способ иммунизации птицы против инфекции, вызванной бактериями clostridium

Формула изобретения

1. Способ иммунизации птицы против инфекции, вызванной бактериями Clostridium, включающий введение in ovo во время последней четверти периода инкубации эффективной иммунизирующей дозы иммуногенной композиции, которая индуцирует иммунный ответ против бактерий вида Clostridium, где иммуногенная композиция включает альфа-токсин Clostridium perfringens, и указанная композиция вводится с помощью in ovo инъекции непосредственно в тело эмбриона.

2. Способ по п.1, где птица представляет собой цыпленка.

3. Способ по п.2, где иммуногенная композиция вводится на 15-20 день инкубации.

4. Способ по п.3, где иммуногенная композиция вводится на 18 или 19 день инкубации.

5. Способ по п.1, где птица представляет собой индейку.

6. Способ по п.1, где иммуногенная композиция включает эмульсию вода-масло-вода.

7. Способ по п.1, где иммуногенная композиция включает адъювант.

8. Способ по п.7, где адъювант включает производное алюминия, сапонин, масло или любую их комбинацию.

9. Способ по п.1, дополнительно включающий введение in ovo иммунного стимулятора в любой момент во время инкубации.

Описание изобретения к патенту

Установление приоритета

В настоящей заявке согласно § 119(e)35 U.S.C. заявлен приоритет предварительной заявки No. 60/787567 от 30.03.2006, содержание которой полностью введено сюда ссылкой.

Область техники

В настоящем изобретении предлагаются композиции и способы получения иммунного ответа у птиц с помощью доставки иммунизирующей композиции in ovo непосредственно эмбриону птицы. В настоящем изобретении дополнительно предлагаются композиции и способы получения иммунного ответа на бактерии вида Clostridium у птиц для защиты птиц от инфекции бактериями Clostridium , и для защиты птиц от родственных нарушений, таких как некротический энтерит.

Уровень техники

In ovo вакцинация предлагает некоторые преимущества для птицеводства, охватывающие текущие способы контроля и возможность вакцинации птиц в период после выведения птицы из яйца, включая возможность для универсальной автоматизированной доставки вакцины; совместное введение с другими вакцинами in ovo, посредством чего уменьшается период выхаживания птиц в период после выведения птицы из яйца; и уменьшается использование антибиотиков.

Открытие того, что определенные вакцины (например, инактивированные или нереплицирующиеся вакцины) могут быть введены в тело эмбриона с получением сильного иммунного ответа (подобного тому или лучшего, какой ожидается при вакцинации птиц в день выведения птицы из яйца), дает возможность разработки автоматизированного устройства, которое может во время применения таких вакцин in ovo целенаправленно вводить их в тело эмбриона (специфично избегая амниотической жидкости, окружающей тело эмбриона). Кроме того, данные о том, что инактивированные вакцины являются предпочтительными для введения в тело эмбриона, дают возможность специалисту разрабатывать композиции вакцин, которые более совместимы с инъекцией в тело эмбриона. Перед этим открытием не было известно и не ожидалось, что введение инактивированной вакцины в тело эмбриона будет необходимым предпочтительным условием для получения сильного иммунного ответа.

Таким образом, настоящее изобретение представляет собой улучшение, охватывающее уровень техники по части предложения более эффективного пути введения инактивированных (убитых) вакцин in ovo. Перед этим изобретением не было указаний на то, что введение инактивированной вакцины в эмбриональную жидкость, окружающую тело эмбриона (амниотическая жидкость), имеет какое-то отличие от введения инактивированной вакцины в тело эмбриона. В настоящем изобретении продемонстрировано, что более правильной является необходимость введения инактивированных вакцин in ovo в тело эмбриона, а не в воды, окружающие тело эмбриона. Данные о том, что тело эмбриона является подходящей мишенью для оптимальной эффективности, дают возможность для разработки инактивированных вакцин и способов доставки путем in ovo. В изобретении охватывается введение иммуногенных композиций домашней птице и другим птицам.

Соответственно, настоящее изобретение охватывает технологическую необходимость улучшения иммуногенных композиций для введения in ovo эмбриону и способы индуцирования иммунного ответа у птиц для защиты птиц от инфекции и/или заражения птичьими и другими патогенами, и для защиты птиц от родственных нарушений.

Инфекция бактериями Clostridium perfringens ассоциирована с несколькими заболеваниями домашней птицы, наиболее заметным из них является некротический энтерит (C. perfringens тип A и тип C), но также включает холангиогепатит, целлюлит, эрозии второго желудка и пупочные инфекции. Поскольку эти бактерии представляют компонент нормальной кишечной флоры, разнообразные факторы могут предрасполагать птиц к развитию заболевания. Такие факторы включают питание, имеющее высокий уровень рыбной муки, пшеницы, ячменя или ржи; очень влажную подстилку; или воздействие Coccidia. Клинические признаки заболевания, как правило, включают диарею, снижение аппетита, кишечные нарушения, депрессию и смертность. Традиционно, эти заболевания контролируются с помощью добавления антибиотиков в корм; однако чрезмерное употребление антибиотиков ведет к развитию штаммов бактерий, устойчивых к антибиотикам, которые представляют существенный риск для здоровья людей и животных. Кроме того, при некоторых обстоятельствах, применение антибиотиков является очень нежелательным или даже запрещенным.

Другие способы контроля бактерий Clostridium включают питание, которое избегает ингредиентов, которые раздражают кишечную слизистую оболочку, например соево-зерновой рацион; использование подстилки с низкой влажностью, имеющей абсорбирующий материал, такой как древесная стружка или рисовая шелуха; использование продукта конкурентного исключения для поддержания здорового баланса кишечной микрофлоры, например, Прималак (Primalac) (Star-Labs/Forage Research, Inc., Clarksdale, MO)1 AVIGUARD(TM) (Bayer Corporation, Kansas City, MO), и BIO-MOS(R) (Alltech, Inc., Nicholasville, KY); и интенсивное превентивное окисление или дезинфекция воды для минимизации потерь во время периода заболевания. Вакцинацию использовали для контроля заболеваний, вызванных бактериями Clostridium у других видов, включающих крупный рогатый скот, овец, коз и свиней. Два главных типа вакцин против C. perfringens были разработаны для видов, отличных от видов домашней птицы: анатоксины (инактивированные токсины) и бактерин-анатоксины (инактивированные ["убитые"] бактериальные культуры и инактивированные токсины). Антитоксины (антитела, специфичные к токсину(ам)) также использовались для предотвращения и лечения заболеваний, вызванных бактериями Clostridium у видов, отличных от видов домашней птицы.

Поскольку заявители настоящего изобретения осознают, что ранее не было публикаций, описывающих in ovo введение (например, в яйцо, содержащее развивающийся птичий эмбрион) вакцины против C. Perfringens, применение существующих анатоксиновых или анатоксин-бактериновых вакцин in ovo является сомнительным, поскольку такие вакцины, как правило, требуют применения адъювантов, которые могут быть вредными для эмбриона, могут инактивировать живые вакцины против других организмов, которые обычно вводятся во время периода in ovo (например, при вакцинации против болезни Марека), и/или могут быть не совместимы с существующим оборудованием для инъекции in ovo. In ovo вакцинация предлагает некоторые преимущества для птицеводства, охватывающие текущие способы контроля и возможность вакцинации птиц в период после выведения птицы из яйца, включая возможность для универсальной автоматизированной доставки вакцины; совместное введение с другими вакцинами in ovo, посредством чего уменьшается период выхаживания птиц в период после выведения птицы из яйца; и уменьшается использование антибиотиков.

Соответственно, существует технологическая необходимость улучшения иммуногенных композиций и способов для индуцирования иммунного ответа против бактерий Clostridium у птиц для защиты птиц от инфекции Clostridium и для защиты птиц от родственных нарушений, таких как некротический энтерит.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В некоторых воплощениях в настоящем изобретении предлагается способ иммунизации птицы против патогена (например, птичьего патогена или не птичьего патогена, которого переносит птица), причем способ включает введение in ovo во время последней четверти периода инкубации эффективной иммунизирующей дозы композиции, которая индуцирует иммунный ответ против патогена, где иммуногенная композиция вводится с помощью in ovo инъекции в тело эмбриона.

В дополнительных воплощениях изобретения композиция индуцирует иммунный ответ для лечения и/или предотвращения инфекции и/или заражения птицы, полученного в результате воздействия или контакта с патогенами, которые вызывают следующие неограничивающие примеры заболеваний, инфекций и/или нарушений: кокцидиоза, болезни Марека, инфекционного бурсита, болезни Ньюкастла, инфекции птичьей оспы, инфекции бактериями вида Clostridium, птичьего гриппа, инфекционного бронхита, инфекции вируса куриной анемии, птичьего ларинготрахеита, инфекции птичьего метапневмовируса, инфекции птичьего реовируса, инфекции птичьего аденовируса, ротавирусной инфекции, астровирусной инфекции, инфекционной гепатомиелопоэтической болезни, синдрома снижения несучести, инфекции Escherichia coli, инфекции бактериями вида Mycoplasma, инфекции бактериями вида Salmonella , инфекции бактериями вида Campylobacter, инфекции бактериями вида Haemophilus, инфекции бактериями вида Listeria , инфекции бактериями вида Pasteurella и их комбинации.

В других дополнительных воплощениях изобретения композиция может включать, состоять по существу из и/или состоять из не репликативного агента, который индуцирует иммунный ответ против птичьего патогена и/или патогена, который вызывает пищевые расстройства, такие как инфекция бактериями видами Salmonella, инфекция бактериями видами Campylobacter, инфекция бактериями видами Listeria, инфекция Escherichia coli и т.д., которые известны из уровня техники.

Настоящее изобретение дополнительно включает способы, где эмбриону вводится in ovo эффективная иммунизирующая доза двух или более композиций, которые индуцируют иммунный ответ против птичьего патогена, где две или более композиций вводятся одновременно или последовательно в любом порядке.

Дополнительно здесь предлагаются способы, где эффективная иммунизирующая доза двух или более композиций, которые индуцируют иммунный ответ против птичьего патогена, вводится in ovo, и, по меньшей мере, одна композиция вводится эмбриону, где две или более композиций вводятся одновременно или последовательно в любом порядке.

В настоящем изобретении предлагаются способы индукции иммунного ответа против бактерий вида Clostridium (например, Clostridium perfringens) у птиц для защиты птиц от инфекции бактериями Clostridium и/или для защиты птиц от родственных нарушений, таких как некротический энтерит. Способы могут применяться in ovo и/или в период после выведения птицы из яйца. В настоящем изобретении дополнительно предлагаются иммуногенные композиции для индукции иммунного ответа против бактерий вида Clostridium у птиц, для защиты птиц от инфекции Clostridium и/или для защиты птиц от родственных нарушений, таких как некротический энтерит.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ иммунизации птицы (например, цыпленка) против некротического энтерита, включающий введение in ovo (например, во время последней четверти периода инкубации) эффективной иммунизирующей дозы иммуногенной композиции, которая индуцирует иммунный ответ против бактерий Clostridium perfringens, где иммуногенная композиция вводится путем in ovo инъекции. В определенных воплощениях иммуногенная композиция вводится амниону или эмбриону. Способ необязательно может применяться в комбинации с другими режимами иммунизации (например, с вакцинацией против заболевания инфекционного бурсита, болезни Марека, болезни Ньюкастла и/или кокцидиоза) и/или с введением питания in ovo в виде композиции питательных веществ и/или кишечного модулятора.

В другом аспекте в изобретении предлагается иммуногенная композиция, включающая эффективную иммунизирующую дозу ослабленных бактерий вида Clostridium в фармацевтически приемлемом носителе. В определенных воплощениях иммуногенная композиция дополнительно включает адъювант, который может представлять собой, например, депо-адъювант. Характерные адъюванты по этому изобретению включают, но не ограничены ими, соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия (квасцы), фосфат алюминия или алганнмулин и/или также может представлять собой соль или минеральные гели кальция, магния, железа и/или цинка, и/или может представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионных или анионных производных полисахаридов, или полифосфазены, и/или сапонины, такие как Quil-A, и/или эмульсии, такие как вода-масло и вода-масло-вода и/или неполный адъювант Фрейнда или адъювант может представлять собой любую их комбинацию. В характерных воплощениях иммуногенная композиция включает эмульсию вода-масло-вода. Необязательно иммуногенная композиция может дополнительно включать один или более дополнительных агентов, которые индуцируют иммунный ответ против других птичьих патогенов (например, агент, который индуцирует иммунный ответ против Eimeria, против вируса инфекционного бурсита, вируса болезни Марека и/или вируса болезни Ньюкастла), и/или композицию питательных веществ и/или кишечный модулятор. Один или более дополнительных агентов могут представлять собой иммунизирующие агенты, которые производят защитный иммунный ответ против Eimeria, вируса инфекционного бурсита, вируса болезни Марека и/или вируса болезни Ньюкастла.

В следующем аспекте в изобретении предлагается иммуногенная композиция, включающая в фармацевтически приемлемом носителе:

(a) эффективную иммунизирующую дозу анатоксина Clostridium, бактерина Clostridium, токсина Clostridium или любую их комбинацию; и

(b) эффективную иммунизирующую дозу вакцины против кокцидиоза, вакцины против болезни Марека, вакцины против инфекционного бурсита, вакцины против болезни Ньюкастла, вакцины против птичьей оспы или любую их комбинацию.

В изобретении также предлагается иммуногенная композиция, включающая в фармацевтически приемлемом носителе:

(a) эффективную иммунизирующую дозу анатоксина Clostridium, бактерина Clostridium, токсина Clostridium или любую их комбинацию; и

(b) масляную эмульсию.

Еще в одном аспекте в изобретении предлагается иммуногенная композиция, включающая в фармацевтически приемлемом носителе:

(a) эффективную иммунизирующую дозу анатоксина Clostridium, бактерина Clostridium , токсина Clostridium или любую их комбинацию; и

(b) адъювант, включающий производное алюминия, сапонин, масло или любую их комбинацию.

В следующих воплощениях в настоящем изобретении предлагается способ иммунизации птицы против инфекции видом Clostridium, включающий введение птице эффективной иммунизирующей дозы композиции бактерина-анатоксина Clostridium путем in ovo инъекции во время последней четверти периода инкубации. В некоторых воплощениях бактерии вида Clostridium могут представлять собой бактерии Clostridium perfringens .

В настоящем изобретении также предлагается способ иммунизации птицы против инфекции бактериями вида Clostridium , включающий введение птице эффективной иммунизирующей дозы рекомбинантного токсина или его иммуногенного фрагмента из бактерий вида Clostridium путем in ovo инъекции во время последней четверти периода инкубации. В некоторых воплощениях токсин или его иммуногенный фрагмент представляют собой токсин Clostridium perfringens или его иммуногенный фрагмент.

Эти и другие аспекты изобретения представлены более подробно в описании изобретения, приведенном ниже.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определенные аспекты настоящего изобретения основаны на неожиданном открытии того, что определенные антигенные или иммуногенные композиции дают возможность более эффективного иммунного ответа у птиц при введении композиции in ovo непосредственно в тело эмбриона.

Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ иммунизации птицы против патогена, который может представлять собой птичий патоген и/или не птичий патоген, переносимый птицей (например, человеческий патоген, передающийся через пищеварительный тракт), причем способ включает введение in ovo во время последней четверти периода инкубации эффективной иммунизирующей дозы композиции, которая индуцирует иммунный ответ против птичьего патогена, где иммуногенная композиция вводится путем in ovo инъекции непосредственно в тело эмбриона. В способах этого изобретения композиция может вводиться непосредственно в ткань скелетной мышцы эмбриона, и ткань скелетной мышцы может представлять собой, но не ограничена ими, ткань мышцы груди и ткани мышцы отростка. В следующих воплощениях композиция может вводиться непосредственно в голову, шею, плечо, крыло, спину, грудь, лапу или в любую их комбинацию.

Кроме того, в способах по этому изобретению композиция может вводиться подкожно в тело эмбриона. В следующих воплощениях композиция может вводиться подкожно в голову, шею, плечо, крыло, спину, грудь, лапу или в любую их комбинацию.

