацию к токсичным субстратам. С этой целью в аэробных условиях иммобилизованные клетки культивируют при постоянном перемешивании (150 об/мин) в течение 12 суток при 28°С в среде, не содержащей фосфаты и приготовленной на основе 50 мМ буфера HEPES (рН 7,2), с введением в нее 0,5 г/л КСl, 0,5 г/л (NH₄)₂SO ₄, 10 мл/л стандартного раствора микроэлементов Wolin Salts (Sigma, США) и 5 мМ изопропилового эфира метилфосфоновой кислоты (ИПЭМФК).

Исходные РМ для биоразложения разбавляют буфером, имеющим рН 6,0-9,0 в 100-190 раз так, что концентрация вещества Vx составляет 10^-8 М, а суммарная концентрация фосфорорганических соединений 2,1-4,0 г/л. В них добавляют источник углерода (глюкозу, или изопропанол, или глицерин, или кукурузный экстракт, или глицерин в смеси с мелассой) в конечной концентрации 20 г/л и подают в реактор с иммобилизованными клетками. Культивирование иммобилизованных клеток в такой среде при 20-25°С в аэробных условиях в течение 15 суток обеспечивает 75%-ное разложение фосфорорганических компонентов РМ. Объем образующихся стоков составляет 1000 л на 1 кг РМ, а общая длительность процесса с учетом необходимой адаптации иммобилизованных клеток к токсичному субстрату - 27 суток.

Основными недостатками этого способа биоразложения фосфорорганических компонентов РМ вещества Vx являются:

- неполное разложение фосфорорганических компонентов РМ (эфиров МФК и самой МФК), в результате которого 25% веществ остается неразложившимися, возникающее вследствие ингибирующего воздействия на клетки остаточных концентраций самого ФОВ, присутствующего в РМ;

- необходима длительная (12 суток) предварительная адаптация иммобилизованных клеток к токсичным субстратам (в данном случае - моноэфиру МФК);

- необходим контроль и поддержание постоянства сложного состава многокомпонентного микробного иммобилизованного консорциума с целью обеспечения заявленной эффективности его действия;

- частицы активированного угля, введенные в состав носителя, согласно данным разработчиков биокатализатора, сорбируют из среды эфиры МФК, в результате чего значительное их количество остается связанными с носителем и не подвергается разложению клетками.

Для повышения эффективности процесса биодеградации фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток микроорганизмов целесообразно первоначально проводить удаление из состава РМ остаточных концентраций ФОВ, которые являются высокотоксичными для клеток.

Известен способ биоразложения фосфорорганических компонентов в составе РМ вещества Vx, основанный на комбинированном использовании химического разложения (под действием сильного окислителя и ультрафиолетового облучения) и биоразложения их остаточных количеств под действием клеток, иммобилизованных аналогично тому методу, что описан в предыдущем способе [Патент США № 6498281 (2002) Treatment of chemical hydrolysates]. Для реализации способа используются РМ Vx, полученные при разбавлении ФОВ 4%-ным раствором NaOH при температуре 90°С в течение 12 ч и суммарно содержащие 280 г/кг фосфорорганических компонентов, подлежащих разложению. Первоначально РМ разбавляют водой в 200 раз так, что на последовательную обработку окислителем и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие остаточные концентрации вещества Vx (концентрация не известна) и 1,4 г/л фосфорорганических соединений. Полученные растворы РМ обрабатывают в течение 6-8 ч сильным окислителем (30% Н₂О₂), смешивая его с разбавленными РМ при соблюдении мольного соотношения между оксидантом и фосфорорганическими соединениями 3:1. Таким образом, объем РМ при смешивании с окислителем увеличивается еще на 2%. Обработку РМ с окислителем комбинируют с ультрафиолетовым облучением этой смеси при следующей его интенсивности: 1 кВт на 0,2-0,3 г фосфорсодержащих соединений. На втором этапе реализации способа химически обработанные разбавленные РМ с разложившимися остаточными количествами ФОВ и эфирами МФК до МФК разбавляют еще в 140 раз и подают для биоразложения накопившейся МФК в реактор с иммобилизованным консорциумом, состав которого был указан в описании предыдущего способа [Патент США № 6080906 (2000) Demilitarization of chemical munitions]. Биоразложение фосфорорганических компонентов в составе разбавленных РМ иммобилизованными клетками проводят при постоянной аэрации среды и поддержании рН в интервале 7,0-8,0. Данный способ обеспечивает 99%-ное удаление всех фосфорорганических компонентов из РМ вещества Vx в течение 8 сут. По окончании процесса объемы стоков составляют 28560 л с 1 кг РМ, а общая длительность процесса с учетом необходимой адаптации иммобилизованных клеток к токсичному субстрату - 20 суток.

