применение мидостаурина для лечения желудочно-кишечных стромальных опухолей

Формула изобретения

1. Способ лечения пациента, страдающего желудочно-кишечными стромальными опухолями, которые характеризуются мутациями, выбранными из группы KIT T670I, V454A и PDGFRA D842V, предусматривающий введение эффективного количества мидостаурина формулы



или его фармацевтически приемлемой соли.

2. Способ по п.1, в котором желудочно-кишечная стромальная опухоль является иматинибрезистентной желудочно-кишечной стромальной опухолью.

3. Способ по п.2, в котором мидостаурин вводят в дозе 100-300 мг в сутки.

4. Способ по п.3, в котором доза составляет 150-250 мг в сутки.

5. Способ по п.4, в котором доза составляет 200 мг в сутки.

6. Способ по одному из предшествующих пунктов, в котором мидостаурин вводят в организм пациенту при условии, что мидостаурин не используют для одновременного, раздельного или последовательного применения с иматинибом.

7. Способ по п.6, в котором мидостаурин вводят в организм перорально.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к применению мидостаурина в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли для получения фармацевтической композиции для лечения желудочно-кишечных стромальных опухолей, например желудочно-кишечных опухолей, устойчивых к соединению I, и к способу лечения терапевтически эффективной дозой мидостаурина теплокровных животных, преимущественно человека, с указанным выше заболеванием или состоянием.

Желудочно-кишечные стромальные опухоли (ГИСО) представляют собой недавно охарактеризованное семейство мезенхимальных опухолей, которые исходят из желудочно-кишечного тракта, при этом от 60 до 70% всех ГИСО возникают в желудке. Ранее эти опухоли классифицировались как лейомиома, лейомиобластома или лейомиосаркома. Однако в настоящее время установлено, что ГИСО представляют самостоятельную клинико-морфологическую форму заболевания, основанную на их уникальном молекулярном патогенезе и клинических особенностях.

ГИСО является относительно редким заболеванием и насчитывает примерно 20 случаев на миллион. ГИСО является наиболее обычной мезенхимальной опухолью желудочно-кишечного тракта. До последнего времени основным способом лечения ГИСО было хирургическое вмешательство. Ограничение применения традиционной цитотоксической химиотерапии и лучевой терапии при ГИСО связано с прогрессирующим течением заболевания и летальным исходом. Средняя выживаемость пациентов составляет от 20 месяцев, например, в случае метастатических ГИСО, до года или менее, например, в случае послеоперационного рецидива.

Наиболее вероятным этиологическим онкогенным молекулярным фактором в подавляющем большинстве ГИСО являются активирующие мутации KIT и рецептора А фактора роста, происходящего из тромбоцитов (platelet-derived growth factor receptor A - PDGFRA). В результате происходит активация сигнальных путей, которые стимулируют пролиферацию и/или выживаемость клеток. Иматиниб мезилат специфически ингибирует рецепторные тирозинкиназы PDGFRA, KIT, ABL и ARG и индуцирует высокие ответные реакции у пациентов с ГИСО. До настоящего времени лечение иматинибом остается единственно эффективным системным лечением этого заболевания. Клинические и экспериментальные наблюдения показали, что ответ связан с наличием и типом мутаций KIT/PDGFRA в опухоли, при этом 11 мутаций в экзоне KIT являются наиболее чувствительными к лечению. Мутации KIT-D816V и PDGFRA-D842V, затрагивающие каталитический домен киназы, препятствуют связыванию иматиниба и приводят к изначальной неэффективности лекарственного средства. У большинства пациентов с ГИСО во время терапии после разного по длительности положительного ответа развивается лекарственная устойчивость. Исследование других злокачественных заболеваний у пациентов, подвергавшихся лечению иматинибом, например хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) или хронического эозинофильного лейкоза (ХЭЛ), показывает, что резистентность к этому ингибитору может быть вызвана различными молекулярными механизмами. Большинство пациентов с ХМЛ с резистентностью к иматинибу имеют клональную экспансию лейкемических клеток, несущих новые мутантные аллели BCR-ABL или экспрессирующих повышенные уровни фузионного белка из-за амплификации BCR-ABL. Развитие резистентности к иматинибу в случае ХЭЛ может быть связано с вторичной мутацией в каталитическом домене фузионного белка FIPL1-PDGFRA. Предварительные исследования у больных с ГИСО с иматинибрезистентной прогрессирующей стадией заболевания показали, что в большинстве опухолей функциональную роль все еще продолжает играть активация KIT с приобретенными мутациями домена киназы KIT или геномной амплификацией гена KIT в качестве причинных факторов в подгруппе пациентов.