Любой подходящий путь введения композиции эмбриону является подходящим для применения в способах по изобретению. Например, композиция может вводиться эмбриону подкожно, интрадермально, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно или путем любой их комбинации.

Птица по этому изобретению может представлять собой любую птицу, и в определенных воплощениях субъект может представлять собой цыпленка, индейку, утку, гуся, фазана, перепела, куропатку, цесарку, страуса, эму или павлина, а также любую другую коммерчески используемую птицу и/или птицу, яйца которой являются доступными для применения в способах по этому изобретению.

В воплощениях, где субъектом является цыпленок, желательно вводить композицию по этому изобретению in ovo во время периода, соответствующего 15-20 дню инкубации, и в конкретных воплощениях композиция может вводиться на 18 или 19 день инкубации. Когда субъектом является индейка, композиция по этому изобретению может вводиться во время периода времени с 21 по 28 день инкубации, и в конкретных воплощениях композиция может вводиться на 24 или 25 день инкубации. В других воплощениях, где субъектом является гусь, композиция по этому изобретению может вводиться во время периода времени с 23 по 31 день инкубации, и в конкретных воплощениях композиция может вводиться на 28 или 29 день инкубации. В следующих воплощениях, где субъектом является утка, композиция по этому изобретению может вводиться во время периода времени с 21 по 28 день инкубации, и в конкретных воплощениях композиция может вводиться на 25 или 26 день инкубации.

Для других птиц последняя четверть периода инкубации и, таким образом, оптимальный предел по дням для in ovo введения композиции по этому изобретению может быть определен согласно способам, хорошо известным из уровня техники. Например, мускусная утка имеет период инкубации в пределе 33-35 дней, фазан имеет период инкубации 23-24 дня, Японский перепел имеет период инкубации 17-18 дней, виргинская куропатка имеет период инкубации 23 дня, азиатская каменная куропатка имеет период инкубации 22-23 дня, цесарка имеет период инкубации 26-28 дней и павлин имеет период инкубации 28 дней.

В конкретных воплощениях этого изобретения композиция может включать, по существу состоять и/или состоять из иммуногенной композиции и адъюванта. Неограничивающие примеры адъювантов по этому изобретению включают производное алюминия, сапонин, минеральные гели, полианионы, плюрониловые полиолы, производные сапонина, лизолецитин и другие подобные поверхностно-активные вещества, гликозиды, все типы масел и любую их комбинацию. В конкретных воплощениях этого изобретения композиция может включать эмульсию вода-масло-вода.

Как предполагается здесь, в некоторых воплощениях настоящего изобретения композиция по этому изобретению может включать адъювант, который в конкретных воплощениях может представлять собой такой адъювант, как производное алюминия (например, гидроксид алюминия), сапонин (например, Quil-A, включающий QuilA QS21), или масло (такое как полный или неполный адъювант Фрейнда), в любой комбинации.

Следующие неограничивающие примеры адъюванта по этому изобретению включают минеральные соли (например, гидроксид алюминия; фосфат алюминия; фосфат кальция), масляные эмульсии и композиции на основе поверхностно-активных веществ (например, эмульгированные масляные адъюванты Фрейнда); Arlacel A; минеральное масло; адъювант на основе эмульгированного арахисового масла (адъювант 65); MF59 (микрофлюидизированный детергент, стабилизированный эмульсией масло-вода); QS21 (очищенный сапонин); AS02 [SBAS2] (масло-вода + MPL + QS21); Montanide ISA-51; ISA-720 (стабилизированная эмульсия вода-масло), бактериальные продукты и производные [например, Bordatella pertussis; компонент P40, выделенный из Corynebacterium granulosum; липополисахарид (адъювант для обоих типов иммунитета - гуморального и клеточно-опосредованного); Микобактерии и их компоненты (MDP, не приемлемые адъюванты для людей); холерный токсин (мукозальный адъювант)], микробные производные (природные и синтетические) [например, монофосфорил липид A (MPL); Detox (MPL + каркас клеточной стенки M. phlei); AGP [RC-529] (синтетический ацилированный моносахарид); DC-Choi (липоидные иммуностимуляторы, способные к самоорганизации в липосомы); OM-174 (производное липида A); CpG-мотивы (синтетические олигонуклеотиды, содержащие иммуностимулирующие CpG-мотивы); модифицированные LT и CT (генетически модифицированные бактериальные токсины для обеспечения не токсических эффектов от адъювантов)], эндогенные куриные иммуномодуляторы [цитокины; антитела; hGM-CSF или hlL-12 (цитокины, которые могут вводиться в виде белка или кодирующей его плазмиды); иммудаптин (C3d тандемный биочип); сквален], адъюванты на основе частиц [вирусомы (однослойные липосомные носители с инкорпорированным антигеном); AS04 ([SBAS4] Al соль с MPL); ISCOM (структурированный комплекс сапонинов и липидов); полилактид ко-гликолид (PLG), и инертные носители (частицы золота; частицы серебра)].

Дополнительные адъюванты по этому изобретению могут включать минеральные гели, полианионы, плюрониловые полиолы, производные сапонина, лизолецитин и другие подобные поверхностно-активные вещества. Дополнительные адъюванты могут включать агонисты toll-подобного рецептора (TLR), включающие, например, агонисты TLR- 1 (например, три-ацил липопептиды); агонисты TLR-2 [например, пептидогликан грам-положительных бактерий, подобных стрептококкам и стафилококкам; липотейхоевую кислоту]; агонисты TLR-3 (например, двухцепочечная РНК и ее аналоги, такие как поли 1:C); агонисты TLR-4 [например, липополисахарид (эндоксин) грам-отрицательных бактерий, подобных Salmonella и E. coli; агонисты TLR-5 (например, флагеллин подвижных бактерий, подобных Listeria); агонисты TLR-6 [например, с TLR-2 пептидогликаном и определенные липиды (диациллипопептиды)]; агонисты TLR-7 [например, геномы одноцепочечной РНК (ssRNA) таких вирусов, как грипп, корь и свинка; и малые синтетические антивирусные молекулы на основе гуанозина, подобные локсорибину и ssRNA, и их аналоги]; агонисты TLR-8 (например связывают ssRNA); агонисты TLR-9 (например, неметилированные CpG из ДНК патогена и их аналоги; агонисты TLR-10 (функция не определена) и TLR-11-агонисты (например, связывают белки, экспрессирующиеся в некоторых инфекционных простейших (Apicomplexa)). Цыплята имеют хорошо развитую систему TLR, содержащую приблизительно 10 TLR, которые в общих чертах подобны тем TLR, что детектировали у млекопитающих.

Большинство примеров адъювантов по этому изобретению включают рецепторы комплимента (секретированные PRR), где компонент комплимента C3d активируется микробным CHO. Путь комплимента ведет к опсонизации патогена и быстрому фагоцитозу.

В следующих воплощениях адъювант по этому изобретению может представлять собой аминокислотную последовательность, которая является пептидом, белковым фрагментом или цельным белком, который функционирует в качестве адъюванта, или адъювант может представлять собой нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, белковый фрагмент или цельный белок, который функционирует в качестве адъюванта. При использовании здесь термин "адъювант" описывает вещество, которое может представлять собой любое иммуномодулирующее вещество, способное соединяться с полипептидной вакциной или с вакциной на основе нуклеиновой кислоты для усиления, улучшения или модулирования иным образом иммунного ответа у субъекта без оказания вредного влияния на субъект.

Адъювант по этому изобретению может представлять собой, но не ограничен ими, например, иммуностимулирующий цитокин (включая, но не ограничиваясь ими, GM/CSF, интерлейкин-2, интерлейкин-12, интерферон-гамма, интерлейкин-4, фактор некроза опухоли-альфа, интерлейкин-1, гемопоэтический фактор flt3L, CD40L, ко-стимулирующие молекулы B7.1 и ко-стимулирующие молекулы B7.2), адъювантный состав 1 SYNTEX (SAF-1), состоящий из 5 процентов (вес/об.) сквалена (DASF, Parsippany, N. J.), 2,5 процента плюронилового геля, L121 полимер (Aldrich Chemical, Milwaukee), и 0,2 процента полисорбата (Tween 80, Sigma) в солевом растворе с фосфатным буфером. Подходящие адъюванты также включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия (квасцы), фосфат алюминия или алганнмулин, но также адъювант может представлять собой соль кальция, железа или цинка, или может представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионных или анионных производных полисахаридов, или полифосфазены.

Другие адъюванты хорошо известны из уровня техники и включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, обозначенный как нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (CGP 19835A, обозначенный как MTP-PE) и RIBI, который содержит три компонента, выделенные из бактерий, монофосфорил липид A, трегалозы димиколат и каркас клеточной стенки (MPL+TDM+CWS) в 2% растворе эмульсии сквален/Tween 80.

Дополнительные адъюванты могут включать, например, комбинацию монофосфорил липида A, предпочтительно, 3-de-O-ацилированного монофосфорил липида A (3D-MPL) вместе с солью алюминия. Усиленная система адъюванта включает комбинацию монофосфорил липида A и производного сапонина, конкретно комбинацию QS21 и 3D-MPL, как описано в публикации PCT WO 94/00153 (полное содержание которой введено сюда ссылкой), или менее реактогенная композиция, где QS21 блокируется холестерином, как описано в публикации PCT WO 96/33739 (полное содержание которой введено сюда ссылкой). Конкретно, возможный состав адъюванта, включающего QS21 3D-MPL & токоферол в эмульсии масло-вода, описан в публикации PCT WO 95/17210 (полное содержание которой введено сюда ссылкой).

Композиции и способы по настоящему изобретению могут применяться для индукции иммунного ответа для лечения и/или предотвращения таких заболеваний и нарушений, как кокцидиоз, болезнь Марека, инфекционный бурсит, болезнь Ньюкастла, птичья оспа, инфекция видами Clostridium (например, некротический энтерит, гангренозный дерматит, холангиогепатит, целлюлит, язвенный энтерит, ботулизм, болезнь Тилера), птичий грипп, инфекционный бронхит, вирусная инфекция куриной анемии, птичий ларинготрахеит, птичий метапневмовирус, птичья реовирусная инфекция, птичья аденовирусная инфекция, ротавирусная инфекция, астровирусная инфекция, инфекционная гепатомиелопоэтическая болезнь, синдром снижения несучести, инфекция Escherichia coli, инфекция бактериями вида Mycoplasma, инфекции бактериями вида Salmonella, инфекции бактериями вида Campylobacter, инфекции бактериями вида Haemophilus , инфекции бактериями вида Listeria, инфекции бактериями вида Pasteurella, Bordetella, Staphylococcus, Streptococcus, Mycobacterium, Erysipelothrix и любой их комбинация.

Таким образом, в определенных воплощениях композиция по изобретению может включать, по существу состоять из и/или состоять из антигена или иммуногена из вируса болезни Марека, инфекционного вируса бронхита, из бактерий вида Mycoplasma, из птичьего вируса лейкоза, реовируса, из бактерий вида Pasteurella, из птичьего вируса гриппа, вируса болезни Ньюкастла (NDV), вируса инфекционного бурсита (IBDV), вируса саркомы Рауса, Escherichia coli , видов Eimeria, таких как Eimeriatenella (вызывающего кокцидиоз), бактерий вида Haemophilus, Mycoplasma, Listeria, Salmonella, Campylobacter, Clostridium (например, C. perfringens, C. septicum, C. sordellii, C. difficile, C. novyi, C. botulinum, C. colinum, C. chauvoei, C. fallax, C. sporogenes , и C. piliforme) и из любой их комбинации.

Подразумевается, что настоящее изобретение охватывает способы и композиции для иммунизации птиц против патогенов, которые могут представлять собой патогены, которые вызывают заболевания у птиц, и/или могут представлять собой патогены, которые переносятся птицами (зараженные птицы) и переходят к людям и другим животным, кто прикасается или ест такую зараженную птицу. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются композиции, включающие, по существу состоящие из и/или состоящие из не репликативного агента, который индуцирует иммунный ответ против птичьего патогена или против патогена, который вызывает заболевание у других животных при контактировании с- или при поедании яиц или мяса, или других частей тела зараженной птицы. Такие патогены могут включать, но не ограничены ими, виды Salmonella, Campylobacter, Listeria, Escherichia coli, Erysipelothrix, Mycobacterium, Clostridium , и т.д.

В некоторых воплощениях способы по изобретению, описанные здесь, могут дополнительно включать стадию введения бустерной дозы композиции по этому изобретению птице в период после выведения из яйца.

В следующих воплощениях способов по изобретению эффективная иммунизирующая доза двух или более композиций, которые индуцируют иммунный ответ против птичьего патогена, вводится in ovo эмбриону, где две или более композиций вводятся одновременно или последовательно в любом порядке. Таким образом, композиции и способы по этому изобретению могут применяться с использованием оборудования и технологии, которые включают введение множественных композиций в одну область, множественных композиций во множественные области и/или одной композиции во множественные области. Такие способы могут применять одну область входа в яйцо или множество областей входа в яйцо. Неограничивающие примеры такого оборудования и технологии описаны в Патенте США No. 4903635, Патенте США No. 5136979, Патенте США No. RE 35973, Патенте США No. 5339766, Патенте США No. 6032612, Патенте США No. 6286455, Патенте США No. 5158038, Патенте США No. 6601534 и Патенте США No. 6981470, полное содержание каждого из которых введено сюда ссылкой.

Также сюда включены способы, где эффективная иммунизирующая доза двух или более композиций, которые индуцируют иммунный ответ против птичьего патогена, вводится in ovo и, по меньшей мере, одна композиция вводится эмбриону, где две или более композиций вводятся одновременно или последовательно в любом порядке. В некоторых воплощениях этих способов, по меньшей мере, одна композиция может вводиться амниону, который включает амниотическую жидкость, тело эмбриона и желточный мешок и/или, по меньшей мере, одна композиция может вводиться непосредственно в амниотическую жидкость, тело эмбриона и желточный мешок индивидуально или в любой комбинации.

В некоторых воплощениях этого изобретения способы могут дополнительно включать введение in ovo иммунного стимулятора в любой момент времени в период инкубации, где иммунный стимулятор и композиция вводятся одновременно или последовательно в любом порядке. Способы по этому изобретению также могут дополнительно включать введение in ovo композиции питательных веществ, кишечного модулятора или их комбинации в любой момент времени в период инкубации, где композиция питательных веществ, кишечный модулятор или их комбинация и композиция вводятся одновременно или последовательно в любом порядке.

Существуют некоторые аспекты развития эмбриона птицы, которые делают эмбрион привлекательной мишенью для иммунизации. Во-первых, поскольку наибольший период времени развития эмбриона происходит в яйце вне материнского репродуктивного тракта, то эмбрион может быть легко доступен для введения композиций, таких как иммуногенные композиции по этому изобретению.

Во-вторых, факт, что яйцо представляет собой единицу со множеством компартментов, может быть использован для доставки биологических материалов к определенным участком и областям эмбриона. Например, желточный мешок на ранней стадии развития эмбриона функционирует для производства крови. Непосредственно в период перед выведением птицы из яйца желточный мешок выполняет основную питательную функцию и частично вовлечен в кишечный тракт и, таким образом, переносится в цекальные сегменты после вылупливания. Таким образом, введение материалов в желточный мешок может приводить к осуществлению обоих систем доставки - цекальной или васкулярной. Кроме того, введение композиции по этому изобретению может эффективно проводиться путем инъекции в хорио-алантоисную мембрану или путем инъекции в мембрану воздушной камеры. Наконец, доступ к мышечному компартменту эмбриона может достигаться путем прямой эмбриональной инъекции, переносимой в последнюю четверть периода инкубации, и для цыплят инъекцию проводят, как правило, в период от 17 до 19 дня инкубации.

Иммуногенная композиция может вводиться в любую область яйца, включая воздушную камеру, белок, хорио-аллантоисную мембрану, желточный мешок, желток, аллантоис, амнион, или непосредственно в эмбрион птицы. В конкретном воплощении изобретения композиция вводится в мышечную ткань эмбриона птицы, и в других воплощениях композиция вводится в ткань скелетной мышцы. В определенных воплощениях может использоваться введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который остается в клетке мышечной ткани, для введения иммуногенного белка непосредственно и специфично в клетки мышечной ткани. Альтернативно, может вводиться молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, который будет секретироваться из клетки мышечной ткани, и этот способ может использоваться для доставки белка во все части тела эмбриона птицы посредством контакта мышечной ткани и плазмы. Типичные области введения для ткани скелетной мышцы представляют собой мышцу груди и мышечную ткань отростка, причем области локализованы рядом со скорлупой и, таким образом, относительно легко достигаются с помощью оборудования для инъекции без повреждения других эмбриональных структур.