Этот способ биоразложения фосфорорганическими компонентами в составе РМ вещества Vx обладает несколькими существенными недостатками:

- способ характеризуется всеми теми же недостатками, что и предыдущий описанный способ биоразложения РМ, связанными с используемым многокомпонентным иммобилизованным консорциумом, то есть длительная его адаптация к токсичным субстратам, необходимость контроля и поддержания постоянства его состава;

- способ характеризуется высокой степенью разбавления исходных реакционных масс, а именно, в 28560 раз, что сопровождается накоплением огромных количеств сточных вод, содержащих 1% неразложившихся фосфорорганических соединений, вследствие чего их последующая утилизация делает процесс чрезвычайно дорогим;

- способ предусматривает применение на первой стадии разложения жесткого ультрафиолетового облучения и введения в среду сильнейшего окислителя в виде концентрированного раствора перекиси водорода, требующего соблюдения дополнительных мер предосторожности для обслуживающего персонала и защитных противокоррозионных мер для применяемого оборудования.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по способу реализации процесса биоразложения фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx, основанному на комбинированном использовании химического разложения остаточных концентраций ФОВ в составе РМ и последующего биоразложения всех фосфорорганических компонентов РМ под действием иммобилизованных клеток бактерий, принято за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ, образующихся при химической детоксикации фосфорорганического нейротоксина.

Поставленная задача решается посредством проведения последовательной обработки разбавленных водных растворов РМ полигистидинсодержащим полипептидом с активностью органофосфатгидролазы и клетками индивидуальных культур микроорганизмов-деструкторов С-Р-связи, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта.

Согласно заявляемому способу разложение остаточных количеств вещества типа Vx в составе РМ проводят в отличие от прототипа не под действием сильного окислителя и ультрафиолетового облучения, а под действием фермента (полигистидинсодержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы - His₆ -OPH), выделенного из штамма бактерий Escherihia coli ЦКМИБХ 29 [Патент РФ № 2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы]. Замена химической обработки, известной из прототипа, на биохимическую (ферментом) - в заявляемом способе - позволяет существенно сократить затраты на обеспечение безопасных условий труда и технически упростить саму технологическую операцию.

Фермент His₆-OPH, используемый в предлагаемом способе для гидролиза остаточных концентраций ФОВ в составе РМ, обладает самой высокой каталитической эффективностью действия по отношению к Vx среди других известных на сегодняшний день ферментов [Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. // Успехи биол. химии, 2004, Т.44, с.307-340]. Также известна высокая эффективность его действия при разложении ФОВ, взятых не в виде чистых веществ, а в составе РМ ФОВ [Патент РФ № 2296164 (2007) Способ ферментативного гидролиза боевых отравляющих веществ].

В заявляемом способе His ₆-OPH может быть использован для разложения остаточных концентраций вещества типа Vx в растворимой форме (в виде клеточного гомогената) или в иммобилизованной форме, предназначенной для разложения фосфорорганических нейротоксинов в проточной системе [Патент РФ № 2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах]. Иммобилизацию His₆-ОРН проводят известным способом на пористом носителе, поверхность которого модифицирована металл-хелатирующими лигандами (остатками иминодиуксусной кислоты) и заряжена ионами двухвалентных металлов (Cu²⁺ или Со²⁺). В качестве пористого носителя используется криогель полиакриламида, полученный при полимеризации мономеров, представляющих собой различные производные акриламида (например, поли-N,N-диметилакриламид, полиоксиэтилметакрилат, поли-N,N-изопропилакриламид, поли-2-оксиэтилпропилакриламид), проводимой при низких температурах. Замораживание растворов мономеров с добавлением сшивающих агентов позволяет получить монолит с трехмерной структурой, для которой характерно наличие большого количества пор размером 10-100 мкм [Plieva, F.M., Savina, I.N., Deraz, S., Andersson, J., Galaev, I.Yu., Mattiasson, В., Characterization of supermacroporous monolithic polyacrylamide based matrices designed for chromatography of bioparticles. // J.Chromatog. 5, 2004, V.807(1), р.129-137]. При этом носитель представляет собой единый монолит, а не отдельные гранулы, что снижает диффузионные проблемы при его использовании в проточном реакторе.

Используемый способ иммобилизации фермента обеспечивает возможность его многократной регенерации и использования для гидролиза ФОВ в составе РМ, что существенно улучшает экономическую сторону данного процесса. Фермент His ₆-OPH в иммобилизованном виде характеризуется длительным периодом функционирования (до 170 сут) при обеспечении полного разложения остаточных концентраций ФОВ, исходно присутствующих в РМ (до 3×10^-3 М).