Иматиниб - низкомолекулярный селективный ингибитор специфических тирозинкиназ, который недавно выявлен в качестве ценного средства для лечения пациентов с ГИСО в продвинутой стадии. Применение иматиниба в качестве монотерапии для лечения ГИСО описано в РСТ WO 02/34727 и включено в настоящее описание в качестве ссылки. Однако, сообщалось, что в популяции больных присутствует первичная резистентность к иматинибу, например у 13,7% больных в одном из исследований. Кроме того, часть пациентов приобретает устойчивость к лечению иматинибом. В большинстве случаев эта устойчивость является неполной, с прогрессированием в некоторых патологических очагах, но при этом в других очагах заболевание остается под контролированием. Поэтому этих больных продолжают лечить иматинибом, но при этом очевидна необходимость в дополнительном или альтернативном лечении.

Иматиниб представляет собой 4-(4-метилпиперазин-1-илметил)-N-[4-метил-3-(4-пиридин-3-ил)пиримидин-2-иламино)фенил]-бензамид формулы I

Получение иматиниба и его применение, особенно в качестве противоопухолевого агента, описаны в примере 21 в заявке ЕР-А-0564409, опубликованной 6 октября 1993 г., и в аналогичных заявках и патентах во многих других странах, например в патенте US 5521184 и в японском патенте 2706682, все они включены в настоящее описание в виде ссылок.

Неожиданно было обнаружено, что мидостаурин, ингибитор портеинкиназы С, обладает лечебными свойствами, благодаря которым он полезен для лечения желудочно-кишечных стромальных опухолей, например желудочно-кишечных стромальных опухолей, резистентных к иматинибу.

Протеинкиназа С, в дальнейшем в настоящем описании сокращенно обозначаемая как РKС, является одним из ключевых ферментов в клеточных сигнальных путях трансдукции и играет центральную роль в контроле клеточной пролиферации и дифференцировки. РKС относится к семейству серин/треониновых киназ. Идентифицировано, по меньшей мере, 12 изоформ РKС, которые, на основании структуры и субстратной специфичности, как правило, подразделяются на три группы. Было установлено, что в биоптатах опухоли молочной железы человека по сравнению с нормальными тканями молочной железы экспрессия РKС повышена, и высокую экспрессию РKС считают биологическим маркером злокачественности астроцитом человека. Одна из изоформ РKС, РKС , является положительным регулятором индукции бессмертия в Т-клетках. Интересно, что Протеинкиназа РKС конститутивно фосфорилируется в ГИСО. Таким образом, РKС может считаться потенциальной киназой-мишенью для лечебного воздействия на ГИСО. В особенности ингибиторы РKС полезны при лечении ГИСО, резистентных к иматинибу.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения ГИСО, заключающемуся в введении мидостаурина пациенту с ГИСО, например, с иматинибрезистентной ГИСО.

Мидостаурин согласно настоящему изобретению является N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-гексагидро-10-метокси-9-метил-1-оксо-9,13-эпокси-1H,9H-дииндоло[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]пирроло[3,4-j][1,7]бензодиазонин-11-ил]-N-металбензамидом формулы (II):

или его солью, далее называемым: «соединением формулы II, или мидостаурином».

Соединение формулы II, или мидостаурин [международное непатентованное название], также обозначается «РKС412».

Мидостаурин является производным встречающегося в природе алкалоида стауроспорина и детально описан в ЕР 0296110, опубликованном 21 декабря 1988 г., а также в патенте US 5093330, опубликованном 3 марта 1992 г., и японском патенте 2708047. Мидостаурин, описанный в этих документах, включен в настоящую заявку в качестве ссылки. Мидостаурин и процесс его получения детально описаны во многих документах, хорошо известных специалисту в данной области.

В каждом случае, где приводятся ссылки на патентные заявки или научные публикации, в особенности, касающиеся мидостаурина, предмет конечных продуктов, фармацевтические препараты и формулы изобретения включаются в настоящую заявку путем ссылки на эти публикации.

В контексте настоящего изобретения понятие «иматинибрезистентный или иматинибрезистентность» означает отсутствие, снижение или потерю терапевтической эффективности иматиниба в лечении желудочно-кишечных стромальных опухолей.

Настоящее изобретение относится к применению мидостаурина, также известного как РKС412, или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения желудочно-кишечных стромальных опухолей, далее обозначаемых как ГИСО, например иматинибрезистентных ГИСО, и к способу лечения теплокровных животных, в том числе людей, с ГИСО, посредством введения упомянутому животному, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества мидостаурина или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение относится к способу лечения ГИСО, например иматинибрезистентных ГИСО, заключающемуся в введении мидостаурина больному с ГИСО, например иматинибрезистентной формой ГИСО.

Точная дозировка мидостаурина, необходимая для лечения вышеупомянутых заболеваний и состояний, зависит от нескольких факторов, включая хозяина заболевания, природу и тяжесть подлежащего лечению состояния, способ введения. В общем, удовлетворительные результаты достигаются при введении мидостаурина парентерально, например внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрь опухоли, или ректально, или энтерально, например перорально, предпочтительно внутривенно, или предпочтительно перорально, внутривенно ежедневно в дозировке от 0,1 до 10 мг/кг массы тела, предпочтительно от 1 до 5 мг/кг массы тела. В исследованиях на людях наиболее допустимой максимально переносимой дозой (МПД) оказалась общая доза 225 мг в сутки. Предпочтительная внутривенная суточная дозировка составляет 0,1-10 мг/кг массы тела или, для наиболее крупных приматов, суточная дозировка составляет 200-300 мг. Обычная внутривенная дозировка составляет 3-5 мг/кг при введении от трех до пяти раз в неделю.