Для введения in ovo композиции по изобретению могут использоваться любые подходящие способы, включающие in ovo инъекцию, впрыскивание под высоким давлением сквозь скорлупу яйца и баллистическую бомбардировку яйца микрочастицами, несущими композицию. В некоторых воплощениях композиция вводится путем введения водного фармацевтически приемлемого раствора в мышечную ткань, причем раствор содержит вводимую композицию.

В случае применения in ovo инъекции, механизм инъекции не является критическим моментом, но предпочтительно, чтобы способ чрезмерно не нарушал тканей и органов эмбриона или внешних эмбриональных мембран, которые окружают эмбрион, так чтобы обработка не уменьшила коэффициент выведения птиц из яйца. Предпочтительные области инъекции являются внутримышечными и подкожными. Предпочтительные области инъекции мышечной ткани представляют собой скелетную мышцу и, более конкретно, мышцу груди и мышечную ткань отростка мышц, причем области локализованы рядом со скорлупой и, таким образом, относительно легко достигаются с помощью оборудования для инъекции без повреждения других эмбриональных структур и без нарушения защиты, которую дает скорлупа. Шприц, снабженный иглой с калибром примерно 18-26, является подходящим для этой цели. В зависимости от точной стадии развития и положения эмбриона игла от 3/4 до 4 дюймов при введении может заканчиваться в жидкости выше цыпленка или в самом цыпленке. Направляющее отверстие может быть пробито или просверлено в скорлупе перед вставкой иглы для предотвращения нарушения или притупления иглы. Если желательно, яйцо может быть сделано герметичным с помощью герметичного, по существу, непроницаемого для бактерий материала, такого как воск или подобного, для предотвращения последующего попадания нежелательных бактерий.

В разнообразных воплощениях этого изобретения композиция вводится в тело эмбриона с помощью иглы, имеющей размер от примерно 3/4 дюйма до примерно 4 дюймов (например, 1 дюйм, 1,25 дюйма, 1,5 дюйма, 1,75 дюйма, 2,0 дюйма, 2,25 дюйма, 2,5 дюйма, 2,75 дюйма, 3,0 дюйма, 3,25 дюйма, 3,5 дюйма, 3,75 дюйма, или 4,0 дюйма). Кроме того, игла по этому изобретению может иметь калибр в пределе от 15g до 28g (например, 15g, 16g, 17g, 18g, 19g, 20g, 21g, 22g, 23g, 24g, 25g, 26g, 27g или 28g). В некоторых воплощениях игла может иметь тупой конец, и в некоторых воплощениях игла может иметь на конце фаску с углом от примерно 10°С до, примерно, 45°С (например, 11°С, 12°С, 13°С, 14°С, 15°С, 16°С, 17°С, 19°С, 20°С, 21°С, 22°С, 23°С, 24°С, 25°С, 26°С, 27°С, 28°С, 29°С, 30°С, 31°С, 32°С, 33°С, 34°С, 35°С, 36°С, 37°С, 38°С, 39°С, 40°С, 41°С, 42°С, 43°С, 44°С, или 45°С).

В конкретных воплощениях этого изобретения в способах введения композиции с помощью этой in ovo инъекции игла может проходить сквозь скорлупу большого конца яйца под углом наклона примерно 1°С-20°С (например, 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С, 8°С, 9°С, 10°С, 11°С, 12°С, 13°С, 14°С, 15°С, 16°С, 17°С, 18°С, 19°С, или 20°С) от длинной оси яйца.

В настоящем изобретении также предлагаются способы, где композиция по этому изобретению вводится in ovo с помощью оборудования для автоматизированной инъекции.

Очевидно, что высокоскоростная система автоматизированной инъекции будет практически подходящей для птичьих эмбрионов для применения на практике настоящего изобретения. Такое оборудование является доступным в большом количестве, типичным примером является система EMBREX INOVOJECT(TM) (описанная в Патенте США No. 4681063 от Hebrank), и в Патентах США No. 4040388, 4469047, и 4593646 от Miller. Описание этих ссылок и всех ссылок, цитированных здесь, введены ссылкой. Все такое оборудование, в адаптированном виде для практического применения в настоящем изобретении, включает инжектор, содержащий ДНК, как описано здесь, вместе с инжектором, помещенным для инъекции яйца, проводимой оборудованием с ДНК. Кроме того, может предлагаться герметизирующее оборудование, функционально связанное с оборудованием для инъекции, для герметизации отверстия в яйце после его инъекции.

В настоящий момент предпочтительное оборудование для практического применения настоящего изобретения описано в Патенте США No. 4681063 от Hebrank и в Патенте США No. 4903625 от Hebrank, описание которых введено сюда ссылкой. Это оборудование включает инжекторное оборудование для доставки жидких веществ в большое количество яиц и всасывающее оборудование, которое одновременно забирает и поднимает большое количество индивидуальных яиц от их расположенных сверху участков, и взаимодействует с инжектором для инъекции яиц, в то время как яйца забирает всасывающее оборудование. Свойства этого оборудования могут быть объединены со свойствами оборудования, описанного выше, для практического применения настоящего изобретения. Специалистам в данной области было бы удобно, если бы это оборудование могло быть адаптировано для инъекции в любую часть яйца путем регулировки глубины проникновения инжектора, как обсуждается со множеством подробностей ниже.

Воплощения способа инъекции и оборудования, которые могут применяться в настоящем изобретении, описаны в Патенте США No. 6032612 (оборудование для инъекции во множество областей), Патенте США No. 6244214 (оборудование для in ovo инъекции и детекции информации, рассматривающей внутреннюю часть яйца), Патентах США No 6176199, 6510811 и 6834615 (способы локализации аллантоисной жидкости в яйце), Патенте США No. 7089879 (способы для манипуляции с воздушными камерами внутри птичьих яиц) и в Патенте США No. 7165507 (способы и оборудование для точного помещения оборудования внутри субгерминальной полости в яйце), полное содержание каждого из патентов введено сюда ссылкой.

Таким образом, в некоторых воплощениях способ и оборудование являются существенными, как описано в одном или более патентов, приведенных выше, и включают помещение удлиненного инжектора или инжекторной иглы со стороны большого конца яйца под углом (A) наклона относительно длинной оси указанного яйца, причем угол выбирают так, чтобы игла направлялась прямо в плечо или грудь указанного эмбриона. Иглу затем вставляют через скорлупу яйца вдоль, по существу, линейной траектории на глубину, достаточную для прохождения в плечо или грудь эмбриона. Затем инъецируют через иглу вещество, которое должно быть помещено в яйцо, причем вещество может быть или жидким, или удобным для спринцевания (например, инъецируемым), твердым (но, как правило, представляющим собой водный раствор, содержащий композицию по этому изобретению, как описано здесь). В некоторых воплощениях иглу удаляют вдоль, по существу, линейной траектории и проводят стадию инъекции вещества одновременно со стадией удаления иглы, так чтобы вещество вводилось вдоль траектории внутрь яйца. Угол наклона (A) является достаточным для усиления возможности инъекции в мышцу плеча или груди. Обычно угол составляет 1-20 градусов и, предпочтительно, составляет от 2 до 3 градусов. В качестве примера, игла может быть вставлена на глубину, достаточную для доступа к нижней точки скорлупы яйца для прохождения внутрь или прохождения внутрь и сквозь плечо или грудь эмбриона. Оборудование может быть модифицировано для включения способов, функционально ассоциированных с оборудованием для помещения яйца под углом по отношению к игле, чтобы достичь указанного угла (A), таких способов, как подъем и помещение иглы под углом по отношению к всасывающему оборудованию.

В конкретном примере, способы по настоящему изобретению могут быть применены на практике с помощью оборудования, описанного в Патенте США No. 6244214 от Hebrank (полное содержание которого введено сюда ссылкой), где оборудование (например, "смарт-зонд") для идентификации специфичной структуры и или компартмента внутри яйца, который контактирует с иглой, которая проникает сквозь скорлупу яйца, и с помощью описанных способов применения оборудования для доставки композиций в специфичные структуры и/или компартменты внутри яйца.

Таким образом, в определенных воплощениях в настоящем изобретении предлагается способ введения вещества в мышцу цыпленка in ovo, включающий: a) получение куриного яйца, где указанное яйцо содержит куриный эмбрион в его последней четверти периода инкубации перед выведением птицы из яйца; b) помещение удлиненной иглы для инъекции со стороны большого конца яйца под углом наклона, составляющим примерно 1-5 градусов относительно длинной оси указанного яйца, причем угол выбирают так, чтобы игла направлялась прямо в плечо или грудь указанного эмбриона; c) вставка иглы через скорлупу яйца вдоль, по существу, линейной траектории на глубину, составляющую примерно 7/8 - 1,5 дюйма, в плечо или грудь указанного эмбриона; и d) инъекция указанного вещества в яйцо через указанную иглу.

Еще в других воплощениях здесь предлагается способ для введения вещества в мышцу цыпленка in ovo, включающий: a) получение куриного яйца, где указанное яйцо содержит куриный эмбрион с периодом инкубации 17-19 дней; b) помещение удлиненной иглы для инъекции со стороны большого конца яйца под углом наклона, составляющим примерно 1-5 градусов относительно длинной оси указанного яйца, причем угол выбирают так, чтобы игла направлялась прямо в плечо или грудь указанного эмбриона; c) вставка указанной иглы через скорлупу указанного яйца вдоль, по существу, линейной траектории на глубину, составляющую примерно 7/8 - 1,5 дюйма, в плечо или грудь указанного эмбриона; и d) инъекция указанного вещества в яйцо через указанную иглу.

В таких способах игла может быть вставлена на глубину, достаточную для прохождения внутрь и сквозь плечо или грудь указанного эмбриона.

Также здесь предлагается оборудование для одновременной инъекции в мышечную ткань куриных эмбрионов во множестве яиц с периодом инкубации, составляющим 17-19 дней, причем указанное оборудование включает: способы забора яиц для забора указанного множества яиц; способы инъекции, взаимодействующие с указанными способами забора яиц, для вставки удлиненной иглы сквозь скорлупу указанных яиц вдоль, по существу, линейной траектории на глубину, составляющую примерно 7/8 - 1,5 дюйма, в плечо или грудь указанного эмбриона; и способы помещения иглы для помещения указанной удлиненной иглы для инъекции со стороны большого конца указанного яйца под углом наклона, составляющим примерно 1-5 градусов, относительно длинной оси указанного яйца, так чтобы указанная игла направлялась прямо в плечо или грудь указанного эмбриона. В таком оборудовании способы забора яиц могут заменять способы всасывания для одновременного подъема множества индивидуальных яиц.

В следующих воплощениях этого изобретения предлагаются композиции и способы для индукции иммунного ответа на бактерии вида Clostridium у птицы. В качестве примера, острая энтеротоксемия, называемая некротическим энтеритом, вызывается бактериями Clostridium perfringens (типы A и C ассоциированы с птичьими заболеваниями). Некротический энтерит может встречаться, когда зараженная бактериями Clostridia пища или частицы подстилки проглатываются птицами, и микроорганизм растет в кишечнике и затем образует споры. Этот процесс споруляции вызывает высвобождение альфа и бета токсинов, ответственных за кишечный некроз (конкретно в тощей кишке и в подвздошной кишке). Клинические признаки включают депрессию, снижение аппетита и диарею. Может встречаться внезапная смертность. Факторы, предрасполагающие к инфекции бактериями C. perfringens и к некротическому энтериту, включают питание и нарушение слизистой кишечника. В контексте коммерческого использования домашней птицы большинство случаев некротического энтерита встречается у бройлерных цыплят в возрасте от двух до пяти недель. Таким образом, конкретные воплощения настоящего изобретения относятся к иммуногенным композициям и способам, которые защищают птиц против инфекции бактериями Clostridium perfringens, и против некротического энтерита, например, путем снижения уровня заболеваемости и/или путем снижения серьезности инфекции и/или заболевания.

Настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные воплощения изобретения. Это изобретение может, однако, быть воплощено в различных формах, и воплощения, представленные здесь, не следует понимать, как ограничения изобретения. Напротив, эти воплощения предлагаются для специалистов в данной области так, чтобы это описание было исчерпывающим и полным, и полностью соответствовало границам изобретения.

Если не определено иным образом, то все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, какое понимают специалисты в данной области, к которой принадлежит изобретение. Терминология используется здесь в описании только для целей описания конкретных воплощений и не рассматривается как ограничение изобретения.

Содержание всех публикаций, патентных заявок, патентов и других ссылок, указанных здесь, полностью введено ссылкой.

Терминология используется здесь в описании только для целей описания конкретных воплощений и не рассматривается как ограничение изобретения.

При использовании в описании изобретения и формулы изобретения подразумевается, что формы единственного числа также включают формы множественного числа, если в контексте ясно не указано иным образом.

При использовании здесь выражение "и/или" обозначает и охватывает любые и все возможные комбинации одного или более из ассоциированных перечисленных предметов, а также отсутствие комбинаций, когда описание интерпретируется альтернативно ("или").

Далее, термин "примерно", при использовании здесь, обозначает, что когда он имеет отношение к измеряемой величине, такой как количество соединения или агента по этому изобретению, дозы, времени, температуры и подобных, то охватываются вариации определенных количеств, включающие +-20%, +-10%, +-5%, +-1%, +-0,5%, или даже +-0,1%.

Подразумевается, что при использовании здесь термины "птичий" или "птица" включают самцов и самок любого вида птиц и, конкретно, охватывают домашнюю птицу, которая выращивается на коммерческой основе для яиц, мяса или в качестве домашних питомцев. Соответственно, термины "птичий" и или "птица" охватывают кур, индеек, уток, гусей, перепелов, фазанов, длиннохвостых попугаев, какаду, австралийских попугаев, страусов, эму и подобных. В конкретных воплощениях субъект представляет собой курицу или индейку. Коммерчески используемая домашняя птица включает бройлеров и несушек, которых выращивают для продукции мяса и яиц, соответственно.

В конкретных воплощениях субъектом является субъект, подверженный риску инфекции или предрасположенный к инфекции или заболеванию, вызванному бактериями вида Clostridium (например, некротический энтерит, вызванный инфекцией бактериями Clostridium perfringens ). Факторы риска для развития некротического энтерита известны из уровня техники и включают, но не ограничены ими, факторы питания (например, питания с высоким содержанием пшеницы, ячменя, ржи или рыбной муки), плохие условия подстилки и/или воздействие Eimeria (например, естественное воздействие живым вакцинам Eimeria). Таким образом, в конкретных воплощениях композиции и способы по изобретению могут преимущественно применяться для уменьшения серьезности и/или степени заболевания некротического энтерита среди птиц, которые были вакцинированы против кокцидиоза, или в стаях, перенесших вспышку кокцидиоза.

Другие заболевания и нарушения, вызванные инфекцией птиц бактериями вида Clostridium, включают, но не ограничены ими, некротический энтерит, гангренозный дерматит, холангиогепатит, целлюлит, язвенный энтерит, ботулизм и болезнь Тилера. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются композиции и способы их применения для защиты птиц против инфекции, вызванной, например, бактериями Clostridium perfringens, C. septicum, C. sordeilii, C. difficile, C. novyi, C. botulinum, C. colinum, C. chauvoei, C. fallax, C. sporogenes и/или C. piliforme.

Субъект "птица" по этому изобретению может представлять собой живого птичьего эмбриона in ovo или может представлять собой птенца, включая только что выведенного птенца (т.е., примерно через один, два или три дня после выведения из яйца), молодую птицу и взрослых птиц.

В конкретных воплощениях птица представляет собой птицу в возрасте примерно шести, пяти, четырех, трех, двух недель или одной недели, или менее. В других характерных воплощениях птица представляет собой наивный субъект, т.е. ранее не подвергавшийся воздействию антигена, против которого желательно наличие иммунитета.

