штамм л-4-18 eimeria necatrix (возбудителя кокцидиоза) для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований

Формула изобретения

Штамм возбудителя кокцидиоза Eimeria necatrix Л-4-18, депонированный в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии под регистрационным номером КЭ № 4, для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной паразитологии и биотехнологии, а точнее к производству вакцинных препаратов против кокцидиоза кур, вызываемого Eimeria necatrix (E.necatrix), и проведения научных исследований.

Кокцидиоз кур, вызываемый Е.necatrix, имеет широкое распространение во всех странах и наносит существенный экономический ущерб промышленному птицеводству. В России кокцидиоз, вызываемый этим видом, получил широкое распространение в последнее десятилетие после завоза в нашу страну зарубежных живых вакцин против кокцидиоза.

Важным методом борьбы с кокцидиозом кур является иммунопрофилактика. Технология производства и применения вакцин такова, что используемые при их изготовлении штаммы должны обладать высокой иммуногенной активностью, не быть устойчивыми к действию различных антикокцидийных препаратов (химиопрепараты и ионофорные антибиотики).

Многие научно-исследовательские центры занимаются изучением как самого паразита, так и вызываемого им заболевания у птиц. Основной целью научных исследований является создание средств и методов диагностики, химио- и специфической профилактики болезни.

Известен ряд штаммов Е.necatrix (1, 2, 3). Эти штаммы выделены в других странах и используются при проведении научных исследований и производстве вакцин.

В России при проведении исследований обычно использовали не чистые штаммы различных видов кокцидий, а их смеси. Однако при разработке эффективных вакцин необходимо иметь чистые лабораторные штаммы возбудителя. Поэтому возникла необходимость выделения такого штамма Е.necatrix, который можно было бы использовать для указанных целей.

В качестве прототипа использован штамм E.necatrix, описанный Edgar S.A. and Seibold C.G., 1964 (4).

Этот штамм относится к наиболее вирулентным для кур, вызывая значительный падеж особенно у взрослого поголовья. В высоких дозах вызывает у зараженных восприимчивых цыплят острое переболевание с характерными клиническими признаками (угнетенный вид, взъерошенные перья, бледность гребешков и слизистых оболочек, жажда, отказ от корма, кровянистый помет). На вскрытии у павших птиц отмечается сильное вздутие и геморрагические поражения слизистой оболочки среднего отдела тонкого кишечника, в тяжелых случаях поражается весь пищеварительный тракт. Стенка кишки сильно утолщена, со стороны серозы заметны геморрагические поражения, а также беловатые узелки. У переболевших цыплят образуется иммунитет к повторному заражению.

Таблица 1
Характеристика прототипа
Показатели
Размеры ооцист, мкм:
длина	13,2-22,7 (средняя 20,4)
ширина	11,3-18,3 (средняя 17,2)
Форма ооцист	Удлиненно-овоидная
Препатентный период, *ч	138
Место локализации в кишечнике	Средняя часть тонкого кишечника
Заражаемость	XXXX*
Смертность	XXXX*
Встречаемость	Обычен
Течение заболевания (дни)	8-12
Чувствительность к кокцидиостатикам	Неизвестна
* Время от заражения до начала выделения ооцист во внешнюю среду
** Х-ХХХХ - степень заражаемости и смертности

Однако мы не обладаем сведениями об иммуногенности и чувствительности к антикокцидийным препаратам вышеуказанного штамма Е.Necatrix.

Задачей изобретения является получение штамма Е.necatrix, обладающего высокими иммуногенными свойствами, чувствительного к кокцидиостатикам.

Поставленная задача достигается штаммом Л-4-18 Eimeria necatrix (возбудителя кокцидиоза) для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований.

Штамм Л-4-18 E.necatrix выделен путем заражения восприимчивого цыпленка одной спорулированной ооцистой из материала, полученного от больных цыплят с одной из птицефабрик Ленинградской области. В лабораторных условиях изучены его иммунобиологические (морфологические, вирулентные, иммуногенные) свойства и чувствительность к антикокцидийным препаратам.

Штамм депонирован в коллекции Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства Россельхозакадемии под номером КЭ № 4.

Характеристика штамма Л-4-18 Eimeria necatrix

Систематическое положение. Штамм Л-4-18 E.necatrix относится к роду Eimeria, семейству Eimeriidae, отряду Coccidiida.

Морфологическая характеристика. Имеет удлиненно-овальные ооцисты длиной 17-26 мкм, шириной 15-20 мкм (средняя 21,5-17,5 мкм).

Биологические свойства. Препатентный период развития паразита составляет 128 часов. Место эндогенного развития в кишечнике инвазированных цыплят - средний отдел тонкого кишечника, ооцисты развиваются в слизистой слепых отростков.