Перорально мидостаурин вводят в дозировке до примерно 300 мг/сутки, например 100-300 мг/сутки. Мидостаурин вводят в виде однократной дозы или дозы, разделенной на две или три части в сутки, предпочтительно на две части. Особо значимая доза составляет 200-225 мг/сутки, особенно по 100 мг два раза в сутки (в целом 200 мг/сутки). Верхний предел дозировки ограничивается побочными эффектами и может быть установлен путем исследования пациента, подвергаемого лечению.

Настоящее изобретение также относится к способу, согласно которому терапевтически эффективное количества мидостаурина вводят млекопитающему с частой от 7 до 4 раз в неделю, т.е. примерно ежедневно или примерно в течение 50% суток во время периода, составляющего от одной до шести недель, за которым следует период от одной до трех недель, в течение которого препарат не вводят, и этот цикл повторяют от одного до нескольких раз.

Обычно введение начинают с низкой дозы и дозировку постепенно повышают до установления оптимальной дозировки для больного, которого подвергают лечению. Верхний предел дозировки ограничивается побочными эффектами и может быть установлен путем исследования пациента, подвергаемого лечению.

Мидостаурин можно сочетать с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и, необязательно, с одним или несколькими традиционными фармацевтическими вспомогательными веществами и вводить энтерально, например перорально, в форме таблеток, капсул, каплеток и т.д., или парентерально, например внутрибрюшинно или внутривенно, в форме стерильных инъекционных растворов или суспензий. Энтеральные и парентеральные композиции могут быть приготовлены обычными способами.

Инфузионные растворы согласно настоящему изобретению предпочтительно должны быть стерильными. Это можно легко выполнить, например, путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. Асептическое приготовление любой композиции в жидкой форме, асептическое заполнение флаконов и/или соединение фармацевтической композиции настоящего изобретения с приемлемым разбавителем в асептических условиях хорошо известны квалифицированным специалистам в данной области.

Мидостаурин может быть приготовлен в виде энтеральных или парентеральных фармацевтических композиций, содержащих такое количество действующего вещества, которое эффективно для лечения вышеупомянутых в настоящем описании заболеваний и состояний, в виде композиций в форме унифицированной дозировки или в виде композиций, включающих фармацевтически приемлемый носитель.

Примеры пригодных композиций описаны в ЕР 0296110, 0657164, 0733372, 0711556, 0711557.

Предпочтительные композиции описаны в ЕР 0657164, опубликованном 14 июня 1995 г. Описанные фармацевтические композиции являются раствором или дисперсией мидостаурина в насыщенном полиалкиленгликольглицериде, в котором гликольглицерид представляет собой смесь глицериловых и полиэтиленгликолевых сложных эфиров одной или нескольких C ₈-C₁₈ насыщенных жирных кислот.

Настоящее изобретение относится к применению мидостаурина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства для лечения ГИСО, например иматинибрезистентных ГИСО, при условии, что мидостаурин не вводят вместе, последовательно или раздельно с иматинибом.

Настоящее изобретение относится к применению мидостаурина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения ГИСО, например иматинибрезистентных ГИСО, в котором иматиниб не используют для лечения указанных ГИСО, например иматинибрезистентных ГИСО.

Настоящее изобретение относится к применению мидостаурина или его фармацевтически приемлемой соли, в котором мидостаурин используется в качестве противоопухолевого агента для лечения ГИСО, например иматинибрезистентных ГИСО.

Настоящее изобретение также относится к мидостаурину в упаковке, которая включает инструкции по использованию мидостаурина или его солей для лечения ГИСО, например иматинибрезистентных ГИСО.

Одна особенность настоящего изобретения заключается в предоставлении способа лечения ГИСО, включающего введение мидостаурина в количестве, терапевтически эффективном в отношении ГИСО, нуждающемуся в этом теплокровному животному, особенно человеку. Особенно, настоящее изобретение предоставляет способ лечения пациента с ГИСО, который включает введение больному эффективного количества мидостаурина или его фармацевтически приемлемой соли. В особенности, настоящее изобретение предоставляет способ лечения больного, страдающего от ГИСО, который включает введение больному эффективного количества мидостаурина или его фармацевтически приемлемой соли, в котором мидостаурин вводится в дозе от 100 до 300 мг в сут., более определенно 150-250 мг в сутки, наиболее определенно 200 мг в сутки, в качестве перорального фармацевтического препарата.

Пример 1. Фармацевтические препараты мидостаурина

Состав А:

Gelucire 44/14 (82 части) расплавляют путем нагревания до 60°С. К расплавленному материалу добавляют порошкообразный мидостаурин (18 частей). Смесь гомогенизируют и полученную дисперсию расфасовывают в твердые желатиновые капсулы разного размера, таким образом, чтобы одни содержали дозировку 25 мг, а другие - дозировку 75 мг мидостаурина. Полученные капсулы пригодны для перорального введения.