При использовании здесь термин "введение in ovo" или "in ovo введение", если не указано по-другому, обозначает введение иммуногенной композиции (например, вакцины) в яйцо птицы, содержащее живой развивающийся эмбрион с помощью любых способов проникновения сквозь скорлупу яйца и введения иммуногенной композиции. Такие способы введения включают, но не ограничены ими, инъекцию in ovo иммуногенной композиции.

В настоящем изобретении предлагаются способы введения иммуногенной композиции субъекту для индукции иммунного ответа против бактерий вида Clostridium , необязательно защитного иммунного ответа у субъекта. Иммуногенная композиция может вводиться в любой подходящий компартмент яйца (например, аллантоис, желточный мешок, амнион, воздушную камеру и/или в сам птичий эмбрион), что будет очевидно для специалиста в данной области. Способы введения в эмбрион включают без ограничения парентеральное введение, такое как, например, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и/или внутрисуставное введение. В конкретных воплощениях иммуногенная композиция вводится в амнион (например, путем аксиальной инъекции сквозь большой конец яйца).

Иммуногенная композиция может вводиться в яйцо любым подходящим способом. В конкретных воплощениях иммуногенная композиция вводится посредством инъекции. Механизм инъекции в яйцо не является критической стадией, но, как правило, выбирается так, чтобы способ не нарушал ткани и органы эмбриона или внешних мембран эмбриона, окружающих его, до такой степени, чтобы обработка чрезмерно не снизила степени выведения птиц из яйца. Шприц, снабженный иглой с калибром примерно 18g-23g, является, как правило, подходящим для этой цели. Примеры игл, подходящих для этого изобретения, включают иглы, имеющие следующие калибры: 18, 19, 20, 21, 22, или 23 калибр. Игла по этому изобретению может иметь длину, составляющую, по меньшей мере, 1/2 дюйма, 5/6 дюйма, 3/4 дюйма, 7/8 дюйма, 1 дюйм, 1 и 1/4 дюйма, 1 и 3/8 дюйма, 1 и 1/2 дюйма, 1 и 5/8 дюйма, 1 и 3/4 дюйма, 1 и 7/8 дюйма или 2,0 дюйма. Примеры предела размеров фаски иглы по этому изобретению составляют от примерно 5 градусов до примерно 45 градусов (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 45, 56, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45 градусов). В определенных воплощениях этого изобретения предел размеров фаски иглы по этому изобретению составляет от примерно 12 градусов до 20 градусов. Направляющее отверстие может быть пробито или просверлено в скорлупе перед вставкой иглы для предотвращения нарушения или притупления иглы. Если желательно, яйцо может быть сделано герметичным с помощью герметичного, по существу, непроницаемого для бактерий вещества, такого как воск или подобного, для предотвращения последующего попадания нежелательных бактерий.

Высокоскоростная система автоматизированной инъекции будет практически подходящей для птичьих эмбрионов для применения на практике настоящего изобретения. Такое оборудование в большом количестве является доступным, типичным примером является оборудование, описанное в Патентах США No. 4681063 и 4903635 от Hebrank, и в Патентах США No. 4040388, 4469047, и 4593646 от Miller, полное содержание каждого из которых введено ссылкой. Такое оборудование, в адаптированном виде для практического применения в настоящем изобретении, включает, как правило, инжектор, содержащий иммуногенную композицию, вместе с инжектором, помещенным для инъекции яйца, проводимой оборудованием с иммуногенной композицией. Кроме того, если желательно, может предлагаться герметизирующее оборудование, функционально связанное с оборудованием для инъекции, для герметизации отверстия в яйце после его инъекции.

В одном воплощении оборудование для практического применения настоящего изобретения может быть описано в Патенте США No. 4681063 от Hebrank и в Патенте США No. 4903625 от Hebrank, описание каждого из которых введено сюда ссылкой. Это оборудование включает инжекторное оборудование для доставки жидких веществ в большое количество яиц и всасывающее оборудование, которое одновременно забирает и поднимает большое количество индивидуальных яиц от их расположенных сверху участков и взаимодействует с инжектором для инъекции яиц, в то время как яйца забирает всасывающее оборудование. Специалистам в данной области было бы удобно, если бы это оборудование могло быть адаптировано для инъекции в любую часть яйца путем регулировки глубины проникновения инжектора, как известно из уровня техники.

Настоящее изобретение может быть также применено на практике с помощью оборудования и способов, описанных в Патенте США No. 6244214 от Hebrank (полное содержание которого введено сюда ссылкой), где оборудование для идентификации специфичной структуры и или компартмента внутри яйца, который контактирует с иглой, которая проникает сквозь скорлупу яйца, и с помощью описанных способов применения оборудования для доставки композиций в специфичные структуры и/или компартменты внутри яйца.

Подходящий объем вводимой иммуногенной композиции будет зависеть от размера яйца, которое подвергается обработке, обычно страусиные яйца способны принимать больший объем, чем куриные яйца. В конкретных воплощениях иммуногенная композиция вводится в объеме от примерно 10 до примерно 500, 1000 или 2000 мкл или более, включая любое значение величины объема между 10 и 2000, даже если здесь отсутствует точная ссылка, с типичным объемом, включающим 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 626, 650, 675, 700, 725, 752, 775, 800, 850, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 мкл. Другие подходящие объемы для введения иммуногенной композиции могут быть легко определены специалистами в данной области.

Согласно конкретным воплощениям настоящего изобретения в яйца (т.е. эмбрионы птиц) вводится иммуногенная композиция в последнюю половину или последнюю четверть периода in ovo инкубации (т.е. эмбрионального развития). Например, для куриных яиц последняя половина периода инкубации приходится на период примерно от двенадцатого до двадцатого дня инкубации (например, E12, E13, E14, E15, E16, E17, E17,5, E18, E18,5, E19, E19,5 и/или E20), и последняя четверть периода in ovo инкубации приходится на период примерно от пятнадцатого до двадцатого дня инкубации (например, E15, E15,5, E16, E16,5, E17, E17,5, E18, E18,5, E19 E19,5 и/или E20). В конкретных воплощениях в яйца вводится иммуногенная композиция примерно на восемнадцатый (E18 или E18,5) или девятнадцатый (E19 или E19,5) день in ovo инкубации. В других воплощениях в яйца индейки иммуногенная композиция вводится примерно на четырнадцатый - двадцать седьмой день инкубации (E14, E15, E16, E17, E18, E19, E20, E21, E21,5, E22, E22,5, E23, E23,5, E24, E24,5, E25, E25,5, E26 и/или E27), примерно на двадцать первый - двадцать седьмой день инкубации (например, E21, E21,5, E22, E22,5, E23, E23,5, E24, E24,5, E25, E25,2, E26, E26,5 и/или E27), или примерно на двадцать пятый день инкубации (E25 или E25,5). Специалистам в данной области было бы удобно, если бы способы по настоящему изобретению можно было проводить в любое определенное время in ovo, до тех пор пока введение не приведет в результате к желаемому иммунному ответу на иммуногенную композицию без чрезмерного уровня заболеваемости и/или смертности среди подвергнутых лечению субъектов.

Альтернативно или дополнительно изобретение может быть применено на практике для введения иммуногенной композиции птенцу, включая только что выведенных птенцов (т.е., птенцов в возрасте примерно одного, двух и/или трех дней после выведения из яйца), молодых и/или взрослых птиц. В определенных воплощениях введение осуществляется в период, соответствующий примерно первым шести, пяти, четырем, трем и/или двум неделям после выведения птицы из яйца, и/или даже в период, соответствующий примерно первой неделе после выведения птицы из яйца. Согласно одному аспекту введение осуществляется в период, примерно соответствующий первым трем неделям после выведения птицы из яйца. В других воплощениях иммуногенная композиция вводится in ovo (например, в последнюю четверть периода периода in ovo инкубации), и бустерная доза вводится в период после выведения птицы из яйца (например, в период, соответствующий примерно первым дням - одному, двум или трем дням, или одной, двум или трем неделям после выведения птицы из яйца).

Способы по изобретению могут отличаться от способов материнской вакцинации, в которых более старшие самки птиц (например, курицы в возрасте, примерно 10-15 недель) вакцинируются с целью обеспечения пассивным иммунитетом их потомства. Такие птицы, вероятно, не являются интактными, т.е. они уже подвергались воздействию бактерий Clostridium (например, Clostridium perfringens), и не иммунизировались с целью защиты вакцинированной птицы, но вместо этого для защиты потомства с помощью пассивной передачи антител.

Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут вводиться птицам с помощью подходящих способов после выведения птиц из яйца. Типичные способы представляют собой пероральное введение (например, с пищей или питьевой водой), внутримышечную инъекцию, подкожную инъекцию, внутривенную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, введение с помощью глазных капель и/или с помощью назального спрея. Далее, птицам могут вводиться иммуногенные композиции в камере для распыления, т.е. в камере, в которую помещают птиц и подвергают воздействию аэрозоля, содержащего вакцину, или воздействию курса распыления.

Изобретение может быть применено на практике для защиты птицы от некротического энтерита. С помощью терминов "защищает", "защищающий" и "защита", и подобных, обозначают любой уровень защиты от некротического энтерита, который приносит какую-то пользу популяции субъектов, такую как уменьшение степени и/или серьезности заболевания среди птиц, подвергнутых лечению, что проявляется либо в форме уменьшения смертности, уменьшения повреждений, повышения веса тела, повышения степени обмена веществ, и/или в форме уменьшения любого другого вредного эффекта заболевания, не взирая на то, является ли защита частичной или полной. Специалистам в данной области будет понятно, что защиту можно оценить на основе сравнения множества подвергнутых лечению птиц с птицами, не подвергавшимися лечению, даже если в индивидуальных случаях подвергнутые лечению птицы не были защищены. В конкретных воплощениях в изобретении предлагается способ уменьшения степени заболевания некротического энтерита среди множества птиц, которым вводились иммуногенные композиции по изобретению. Также предлагается способ уменьшения заболеваемости и/или смертности среди множества птиц, подвергнутых лечению согласно настоящему изобретению.

При использовании здесь термины "инициировать", "инициированный" или "инициирование" (и их грамматические варианты) обозначают инициирование активного иммунного ответа, который слабее, чем защитный иммунный ответ до получения второй дозы (бустерной) в более поздний период времени после выведения птицы из яйца.

При использовании здесь термины "уменьшать", "уменьшенный", "уменьшающий" и "уменьшение" (и их грамматические варианты) обозначают уменьшение указанного параметра инфекции или заболевания (например, инфекции, заболеваемости, смертности, степени заболевания некротического энтерита, повреждений и подобных), которые имеют какое-то значение или приносят какую-то пользу для потребителя (например, коммерческое значение), например уменьшение указанного параметра инфекции или заболевания, по меньшей мере, примерно на 20%, 25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или более по сравнению с соответствующим параметром у птиц, не подвергавшихся лечению.

В изобретении также предлагаются способы защиты птиц от инфекции бактериями вида Clostridium , которые приводят в результате к любому уровню защиты, который приносит какую-то пользу популяции субъектов, такую как уменьшение степени и/или серьезности инфекции бактериями Clostridium среди птиц, подвергнутых лечению.

Изобретение также может применяться на практике для индукции иммунного ответа на инфекцию бактериями Clostridium. При использовании здесь подразумевается, что термин "индуцирует (или его грамматические варианты) иммунный ответ против инфекции бактерий Clostridium " охватывает агенты, которые индуцируют иммунный ответ против самого организма, и/или токсины, продуцируемые организмом, с помощью способов пассивного переноса или активного иммунного ответа. Необязательно, иммунный ответ, который индуцируется, является защитным иммунным ответом, например, при способах вакцинации. Защита не требуется, если существуют какие-то другие цели для индукции иммунного ответа, например, для исследовательских целей или для получения антитела для пассивных иммунизаций или для использования в качестве реагента (например, для детекции, выделения и/или идентификации бактерий вида Clostridium).

При использовании здесь, если не указано иным образом, подразумевается, что термин "C. perfringens" включает C. perfringens типа A и/или C. perfringens типа C и/или C. perfringens любого другого типа, который вовлечен в этиологию некротического энтерита у птиц. В конкретных воплощениях в изобретении предлагаются способы защиты птиц от инфекции бактериями вида C. perfringens типа A и/или C. perfringens типа C. В изобретении также предлагаются способы индукции иммунного ответа против бактерий вида C. perfringens типа A и/или C. perfringens типа C. Различные типы бактерий C. perfringens и их штаммы хорошо известны из уровня техники. Смотри, например, AMERICAN ASSOCIATION OF AVIAN PATHOLOGISTS, A LABORATORY MANUAL FOR THE ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PATHOGENS (3d. ed. 1989).

При использовании здесь, если не указано иным образом, термин "эффективная иммунизирующая доза" обозначает дозу иммуногенной композиции, достаточную для индукции защитного иммунного ответа у птиц, подвергнутых лечению, который гораздо выше, чем наследственный иммунитет не иммунизированных птиц. В случае птиц, подвергнутых лечению in ovo, "эффективная иммунизирующая доза" указывает на дозу, достаточную для индукции защитного иммунного ответа у птиц, выведенных из яйца, которые были подвергнуты лечению in ovo, причем иммунитет гораздо выше, чем наследственный иммунитет птиц, не иммунизированных in ovo. Эффективная иммунизирующая доза в любом конкретном контексте обычно может быть определена с использованием способов, известных из уровня техники.

"Эффективная иммунизирующая доза" может включать одну или более (например, две или три) дозы иммуногенной композиции, так чтобы достичь желаемого уровня защиты. Индивидуальные дозы могут вводиться in ovo и/или в период после выведения птицы из яйца.

Как обсуждалось выше, для специалистов в данной области будет очевидно, что когда подвергается лечению множество птиц (так, как при коммерческой продукции с использованием домашней птицы), эффективность дозы можно оценить путем определения эффектов вакцинации у стаи в целом. Другими словами, эффективная иммунизирующая доза или эффективная вакцина для стаи в целом могут все же не индуцировать иммунный ответ и/или не обеспечивать подходящую защиту против заболевания у индивидуальных птиц.

Термины "вакцинация" или "иммунизация" хорошо понятны из уровня техники и используются здесь взаимозаменяемо. Например, можно понимать, что под терминами вакцинация или иммунизация представляется процесс, который увеличивает иммунную реакцию субъекта на антиген (путем обеспечения активного иммунного ответа) и, таким образом, его способность сопротивляться, преодолевать и/или излечиваться от инфекции (т.е., путем обеспечения защитного иммунного ответа).

При использовании здесь подразумевается, что термины "защитный иммунитет" или "защитный иммунный ответ" обозначают, что у животного-хозяина увеличивается активный иммунитет на иммуногенную композицию, и/или что иммуногенная композиция обеспечивает пассивный иммунитет, так что при последующем воздействии или введении иммуногенной композиции животное было способно сопротивляться или преодолевать инфекцию и/или заболевание. Таким образом, защитный иммунный ответ будет уменьшать степень заболеваемости и/или смертности от последующего воздействия патогена среди птиц, подвергнутых лечению.

"Активный иммунный ответ" или "активный иммунитет" характеризуется "участием тканей и клеток организма-хозяина после столкновения с иммуногеном. Оно включает дифференцировку и пролиферацию иммунокомпетентных клеток в лимфоретикулярных тканях, что приводит в результате к синтезу антитела или развитию клеточно-опосредованной реактивности, или к обоим эффектам". Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Альтернативно установлено, что активный иммунный ответ увеличивается у хозяина после воздействия иммуногенов при инфекции или вакцинации. Активный иммунитет может контрастировать с пассивным иммунитетом, который приобретается через "перенос заранее образованных веществ (антитела, фактора переноса, тимусного трансплантата, интерлейкина-2) из активно иммунизированного хозяина к не иммунизированному хозяину". Id.