Согласно заявляемому способу для проведения ферментативного гидролиза остаточных концентраций ФОВ в составе реакционных масс вещества типа Vx их разбавляют в 10-100 раз, в зависимости от примененного способа химического уничтожения вещества типа Vx и соответствующего ему химического состава РМ (РМ-ГД или РМ-РД-4М), одной из перечисленных сред: водопроводной водой, 50 мМ карбонатным буфером (рН 10), 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5), 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5).

Собственно ферментативный гидролиз остаточных концентраций ФОВ проводят путем внесения растворимой формы His ₆-OPH в разбавленные РМ и экспонирования полученной смеси при комнатной температуре в течение времени, необходимого для разложения концентрации вещества типа Vx, присутствующего в РМ, или прокачиванием с помощью перистальтического насоса разбавленных РМ через колонный реактор, заполненный иммобилизованным ферментом His₆-OPH. Скорость протока и время удерживания раствора разбавленных РМ в реакторе с иммобилизованным ферментом зависят от концентрации ФОВ, присутствующей в составе РМ. Согласно применяемым способам химического уничтожения ФОВ остаточная концентрация вещества типа Vx в составе РМ может варьироваться от 3×10 ^-6 М (РД-4М) до 3×10^-3 М (РМ-ГД).

Для биоразложения фосфорорганических компонентов (эфиров МФК и самой МФК) в составе растворов РМ, получаемых после ферментативной обработки, в заявляемом способе применяют иммобилизованные в криогель поливинилового спирта (ПВС) клетки бактерий или мицелиальных грибов, способных разрушать С-Р связь и утилизировать фосфаты, являющиеся продуктами разложения МФК.

Для иммобилизации в заявляемом способе используются клетки индивидуальных культур, а не консорциум микроорганизмов, как в аналоге и прототипе, что должно обеспечить получение образца иммобилизованных клеток с хорошо воспроизводимыми свойствами и упростить контроль их состояния в процессе биоразложения фосфорорганических компонентов РМ, поскольку требуется мониторинг метаболической активности только одной культуры, а не нескольких культур одновременно.

Для иммобилизации заявляемый способ предлагает использование индивидуальных культур бактерий или мицелиальных грибов, способных разрушать С-Р связь в молекулах МФК и ее эфиров: Pseudomonas species 78Г [Патент РФ № 2154103 (2000) Штамм Pseudomonas species 78Г, предназначенный для деградации продуктов деструкции фосфорорганических отравляющих веществ]; Escherichia coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH [Патент РФ № 2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы], Escherichia coli DH5 /pTrcTE-OPH [Патент РФ № 2232807 (2004) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcTE-OPH и продуцент фермента органофосфатгидролазы], Chryseomonas luteola [Кравцов И.С., Янов С.Н., Дармов И.В., Ковтун А.Л. Выделение из окружающей среды микроорганизмов, способных разлагать фосфонаты. // Химическая и биологическая безопасность, 2006, № 6(30), с.3-9], Comamonas teastosteroni В-1241 (ВКМ), Sinorhizobium meliloti В-1010 (ВКМ), Pseudomonas stutzeri В-1199 (ВКМ), Aspergillus awamory F-9 (ВКПМ), Aspergillus terreus F-394 (ВКПМ), Mucor circinelloides F-1226 (BKM).

Применение этих клеток в иммобилизованном виде способствует повышению их устойчивости к воздействию токсичных компонентов РМ ФОВ и продуктов их деструкции, а также позволяет создавать высокие концентрации клеток в реакторе для эффективного биоразложения фосфорорганических соединений, присутствующих в растворах РМ, полученных после их обработки ферментом His ₆-OPH. Иммобилизация клеток также позволяет многократно использовать их в периодическом режиме культивирования для реализации процесса деструкции эфиров МФК и МФК. Иммобилизованные клетки характеризуются длительным периодом функционирования (до 60 сут) при обеспечении разложения фосфорорганических соединений на 99%.

При использовании иммобилизованных клеток индивидуальных культур из реакционной среды последовательно удаляются продукты биоразложения РМ (при разложении эфира МФК образуется МФК, которая разлагается до остатков фосфорной кислоты и усваивается клетками). При использовании консорциумов все эти последовательные превращения осуществляются разными клетками микроорганизмов, при этом продукты жизнедеятельности одних клеток являются субстратами для других. Диффузия метаболитов одних клеток к другим клеткам в качестве субстратов, биодоступность таких субстратов для пространственно разобщенных клеток существенно влияют на скорость процесса разложения фосфорорганических веществ в целом. В случае высокоактивных монокультур все эти процессы осуществляются одними и теми же клетками, что в целом позволяет избавиться от массообменных проблем, присутствующих в консорциумах, и существенно увеличить эффективность биоразложения фосфорорганических веществ.