Состав Б:

Gelucire 44/14 (86 частей) расплавляют путем нагревания до 60°С. К расплавленному материалу добавляют порошкообразный мидостаурин (14 частей). Смесь гомогенизируют и полученную дисперсию фасуют в твердые желатиновые капсулы разного размера, таким образом, чтобы одни содержали дозировку 25 мг, а другие - дозировку 75 мг мидостаурина. Полученные капсулы пригодны для перорального введения.

Коммерчески доступный Gelucire 44/14 фирмы Gattefossé представляет смесь сложных эфиров C₈-C₁₈ насыщенных жирных кислот с глицерином и полиэтиленгликолем с молекулярной массой примерно 1500, технические характеристики композиции жирнокислотной составляющей по массе следующие: 4-10% каприловой кислоты, 3-9% каприновой кислоты, 40-50% лауриновой кислоты, 14-24% миристиновой кислоты, 4-14% пальмитиновой кислоты и 5-15% стеариновой кислоты.

Предпочтительный пример состава с Gelucire включает:

Gelucire (44/14): 47 г

Мидостаурин: 3,0 г, помещенные завинчивающиеся флаконы объемом 60 мл.

Состав В: Пример мягкого геля может содержать следующую микроэмульсию:

Глицериды кукурузного масла	85,0 мг
Полиэтиленгликоль 400	128,25 мг
Кремофор RH 40	213,75 мг
Мидостаурин	25,0 мг
DL-альфа-токоферол	0,5 мг
Абсолютный этанол	33,9 мг
Всего	486,4 мг

Пример 2.

РKС412 прочно взаимодействует с АТФ-связывающими участками обычных РKС, FLT3, PDGFR, VEGFR, KIT и комплекса CDK1-циклин В. Было установлено, что РKС412 полностью ингибирует иматинибрезистентную мутантную форму T674I, производную FIPL1-PDGFRA, у плохо поддающихся лечению больных ХЭЛ, см., например, Cools J. и др., Cancer Cell, 3, 2003, cc.459-469. Каталитические участки тирозинкиназ весьма консервативны, и мутация T674I в PDGFRA соответствует мутации T315I в ABL и мутации T670I в KIT, мутациям резистентности у больных с прогрессирующей BCR-ABL-положительной ХМЛ и у больных с KIT-мутантными ГИСО, соответственно. Изучают механизм резистентности к иматинибу у 26 больных с ГИСО, не поддающихся лечению иматинибом, и исследуют применение РKС412 для преодоления клинической устойчивости к иматинибу у этих больных из-за повторных мутаций киназного домена KIT-T670I или -V654A, и PDGFRA-DS42V.

Материалы и методы

Пациенты: Прогрессирующие опухоли оценивают у 26 больных, которых подвергают лечению иматинибом в отделении онкологии университетского госпиталя Лувена. Пациентами являются 20 мужчин и 6 женщин среднего возраста 53 года (диапазон 37-77 лет). У 22 из 26 пациентов первичная опухоль хирургически удалена. До лечения иматинибом у 13 больных с продвинутой стадией заболевания применялась химиотерапия и/или лучевая терапия. У больных с прогрессирующей опухолью, но по другим показателям находящихся в хорошем клиническом состоянии, допускают увеличение дозы до 1000 мг в сутки. Решения о повышение доз принимают на основании данных о пациентах, которые подвергались лечению на протяжении, по меньшей мере, 4 недель. Заново оценку поражений проводят после одного месяца, трех месяцев и каждые последующие шесть месяцев. Улучшение состояния оценивают на основании клинического обследования и данных КТ/ПЭТ в соответствии с ранее опубликованными критериями, см., например, Van Oosterom A.T. и др., Lancet, 358, 2001, cc.1421-1423. Гистопатологические и молекулярные изменения в течение лечения оценивают у отобранных больных с их согласия посредством последовательных биопсий опухоли.

Патология: Гистопатологические и иммуногистохимические анализы проводят на тканях, залитых в парафин. Поликлональные антитела против CD117 (А4502, раствор 1/250, фирма DAKO, Дания) и авидин-биотин-пероксидазные комплексы используют без какой-либо выборки антигена.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH): Двухцветный интерфазный FISH анализ проводят на срезах толщиной 4 мкм залитой в парафин ткани образцов опухолей, полученных до лечения иматинибом (18 случаев), или на препаратах-отпечатках свежих биоптатов иматинибрезистентных поражений (все 26 случаев). Дигоксигенин- или биотин-меченые ВАС-клоны для KIT/4q12 (RP11-568A2) или PDGFRA/4q12 (RP11-24011) габридизуют с центромерными зондами четвертой хромосомы, мечеными красителями SpectrumGreen- или SpectrumOrange (CEP4, фирма Vysis Inc., Downers Grove, Иллинойс, США), соответственно, согласно приведенному ранее описанию. FISH-данные накапливают с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DMRB (фирма Leica, Вецлар, Германия), оснащенного охлаждаемой черно-белой ПЗС (charged couple device - прибор с зарядовой связью, ПЗС) камерой (фирма Photometries, Тускон, Аризона), обрабатывают с использованием компьютерной программы Quips SmartCaptureTM FISH Imaging Software (фирма Vysis, Bergisch-Gladbach, Германия). Оценивают сто интерфазных ядер и вычисляют соотношение KIT/PDGFRA к CEP4. Соотношение 2 характеризуют как специфическую амплификацию KIT/PDGFRA.