Модели некротического энтерита (NE) для оценки вакцин и стратегий вакцинации известны из уровня техники. Например, в публикации Hofacre et al. (2003, J. Appl. Poult. Res. 12:60-64) описана модель, в которой цыплят кормили соево-зерновым рационом с содержанием 26% рыбной муки, начиная с дня 0 до дня 14 в период после выведения птенцов. Рыбную муку удаляли из питания на 14 день. Птицам вводили coccidia путем перорального принудительного введения на 14 день, затем ежедневно, начиная с дней 17-19, вводили C. perfringens путем перорального принудительного введения. Степень обмена веществ, вес тела и подсчет повреждений кишечника использовали для оценки присутствия и серьезности некротического энтерита у сенсибилизированных птиц. NE повреждения оценивали на 22 день или на 28 день с использованием шкалы 0=нет, 1=легкие, 2=средние и 3=значительные/серьезные. Другие способы могут применяться для оценки эффективности вакцины и режимов вакцины, как известно из уровня техники. В определенных воплощениях настоящего изобретения введение композиции по этому изобретению (например, эффективного количества композиции по этому изобретению) может привести в результате к уменьшению повреждений кишечника и/или изменений веса тела животных по этой модели или по другой известной модели примерно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 80, 90, или 100% по сравнению с не иммунизированными или контрольными животными.

В дополнительных воплощениях этого изобретения композиции и способы по этому изобретению могут применяться для индукции ответа антител у птиц, который, по меньшей мере, выше или равен примерно 0,5 единиц антитоксина/мл (например, по меньшей мере, примерно 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 или 10 A.Е. антитела к токсину на 1 мл антисыворотки птицы).

В следующих воплощениях, где применяются композиции и способы по изобретению, где процент яиц в популяции яиц, в которых проводили доставку композиции по изобретению в тело эмбриона, может составлять от примерно 70% до примерно 100% (например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) от общего числа яиц в популяции яиц, в которые вводилась композиция.

Настоящее изобретение также охватывает иммуногенные композиции, которые индуцируют активный и/или пассивный иммунный ответ против бактерий C. perfringens (включая типы A и/или C), и которые необязательно могут использоваться для защиты птицы против инфекции бактериями C. perfringens и/или для защиты против некротического энтерита, как описано более подробно выше.

Иммуногенные композиции по изобретению включают, по существу состоят из и/или состоят из агента(ов), который индуцирует иммунный ответ против бактерий Clostridium. Иммунный агент из бактерий Clostridium может представлять собой репликативный антиген и/или нерепликативный антиген. Репликативный и нерепликативный антигены по этому изобретению могут быть введены in ovo в амнион, эмбрион и/или в оба - амнион и эмбрион.

Кроме того, иммуногенные композиции по изобретению включают, по существу состоят из и/или состоят из иммунизирующего агента из бактерий Clostridium в фармацевтически приемлемом носителе. В характерных воплощениях в состав иммуногенной композиции могут быть включены анатоксины и/или бактерины Clostridium. Согласно этому воплощению иммуногенная композиция необязательно дополнительно включает адъювант (смотри ниже). Анатоксины представляют собой инактивированные токсины и могут быть выделены из токсинов Clostridium, включая выделенные из C. perfringens, включающие альфа токсин, бета токсин, бета 2 токсин, энтеротоксин, эпсилон токсин, йота токсин, каппа токсин, лямбда токсин и/или тета токсин; включая выделенные из C sordeilii, включающие геморрагический токсин и/или летальный токсин; включая выделенные из C. difficile, включающие A токсин (энтеротоксин) и B токсин (цитопатический токсин); включая выделенные из C. septicum, включающие альфа токсин; включая выделенные из C. novyi, включающие альфа токсин и/или бета токсин; и/или включая выделенные из C. botulinum, включающие токсин типа C. Способы получения анатоксинов известны из уровня техники и включают, например, обработку токсина формальдегидом или

термообработку (смотри, например, Walker, (1992) Vaccine 10:977-990). Бактерины представляют собой бактериальные клеточные компоненты и могут быть выделены из бактерий вида Clostridium, такого как, например, C. perfringens типов A и/или C. perfringens типа C. Анатоксиновые вакцины C. perfringens известны из уровня техники (смотри, например, Патент США No. 4292306 от Zemlyakova).

В других воплощениях иммуногенная композиция включает, по существу состоит из или состоит из убитых (т.е., нерепликативных) бактерий Clostridium (т.е., бактерина), необязательно в виде эмульсии вода-масло-вода (смотри, например, Патент США No. 5817320 от Stone, описывающий иммунизацию in ovo птичьих эмбрионов с помощью вакцин в виде масляных эмульсий, полное содержание патента введено сюда ссылкой), и/или фармацевтически приемлемого носителя. В других воплощениях иммуногенная композиция включает, по существу состоит из или состоит из убитых бактерий Clostridium и адъюванта (например, адъюванта в виде производного алюминия, такого как гидроксид алюминия, сапонин, такой как Quil-A, включая QuilA QS21, или в виде масла, такого как полный или неполный адъювант Фрейнда), необязательно в виде эмульсии вода-масло-вода и/или в фармацевтически приемлемом носителе.

В качестве дополнительной альтернативы иммуногенная композиция включает, по существу состоит из или состоит из репликативного иммунного агента из бактерий Clostridium, например живых бактерий C. perfringens, которые, как правило, являются ослабленными (т.е., с уменьшенной вирулентностью) живыми бактериями C. perfringens (смотри, например, публикацию PCT WO 2005/053737, полное содержание которой введено сюда ссылкой, для руководства по получению живых ослабленных бактерий для применения в вакцинах). Способы получения ослабленных бактерий известны из уровня техники и включают без ограничения: облучение, химическую обработку, серийный пассаж в культуре и подобные. В определенных воплощениях изобретения вводятся живые бактерии Clostridium (например, C. perfringens) в присутствии агента, который защищает субъект от патологических эффектов организма, например, путем совместного введения нейтрализующего фактора, как описано в Патенте США No. 6440408 от Thoma et al., или введения интерферона, как описано в Патенте США No. 6506385 от Poston et al. Необязательно бактерии Clostridium и нейтрализующий фактор и/или интерферон вводятся в одну и ту же композицию.

Дополнительные примеры иммуногенных композиций, включающих, по существу состоящих из или состоящих из антитоксинов (т.е, антител, которые обеспечивают пассивный иммунитет против альфа и/или бета токсинов Clostridium ; смотри, например, Патент США No. 5719267 от Carroll et al.), антигенных пептидов, которые индуцируют иммунный ответ против бактерий Clostridium (включая токсины C. Perfringens , смотри, например, Патенты США No.5817317 и 5851827 от Titball et al.; Патент США No. 6610300 от Segers et al.; Патент США No. 5695956 от McClane et al.), и рекомбинантных вакцин, которые включают нуклеиновую кислоту-носитель (например, плазмиду или вирус), которая доставляет нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенный пептид(ы) или белок(и), которые индуцируют иммунный ответ против бактерий Clostridium.

В характерных воплощениях иммуногенная композиция включает, по существу состоит из или состоит из рекомбинантного альфа и/или бета токсина из бактерий Clostridium, например, из альфа токсинов, имеющих аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:2 [полноразмерная последовательность из 370 аминокислот; GenBank номер доступа 1GYGB (Gl:21730290), кодирующая последовательность которой представлена здесь в виде SEQ ID NO:1], SEQ ID NO:4 (Cpa247-370; аминокислоты 247-370 из SEQ ID NO:2; кодирующая последовательность которой представлена здесь в виде SEQ ID NO:3), SEQ ID NO:6 (аминокислоты 1-278 из SEQ ID NO:2; кодирующая последовательность которой представлена здесь в виде SEQ ID NO:5), SEQ ID NO:8 (Cpa261-300; аминокислоты 261-300 из SEQ ID NO:2, кодирующая последовательность которой представлена здесь в виде SEQ ID NO:7), как описано здесь, и/или, например, в Патентах США No. 5817317 и 5851827 от Titball et al., или SEQ ID NO:10 [полноразмерная последовательность из 398 аминокислот, кодирующая последовательность которой представлена здесь в виде SEQ ID NO:9]. В некоторых воплощениях токсин по настоящему изобретению представляет собой иммуногенную композицию, включающую аминокислоты 1-278 (SEQ ID NO:6) из последовательности из 370 аминокислот (SEQ ID NO:2) альфа токсина из C. perfringens .

Следующие примеры токсинов (включая их иммуногенные фрагменты), которые могут применяться в композициях и способах этого изобретения, включают, но не ограничены ими, токсины C. perfringens [например, альфа токсин, номер доступа CAA35186 (Saint-Joanis et al. MoI. Gen. Genet. 219(3):453-460 (1989); бета токсин, номер доступа CAA58246 (Steinthorsdottir et al. FEMS Microbiol. Lett. 130(2-3):273-278 (1995)); бета 2 токсин, номер доступа NP_150010 (Shimizu et al. Proc. Natl. Acad. Set. U.S.A. 99(2):996-1001 (2002)); энтеротоксин, номер доступа BAE79112 (Miyamoto et al. J. Bacteriol. 188(4): 1585-1598 (2006)); эпсилон токсин, номер доступа 31 AAA23236 (Havard et al. FEMS Microbiol. Lett. 97:77-82 (1992); йота токсин, номер доступа CAA51959 (Perelle et al. Infect Immun. 61(12):5147-5156 (1993)); каппа токсин, номер доступа NP_561089, Shimizu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. США 99(2):996-1001 (2002)); лямбда токсин, номер доступа CAA35187 (Saint-Joanis et al. MoI. Gen. Genet. 219(3):453-460 (1989)); и тета токсин, номер доступа NP_561079 (Shimizu et al. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 99(2):9.96-1001 (2002))], токсины C. difficile [например, токсин A, номер доступа A37052 (Wren et al. FEMS Microbiol. Lett 70:1 -6(1990)); и токсин B, номер доступа CAA43299 (von Eichel-Streiber et al. MoI. Gen. Genet. 233(1-2): 260-268 (1992))], токсины C. septicum [например, альфа токсин, номер доступа AAB32892 (Ballard et al. Infect. Immun. 63(1):340-344 (1995))] и токсины C. novyi [например, альфа токсин, номер доступа AAB27213 (Ball et al. Infect. Immun. 61 (7):2912-2918 (1993))].

Термины "токсин", "альфа токсин", "бета токсин", "эпсилон токсин" (или подобный термин), и т.д., при использовании здесь, включают полноразмерный токсин, а также антигенные или иммуногенные пептиды или их антигенные или иммуногенные варианты (например, ослабленные), которые индуцируют иммунный ответ у субъекта (необязательно защитный иммунный ответ) против бактерий Clostridium. В конкретных воплощениях антигенный пептид включает, по меньшей мере, примерно 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 50, 75 или 100 или более последовательно расположенных аминокислот полноразмерного токсина (смотри, например, полноразмерную последовательность альфа токсина, показанную в SEQ ID NO:2 в Патентах США No. 5817317 и 5851827 и в SEQ ID NO:2, представленной здесь).

Также понятно, что иммуногенные фрагменты по этому изобретению могут быть объединены в любом порядке или количестве. Например, фрагмент 1-10 может быть объединен с фрагментом 10-20 с получением фрагмента из аминокислот 1-20. В качестве другого примера фрагмент 1-20 может быть объединен с фрагментом 50-60 с получением одного фрагмента по этому изобретению, имеющего последовательность из 31 аминокислоты (AA 10-20 и AA 50-60). Также фрагменты могут присутствовать в многочисленных количествах и в любой комбинации во фрагменте по этому изобретению. Таким образом, например, фрагмент 1-150 может быть объединен со вторым фрагментом 1-150 и/или объединен с фрагментом 400-500 с получением фрагмента по этому изобретению.

В некоторых воплощениях антигенный или иммуногенный фрагмент токсина Clostridium по этому изобретению может включать, по существу состоять из и/или состоять из аминоконцевого домена из альфа токсина C. perfringens (аминокислоты 1-246 из SEQ ID NO:2), карбоксиконцевого домена из альфа токсина C. perfringens (аминокислоты 256-370 из SEQ ID NO:2) и/или фрагмента между этими доменами (аминокислоты 247-255 из SEQ ID NO:2) в любой комбинации и с любым количеством перекрывающихся аминокислотных последовательностей, что приводит в результате к получению фрагмента, имеющего иммуногенную активность. Подразумевается, что эта фраза охватывает все возможные пептиды токсинов и фрагменты, как это очевидно представлено здесь (например, любой пептид или фрагмент, включающий, по меньшей мере, примерно 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 50, 75 или 100 или более последовательно расположенных аминокислот полноразмерной последовательности альфа токсина, как показано в SEQ ID NO:2 в Патентах США No. 5817317 и 5851827 и в SEQ ID NO:2 и в SEQ ID NO:10, представленных здесь). В конкретных воплощениях антигенный пептид лишен аминокислотной последовательности, обладающей гидролизующей активностью фосфолипазы С и/или сфингомиелина (например, антигенный пептид альфа токсина может быть лишен аминокислот 1-240). Было определено расположение некоторых эпитопов альфа токсина C. perfringens (смотри, например, публикацию Logan et al., (1992) Infection and Immunity 59:4338-4382, полное содержание которой введено сюда ссылкой для руководства по эпитопам альфа токсина).

Дополнительные примеры рекомбинантных токсинов Clostridium, которые могут применяться в способах по этому изобретению, включают, но не ограничены ими, бета токсин Clostridium perfringens или его иммуногенный фрагмент, где бета токсин имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11. Бета токсин из SEQ ID NO.11 может дополнительно включать мутацию аминокислоты 62, 182, 197 или мутацию в одной из областей между аминокислотами No. 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 или ниже аминокислоты с положением 292 (как описано в Патенте США No. 6610300, полное содержание которого введено сюда ссылкой), посредством чего полученный в результате токсин или его фрагмент обладает иммуногенной активностью.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности альфа и бета токсинов из C. perfringens известны из уровня техники, смотри, например, GenBank номер доступа DQ202275; NP_560952; NCJ303366; AY823400; AY277724; AF204209; X17300; X13608; L43548; L43547; L77965 и L13198. Смотри также публикацию Sheedy et al., Highly Conserved Alpha-Toxin Sequences of Avian Isolates of Clostridium perfringens, J. Clin. Microbiol. 42:1345-1347 (2004), где представлен анализ последовательностей альфа токсина из штаммов C. perfringens , выделенных из цыплят.

В следующих воплощениях этого изобретения токсин Clostridium может представлять собой эпсилон ( ) токсин из C. perfringens, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12 (328 аминокислот; или SEQ ID NO:13). В следующих воплощениях токсин может включать аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:13, где остаток 2 представляет собой пролин, как описано в Патенте США No. 6403094, полное содержание которого введено сюда ссылкой.

В определенных воплощениях в настоящем изобретении предлагается способ иммунизации птицы против инфекции бактериями Clostridium, включающий введение птице эффективной иммунизирующей дозы композиции бактерин-анатоксина из Clostridium путем in ovo инъекции в последнюю четверть периода инкубации. Способы по этому изобретению могут дополнительно включать стадию введения бустерной дозы композиции бактерин-анатоксина из Clostridium птице после выведения птицы из яйца. Бактерии вида Clostridium по этому изобретению могут включать, но не ограничены ими, Clostridium perfringens. В конкретных воплощениях этого изобретения композиция может включать вакцину Vision CD^®. В конкретных воплощениях, где субъектом является цыпленок, композиция бактерин-анатоксина может вводиться в амниотическую жидкость посредством иглы с калибром 20g, 1,0 дюйм или с калибром 22g, 1,0 дюйм в течение 18 дня инкубации.

В дополнительных воплощениях этого изобретения предлагаются способы иммунизации птицы против инфекции бактериями Clostridium , включающие введение птице эффективной иммунизирующей дозы рекомбинантного токсина или его иммуногенного фрагмента из Clostridium путем in ovo инъекции в последнюю четверть периода инкубации. В некоторых воплощениях эти способы могут дополнительно включать стадию введения бустерной дозы рекомбинантного токсина или его иммуногенного фрагмента птице после выведения птицы из яйца. В конкретных воплощениях композиция, применяемая в этих способах, может включать адъювант, который может представлять собой Quil A и неполный адъювант Фрейнда. В воплощении, где субъектом является цыпленок, композиция бактерин-анатоксина может вводиться в тело эмбриона посредством иглы с калибром 23g, 1,25 дюйма в течение 19 дня инкубации.