Применение в качестве носителя клеток криогеля поливинилового спирта (ПВС), формируемого при замораживании-оттаивании раствора полимера, обусловлено высокой пористостью гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками криогеля на основе ПВС [Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, 2002, т.71(6), с.559-585]. Иммобилизация клеток микроорганизмов в заявляемом способе осуществляется методом их включения в макропористую матрицу, а не методом сорбции, как в аналоге и прототипе. Включение клеток в матрицу по сравнению с сорбционной иммобилизацией обеспечивает их более надежное удерживание в носителе при использовании в процессе биоразложения компонентов РМ, что позволяет вести процесс с интенсивным перемешиванием и подачей воздуха в реактор с иммобилизованными клетками для улучшения их метаболической активности и повышения эффективности биодеструкции.

Иммобилизация биомассы бактериальных клеток или спор осуществляется путем ее суспендирования в растворе ПВС с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и размораживанием), что приводит к формированию прочного полимерного криогеля, содержащего включенные в его матрицу клетки. Известный способ иммобилизации клеток микроорганизмов в криогель ПВС предусматривает формирование криогеля ПВС с одновременным включением клеток бактерий или спор мицелиальных грибов в матрицу носителя.

Иммобилизацию мицелиальных грибов проводят согласно известному способу [Патент РФ № 2253677 (2005) Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора], включая в матрицу носителя споры с последующим их культивированием в богатой питательной среде с целью их проращивания и получения в матрице носителя иммобилизованного развитого метаболически активного мицелия.

Для иммобилизации монокультуры бактерий клетки выращивают на богатых питательных средах, известных для данных культур, с целью накопления метаболически активной биомассы, которую концентрируют (сгущают) перед включением в матрицу полимерного носителя. Иммобилизацию бактериальных клеток проводят путем смешивания биомассы клеток с раствором ПВС до получения однородной массы, которую распределяют с помощью дозирующего устройства (шприц, дозатор, др.) в различные емкости, далее в них полученную смесь клеток с раствором полимера замораживают, выдерживают в замороженном состоянии и проводят размораживание.

Применяемые для реализации способа иммобилизованные клетки, в отличие от прототипа, не нуждаются в специальной адаптации перед их использованием для разложения МФК или ее эфиров, входящих в РМ разного химического состава.

Собственно биоразложение МФК и её эфиров с помощью иммобилизованных клеток, а также потребление образующихся фосфатов в качестве источника фосфора иммобилизованными клетками осуществляется в растворах РМ, полученных после обработки их ферментом His₆-OPH, и состоит в том, что полимерные гранулы с включенными в них клетками вносятся в реактор, где при рН среды 7,5-9,0 проводится аэробный процесс биоразложения фосфорорганических компонентов РМ и утилизации их в качестве источника фосфора в присутствии источника углерода, в качестве которого используют общеупотребимые в микробиологическом производстве глюкозу, глицерин и др.

Существенными отличиями заявляемого изобретения от прототипа, предназначенного для биоразложения фосфорорганических соединений в РМ вещества Vx, является новые, ранее не известные сочетания, последовательность и условия выполнения технических операций, направленных на биоразложение фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx с разным химическим составом, соответствующим примененному химическому способу уничтожения ФОВ, сочетающие в себе биохимический гидролиз остаточных концентраций неразложившегося ФОВ под действием растворимого или иммобилизованного фермента и биоразложение МФК и ее эфиров, содержащих С-Р связь, под действием клеток индивидуальных культур бактерий или мицелиальных грибов, иммобилизованных методом включения в макропористый криогель ПВС.

Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие заявляемое техническое решение.

Пример 1. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 100 раз растворов реакционных масс в присутствии иммобилизованного фермента His ₆-OPH и клеток Pseudomonas species 78Г, иммобилизованных в криогель ПВС.

Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 100 раз 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 3,75×10^-5 М вещества типа Vx и 9,9 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию фермента His₆-OPH проводят согласно известному методу [Патент РФ № 2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах], используя в качестве пористого носителя криогель поли-N,N-диметилакриламида, поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Cu²⁺ .