Секвенирование: Геномную ДНК экстрагируют из замороженной ткани, используя High Pure PCR Template Preparation Kit (фирма Roche, Манхейм, Германия). Экзоны 9, 11, 13, 14, 15 и 17 KIT, а также экзоны 12 и 18 PDGFRA амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) по приведенному ранее описанию, см., например, Debiec-Rychter М. и др., J Pathol, 202, 2004, cc.430-438. Продукты ПЦР очищают (Microcon PCR, фирма Millipore, Массачусетс, США) и проводят определение мутаций методом денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии в Transgenomic WAVE DHPLC системе (DHPLC; фирма Transgenomic, Inc., Великобритания). Образцы, показывающие аберрантные профили элюции, повторно амплифицируют и секвенируют.

Вестерн-блоттинг: Оценке подвергают замороженные образцы опухолей, достаточные для получения клеточных лизатов, из десяти устойчивых ГИСО. Лизиз клеток, SDS-ПААГ-электрофорез и иммуноблоттинг проводят согласно приведенному ранее описанию. Иммуноблоттинг мембран (фирма Amersham Pharmacia Biotechnology, Великобритания) проводят в течение ночи с использованием антител к фосфо-KIT (Y703) (фирма Zymed, Сан-Франциско, Калифорния) в разведении 1:500. HRP-конъюгированный антикроличий IgG используют в разведении 1:2500 и визуализируют с помощью Enhanced Chemiluminescence (фирма Pierce). Затем мембраны снимают и подвергают повторному блоттингу для определения общих белковых уровней с использованием антитела, распознающего общий белок KIT (анти-CD117, А4502, фирма DAKO, Глоструб, Дания).

Оценка первичной резистентности клеток ГИСО: Кристаллические соединения мезилат иматиниба и РKС412 в количестве 10 ммолей растворяют в 100% ДМСО (фирма Sigma) и аликвоты хранят при -80°С. Исследования проводят с серийными разведениями 10 ммолярного исходного раствора. В качестве контроля используют разведения растворителя (ДМСО). Первичные клетки получают из образцов прогрессирующих опухолей, дезагрегированных коллагеназой, высевают при 60-70% плотности в 10 мм чашки для культур клеток (фирма Coming Inc., Корнинг, Нью-Йорк) и выращивают в течение трех суток в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 0,1 ммолей заменимых аминокислот и 1,0 ммоля пирувата натрия. Клетки обрабатывают мезилатом иматиниба, или РKС412, или только растворителем в течение 90 мин, промывают 10 мл холодного фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) и лизируют в буфере [1% NP40, 50 ммолей Tris-HCl pH 8,0, 150 ммолей NaCl, с добавлением таблеток полной смеси ингибиторов протеазы (фирма Boehringer Mannheim GmbH, Манхейм, Германия) и 0,2 ммолей ортованадата натрия (фирма Sigma, Сент-Луис, Миссури)].

Конструкция: Мутантные PDGFRA и KIT кДНК получают методом ОТ-ПЦР на РНК, выделенной из прогрессирующих опухолей. кДНК клонируют в ретровирусном векторе pMSCV-puro (фирма Clontech).

Культура клеток: Клетки 293Т культивируют в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки Ba/F3 культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FCS и интерлейкина-3 (1 нг/мл). Вирус продуцируют согласно представленному ранее описанию, см., например. Cools J. и др., N Engi J Med, 348, 2003, cc.1201-1214.

Клетки Ba/F3, трансдуцированные различными конструкциями, отбирают с помощью пуромицина (2 мкг/мл). Чтобы исследовать независимый от фактора рост, клетки Ba/F3 отмывают 3 раза в ФСБ, и новые культуры инициируют в отсутствие интерлейкина-3. Клетки, ставшие независимыми от интерлейкина-3, поддерживают в отсутствии интерлейкина-3. Для построения кривых «доза-ответ» клетки Ba/F3 выращивают в 24-луночных планшетах с различными концентрациями ингибитора. Количество жизнеспособных клеток определяют в начале эксперимента и после 24 ч, используя раствор AqueousOne (фирма Promega).

Результаты: Оценивают прогрессирующие опухоли от 26 пациентов, подвергнутых лечению иматинибом. Среднее время от постановки диагноза до подтверждения злокачественности заболевания составляет 48 недель (диапазон о 0 до 265 недель), а среднее время от постановки диагноза до начала лечения иматинибом составляет 91 неделю (диапазон от 6 до 304 недель). Пятнадцать больных (57,6%) достигли частичной ремиссии и 10 больных (38,4%) показали стабилизацию состояния во время лечения иматинибом, со средней продолжительностью периода ремиссии 48 недель (диапазон о 16 до 200 недель).