Вирулентные свойства. При заражении 15-дневных цыплят ооцистами, хранившимися не более 2-х месяцев, в дозе 900000 ооцист на голову, летальность составляет не менее 30%.

Иммуногенные свойства. Заражение цыплят ооцистами вызывает формирование специфического иммунитета (гуморального и клеточного).

Культурально-биохимические свойства. Штамм Л-4-18 E.necatrix не культивируется на питательных средах. Поддерживается путем пассирования на цыплятах, вызывая через 96 часов характерные поражения в кишечнике с выделением ооцист, начиная с 128 часа после заражения.

Штамм чувствителен к антикокцидийным препаратам - ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам.

Специфичность. Штамм Л-4-18 E.necatrix специфичен только для кур.

Пример 1. Использование штамма Л-4-18 E.necatrix для наработки культуры кокцидий для иммунохимиопрофилактики кокцидиозов кур.

Для иммунизации птицы используются специально подобранные штаммы кокцидий, обладающие слабой вирулентностью и высокой иммуногенностью, в дозах, не вызывающих клинического переболевания кокцидиозом. Такими свойствами обладает штамм Л-4-18 E.necatrix. Иммуногенный материал получают следующим образом. 14-дневных цыплят, свободных от кокцидий, заражают перорально ооцистами штамма Л-4-18 E.necatrix из матричной расплодки в дозе 40 тысяч на 1 голову. На 6-9 сутки после заражения из собранного от цыплят помета выделяют ооцисты методом флотации в насыщенном растворе поваренной соли. Споруляцию ооцист проводят в 2%-ном растворе двухромовокислого калия при температурном режиме 26±2°C в течение 3-5 суток. Спорулированные ооцисты штамма Л-4-18 E.necatrix используют при изготовлении антикокцидийной вакцины.

Вакцина против кокцидиоза представляет собой гомогенную стерильную смесь серовато-оранжевого цвета без посторонних примесей, плесени, неразбивающегося осадка, безвредную для цыплят. Пероральное применение культуры кокцидий вызывает субклиническое переболевание цыплят с последующим выделением ооцист во внешнюю среду, что создает возможность естественного реинвазирования хозяина и формирования у него иммунитета, напряженность которого может быть определена после контрольного заражения.

Пример 2. Изучение в экспериментальных условиях антикокцидийной активности препаратов.

В настоящее время основным методом профилактики кокцидиозов кур является использование антикокцидийных препаратов. В связи с тем, что длительное применение кокцидиостатиков вызывает появление резистентных форм паразитов, что существенно снижает эффективность химиопрофилактики, необходимо знать степень чувствительности лабораторных штаммов к применяемым препаратам. Кроме того, эффективность вновь синтезированных кокцидиостатиков также должна проверяться на чувствительных штаммах кокцидий с известной вирулентностью. К таким штаммам относится штамм Л-4-18 E.necatrix.

Интактных цыплят заражают перорально ооцистами штамма Л-4-18 E.necatrix и сразу начинают давать с кормом изучаемые препараты. Наблюдения за птицей ведут в течение 10 дней. Для оценки антикокцидийной активности препарата используют показатели выживаемости и привесов, которые служат для определения противококцидиозного индекса (ПКИ).

Таблица 2
Сравнительная оценка эффективности различных кокцидиостатиков при заражении цыплят кокцидиями штамма Л-4-18 E.necatrix
Назначение групп	Наименование препаратов	Доза препарата, % к корму	Доза ооцист, тысяч	Процент
выживаемости	привеса	ПКИ
Подопытная	химкокцид	0,07	900	100	90,2	199
Подопытная	никарбазин	0,125	900	100	89,7	198
Контрольная зараженная, без препарата	-	-	00	60,0	28,6	92
Контрольная незараженная	0	0	0	100	90,4	200

В данном опыте установлено, что и химкокцид, и никарбазин обладают выраженной антикокцидийной активностью при заражении цыплят кокцидиями штамма Л-4-18 E.necatrix.

Таким образом, штамм Л-4-18 E.necatrix обладает такими иммунобиологическими свойствами, которые позволяют использовать его для проведения экспериментальных исследований, а также в целях получения антигенного и иммуногенного материала, используемого для диагностики и специфической профилактики заболевания.

Источники информации

1 Singh J. and Gill B.S. Effect of gamma irradiation on oocysts of Eimeria necatrix. Parasitology, 71, 1975.

2. Shirley M.W. Eimeria necatrix: the development and characteristics of an egg adapted (attenuated) line. Parasitology, 81, 1980.

3. Long P.L. and Rose M.E. Prospects for the Control of Coccidiosis by Immunization. World's Poultry Sci.J., 38 (2), 1982.

4. Edgar S.A., Siebold C.T. A new coccidium of chickens, Eimeria mivati sp.n. (Protozoa: Eimeriidae) with details its life history. Journal of Parasitology 50 (2), 1964.