Иммобилизацию клеток бактерий Pseudomonas sp. 78Г проводят следующим образом: 8,4 г биомассы клеток, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 20 г/л глюкозы, 4,0 г/л дрожжевого экстракта, 3,0 г/л (NH₄)SO ₄, 5 мг/л ZnSO₄×4H₂O (рН 6,8-7,0), центрифугированием (20 мин, 8000 об/мин), смешивают с 167,6 г 8%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе физиологического раствора (0,9% NaCl), при комнатной температуре до получения однородной массы. Эту суспензию далее распределяют в лунки 96-луночных иммунологических планшетов по 0,1 мл, которые помещают в морозильную камеру при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 17 ч и проводят размораживание при +8°С. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул цилиндрической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx препаратом иммобилизованного фермента проводят, прокачивая с помощью перистальтического насоса через колонный реактор (30 мл), заполненный иммобилизованным ферментом, растворы РМ со скоростью 0,25 мл/ч при комнатной температуре. Обработка растворов РМ иммобилизованным ферментом в течение 120 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx. Иммобилизованный фермент способен функционировать в заданных условиях до 140 сут.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Pseudomonas sp. 78Г проводят в течение 120 ч в аэробном реакторе (1 л) в периодическом режиме культивирования при 28°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (180 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 20 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (15 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 99% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 60 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 2000 л с 1 кг РМ-ГД, а общая длительность процесса биоразложения - 10 суток.

Пример 2. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 10 раз растворов реакционных масс в присутствии иммобилизованного фермента His₆-OPH и клеток Е. coli DH5 /рТvсТЕ-ОРН, иммобилизованных в криогель ПВС.

Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 10 раз водопроводной водой. Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 3,75×10^-7 М вещества типа Vx и 32 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию фермента His₆-OPH проводят согласно известному методу [Патент РФ № 2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах], используя в качестве пористого носителя криогель полиоксиэтилметакрилата, поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Cu²⁺ .

Иммобилизацию клеток бактерий Е. coli DH5 /pTrcTE-OPH проводят следующим образом: 4,3 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl (рН 6,8), 47,7 мг/л изопропил- -D-тиогалактопиранозида, центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин), перемешивают с 171,7 г 10%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе 50 мМ Na-карбонатного буфера (рН 10), при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную смесь выливают ровным слоем на противень с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,5 см, замораживают при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч и проводят размораживание при +10°С. Размороженные гелевые блоки разрезают на кубические гранулы с линейным размером 4 мм. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул кубической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx препаратом иммобилизованного фермента проводят, прокачивая с помощью перистальтического насоса через колонный реактор (60 мл), заполненный иммобилизованным ферментом, растворы РМ со скоростью 0,50 мл/ч при комнатной температуре. Обработка растворов РМ иммобилизованным ферментом в течение 120 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx. Иммобилизованный фермент способен функционировать в заданных условиях до 120 сут.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Е. coli DH5 /pTrcTE-OPH проводят в течение 120 ч в аэробном реакторе (1 л) в периодическом режиме культивирования при 28°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (180 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 100 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (12 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 60 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 1000 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 10 суток.

Пример 3. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 100 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His ₆-OPH и клеток Е. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH, иммобилизованных в криогель ПВС.

Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 100 раз 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 3,75×10^-5 М вещества типа Vx и 9,9 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию клеток бактерий Е. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-ОРН проводят следующим образом: 11 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 12 г/л триптона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 4 г/л глицерина, 6,95 г/л KH₂PO₄, 12,54 г/л KH₂ PO₄×3H₂O, 2,37 мг/л CoCl₂ (рН 6,8-7,0), 23,8 мг/л изопропил- -D-тиогалактопиранозида, центрифугированием (15 мин, 8500 об/мин) смешивают с 869 г 13%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе стерильной водопроводной воды, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в лунки иммунологических 96-луночных планшетов со сферическим дном по 0,2 мл. Замораживание осуществляют при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии - 28 ч и проводят размораживание при +4°С. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул с полусферической формой, используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 30 мл в разбавленный раствор РМ (270 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 116 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Е. coli SG13009[pREP4]/pTES-His-OPH проводят в течение 100 ч в аэробном реакторе (10 л) в периодическом режиме культивирования при 28°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (180 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 20 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (15 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 50 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 2220 л с 1 кг РМ-ГД, а общая длительность процесса биоразложения - 9 суток.

Пример 4. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 20 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His₆-OPH и клеток Comamonas teastosteroni В-1241, иммобилизованных в криогель ЛВС.

Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 20 раз 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 1,9×10^-7М вещества типа Vx и 16 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию клеток бактерий С. teastosteroni В-1241 проводят следующим образом: 7,5 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 10 г/л триптона, 20 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л хлорида натрия, центрифугированием (15 мин, 7000 об/мин) смешивают с 74,2 г 10%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе физиологического раствора, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в лунки иммунологических 96-луночных планшетов с плоским дном по 0,3 мл. Замораживание осуществляют при -10°С, выдерживают в замороженном состоянии 20 ч и проводят размораживание при +8°С. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде цилиндрических гранул используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 50 мл в разбавленный раствор РМ (950 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 12 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток С.teastosteroni В-1241 проводят в течение 96 ч в аэробном реакторе (100 л) в периодическом режиме культивирования при 25°С, рН 7,5 и непрерывным перемешиванием среды (200 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 40 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенный в качестве источника углерода глицерин (20 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 50 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 800 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 4,5 суток.