Гистопатология: Двадцать пять первичных ГИСО состояли из веретеновидных клеток, а одна имела смешанную морфологию. Экспрессия антигена CD117 показана в каждой первичной опухоли и в 24 из 26 (92%) случаях биопсии прогрессирующих опухолей. Две иматинибрезистентных ГИСО изменились по своему гистологическому проявлению от губчатого до эпителиоидного типа, а также по своему иммунофенотипу и стали CD 117-негативными (данные не представлены).

Мутационный анализ: Комбинацией метода D-HPLC и прямого секвенирования выявляют мутации KIT в 25 из 26 (96,1%) случаях биопсии исходных ГИСО, см. табл.1. Девятнадцать опухолей содержат околомембранные мутации в экзоне 11 и шесть нест мутации в экзоне 9. Ни один из образцов опухолей ранее леченых больных не имеет мутаций в PDGFRA или более одной мутации в KIT. Одна опухоль не имеет определяемого изменения последовательности KIT или PDGFRA в исследованных экзонах. Не было обнаружено точечных мутаций KIT киназного домена в опухолях до лечения иматинибом, но шесть явных вторичных мутаций KIT идентифицировано у 12/26 (48%) пациентов во время прогрессирования в среднем через 77 недель лечения (диапазон от 16 до 188). Четверо больных имели замену V654A и трое больных имели замену T670I, а остальные больные несли мутации D716N, D816G, D820Y, D820E или N822K. Один больной с исходной мутацией G565R в KIT приобрел точечную мутацию D842V в PDGFRA, которая не обнаруживалась в первичной опухоли этого больного.

FISH анализ: FISH анализы показывают амплификацию KIT у 2 из 26 (7,7%) прогрессирующих опухолей. В первичной резистентной опухоли больного 26 амплификация KIT связана с одновременной амплификацией PDGFRA (данные не приведены). В опухоли этого больного не обнаруживают ни KIT мутаций, ни PDGFRA мутаций, ни до лечения, ни в течение прогрессирования заболевания. У одного больного амплификация KIT (до 5-кратного увеличения числа копий) не связана с увеличением числа копий PDGFRA. В этом случае присутствует первичная мутация KIT, но не было обнаружено вторичных мутаций во время прогрессирующего развития. В шести иматинибрезистентных образцах посредством интерфазного FISH анализа выявлена потеря локусов KIT/PDGFRA/CEP4. Хотя в случае трех опухолей эта гемизиготность наблюдалась уже при биопсии исходных опухолей, в трех других образцах она присутствовала только в прогрессирующих поражениях. Среди последних, однако, отмечается явная гетерогенность по количеству сигналов KIT/CEP4 на ядро (в пределах от 0 до 4). В частности, 23% клеток в биоптатах прогрессирующих опухолей от одного больного показали двухаллельные потери KIT/PDGFRA/CEP4.

Активация KIT в резистентных ГИСО: Активацию KIT в 10 иматинибрезистентных ГИСО оценивают посредством вестерн-блоттинга с антителами к фосфотирозину Y703 KIT и общему KIT. В восьми образцах обнаружена экспрессия KIT и различные уровни конститутивного аутофосфорилирования KIT. Четыре из этих восьми опухолей имели вторичные мутации KIT, для остальных четырех опухолей причина реактивации KIT в клетках иматинибрезистентных опухолей неизвестна. В двух резистентных метастатических опухолях отмечено полное отсутствие экспрессии KIT, которое соответствует утрате СD117-позитивности по иммуногистохимии, и в одном случае наблюдаемой двухаллельной потере локусов KIT.

Ответ резистентных ГИСО на иматиниб и РKС412 ex-vivo: Эффект иматиниба и РKС412 на аутофосфорилирование остатка Y703 KIT в культивируемых иматинибрезистентных клетках, которые содержат мутантные изоформы KIT 557-558/Т670I или KITInsAY502-503/V654A, устанавливливают посредством вестерн-блоттинга. Результаты сравнивают с клетками ГИСО882, которые несут гемизиготную мутацию KIT K642E. Данные стандартизируют по суммарной экспрессии KIT, используя анти-KIT антитело. Белок KIT экспрессируется и фосфорилируется до значимого уровня в обеих резистентных KIT 557-558/Т670I и KITIns503AY/V654A опухолях и их культивируемых in vitro клеточных аналогах. Экспозиция любой первичной клеточной линии с иматинибом (до 5 мкмолей) не оказывает влияния на аутофосфорилирование KIT. В противоположность, РKС412 в концентрации 0,5 мкмоля редуцирует, а в концентрации 1 мкмоль полностью ингибирует аутофосфорилирование KIT мутантных клеток KIT 557-558/Т670I. Подобным же образом, РKС412 редуцирует аутофосфорилирование KIT у мутанта KITIns503AY/V654A уже в концентрации 0,5 мкмолей и полностью ингибирует при десятикратном повышении концентрации.