Еще в следующих воплощениях, когда субъектом является цыпленок, токсин или его иммуногенный фрагмент по этому изобретению может вводиться в тело эмбриона посредством иглы с калибром 20g, 1,5 дюйма в течение 19 дня инкубации. Также предел дозировки токсина (например, альфа токсина) или его иммуногенного фрагмента и/или другой субъединицы белка или гликопротеина или другого типа биологической молекулы, применяемой в качестве вакцины по этому изобретению, может находиться от примерно 1 мкг до примерно 1000 мкг на дозу с типичным пределом дозировки от примерно 55 мкг до примерно 60 мкг на дозу. Для композиций по этому изобретению, включающих инактивированный вирус, концентрация вируса на дозу может находиться в интервале от примерно 10³ EID₅₀/TCID₅₀ до примерно 10¹² EID₅₀/TCID₅₀ (EID = инфицирующая доза для яйца; TCID = инфицирующая доза для тканевой культуры). В воплощениях, включающих активированный вирус, концентрация на дозу может находиться в пределе от примерно 10^0,1 EID₅₀/TCID₅₀ до примерно 10¹² EID₅₀/TCID₅₀. В конкретных воплощениях этого изобретения токсин по этому изобретению включает, по существу состоит из и/или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 или 10, включая любую их комбинацию.

Здесь предполагается, что в некоторых воплощениях настоящего изобретения композиция по этому изобретению дополнительно включает адъювант, который в конкретных воплощениях может представлять собой такой адъювант, как производное алюминия (например, гидроксид алюминия), сапонин (например, Quil-A, включая QuilA QS21), или масло (такое как полный или неполный адъювант Фрейнда), в любой комбинации. Здесь предлагаются дополнительные примеры адъювантов, которые могут применяться в любых способах изобретения, описанных здесь.

В характерных воплощениях иммуногенная композиция по этому изобретению включает, состоит из, по существу состоит из энтеротоксина (CPE) C. Perfringens , бета-2 токсина, эпсилон токсина, каппа токсина, лямбда токсина, тета токсина и/или йота токсина, необязательно в дополнении к альфа и/или бета токсину C. perfringens.

В других характерных воплощениях иммуногенная композиция включает, по существу состоит из или состоит из анатоксина или анатоксина/бактерина. Бактерин может представлять собой бактерин из C. perfringens типа А и/или С. Например, типичная иммуногенная композиция включает, по существу состоит из или состоит из альфа анатоксина и бактерина из C. perfringens типа А. Необязательно иммуногенная композиция дополнительно включает адъювант, такой как производное алюминия (например, гидроксид алюминия), сапонин (например, Quil-A, включая QuilA QS21), или масло (такое как полный или неполный адъювант Фрейнда).

Характерная иммуногенная композиция по изобретению включает, по существу состоит из или состоит из эффективной иммунизирующей дозы иммунизирующего агента C. perfringens в эмульсии вода-масло-вода (смотри, например, Патент США No. 5817320 от Stone), необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

Иммуногенная композиция может дополнительно включать два или более агентов, которые индуцируют иммунный ответ против бактерий C. perfringens (например, любую комбинацию из описанных выше агентов).

В конкретных воплощениях агент, который индуцирует иммунный ответ против бактерий C. perfringens (например, анатоксин, бактерин, ослабленные бактерии C. perfringens, и/или токсин и подобные), представляет собой выделенный из птиц, необязательно выделенный из цыплят штамм C. perfringens.

При использовании здесь термин "по существу состоит из" (и грамматические варианты) обозначает, что иммуногенная композиция не включает другого вещества, в виде иммуногенного агента, отличного от указанных агентов. Термин "по существу состоит из" не исключает присутствия других компонентов, таких как адъюванты, иммуномодуляторы и подобные.

Термин "фармацевтически приемлемый" обозначает вещество, которое не является биологически или иным образом нежелательным, т.е. вещество может вводиться субъекту, не оказывая существенных нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такая фармацевтическая композиция может применяться, например, для приготовления композиций для иммунизации. Физиологически и фармацевтически приемлемые носители могут содержать другие соединения, включающие, но не ограниченные ими, стабилизаторы, соли, буферы, адъюванты и/или консерванты (например, антибактериальные, противогрибковые и противовирусные агенты), как известно из уровня техники. Нет необходимости в том, чтобы фармацевтически приемлемый носитель был стерильным, хотя он предназначается, как правило, для введения in ovo птичьим эмбрионам.

В конкретных воплощениях иммуногенная композиция дополнительно включает иммунный стимулятор. Альтернативно, иммунный стимулятор не может вводиться субъекту в отдельной композиции. Иммунные стимуляторы, которые могут применяться в настоящих способах, включают, но не ограничены ими, цитокины, факторы роста, хемокины, супернатанты клеточных культур лимфоцитов, моноциты или клетки лимфоидных органов, клеточные препараты или клеточные экстракты (например, фиксированные препараты Staphylococcus aureus или препараты липополисахпридов), митогены или адъюванты, включая низкомолекулярные лекарственные средства. Иммунные стимуляторы могут вводиться in ovo в любой момент во время инкубации. Необязательно иммунный стимулятор и агент, который индуцирует иммунный ответ против бактерий C. Perfringens, вводятся одновременно, необязательно они вводятся в одной и той же композиции.

При использовании здесь слово "одновременно" обозначает достаточно близко по времени с получением комбинированного эффекта (который заключается в том, что одновременно может представлять собой совместно или может представлять собой два или более событий, происходящих внутри короткого периода времени до и/или после друг друга).

Любой подходящий вакцинный адъювант может применяться согласно настоящему изобретению, включая химические и полипептидные иммуностимуляторы, которые усиливают ответ иммунной системы на антигены. Адъюванты включают, но не ограничены ими, адъювант на основе производного алюминия (например, гидроксид алюминия), фосфат алюминия, растительные и животные масла (например, неполный или полный адъювант Фрейнда), сапонин (например, Quil-A, включающий QuilA, QS21), Spur^® (Intervet), и подобные. Характерные адъюванты по этому изобретению включают, но не ограничены ими, соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия (квасцы), фосфат алюминия или алганнмулин, но также адъювант может представлять собой соль или минеральные гели кальция, магния, железа или цинка, или может представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионных или анионных производных полисахаридов, или полифосфазены, или сапонины, такие как Quil-A, или эмульсии, такие как вода-масло и вода-масло-вода, или полный или неполный адъювант Фрейнда, или адъювант может представлять собой любую их комбинацию.

Иммуногенная композиция необязательно может содержать один или более стабилизаторов. Может применяться любой подходящий стабилизатор, включая углеводороды, такие как сорбит, маннит, крахмал, сахарозу, декстрин или глюкозу; белки, такие как альбумин или казеин; и буферы, такие как фосфат щелочного металла и подобные.

Часто является удобным иммунизировать птицу против множества заболеваний одним курсом лечения. Таким образом, в конкретных воплощениях иммуногенная композиция включает один или более дополнительных агентов, которые индуцируют иммунный ответ против других птичьих патогенов (например, вирусных, бактериальных или грибковых), необязательно иммунизирующих агентов, которые производят защитный иммунный ответ. Например, иммуногенная композиция может дополнительно включать иммунизирующий агент против кокцидиоза (такого, как вызванного бактериями Eimeria), заболевания инфекционного бурсита, болезни Марека, болезни Ньюкастла, птичьего гриппа, птичьей оспы, птичьего реовируса, птичьего метапневмовируса, птичьего аденовируса, инфекционного бронхита, инфекционных заболеваний, вызванных бактериями видов Salmonella, Camplyobacter, Pasteurella, Hemophilusparagallinarum и/или Mycoplasma. Птичьи вакцины, подходящие для периода in ovo или после выведения птицы из яйца, хорошо известны из уровня техники и являются коммерчески доступными (например, вакцина Bursaplex^TM для заболевания бурсита; вакцина Newplex ^TM для болезни Ньюкастла, и вакцина Inovocox^TM для кокцидиоза, все вакцины доступны от фирмы Embrex, Inc., и вакцина Марека HVT-SB-1 для болезни Марека, доступная от Merial). Иммуногенные композиции, включающие вакцинные агенты против обоих типов кокцидиоза (т.е., вызванного бактериями Eimeria) и некротического энтерита (т.е., вызванного бактериями C. perfengens), имеют конкретную пользу, так как известно, что воздействие бактерий Eimeria увеличивает восприимчивость птиц к некротическому энтериту путем нарушения желудочно-кишечной среды.

Таким образом, в качестве следующего аспекта изобретение охватывает способы совместного введения иммуногенной композиции, которая включает, по существу состоит из или состоит из эффективной иммунизирующей дозы иммунизирующего агента C. Perfringens и эффективной иммунизирующей дозы иммунизирующего агента, который обеспечивает защиту против одного или более других птичьих заболеваний (как описано выше). Множественные иммунизирующие агенты могут предлагаться в одном составе, или могут вводиться одновременно или последовательно в любом порядке в отдельных композициях. Как обсуждалось выше, этот аспект изобретения конкретно применяется для совместного введения вакцин кокцидиоза и некротического энтерита.

В другом характерном воплощении сначала птицу иммунизируют против некротического энтерита и затем иммунизируют против кокцидиоза или наоборот. Обе иммунизации могут происходить in ovo, обе иммунизации могут происходить в период после выведения птицы из яйца, или одна иммунизация может происходить в период после выведения птицы из яйца. Например, в одном иллюстративном воплощении птицу иммунизируют против кокцидиоза in ovo и затем иммунизируют против некротического энтерита в период после выведения птицы из яйца.

Изобретение также может быть применено на практике для введения иммунизирующего агента C. perfringens in ovo или в период после выведения птицы из яйца в соответствии с "in ovo питанием" птицы (смотри Патент США No. 6592878; полностью введенный сюда ссылкой). Например, согласно определенным воплощениям иммунизирующий агент C. perfringens и композиция питательных веществ и/или кишечный модулятор вводятся птице in ovo, необязательно введением в амнион. Необязательно вакцины против других инфекционных агентов вводятся in ovo и/или также в период после выведения птицы из яйца (как описано выше). Иммунизирующий агент C. perfringens и композиция питательных веществ и/или кишечный модулятор могут вводиться одновременно в одной или в отдельных композициях.

Следующие воплощения настоящего изобретения могут включать композицию, включающую антиген, выбранный из группы, состоящей из альфа анатоксина C. Perfringens, антигенного фрагмента из альфа анатоксина C. Perfringens, инактивированного антигенного фрагмента из альфа токсина C. Perfringens и любой их комбинации; где одна или более дозировок, составляющая от примерно 0,1 до примерно 1,0 мл (например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, или 1,0) на дозу композиции, являются достаточными для индукции, по меньшей мере, 0,5 единиц антитоксина (A.U.) антитела к альфа токсину на 1 мл антисыворотки птицы (например, цыпленка), вакцинированной с применением вакцины. В некоторых воплощениях композиция может индуцировать, по меньшей мере, примерно 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 или 10 A.U. антитела к токсину на 1 мл антисыворотки птицы.

При использовании здесь термины "единица антитоксина" или "A.U." антитела к токсину на 1 мл антисыворотки (которые могут использоваться взаимозаменяемо с терминами единицы "теста нейтрализации антитоксина" или "TNT" единицы) определяются при помощи способности сыворотки нейтрализовать токсические эффекты токсина с использованием биотеста мыши. В этом тесте известное количество токсина, установленное с помощью международных стандартов, которые известны из уровня техники, смешивают с серийными разведениями сыворотки из вакцинированных животных. Смесь инкубируют один час при комнатной температуре и затем инъецируют внутривенно мышам. Мыши выживают, если токсин полностью нейтрализуется с помощью сыворотки, в противном случае они умирают. Единицы антитоксина или титр определяются как обратно пропорциональная величина наибольшего разведения сыворотки, при котором нейтрализуется токсин.

В следующих воплощениях композиция может включать антиген в виде бесклеточного препарата. В других воплощениях антиген может представлять собой альфа анатоксин в виде супернатанта альфа анатоксина C. perfringens. В определенных воплощениях композиция может включать, по существу состоять из и/или состоять из антигена, который может представлять собой альфа анатоксин C. perfringens Типа A и/или альфа анатоксин C. perfringens Типа C. В некоторых воплощениях композиция по этому изобретению может включать бета токсин C. perfringens, бета 2 токсин C. perfringens , энтеротоксин C. perfringens, эпсилон токсин C. perfringens , йота токсин C. perfringens, каппа токсин C. perfringens, лямбда токсин C. Perfringens, тета токсин C. perfringens , геморрагический токсин C. sordelli, летальный токсин C. sordelli, токсин A C. difficile, токсин В C. difficile, альфа токсин C. septicum, альфа токсин C. novyi, бета токсин C. novyi и/или любой их комбинации. Такая композиция может дополнительно включать, по существу состоять из и/или состоять из одного или более вирусных антигенов, одного или более бактериальных антигенов, и/или одного или более паразитных антигенов, как описано здесь.

Настоящее изобретение далее объясняется в следующих неограничивающих примерах. В этих Примерах "мкл" обозначает микролитры, "мкг" обозначает микрограммы, "мл" обозначает миллилитры, "кс" обозначает кубические сантиметры, "мм" обозначает миллиметры, "мМ" обозначает концентрацию в миллимолях, "мг" обозначает миллиграммы, "°C" обозначает градусы Цельсия и E18 и E19 обозначает эмбриональное развитие, соответствующее дням 18 и 19, соответственно.

ПРИМЕРЫ

Пример I. Иммунный ответ, следующий за in ovo вакцинацией с помощью коммерчески доступных вакцин Clostridium perfringens Типа C&D (Siteguard G & Vision CD).

План эксперимента

В бройлерные яйца инъецировали вручную in ovo коммерчески доступный анатоксин Clostridium perfringens (Siteguard^® G) и бактерин-анатоксиновые вакцины (вакцина Vision^® CD^®). Выведенных из яйца птиц выращивали для измерения ответа антител. Осуществляли оценку области инъекции. В день 0 (выведение птицы из яйца) выбирают группы для обработки, получающие вакцинацию в период после выведения птицы из яйца. Всех птиц помещают в клетки (5 птиц/на клетку). Каждую клетку снабжают питанием обычного стартера для бройлеров. На 14 день птиц переключают на питание для роста бройлеров. Птиц умерщвляли с помощью кровоизвлечения, и сыворотку тестировали на ответ антител с помощью теста нейтрализации токсина сывороткой.

Материалы и методы

Материал для инъекции (Siteguard^® G):

Siteguard^® G (адъювант не известен) представляет собой анатоксиновую вакцину C. perfringens типа C & D, производимую фирмой Schering-Plough. Она защищает овец и крупный рогатый скот от заболеваний, вызванных токсинами типа C & D. Для вакцинации вводят подкожно (SQ) или внутримышечно (IM) 4,0 мл (крупный рогатый скот) или 2,0 мл (овцы) вакцины. Бустерные вакцинации водят через три-четыре недели после исходной вакцинации и затем вводят ежегодно.

Материал для инъекции (Vision^® CD^® ):

Vision^® CD^® (с подходящим адъювантом 'Spur^®') представляет собой бактерин-анатоксиновую вакцину C. perfringens типа C & D, производимую фирмой Intervet. Она защищает крупный рогатый скот, овец и коз от энтеротоксемии, вызванной бактериями C. perfringens типа C & D. Для вакцинации вводят подкожно животному (крупный рогатый скот, овцы или козы) 2,0 мл вакцины. Через три-четыре недели после исходной вакцинации животное получает дополнительные 2,0 мл (SQ) и затем ревакцинируется ежегодно.

Протокол инъекций

В день E19 в бройлерные яйца инъецируют тестовое вещество, направленное или в амниотическую жидкость, или в тело эмбриона в каждом яйце. Кроме того, в день 0 после выведения птицы из яйца некоторые группы для обработки, инъецированные in ovo и способом, отличным от in ovo, получали вакцинацию или бустерную иммунизацию тестируемыми материалами. Для вакцинации в период после выведения птицы из яйца или бустерной иммунизации вводили 0,5 мл вакцины путем подкожной инъекции в спину или шею.

Область инъекции

В момент инъекции яйца, распределенные для оценки области инъекции, инъецировали красителем. Яйца затем умерщвляли и вскрывали для оценки места инъекции. Область инъекции анализировали с помощью отношения правдоподобия по критерию хи-квадрат (таблица 1).