Пример 5. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОБ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 80 раз растворов реакционных масс в присутствии иммобилизованного фермента His₆-OPH и клеток Pseudomonas stutzeri В-1199, иммобилизованных в криогель ПВС.

Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 80 раз 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 4,68×10^-5 М вещества типа Vx и 12,4 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию фермента His₆ -OPH проводят согласно известному методу [Патент РФ № 2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах], используя в качестве пористого носителя криогель поли-N,N-диметилакриламида, поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Cu²⁺ .

Иммобилизацию клеток бактерий Р. stutzeri В-1199 проводят следующим образом: 23,2 г биомассы клеток, полученной после отделения от среды роста, исходно содержащей 100 мл/л мясопептонного бульона, 2,0 г/л дрожжевого экстракта, 3,0 г/л NH₄ Cl, (pH 6,5-7,0), центрифугированием (10 мин, 8000 об/мин), смешивают с 456,8 г 9%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе 50 мМ Na-фосфатно-карбонатного буфера (pH 8,0), при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в прямоугольную металлическую форму с бортами высотой 1 см для получения гелевых блоков высотой 0,3 см. Замораживание осуществляют при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч и проводят размораживание при +5°С. Размороженный биокатализатор, имеющий форму гелевого пласта, разрезают и получают кубические гранулы с размером 0,5×0,5×0,5 см. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул кубической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx препаратом иммобилизованного фермента проводят, прокачивая с помощью перистальтического насоса через колонный реактор (250 мл), заполненный иммобилизованным ферментом, растворы РМ со скоростью 1,25 мл/ч при комнатной температуре. Обработка растворов РМ иммобилизованным ферментом в течение 200 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx. Иммобилизованный фермент способен функционировать в заданных условиях до 170 сут.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Р. stutzeri В-1199 проводят в течение 130 ч в аэробном реакторе (20 л) в периодическом режиме культивирования при 26°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (160 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 30 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенный в качестве источника углерода глицерин (10 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 99% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 45 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 2400 л с 1 кг РМ-ГД, а общая длительность процесса биоразложения - 13,5 суток.

Пример 6. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 30 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His₆-OPH и клеток Sinorhizobium meliloti В-1010, иммобилизованных в криогель ЛВС.

Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 30 раз 100 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 1,25×10^-7 М вещества типа Vx и 10,7 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию клеток бактерий S. meliloti В-1010 проводят следующим образом: 6,4 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 15 г/л пептона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л MgSO₄×7H ₂O, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 2 г/л NaHCO ₃, центрифугированием (20 мин, 6000 об/мин) смешивают с 55,6 г 12%-ного раствора ПВС, приготовленного на минимальной питательной среде (1 г/л MgSO₄×7H₂ O, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 2 г/л NaHCO₃ ), при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в лунки иммунологических 96-луночных планшетов с плоским дном по 0,25 мл. Замораживание осуществляют при -18°С, выдерживают в замороженном состоянии в течение 30 ч и проводят размораживание при +6°С. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде цилиндрических гранул используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 100 мл в разбавленный раствор РМ (900 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 120 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток S. meliloti В-1010 проводят в течение 120 ч в аэробном реакторе (100 л) в периодическом режиме культивирования при 25°С, рН 7,5, в среде, представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 25 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода мелассу (15 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 40 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 833 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 10 суток.

Пример 7. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОБ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 50 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His ₆-OPH и клеток Chryseomonas luteola, иммобилизованных в криогель ПВС.

Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 50 раз 50 мМ карбонатным буфером (рН 10,0). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 7,5×10^-5 М вещества типа Vx и 19,8 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию клеток бактерий С.luteola проводят следующим образом: 78 г биомассы клеток бактерий, полученной после отделения от среды культивирования, исходно содержащей 10 г/л триптона, 20 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л хлорида натрия, центрифугированием (15 мин, 7000 об/мин) смешивают с 700 г 15%-ного раствора ПВС, приготовленного на водопроводной воде, при комнатной температуре до получения однородной массы. Полученную суспензию распределяют в Чашки Петри по 25 мл. Замораживание осуществляют при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии в течение 10 ч и проводят размораживание при +3°С. Полученный образец криогеля ПВС с иммобилизованными клетками разрезают на гранулы в виде параллелепипеда со сторонами 0,5×0,6×0,5 см и используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 100 мл в разбавленный раствор РМ (500 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 130 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток С.luteola проводят в течение 110 ч в аэробном реакторе (100 л) в периодическом режиме культивирования при 22°С, рН 8,0 и непрерывным перемешиванием среды (250 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 40 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (18 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 60 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 2400 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 10 суток.