Действие иматиниба и РKС412 на мутанты KIT и PDGFRA in vitro: Мутантные формы KIT 557-558/Т670I, а также PDGFRA DIM842-844 и D842V, экспрессируются в мышиных клетках линии Ва/F3. Клетки Ba/F3 для своего роста нуждаются в ИЛ-3, однако становятся ИЛ-3-независимыми при экспрессии многих активированных киназ, например FIP1L1-PDGFRA и BCR-ABL. Мутантные белки KIT и PDGFRA, введенные в клетки Ba/F3, также выполняют функцию фактора независимого роста и конститутивно фосфорилируются, подтверждая, что они являются активированными киназами (данные не приведены). Кривые зависимости доза-ответ и анализ состояния фосфорилирования KIT 557-558/Т6701 с иматинибом подтверждают резистентность к иматинибу, с фосфорилированием, не полностью ингибируемым при концентрации иматиниба 10 мкмолей (клеточная ИК₅₀ ~5 мкмолей). Мутант PDGFRA D824V также проявляет резистентность к иматинибу, хотя и в меньшей степени (клеточная ИК₅₀ ~1 мкмоль). Мутант PDGFRA DIM842-844 в этом эксперименте является контролем. РKС412 ингибирует все 3 мутанта в концентрации ниже 1 мкмоля, при этом PDGFRA D842V имеет самое высокое клеточное значение ИК₅₀ ~200 нмолей.

Предварительные исследования описывают две категории устойчивости к иматинибу: KIT-зависимый или KIT-независимый механизмы. На основании полученных результатов сделан вывод, что реактивирование KIT является наиболее важным механизмом устойчивости. Было обнаружено, что KIT фосфорилируется (активируется) в 8 из 10 прогрессирующих опухолей, которые можно было исследовать с помощью вестерн-блоттинга в процессе лечения иматинибом. В 50% этих случаев, реактивация KIT является результатом вторичных мутаций резистентности, а для других 50% случаев причина реактивации остается неизвестной. Полное секвенирование KIT в этих образцах может выявить новые мутации в неожиданных участках KIT, которые приводят к тому, что белок становится нечувствительным к дейстию иматиниба. С другой стороны, факторы, влияющие на доставку и клиренс препарата на внутриклеточном уровне, могут привести к недостаточному ингибированию рецептора, с последующим прогрессированием заболевания.

В нашем исследовании у 26 больных приобретенные вторичные мутации KIT являются наиболее частой причиной (в 48% случаях) возникновения резистентности к иматинибу. В прогрессирующих опухолях идентифицированы шесть особых вторичных мутаций KIT. Все они представляют собой замещения единственного аминокислотного остатка и все присутствуют в дополнение к активирующим мутациям KIT, которые идентифицированы в исходных, не подвергавшихся лечению опухолях. Известно, что две возвратные мутации KIT, V654A и T670I, а также три других мутации, D716N, D820E и D816G, присутствующие в единичных случаях, ранее не были зарегистрированы в первичных ГИСО. Это подтверждает тесную связь данных мутаций с развитием резистентности к препарату. Мутации D820Y и N822K ранее описывались в ГИСО, не подвергавшихся лечению иматинибом. Активирующие скачкообразные мутации, например D816G, D820E/Y, N822K, вероятно являются активирующими мутациями в KIT, которые также непосредственно приводят к резистентности к иматинибу. Мутация KIT D816V у пациентов с системным мастоцитозом и в субпопуляции семином связана с первичной резистентностью к иматинибу.

Одна опухоль с первичной мутацией KIT G565R приобрела устойчивость к иматинибу в результате вторичной мутации PDGFRA D842V. Мутация D842V является наиболее частой активирующей мутацией PDGFRA в ГИСО и, что также доказано, приводит к устойчивости к иматинибу. Эта мутация является активирующей мутацией, которая приводит к понижению чувствительности к иматинибу. Резистентность к иматинибу может происходить благодаря мутациям в разных киназах, например в PDGFRA, что свидетельствует о ранее неописанном механизме устойчивости. В общем, резистентность опухоли, связанная с чувствительностью активированной киназы к низкомолекулярному ингибитору, могла возникнуть благодаря активирующей мутации в отдельной киназе, которая не чувствительна к данному ингибитору. Остается установить, функционирует ли этот механизм устойчивости более часто в ГИСО и других опухолях и лейкозах, и является ли он причиной резистентности в случаях настоящего исследования, в которых не удается установить вторичные геномные изменения в KIT.

В двух случаях этого исследования иматинибрезистентность связана с амплификацией генов KIT или KIT/PDGFRA. В последнем случае больной показал первичную резистентность к иматинибу с сильным прогрессирующим опухолевым ростом, в результате чего больной умер через пять недель после начала введения иматиниба. Поскольку злокачественная стадия болезни у этого больного продолжалась более одного года, и до лечения иматинибом больной подвергался высоким дозам химио- и лучевой терапии, амплификация, наиболее вероятно, уже происходила в опухолевых клетках до введения иматиниба, и в дальнейшем в присутствии препарата происходила селекция на амплификацию.