Кровоизвлечение

В дни 7, 14, 21 и 28 в период после выведения птицы из яйца кровь собирали от каждой индивидуальной птицы и объединяли в индивидуальные контейнеры для сбора крови (на группу для обработки). На 7, 14 и 21 день собирали 0,5 мл крови или через крыло, или через яремную вену. На 28 день собирали 0,5 мл крови посредством пункции сердца. Кровь затем инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем образцы крови помещали в настольную центрифугу и центрифугировали при 2400 об/мин в течение 10 минут. Как только центрифугирование завершалось, удаляли сыворотку из каждого образца крови, и хранили в 96-ти луночных планшетах (при 2-8°С или -70°С) для будущих оценок иммунного ответа.

Тест нейтрализации токсина (бета) Clostridium perfringens типа С у мышей: приготовление образца для инокуляции мышей

A. Материалы

1. Токсин (бета) Clostridium perfringens Типа С - CVBL, лот № . IRP513(04)

2. Антитоксин (бета) Clostridium perfringens Типа С - CVBL, лот № . IRP486

3. Разбавитель (пропись) - 1% пептон, 0,25% NaCl, pH 7,2, BBL, лот № . 0510,06 (ссылка), NB - NB 140 p. 87

4. Образцы сыворотки цыплят - EMHE1381, NB 140 p. 80 a. Образцы № . 7, 8, 9, 10A, 10B, 11A, 11B, 12A, 12B, 13A, 14A, 15A

5. Стерильные пробирки на 3 мл и 1,8 мл

B. Методы:

1. Разведение стандартного бета антитоксина 1:50 в разбавителе, с общим объемом 10 мл.

a. Размораживают бета антитоксин при комнатной температуре.

b. Смешивают 200 мкл бета антитоксина и 9,8 мл разбавителя = 1:50.

c. Держат на льду.

2. Разведение бета токсина 1:120 в разбавителе, с общим объемом 12 мл.

a. Размораживают бета токсин при комнатной температуре.

b. Смешивают 200 мкл бета токсина и 1,8 мл разбавителя = 1:10.

c. Смешивают 1 мл разведенного 1:10 бета токсина с 11 мл разбавителя = 1:120

d. Держат на льду.

3. Приготовление контрольного образца L₀ .

a. Смешивают 0,5 мл бета токсина (разведение 1:120) с 0,5 мл разбавителя.

b. Добавляют 1 мл бета антитоксина (разведение 1:50).

c. Смешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.

d. Держат образцы на льду.

4. Приготовление контрольного образца L₊.

a. Смешивают 0,8 мл бета токсина (разведение 1:120) с 0,2 мл разбавителя.

b. Добавляют 1 мл бета антитоксина (разведение 1:50).

c. Смешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.

d. Держат образцы на льду.

5. Приготовление 12 тестовых образцов сыворотки.

a. Смешивают 3.25 мл бета токсина (разведение 1:120) с 3,25 мл разбавителя.

b. В каждую из двенадцати пробирок на 1,8 мл добавляют 0,5 мл токсина из образцов стадии 5.a.

c. Метят каждую пробирку с помощью No. образца и No. группы для обработки.

d. Добавляют 0,5 мл каждой неразведенной сыворотки цыпленка в помеченную соответствующим образом пробирку.

e. Смешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.

f. Хранят образцы на льду.

6. Все неиспользованные образцы хранят при 2-7°С.

Активности по предварительному исследованию

Двадцать восемь самок швейцарских белых мышей (CD-1) (с весом тела 16-20 граммов) были приобретены для использования в этом исследовании. Мыши были отправлены поставщиком (Charles River Laboratories) и транспортированы в лабораторию для клинических испытаний.

Мышей помещали в клетки, размещая по 2 мыши на клетку для групп с использованием сыворотки цыплят, и 4 клетки по 5 мышей на клетку для контрольных групп. Мышей держали в течение периода акклиматизации, составляющего 5 дней, перед началом исследования в день 0. Мышей размещали и следили за ними согласно стандартным плановым процедурам, и кормили с использованием стандартного лабораторного питания, и предлагали воду ad libitum.

День 0

Мышей обследовали на предмет нормального здоровья и внешнего вида, и выбирали для участия в тестах семьдесят шесть мышей. Две мыши не участвовали в исследовании и были умерщвлены. Каждой мыши инъецировали внутривенно (IV) с помощью иглы 26g × 3/8 в хвостовую вену согласно группам для обработки, описанным в Плане Исследования. Осуществляли мониторинг мышей дважды в день на предмет признаков шока, боли или мучений по очевидным следующим признакам:

Летаргия

Суета

Жесткий/взъерошенный волосяной покров

Искривленная поза

Атаксия

Анорексия или неспособность добраться до пищи или воды

Умирающих мышей умерщвляли посредством превышения дозы CO ₂ согласно стандартным плановым процедурам.

День 1 (приблизительно через 24 часа после инокуляции)

За мышами наблюдали и фиксировали количество случаев смертности.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Положительный специфичный ответ антител детектировался в сыворотке, полученной от птиц, вакцинированных in ovo (направлено в тело эмбриона) коммерческой вакциной бактерин-анатоксина C. Perfringens , с введением или в отсутствии бустерной дозы в период после выведения птицы из яйца с использованием теста нейтрализации токсина сывороткой. Эти данные указывают на то, что введение вакцины бактерин-анатоксина C. perfringens in ovo выявляет частичную защиту, и введение in ovo с последующим введением бустерной дозы в период после выведения птицы из яйца обеспечивает полную защиту против бактерий C. perfringens (таблица 2).

ПРИМЕР II. Иммунный ответ, следующий за in ovo вакцинацией с помощью экспериментального препарата вакцины, содержащего рекомбинантный альфа токсин

План эксперимента

Вышеописанное исследование проводили для определения, может ли детектироваться гуморальный иммунный ответ (ответ антител) у бройлерных птиц после вакцинаций in ovo, in ovo + вакцинация после выведения птицы из яйца, или вакцинаций после выведения птицы из яйца рекомбинантным альфа токсином Clostridium perfringens (SEQ ID NO:6) (предоставленного Dr. Glenn Songer, Dept. of Veterinary Science and Microbiology, The University of Arizona), дополненным адъювантом, представляющим собой неполный адъювант Фрейнда и Quil-A. Стратегия иммунизации включала направленную в тело эмбриона вакцинацию in ovo в день E18, а также осуществляли вакцинацию на 7 день после выведения птицы из яйца. Ответ антител оценивали у птиц в возрасте 28 дней.

В день E18 в бройлерные яйца инъецировали in ovo вручную или контрольные вещества (Quil A; Accurate Chemical & Scientific Corporation, продукт # AP04991, класса адъювантов, лот # L77-238), эмульгированные с помощью неполного адъюванта Фрейнда (IFA; Rockland, лот # 16235), или рекомбинантный альфа токсин C. perfringens (55 или 60 мкг/на дозу вместе с адъювантом Quil A + IFA (13 или 15 мкг/на дозу). Оценку области инъекции осуществляли с помощью инъекции красителя. В день 0 (выведение птицы из яйца) птиц помещают в клетки (5 птиц/на клетку). Птицы получают питание обычного стартера для бройлеров. Кроме того, некоторых птиц вакцинировали на 7 или 17 день согласно выбранному типу обработки (0,2 мл вакцины путем подкожной инъекции в спину или шею). Сыворотку птицы затем оценивали на специфичный ответ антител посредством вестерн-блот анализа.

Материалы и методы

Инъекция :

В день E18 в бройлерные яйца инъецировали тестовые вещества (альфа токсин Clostridium perfringens + вакцинный адъювант), направленные в тело эмбриона в каждом яйце. Кроме того, на 7 или 17 день после выведения птицы из яйца некоторые группы для обработки, инъецированные in ovo и способом, отличным от in ovo, получали вакцинацию (таблица 3).

Область инъекции (SOI):

В момент инъекции яйца, распределенные для оценки SOI, инъецировали красителем. Яйца затем умерщвляли и вскрывали для оценки SOI (таблица 4).

Сбор сыворотки:

В дни 7, 14, 21 и 28 в период после выведения птицы из яйца кровь собирали от каждой индивидуальной птицы и помещали в индивидуальные контейнеры для сбора крови. На 7, 14 и 21 день собирали 0,5 мл крови или через крыло или через яремную вену. На 28 день собирали 0,5 мл крови посредством пункции сердца. Образцы крови затем инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем образцы крови центрифугировали и удаляли сыворотку, и хранили в 96-ти луночных планшетах (при 2-8°С или -70°С) для будущих оценок иммунного ответа.

Вестерн-блот тест:

SDS-электрофорез в блоке геля проводили согласно методу Laemmli (Nature 227:680-685 (1970)), как описано в публикации O'Farrell (J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975), second dimension), с использованием 10% акриламидного блока геля (125 мм длиной × 150 мм шириной × 0,75 мм толщиной) с наложением 25 мм концентрирующего геля. Электрофорез проводили при 12 мА примерно 3,5 часов или до тех пор, пока фронт красителя бромфенолового не мигрирует к концу блока геля. После электрофореза в блоке геля гель для проведения процедуры блотинга помещали в буфер для переноса (12,5 мМ Tris, pH 8,8, 96 мМ глицина, 20% MeOH) и осуществляли перенос на мембрану PVDF в течение ночи при 200 мА и приблизительно 100 вольт/на два геля. Мембрану PVDF окрашивали с помощью красителя Кумасси синего и сушили между листами фильтровальной бумаги.

Мембрану PVDF окрашивали с помощью красителя Куммасси бриллиантового синего R-250, сканировали на столе перед и после вырезания индивидуальных полос. Каждую полосу блота помещали в индивидуальный контейнер и блокировали в течение двух часов в присутствии 5% обезжиренного сухого молока в солевом растворе с буфером Tris Tween-20 (TTBS) и промывали в растворе TTBS.

Блоты затем инкубировали с первичными антителами (разведенными 1:100 в присутствии 2% обезжиренного сухого молока в TTBS) в течение ночи и промывали 3×10 минут в TTBS.

Полосу 1 блота (положительный контроль) затем помещали в раствор с вторичными антителами [кроличьи анти-козьи IgG-HRP (Sigma Cat. # A-5420 и лот #034K4858), разведенными 1:5000 в 2% NFDM в TTBS] в течение двух часов, промывали 3×10 минут в TTBS, обрабатывали с помощью ECL и экспонировали с рентгеновской пленкой.

Оставшиеся полосы блота затем помещали индивидуально в раствор со вторичными антителами [кроличьи анти-куриные IgG-HRP (Bethyl Cat. # A30-107P и лот # A30-107P-3), разведенными 1:2000 в 2% обезжиренном сухом молоке в TTBS] в течение двух часов, промывали 3×10 минут в TTBS, обрабатывали с помощью ECL и экспонировали с рентгеновской пленкой.

Результаты вестерн-блот исследования представлены в таблице 5.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Специфичный ответ антител детектировали у птиц, вакцинированных in ovo (направленно в тело эмбриона) рекомбинантным альфа токсином, дополненным адъювантом Quil-A & IFA, с введением или в отсутствии бустерной дозы в период после выведения птицы из яйца. Эти данные демонстрируют, что in ovo вакцинация с помощью рекомбинантного альфа токсина может выявить у бройлеров иммунный ответ против альфа токсина C. perfringens.

ПРИМЕР III

Коммерчески доступные инактивированные вакцины для болезни Ньюкастла в виде масляных эмульсий были приобретены у Maine Biological Laboratories. Вакцину вводили in ovo в день E18, используя путь введения через амниотическую жидкость, или вводили in ovo в день E19, используя путь введения через тело эмбриона. Направленное введение в область амниотической жидкости и в область тела эмбриона подтверждалось с помощью проведения анализа области инъекции с использованием красителя в день E18 или E19. Направленное введение в область амниотической жидкости выполняли с использованием тупой иглы (группа 2). Направленное введение в область тела эмбриона проводили с использованием острой 1,25-дюймовой иглы (группа 3). Сыворотку крови собирали у птиц в возрасте 14, 21 и 28 дней и анализировали с использованием ELISA (Idexx, Inc.) на антитела, специфичные к вирусу болезни Ньюкастла (NDV). Различных индивидуальных птиц умерщвляли путем кровоизвлечения в день сбора крови.

Анализ области инъекции группы E18 показал, что 22/24 яиц были инъецированы в амниотическую жидкость, 22/24 в аллантоисную жидкость и 0/24 в тело эмбриона. Анализ области инъекции группы E19 показал, что 7/10 яиц были инъецированы в тело эмбриона и 3/10 яиц были инъецированы в амниотическую жидкость.

В таблице 6 показан ответ антител на вирус болезни Ньюкастла, следующий за in ovo вакцинацией цыплят. В таблице 7 показаны данные по проценту выведения птиц из яйца.

Исследование демонстрирует, что иммунный ответ развивающегося эмбриона серьезно подвержен влиянию со стороны области введения in ovo инактивированной вакцины против болезни Ньюкастла в виде масляной эмульсии (таблица 6). Эмбрионы, вакцинированные в амниотическую жидкость, которая окружает тело эмбриона, не отвечали выработкой антител, специфичных для болезни Ньюкастла. С другой стороны, эмбрионы, вакцинированные непосредственно в тело эмбриона, давали сильный ответ антител, который увеличивался в возрасте 28 дней. В целом 34 птицы были умерщвлены путем обескровливания в ходе этого исследования, и 26/34 имели положительный ответ антитела к вирусу болезни Ньюкастла (таблица 6). 26/34 представляют собой 76,5%, что очень близко к результатам исследования области инъекции, где 70% эмбрионов, иммунизированных в день E19, были инъецированы в тело эмбриона. Процент выведения птицы из яйца находился в пределах нормы для групп, подвергнутых и не подвергавшихся обработке (таблица 7).

ПРИМЕР IV

Коммерчески доступные инактивированные вакцины для болезни Ньюкастла в виде масляных эмульсий были приобретены у Maine Biological Laboratories. Вакцину вводили in ovo в день E19, используя путь введения через тело эмбриона или путь подкожного введения после выведения птицы из яйца. Направленное введение в область тела эмбриона проводили с использованием острой 1,25-дюймовой иглы (группа 3). Вакцинацию птиц после выведения из яйца проводили путем инъекции вакцины подкожно в заднюю часть шеи только что выведенных цыплят (группа 2). Сыворотку крови собирали у птиц в возрасте 21 дня и анализировали с использованием ELISA (Idexx, Inc.) на антитела, специфичные к вирусу болезни Ньюкастла (NDV). Результаты показаны в таблице 8. Данные, представленные в таблице 8, показывают, что эмбрионы, вакцинированные в тело с помощью вакцины против болезни Ньюкастла в виде масляной эмульсии, дают такой же ответ, как и цыплята, вакцинированные с помощью стандартной процедуры вакцинации птиц после выведения из яйца. Процент выведения птиц из яйца находился в пределах нормы для групп, подвергнутых и не подвергавшихся обработке (таблица 9).

Данные, представленные в примерах III и IV выше, показывают, что направленное попадание в тело эмбриона является необходимым для стимулирования активного иммунного ответа на инактивированный антиген (в этом случае на вирус болезни Ньюкастла). Эти данные также указывают на то, что инъекция инактивированного антигена в масляной эмульсии адъюванта в тело эмбриона не оказывает негативного влияния на эмбрионы.

Инъекция in ovo (перед выведением птицы из яйца) в тело эмбриона может быть выполнена вручную с использованием шприца и иглы или с помощью автоматизированного оборудования, также использующего иглы. В примерах, приведенных здесь, шприц и игла использовались вручную для введения вакцины в тело эмбриона или в амниотическую жидкость (только пример III), окружающую тело эмбриона. Для выполнения инъекции в тело эмбриона иглу вставляли через отверстие в скорлупе яйца в воздушную камеру яйца. Вставленная игла проходила сквозь мембрану воздушной камеры, аллантоисные мембраны и жидкость и, наконец, в полость амниона, где находится тело эмбриона. Затем игла проникала в тело эмбриона и вводилась вакцина. Инъекции в тело эмбриона могут осуществляться в многочисленные области тела эмбриона и включают подкожное введение вакцины, интрадермальное, внутривенное, внутримышечное и внутрибрюшинное введение вакцины, а также любую комбинацию этих областей введения. Кроме того, инъекции в тело эмбриона могут осуществляться в голову, плечо, крыло, спину, грудь или лапу, включая любые комбинации. Инъекции в тело эмбриона не включают исключительные случаи введения вакцины в воздушную камеру, аллантоисную полость, амниотическую жидкость или в альбумин.