Пример 8. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 80 раз растворов реакционных масс в присутствии иммобилизованного фермента His₆-OPH и клеток Mucor circinelloides F-1226, иммобилизованных в криогель ПВС.

Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 80 раз 50 мМ карбонатным буфером (рН 10,0). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 4,7×10^-8 М вещества типа Vx и 4 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию фермента His₆ -OPH проводят согласно известному методу [Патент РФ № 2315103 (2008) Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах], используя в качестве пористого носителя криогель поли-2-оксиэтилпропиламида, поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты и заряжена ионами Со²⁺ .

Иммобилизацию клеток мицелиального гриба М. circinelloides F-1226 проводят следующим образом: к 100 г 10%-ного водного раствора ПВС добавляют 1 мл суспензии спор мицелиального гриба М. circinelloides с концентрацией 1×10⁸ спор/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем выливают ровным слоем толщиной 0,3 см на противень, который помещают в морозильную камеру при -13°С, где выдерживают в замороженном состоянии 18 ч, а далее проводят размораживание при +4°С. Получают криогель ПВС в виде листового материала (100 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба, который с помощью шнекового экструдера и резака измельчают на гранулы произвольной формы с линейным размером не более 0,25 см. Полученные гранулы помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей солодовое сусло (100 г/л), (NH₄)₂SO₄ (3,0 г/л), MgSO₄×7H₂O (0,25 г/л), ZnSO ₄×7H₂O (0,1 г/л); NaCl (2,0 г/л), K ₂HPO₄ (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 52 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx препаратом иммобилизованного фермента проводят, прокачивая с помощью перистальтического насоса через колонный реактор (40 мл), заполненный иммобилизованным ферментом, растворы РМ со скоростью 0,85 мл/ч при комнатной температуре. Обработка растворов РМ иммобилизованным ферментом в течение 47 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx. Иммобилизованный фермент способен функционировать в заданных условиях до 150 сут.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток Mucor circinelloides F-1226 проводят в течение 169 ч в аэробном реакторе (2 л) в периодическом режиме культивирования при 24°С, рН 7,0 и непрерывным перемешиванием среды (200 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 10 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенное в качестве источника углерода солодовое сусло (10 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 99% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 30 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 800 л с 1 кг РМ-ГД, а общая длительность процесса биоразложения - 9 суток.

Пример 9. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-ГД, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 60 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His₆-OPH и клеток Aspergillus terreus F-394, иммобилизованных в криогель ПВС.

Для реализации способа используют РМ-ГД, содержащие вещество типа Vx (1 г/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 990 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 60 раз 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 6,25×10^-5 М вещества типа Vx и 16,5 г/л фосфорорганических соединений. Иммобилизацию клеток мицелиального гриба A. terreus F-394 проводят следующим образом: к 30 г 11%-ного водного раствора поливинилового спирта добавляют 3 мл суспензии спор мицелиального гриба A. terreus с концентрацией 5×10 ⁶ спор/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования сферических гранул диаметром 1,5±0,2 мм. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки [Патент РФ № 2036095 (1992) Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем] известным методом. Замораживание гранул осуществляют при -20°С, выдерживают их в замороженном состоянии 16 ч и проводят размораживание при +8°С. Полученные гранулы криогеля ПВС (33 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (120 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), (NH₄)₂SO₄ (3,0 г/л), MgSO₄×7H₂O (0,25 г/л), ZnSO₄ ×7H₂O (0,25 г/л); NaCl (5,0 г/л), K₂ HPO₄ (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 40 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул сферической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 100 мл в разбавленный раствор РМ (300 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 120 ч обеспечивает 98% разложение вещества типа Vx.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток A. terreus F-394 проводят в течение 144 ч в аэробном реакторе (50 л) в периодическом режиме культивирования при 26°С, рН 7,2 и непрерывным перемешиванием среды (210 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 35 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (20 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 50 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 2800 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 11 суток.

Пример 10. Способ биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, являющихся продуктами его деструкции в составе РМ-РД-4М, образующихся при химической детоксикации ФОВ, реализуемый посредством последовательного экспонирования разбавленных в 90 раз растворов реакционных масс в присутствии растворимой формы фермента His₆-OPH и клеток Aspergillus awamory F-9, иммобилизованных в криогель ПВС.