Это указывает на то, что амплификация KIT может вызывать первичную резистентность и предостерегает от использования классической химиотерапии у больных с ГИСО, которая может усиливать развитие клонального разнообразия, связанного с прогрессированием заболевания, с возможной генерацией генетических изменений, оказывающих влияние на реакцию на лекарственное средство.

В двух прогрессирующих опухолях экспрессия KIT была полностью утеряна, указывая на KIT-независимый механизм резистентности. Интерфазный FISH анализ обнаружил селективный рост клеток с двухаллельной потерей целевых генов KIT/PDGFRA в одной из этих опухолей, дополнительно подчеркивая избавление

от рецепторной зависимости. Переход к гемизиготности KIT/PDGFRA наблюдался в двух опухолях при резистентности к иматинибу, которая связана с появлением вторичных мутаций KIT. Усиливает ли гемизиготность/гомозиготность нечувствительность возвратных мутантов к иматинибу является неясным и требует дальнейшего исследования.

В попытке определить чувствительность к иматинибу общих мутаций KIT V654A и T670I, присутствующих в клетках опухолей в процессе прогрессирования, проводилось исследование ингибиторного действия иматиниба на лиганднезависимое фосфорилирование KIT в клетках, содержащих эти мутации, используя оценку ex vivo. В обоих случаях аутофосфорилирование KIT не ингибировалось такой высокой концентрацией иматиниба (5 мкмоль), которая представляет собой примерно максимальный уровень иматиниба, допустимый in vivo. Другой ингибитор KIT и PDGFR, PKC412, оказывал ингибиторное действие на оба мутанта в концентрациях, которые соответствуют терапевтическому применению препарата. Различная чувствительность к иматинибу и PKC412 у мутанта KIT T670I в дальнейшем подтверждена in vitro с использованием трансформированных мышиных клеток Ba/F3. Чтобы дополнительно проанализировать чувствительность к PKC412 других иматинибрезистентных мутаций, исследовались клетки Ba/F3, трансфецированные иматинибрезистентным мутантом PDGFRA D842V. PKC412 эффективно ингибирует мутант PDGFRA D842V в концентрации 1 мкмоль, сверх того подчеркивая потенцию препарата in vitro для ингибирования опухолей, содержащих различные иматинибрезистентные мутантные изоформы. Подтверждено существование KIT-зависимого и KIT-независимого механизмов иматинибрезистентности у больных с ГИСО и выявлены новые иматинибрезистентные мутантные изоформы KIT. Это подчеркивает, что приобретение мутаций иматинибрезистентности PDGFRA может быть причиной вторичной резистентности у KIT-положительной опухоли и указывает на амплификацию KIT как на возможное объяснение не только вторичной, но также первичной резистентности к лекарственному препарату. Доказана чувствительность мутаций KIT T670I и V654A и мутаций PDGFRA D6842V к РIС421. Исходя из того что отдельные мутации в киназном домене проявляют различную чувствительность к различным киназным ингибиторам, трудно подобрать терапию второго уровня именно к конкретному механизму резистентности.

Таблица
Опухолевый генотип KIT и PDGFRA у 26 больных с ГИСО
Пациент	Генотип
Исходная биопсия	Вторичные мутации а
KIT	KIT или PDGFRA
1	PM K558N
2	Del WK557-558
3	Del WK557-558B
4	Del WK557-558B
5	Del KVVE558-561
6	Del KVVEEI 558-563
7	Del VYIDPTQL 569-576
8	Del GNNYVYIDPTQLPYD565-579V
9	PM V559G	KIT V654A (GTG GCG)
10	PM L576PВ	KIT V654A (GTG GCG)b
11	Ins 574PT	KIT V654A (GTG GCG)
12	Del WK557-558	KIT D716N (GAT AAT)
13	Del WK557-558	KIT T670I (ACA ATA)
14	Del WK557-558	KIT T670I (ACA ATA)b
15	Del KPMYEVQWK 550-558Q	KIT T670I (ACA ATA)
16	Del VEEINGNNYVYIDPTQL560-576	KIT D820E (GAT GAA)
17	Del VYIDPTQL 569-576	KIT D820Y (GAT TAT)
18	Del VYIDPTQL 569-576	KIT N822K (AAT AAA)b
19	Ins 503AY	KIT V654A (GTG GCG)
20	Ins 503AY	KIT D816G (GAC GGC)
21	Ins 503AY
22	Ins 503AY
23	Ins 503AY
24	Ins 503AY
25	РМ G565R	PDGFRA D842V (GAC GTC)
26	ДТ

Аббревиатура: ДТ - дикий тип; а - мутации, обнаруженные относительно первоначального состояния мутантной изоформы; б - диапазон сигналов KIT на ядро; в - гемизиготное состояние по секвенированию.