Инъекция в тело эмбриона in ovo может быть проведена с использованием иглы длиной в пределах от 3/4 дюйма до 4 дюймов и с калибром в пределах от 15 до 28. Концы игл могут находиться в пределах от очень острых (подкожных) до острых.

В примерах III и IV вакцина против вируса болезни Ньюкастла применялась в качестве антигенной модели. Однако ожидается, что любой подходящий состав вакцины в виде масляной эмульсии с достаточной антигенной массой будет подобен тестированной вакцине против болезни Ньюкастла. Таким образом, согласно способам по настоящему изобретению, описанным здесь, могут быть введены in ovo непосредственно в тело эмбриона вакцины против инфекционного бурсита, птичьего гриппа, инфекционных бронхитов, инфекционного вируса куриной анемии, ларинготрахеита, птичьего реовируса, аденовируса, ротавируса, астровируса, инфекционной гепатомиелопоэтической болезни, синдрома снижения несучести, инфекции Escherichia coli, инфекции бактериями вида Mycoplasma , инфекции бактериями вида Salmonella, инфекции бактериями вида Campylobacter, инфекции бактериями вида Clostridium , инфекции бактериями вида Haemophilus, инфекции бактериями вида Pasteurella. Вакцины, полученные из этих агентов, могут представлять собой цельную клетку или субъединицу. Вакцины, полученные из этих агентов, могут быть получены традиционными способами в ростовой среде, яйцах или тканевых клеточных культурах, и/или могут быть получены способами рекомбинантной ДНК согласно методам, хорошо известным из уровня техники. Кроме того, ожидается, что любой агент заболевания, который может быть получен с достаточной эффективной массой для эффективной вакцинации цыплят, при инактивации также будет эффективно вакцинировать эмбрионы in ovo, если будет введен непосредственно в тело эмбриона.

Адъювант, применяемый в тестируемой вакцине в этих примерах, представлял собой обычную коммерческую масляную эмульсию. Ожидается, что немасляные эмульсии инактивированных вакцин с адъювантами, отличными от масляных, производят активный иммунный ответ при введении непосредственно в тело эмбриона в период перед выведением птицы из яйца. Подходящие адъюванты включают, но не ограничены ими, минеральные гели, полианионы, плюрониловые полиолы, производные сапонина, лизолецитин и другие подобные поверхностно-активные вещества, гликозиды и все типы масел и их комбинацию.

ПРИМЕР V

Леггорны, свободные от специфичных патогенов (SPF), вакцинировались in ovo следующим образом - группа 1: фосфатно-солевой буфер (PBS); группы 2 и 3: 0,3×10 ⁹ инактивированный NDV EID50/на дозу в PBS; группа 4: 0,3×10 ⁹ инактивированный NDV EID50/на дозу с адъювантом квасцы-депо (Imject, Pierce; гидроксид алюминия и гидроксид магния); группа 5: коммерческая масляная эмульсия вакцины для NDV. В возрасте 11 дней субъекты группы 3 получали вторую дозу NDV в PBS с помощью подкожной инъекции. Вакцины, полученные in ovo, были направлены в тело эмбриона, и анализ области инъекции проводили на отдельной группе одинаковых яиц для оценки процента эмбрионов, инъецированных непосредственно в тело эмбриона. Вакцинацию in ovo проводили на 19 день инкубации с помощью 1,25-дюймовой иглы с калибром 23. Четырнадцать птиц на группу помещали в клетки и выращивали до возраста 21 день.

Образцы сыворотки собирали у птиц в возрасте 21 день и тестировали на IgG антитело к NDV с помощью ELISA (Idexx, Inc.). Образцы сыворотки из групп 2, 4 и 5 также тестировали на специфичное к NDV антитело с помощью ингибирования гемагглютинации (HI) с использованием четырех HA единиц. Количество образцов, тестированных с помощью HI, отличалось от количества тех образцов, которые тестировали с помощью ELISA, потому что нескольких сывороток из нескольких образцов было недостаточно для проведения теста HI. Предполагалось, что птицы показывали измеряемый ответ антител (т.е, сероконвертировались) по отношению к вакцинации, если образец сыворотки имел титр ELISA 200 или титр HI 3,0 Log2 (т.е. титр 1:8).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ области инъекции показал, что инъекции в тело эмбриона соответствовали 78% всех инъекций (таблица 10).

Процент выведения птиц из яйца и степень сероконверсии по отношению к NDV по измерениям с помощью ELISA показаны в таблице 11. В таблице 12 показано количество птиц, которые были сероконвертированы с использованием теста HI.

Исходя из этих исследований, были отмечены следующие ключевые моменты 1) NDV антиген в PBS не стимулировал измеряемой реакции антител с помощью NDV ELISA, даже когда инактивированный NDV антиген субъекты получали дважды, как в группе 3 (один раз in ovo и снова в возрасте 11 дней); 2) NDV-Квасцы (группа 4) стимулировала сероконверсию у 8/14 птиц, при измерении с помощью ELISA, в то время как коммерческая вакцина в виде масляной эмульсии (группа 5) стимулировала сероконверсию у 10/13 птиц, при измерении с помощью ELISA; 3) NDV-квасцы (группа 4) стимулировала сероконверсию у 12/14, при измерении с помощью HI, в то время как вакцина в виде масляной эмульсии стимулировала сероконверсию у 11/11 птиц, при измерении с помощью HI; и 5) коммерческая вакцина против болезни Ньюкастла в виде масляной эмульсии (группа 5) стимулировала более сильный ответ антител, чем вакцина NDV-Квасцы (группа 4). В примере III показано, что при введении in ovo антигена, присутствующего в масляной эмульсии депо-адъюванта, требуется, чтобы вакцина была введена в тело эмбриона для стимулирования измеряемой реакции антител с помощью ELISA. В настоящем примере анализ области in ovo инъекции показал, что 78% яиц получили вакцину непосредственно в тело эмбриона.

ПРИМЕР VI

Исследование проводили с использованием SPF леггорнов для определения того, стимулирует ли адъювант квасцы-депо иммунный ответ при введении in ovo. Тестируемые группы представляли собой следующие группы: группа 1: фосфатно-солевой буфер (PBS) in ovo; группы 2 и 3: 1,2×10⁹ EID50, инактивированного -пропиолактоном NDV/на дозу в PBS in ovo; группа 4: введение in ovo 1,2×10⁹ EID50, инактивированного -пропиолактоном NDV/на дозу с квасцами, в соотношении квасцов к антигену NDV 30%:70%. Используемые квасцы представляли собой коммерческий раствор гидроксида алюминия и гидроксида магния (Imject, Peirce). Группа 3 получила дополнительную дозу антигена NDV в PBS в возрасте 11 дней путем подкожной инъекции. Введение вакцины in ovo проводили на 19 день инкубации с использованием 1,25-дюймовой иглы с калибром 23. Вакцины вводили in ovo в тело эмбриона, и анализ области инъекции проводили на отдельной группе одинаковых яиц для оценки процента эмбрионов, инъецированных непосредственно в тело эмбриона. Образцы сыворотки собирали у птиц в возрасте 21 день и тестировали на IgG антитело к NDV с помощью ELISA (Idexx, Inc.). Предполагалось, что птицы показывали измеряемый ответ антител (т.е, сероконвертировались) по отношению к вакцинации, если образец сыворотки имел титр ELISA >200.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ области инъекции показал, что инъекции в тело эмбриона соответствовали 81% всех инъекций (таблица 13).

Процент выведения птиц из яйца и степень и величина сероконверсии против вируса болезни Ньюкастла показаны в таблице 14.

В этих исследованиях представлены следующие ключевые моменты: 1) эмбрионов инъецировали в день E19, и данные анализа области инъекции показали, что 81% эмбрионов были инъецированы в тело эмбриона; и 2) в этом исследовании квасцы смешивали с инактивированным с помощью -пропиолактона NDV в соотношении 30% к 70%, и в этом состояло отличие от исследования, описанного здесь в примере V, в котором инактивированный нагреванием NDV смешивали в соотношении 50% квасцов и 50% антигена NDV. Отличие в иммунных ответах в двух исследованиях может быть объяснено благодаря отличиям используемых антигенов NDV и/или благодаря отличию тестируемых соотношений квасцов к антигену, а также благодаря отличиям в анализе ELISA, используемом для измерения антител.

В примере III показано, что в случае антигена, присутствующего в масляной эмульсии депо-адъюванта, требуется, чтобы вакцина была введена в тело эмбриона для стимулирования измеряемого ответа антител с помощью ELISA. В этом исследовании анализ области инъекции показал, что 81% яиц были инъецированы в тело эмбриона, и на основе этих данных ожидается, что приблизительно 11 из 14 яиц, вакцинированных in ovo, будут давать ответ антител. Действительное количество яиц, которые давали ответ антител, составило девять из четырнадцати.

ПРИМЕР VII

Коммерческую вакцину болезни Ньюкастла в виде масляной эмульсии вводили способом in ovo бройлерам. Это исследование определяло способность бройлеров отвечать на инактивированные антигены вируса болезни Ньюкастла при введении способом in ovo в амниотическую жидкость и способом введения внутрь эмбриона. Птиц умерщвляли путем кровоизвлечения в возрасте 13, 21, 26 и 35 дней, и титр антител к NDV определяли с использованием ELISA (Idexx, Inc.). Анализ области инъекции проводили в дни E18 и E19 с использованием красителя.

Данные по выведению птиц из яйца показаны в таблице 16. Процент выведения птиц из яйца был в норме при введении вакцины в виде масляной эмульсии в тело эмбриона.

Область инъекции (таблица 15) была очень точной, более чем 90% эмбрионов были инъецированы способом, указанным для типа обработки (таблица 16).

Данные по реакции антител, специфичных для вируса болезни Ньюкастла, показаны в таблице 17. Можно видеть, что птицы отвечали на антиген болезни Ньюкастла при введении вакцины in ovo в тело эмбриона или подкожно птенцу. Когда вакцину NDV вводили in ovo в амниотическую жидкость, реакции антител не следовало, что указывало на то, что вакцину следует вводить в тело эмбриона для стимулирования подходящего иммунного ответа.

Указанные примеры иллюстрируют настоящее изобретение, и их не следует понимать, как его ограничение. Изобретение определяется следующими пунктами формулы изобретения с эквивалентами пунктов формулы изобретения, включенными сюда.

Таблица 3
Краткое описание исследования
	Птица	Бройлер
День инъекции	Е18, Д7 и Д17
Тип инъекции	Эмбрион +/- бустерная доза в период после выведения птицы из яиц (Д7), вакцинация только в период после выведения птицы из яиц (Д7), бустерная доза (Д17)
Контроль	Нет инъекции (прокол)
Тестируемые материалы	Инактивированный рекомбинантный альфа токсин (SEQ ID NO:6), дополненный адъювантом Quil A + неполный адъювант Фрейнда
Доза токсина	55,2-60 мкг/0,2 мл

Таблица 6
Ответ антител цыплят на вирус болезни Ньюкастла после направленного в определенную область введения in ovo инактивированной вакцины против болезни Ньюкастла в виде масляной эмульсии
Гp	Путь введения вакцины	Возраст 14 дней	Возраст 21 день	Возраст 28 дней
Значение титра	# пол./# тест.1	Значение титра	# пол./# тест.1	Значение титра	# пол./# тест.1
1	Не вакцинировались	7	0/10	1	0/12	23	0/12
2	NDV вакцина in ovo, амниотическая жидкость	1	0/10	1	0/12	1	0/12
3	NDV вакцина in ovo, тело эмбриона	909	7/10	3262	8/12	7819	11/12
1Количество птиц с положительным ответом антител к вирусу болезни Ньюкастла/количество тестируемых птиц

Таблица 8
Ответ антител цыплят на вирус болезни Ньюкастла после внутри-эмбрионального введения in ovo или подкожного введения в день выведения птенцов инактивированной вакцины против болезни Ньюкастла в виде масляной эмульсии
Группа	Путь введения вакцины	Возраст 21 день
Значение титра	пол./# тест.1
1	Буфер in ovo, тело эмбриона	1	0/12
2	NDV вакцина, подкожно, в момент выведения птицы из яиц	3785	10/12
3	NDV вакцина, in ovo, тело эмбриона	3261	12/12
1Количество птиц с положительным ответом антител к вирусу болезни Ньюкастла/количество тестируемых птиц

Таблица 9
Процент выведения птицы из яиц после внутри-эмбрионального введения in ovo инактивированной вакцины против болезни Ньюкастла в виде масляной эмульсии
Группа	Путь введения вакцины	Данные процента выведения птицы из яиц
# выведенных птиц из яиц /# инъекций	Процент выведения птицы из яиц
1	Буфер in ovo, тело эмбриона	17/21	81%
2	NDV вакцина, подкожно, в момент выведения птицы из яиц	80/101	79,2%
3	NDV вакцина, in ovo, тело эмбриона	18/20	90%

Таблица 11
Процент выведения птицы из яиц и результаты NDV ELISA для птиц, вакцинированных in ovo с NDV антигеном, NDV антигеном вместе с квасцами или с вакциной NDV в виде масляной эмульсии
Группа	Вакцина	Бустерная доза на 11 день	Процент выведения птицы из яиц от общего количества (%)	Количество сероконвертированных птиц/общее количество тестируемых птиц	Значение титра для сероконвертированных птиц, полученное с помощью ELISA (в возрасте 21 день)
1	нет	Нет	96	0/13	не применимо
2	NDV	Нет	77	0/14	не применимо
3	NDV	Да	86	0/14	не применимо
4	NDV-квасцы	Нет	88	8/14	1272
5	NDV-OE**	Нет	87	10/13	3038
** NDV-OE = коммерческая вакцина NDV в виде масляной эмульсии (LAHI)

Таблица 12
Результаты ингибирования NDV гемагглютинации у бройлеров, вакцинированных in ovo с NDV антигеном вместе с квасцами или с вакциной NDV в виде масляной эмульсии
Группа	Обработка	HI тест (log2 ) Значение ± стандартное отклонение	Количество птиц с титром HI 3/количество тестируемых птиц (в возрасте 21 дня)
2	NDV	1,8±0,4	0/13
4	NDV-квасцы	3,8±1,1	12/14
5	NDV-OE**	8,9±2,2	11/11
** NDV-OE = коммерческая вакцина NDV в виде масляной эмульсии (LAHI)

Таблица 13
Результат анализа области инъекции
Обработка	Воздушная камера	Аллантоисный мешок	Амниотическая жидкость	Тело Эмбриона	Желточный мешок	N
23G×1,25"	0%	2,1%	16,7%	81,3%	0%	48

Таблица 14
Процент выведения цыплят и результаты анализа ELISA для бройлерных цыплят, вакцинированных in ovo с помощью NDV антигена или NDV-квасцы
Номер группы	Антиген-адъювант	Бустерная доза на 11 день	Процент выведения птицы из яиц от общего количества (%)	Количество сероконвертированных птиц/общее количество тестируемых птиц	Значение титра для сероконвертированных птиц, полученное с помощью ELISA (в возрасте 21 день)
1	Нет	Нет	97	0/11	Не применимо
2	NDV	Нет	94*	0/14	Не применимо
3	NDV	Да	1/14	200
4	NDV-квасцы	Нет	96	9/14	411
*Обе обработки с помощью NDV были из одной группы выведенных из яиц птиц

Таблица 15
Область инъекции для направленной в определенную область in ovo доставки инактивированной вакцины против вируса болезни Ньюкастла в виде масляной эмульсии
Возраст эмбриона в момент инъекции		Область инъекции
День 18		Тело эмбриона	Амниотическая жидкость	Аллантоисная жидкость
1/34	33/34	0
%	2,9	97,1	0
День 19		Тело эмбриона	Амниотическая жидкость	Аллантоисная жидкость
	57/63	6/63	0
%	90,5	9,5	0