Для реализации способа используют РМ-РД-4М, содержащие вещество типа Vx (1 мг/л) и фосфорорганические соединения (ДЭМФК, МЭМФК и МФК) в суммарном количестве - 320 г/кг, которые разбавляют перед обработкой ферментом в 90 раз 200 мМ карбонатным буфером (рН 10,5). Таким образом, на последовательную обработку ферментом и иммобилизованными клетками поступают растворы РМ, содержащие 4,17×10^-8 М вещества типа Vx и 3,56 г/л фосфорорганических соединений.

Иммобилизацию клеток мицелиального гриба A. awamory F-9 проводят следующим образом: к 50 г 12%-ного водного раствора ПВС добавляют 5 мл суспензии спор мицелиального гриба A. awamory с концентрацией 1×10⁵ спор/мл и перемешивают до получения однородной массы, которую затем разливают в 96-луночные иммунологические плашки с плоским дном (по 0,25 мл в лунку) для формирования гранул криогеля ПВС. Замораживание гранул осуществляют при -15°С, выдерживают их в замороженном состоянии 20 ч и проводят размораживание гранул при 4°С. Полученные гранулы криогеля ПВС (55 г) с включенными в него спорами мицелиального гриба помещают в аэробный реактор с 1 л среды, содержащей глюкозу (100 г/л), дрожжевой экстракт (8 г/л), (NH₄)₂SO₄ (3,5 г/л), MgSO₄×7H₂O (0,2 г/л), ZnSO ₄×7H₂O (0,2 г/л); NaCl (3,0 г/л), K ₂HPO₄ (3,0 г/л), и проводят их культивирование при 30°С в течение 52 ч для прорастания спор и накопления мицелиальной биомассы в порах носителя. Полученный образец иммобилизованных клеток в виде гранул цилиндрической формы используют для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ, прошедших ферментативную обработку.

Ферментативный гидролиз остаточных концентраций вещества типа Vx растворимым препаратом фермента проводят путем внесения препарата в количестве 100 мл в разбавленный раствор РМ (900 мл). Обработка растворов РМ растворимой формой фермента в течение 48 ч обеспечивает 100% разложение вещества типа Vx.

Биоразложение фосфорорганических соединений в составе РМ под действием иммобилизованных клеток A. awamory F-9 проводят в течение 108 ч в аэробном реакторе (50 л) в периодическом режиме культивирования при 27°С, рН 6,8 и непрерывным перемешиванием среды (200 об/мин), представляющей собой ферментативно обработанные растворы РМ, разбавленные в 10 раз водопроводной водой после обработки ферментом и содержащие дополнительно внесенную в качестве источника углерода глюкозу (15 г/л). Иммобилизованные клетки обеспечивают 100% разложение фосфорорганических соединений и способны функционировать в заданных условиях до 50 сут.

По окончании процесса объемы стоков составляют 990 л с 1 кг РМ-РД-4М, а общая длительность процесса биоразложения - 6,5 суток.

Пример 11. Пример многократного использования иммобилизованного ферментного препарата His₆-OPH и образцов иммобилизованных клеток микроорганизмов для биоразложения фосфорорганических соединений в составе РМ.

На Фиг.1 представлена зависимость остаточной активности иммобилизованного ферментного препарата His₆-OPH, многократно используемого согласно тому, как описано в Примерах № 1 ( ), № 2 ( ), № 5 ( ) и № 8 (×), от времени его применения для обработки растворов РМ вещества типа Vx.

На Фиг.2 представлена динамика биоразложения фосфорорганических соединений в среде, содержащей ферментативные гидролизаты РМ, при многократном применении образца иммобилизованных клеток бактерий Pseudomonas sp. 78Г ( ), полученного и использованного, как описано в Примере 1, и образца иммобилизованных клеток мицелиального гриба Aspergillus awamory F-9, полученного и использованного, как описано в Примере 10 ( ).

Представленные данные подтверждают возможность длительного использования иммобилизованных препаратов фермента и клеток микроорганизмов для биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и фосфорорганических соединений, содержащихся в РМ, получаемых после химического уничтожения ФОВ.

Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является способ для биоразложения остаточных концентраций вещества типа Vx и других фосфорорганических компонентов РМ вещества типа Vx, позволяющий увеличить суммарные концентрации разлагаемых веществ при 99% степени их разложения в РМ с разным химическим составом, сократить время, необходимое для проведения биоразложения, как минимум, в 1,5 раза по сравнению с прототипом, уменьшить объемы образующихся стоков, как минимум, в 10 раз и увеличить экономическую привлекательность процесса при длительном сроке функционирования клеток микроорганизмов (до 60 сут) и фермента (до 170 сут) в иммобилизованной форме.